Гребенникова В.В.(сост.) Биотехнология- сборник ситуационных задач с эталонами ответов (1)


Чтобы посмотреть этот PDF файл с форматированием и разметкой, скачайте его и откройте на своем компьютере.


Типография КрасГМУ
Подписано в печать 31.
5.11. Заказ № 1
756
Тираж
660022, г.Красноярск, ул.П.Железняка, 1
пассивный иммунитет возникает через несколько часов после
инъекции и длится до двух недель.
Недостатки:
малая длительность иммунитета;
необходимость контроля доноров-добровольцев на отсутствие
антител к вирусам иммунодефицита человека ВИЧ-1 и ВИЧ-2,
гепатита С , поверхностного антигена вируса гепатита В.
Основные этапы получения:
Иммунизация доноров-добровольцев вакциной против
клещевого энцефалита.
Заготовка крови доноров и получение плазмы.
выделение γ-глубина, стерилизующая фильтрация и
ампулирование.
Контроль качества
Заготовка крови доноров и получение плазмы методом плазмофереза.
Кровь донора собирают в стерильные емкости из полимерного материала,
содержащие раствор антикоагулянта (5% раствор натрия цитрата) для
предотвращения свертывания крови; центрифугируют кровь, при этом
отделяется плазма и осаждаются клетки, которые возвращаются донору, что
значительно снижает возможность возникновения неблагоприятных
последствий в организм донора.
Выделение γ-глобулиновой части белков крови осуществляют
фракционированием 8-26% этанолом при температуре ниже 0
С. В этих
условиях денатурирующие действие этанола на белки крови незначительно и
выделяемая γ-глобулиновая фракция сохраняет растворимость.
Лиофилизация γ-глобулина осуществляется методом лиофильной
сушки. Далее следует изготовление 10% раствора γ-глобулина,
стерилизующая фильтрация и ампулирование.
Контроль качества проводится по следующим показателям:
- стерильность;
-апирогенность;
-содержание белка;
-безвредность;
-специфическая активность.
Условия хранения и транспортирования: в сухом, защищенном от света месте
при температуре 6±4
Влияние на иммунитет: специфическое взаимодействие с антигенами,
создание искусственного пассивного иммунитета.
Применение: экстренная профилактика и лечение клещевого энцефалита у не
привитых людей, отметивших присасывание клеща в районах, эндемичных
по клещевому энцефалиту.

легко проверять факторы, влияющие на эффективность иммунизации.
2. Клонирование осуществляется для выделения стабильных клонов
гибридомных клеток. Для недавно образованных гибридомных клеток
характерна высокая нестабильность, связанная с утратой хромосом. При
культивировании могут появляться клетки, потерявшие способность
продуцировать антитела и они могут перерастать антителообразующие
гибридные клетки.
К основным методам клонирования клеток относятся клонирование методом
лимитирующих разведений, клонирование в полужидком агаре и
клонирование с помощью прибора – проточного цитофлуориметра.
3. Принцип работы теста для ранней диагностики беременности. На
поверхности индикаторной полоски иммобилизованы антитела к
хорионическому гонадотропину. В тестовой и контрольной зонах нанесены
моноклональные меченые антитела. В контрольной зоне также нанесено
минимальное количество антигена - гонадотропина хорионического. При
проведении анализа полоску опускают в исследуемый образец мочи д
отмеченного на полоске уровня. В процессе движения жидкости вверх по
полоске определяемый антиген взаимодействует с иммобилизованными
антителами, вызывая их постепенное насыщение. При наличии в моче
хорионического гонадотропина в концентрации выше 25 мг/мл в тестовой
зоне - образуется «сендвич» антитело - определяемый антиген - меченое
антитело и появляется полоса розового цвета. При отсутствии в пробе
гонадотропина хорионического окраски в тестовой зоне не наблюдается. В
контрольной зоне, расположенной выше тестовой зоны, образуется
«сендвич» антитело-стандартный антиген-меченное антитело» и появляется
полоса розового цвета. Таким образом, при наличии двух розовых полос на
тесте концентрация гонадотропина в моче превышает уровень 25 мг/мл и с
достоверностью близкой к 100 % можно говорить об установлении факта
беременности. Наличие только одной розовой полосы в контрольной зоне
свидетельствует об отсутствии беременности.
Ответ к задаче №
Название иммунотропного лекарственного средства
иммуноглобулин
человека против клещевого энцефалита.
Класс и группа
препаратов,
которым относит
ое средство:
эндогенные специфические иммуностимуляторы, иммуноглобулины
(поликлональные антитела).
Достоинства:
обеспечивают высокий титр антител благодаря концентрированию
целевого продукта;
освобождены от балластных белков, что снижает количество
аллергических реакций и осложнений;
современная технология получения гарантирует гибель вируса
инфекционного гепатита;
��71 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;использовании моноклональных антител, которые обладают высокой
специфичностью и реагируют с определенной детерминантой антигена.
Использование моноклональных антител позволяет объединять
иммобилизованные и меченые антитела на одной подложке и,
следовательно, уменьшать количество стадий анализа и промывок.
«Сендвич» - анализ включает следующие этапы:
1.Инкубация определяемого антигена анализируемой пробы с
иммобилизованными антителами и промывка несвязавшихся
компонентов.
2.Введение меченных антител, инкубация и отмывка.
3.Детекция ферментативной активности. Ферментативная активность
твердой фазы пропорциональная количеству антигена в пробе.
Ответ к задаче №
1. Процедура получения моноклональных антител включает в себя
следующие этапы:
иммунизация животных
подготовка клеток к слиянию
слияние
отбор индуцирующих специфические антитела клонов
клонирование и реклонирование
массовая наработка гибридомных клеток
получение культуральной жидкости или асцита, содержащих антитела
выделение антител.
Обычно вся процедура от момента начала иммунизации до выделения
антител занимает 3-4 месяца.
Назначение процесса иммунизации состоит в том, чтобы увеличить
долю клеток, продуцирующих антитела заданной специфичности, и
перевести эти клетки в функциональное состояние, при котором они
способны сливаться и образовывать антителообразующие гибридные клетки.
Экспериментально установлено, что для гибридизации необходимы
выделять селезеночные клетки животных через 3-4 суток после последнего
введения антигена, то есть тогда, когда в лимфоидных органах много активно
пролиферирующих клеток.
Ответ к задаче №
1. В последнее время активно развиваются методы полной иммунизации вне
организма с целью получения гибридомы. Иммунизация in vitro имеет ряд
существенных преимуществ:
укорачивается период иммунизации до 4-5 суток;
требуется существенно меньшее количество антигена;
ко многим антигенам можно получить более выраженный иммунный
ответ (частично за счет снижения вклада толерантности и супрессии);
повышается процент отвечающих клеток;
�� &#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;&#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;70 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;Метод основан на возможности антител модулировать активность фермента,
связанного с измеряемым веществом (антигеном). Изменение активности
фермента происходит из-за создаваемых антителом в процессе реакции с
конъюгированным антигеном пространственных затруднений для субстрата в
результате изменения конформации. В качестве ферментов в гомогенном
ИФА используют дегидрогеназы, а субстратов - кофакторы.
Прямой конкурентный метод ELISA (гетерогенный метод ИФА) для
определения антигенов выполняется в том случае, когда антитела
иммобилизованы на твердой фазе, а меченный и не меченный
антигены, добавленные одновременно, конкурируют друг с другом за
связывание с антителом. В связи с тем, что количество антител на
твердой фазе ограниченно, меченного конъюгата образуется тем
меньше, чем выше концентрация анализируемого антигена в пробе.
Метод последовательного насыщения ELISA применяют для
определения антигенов в том случае, если исследуемый образец влияет
на маркер или если константы связывания обоих компонентов с
антителами различны. На первом этапе с антителами инкубируют обра-
зец, затем удаляют в результате промывки несвязавшиеся компоненты,
и на следующем этапе добавляют меченый антиген. Ферментативная
активность твердой фазы обратно пропорциональна содержанию
антигена в анализируемой пробе.
. Метод ингибирования ELISA с использованием двойных антител
основан на конкуренции свободных антител с антигеном,
предварительно фиксированном на носителе, и определяемым
антигеном, находящимся в растворе. Маркер введен во второе
антитело. Ферментативная активность твердой фазы прямо
пропорциональна содержанию антигена в анализируемой пробе.
Определение антител осуществляют: прямым конкурентным методом;
методом с использованием меченого антигена; непрямым методом.
Прямой конкурентный метод ELISA для определения антител основан
на фиксации антигена на твердой фазе и конкуренции между мечеными
антителами (конъюгатами) и антителами опытной пробы. Конъюгат с
фиксированным антигеном связывается тем меньше, чем больше
антител в пробе, и, следовательно, ферментативная активность твердой
фазы, определяемая после промывки, обратно пропорциональна
содержанию антител в анализируемой пробе.
Иммунометрический вид ИФА («сендвич» - анализ) заключается в
том, что на твердой фазе иммобилизован избыток антител, с которыми
инкубируют антиген. После удаления несвязавшихся компонентов в
систему добавляют избыток меченых ферментом антител, которые
взаимодействуют с антигеном. Образуется «сендвич» - комплекс, в
котором между двумя антителами находится антиген, имеющий две
детерминанты, расположенные на достаточном расстоянии друг от
друга. «Сендвич» - анализ выполняют как с поликлональными, так и
моноклональными антителами. Более точные результаты получают при
простота.
Наиболее существенные недостатки РИА:
радиоактивные изотопы являются короткоживущими,
испускающими высокоэнергетическое излучение, что ограничивает
время их использования и требует специального оборудования;
радиоактивное повреждение меченого реагента приводит к потере
активности в иммунологических реакциях;
необходимость проведения исследований в специально
оборудованной лаборатории для работы с радиоактивными
изотопами с использованием громоздкой и дорогостоящей
аппаратуры для регистрации результатов исследований;
необходимость существования централизованной системы
распределения радиоиммунных диагностических наборов,
безопасной утилизации отходов (проб анализа) и неиспользованных
тест-систем по истечении их срока годности;
сложность утилизации радиоактивных отходов
затратность.
Иммуноферментный анализ-ИФА получил широкое применение
благодаря особым преимуществам ферментной метки, которая не только
позволяет выявить комплекс «антиген-антитело», но и обладает
следующими положительными свойствами:
многократное усиление сигнала за счет того, что в присутствии
одной молекулы фермента за короткое время образуются миллионы
и миллиарды молекул продукта реакции, катализируемой данным
энзимом;
проведение анализа в ряде случаев без разделения вошедших в
комплекс и не связавшихся компонентов;
возможность регулирования каталитической активности.
Благодаря перечисленным преимуществам ферментной метки, а также
экологической чистоте метода иммуноферментный анализ практически
вытеснил РИА.
Одним из важных моментов в проведении ИФА является разделение
свободных и связанных с антителами меченых компонентов. В зависимости
от принципа разделения ИФА подразделяется на гомогенный и гетерогенный
вариант иммуноанализа.
Ответ к задаче №57
. Гомогенный вид иммуноферментного анализа (EMIT - Enzyme
multiplied Immunoassay Technique) - иммуноаналитический метод с
регуляцией ферментативной активности) осуществляется без
разделения компонентов и заключается в построении такой системы,
при которой активность фермента изменяется в процессе иммунной
реакции.
�� &#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;&#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;68 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ; 3. Вторичные иммунодефициты (вторичная иммунная недостаточность) -
клинико-лабораторный синдром недостаточности эффекторных функций
иммунокомпетентных клеток, сочетающийся с осложненным течением
воспалительных заболеваний и травм, повышенным риском развития
аутоиммунных, аллергических заболеваний и новообразований.
Вторичные иммунодефициты развиваются в результате:
длительного применения иммунодепрессантов при аутоиммунных
заболеваниях;
хронических и рецедивирующих аллергических заболеваний;
злокачественных новообразований и их лучевой и химиотерапии;
выраженного нарушения обмена веществ,
длительного проживания в экологически неблагоприятных
районах;
генерализованных инфекционных заболеваний;
тяжелых и обширных травм и хирургических вмешательств;
хронического стресса и старения организма.
Ответ к задаче №
1. Диагностический тест должен отвечать следующим требованиям:
воспроизводимость; правильность; высокая чувствительность при выявлении
очень малых количеств молекулы-мишени, высокая специфичность в
отношении молекулы-мишени; высокая точность; простота метода
определения (возможность получать однозначные результаты при небольших
затратах времени и при отсутствии сложного оборудования).
2. Иммуноанализ используется в двух вариантах:
для определения определенных антигенов с помощью специфических к
этим антигенам антител (диагностикумы на основе антител);
для детекции антител определенной специфичности с помощью
соответствующих антигенов (диагностикумы на основе антигенов).
3. Радиоиммунологический (радиоиммунный) метод -РИА- заключается во
введении в систему «антиген-антитело» меченого радиоактивным изотопом
антигена, в результате происходит связывание определяемого и меченого
антигена с ограниченным количеством стандартных антител. Реакция
антиген-антитело приводит к состоянию равновесия между свободным и
связанным антигеном. Меченые и немеченые антигены конкурируют за
ограниченное число участков связывания антител. Количество меченого
антигена, включившегося в состав иммунных комплексов, обратно
пропорционально количеству немеченого антигена в пробе.
РИА характеризуется следующими достоинствами:
высокая точность;
высокая специфичность;
высокая чувствительность определения малых концентраций
соединений при наличии в пробах примесей с близкой структурой и
сходной биологической активностью;
��67 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;3. Для дегидрирования в положении 1,2 в основном применяют Согупеbacterium
simplex. Для изомеризации с одновременным окислением 3-оксигруппы в 3-
кетогруппу широко используются штаммы Corynebacterium mediolanum (sin.
Flavobacterium dehydrogenans). Отметим важность этой реакции, поскольку
источники сырья (диосгенин, соласодин) содержат Збета-оксигруппу, тогда
как активные стероидные препараты должны иметь 3-кетогруппу.
Ответ к задаче №
Активирующие агенты иммунной системы (антигены) - это клетки
микроорганизмов, вирусы, белки, нуклеиновые кислоты, антибиотики,
пестициды и другие ксенобиотики, а также ошибочно измененные
клетки самого организма.
Компоненты иммунной системы подразделяют на следующие виды:
Клеточный компонент.
Молекулярный компонент.
Генетический компонент.
3. Молекулярный компонент - это иммуноглобулины (антитела),
вырабатываемые дифференцированными В - лимфоцитами. Известно 5
классов иммуноглобулинов IgA, IgD, IgE, IgG, IgM.
Ответ к задаче №55
1. Генетический компонент иммунной системы включает множество
генов, кодирующих синтез главного комплекса гистосовместимости и синтез
иммуноглобулинов, определяющих индивидуальную чувствительность
организма к заболеваниям благодаря регулированию силы ответа на
соответствующие антигены. Каждая из четырех белковых цепей мономерных
молекул антитела кодируется двумя структурными генами. Гены главного
комплекса гистосовместимости объединяют 15 генов, расположенных в 6
паре хромосом.
В результате перенесенной инфекции в организме сохраняются
субпопуляции специфических (сенсебилизированных) В - и Т-лимфоцитов,
которые при повторном инфицировании могут размножаться, синтезировать
специфические макромолекулы и обеспечивать устойчивость организма к
данном) патогену. Такое состояние организма называют приобретенным
иммунитетом.
2. Первичная иммунная недостаточность или первичный иммунодефицит -
это совокупность патологических состояний, обусловленных генетическим
дефектами эффекторных звеньев иммунной системы и приводящих к
нарушению элиминации антигенов: возбудителей инфекционных
заболеваний, аутоантигенов, аллергенов, антигенов опухолевой природы.
Врожденные иммунодефициты передаются по наследству по рецессивному
типу и проявляются вскоре после рождения. Лечение первичных
имунодефицитов осуществляется путем трансплантации костного мозга,
заместительной терапии и иммунокоррекции.
�� &#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;&#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;66 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;2. В случае, когда растворимость стероидного субстрата слишком мала для
проявления присущей микроорганизму ферментативной активности,
задействуют методы, повышающие водорастворимость стероидов.
Первый — подача стероида в растворителе, смешивающемся с водой
(ацетоне, метаноле, этаноле, диметилформамиде, диметилсульфоксиде и др.)
Ограничением для применения этого метода является токсичность
определенных концентраций растворителей.
Второй — использование водорастворимых форм стероидов в виде
натриевых солей 2,1-гемисукцинатов или фосфатов. Осложняющим
моментом для широкого использования таких модификаций является
высокая степень избирательности по отношению к ним со стороны
микроорганизмов, например для дегидрирующего микроорганизма
Corynebacterium simplex эти формы стероидов оказались недоступны.
Третий метод — заключение стероидов в растворимый комплекс с
циклодекстрином. Использование комплекса стероидов с циклодекстрином
не имеет ограничений предыдущих методов.
Микробиологическое гидроксилирование — наиболее часто применяемый
метод получения стероидных препаратов, так как присутствие
гидроксильных групп в 3, 11, 16, 17-положениях молекулы стероида
обусловливает, как правило, физиологическую активность для большинства
гормональных стероидных препаратов.
Широко используется в промышленности микробиологический синтез
одного из основных кортикостероидов — гидрокортизона (кортизола) и его
синтетических аналогов: преднизолона и дексаметазона. В этом случае
исходным продуктом для 11(3-гидроксилирования может служить вещество
Рейхштейна (кортексолон), которое для краткости принято называть
«вещество S». Само по себе «вещество S» является модифицированным
продуктом биотрансформации (с помощью культуры Corynebacterium
mediolanum) моноацетата «вещества R».
Ответ к задаче №53
Причины низкой производительности ферментации при
микробиологическом гидроксилировании стероидов:практическая
нерастворимость стероидных субстратов в воде и токсичность применяемых
растворителей и, следовательно, невозможность использования достаточно
высоких концентраций субстрата.
Актинобактерии являются эффективными биокатализаторами многих
процессов биоконверсии стероидов, имеющих важное значение для синтеза
фармацевтических гормональных препаратов. Биокаталитический потенциал
этих микроорганизмов в отношении широкого ряда стероидных субстратов
позволяет прогнозировать их эффективное использование для создания
новых технологий получения стероидных фармсубстанций: в отношении
различных реакций трансформации стероидов, таких, как гидроксилирование,
введение и восстановление двойной связи, окисление стероидных спиртов,
восстановление кетонов, деэтерификация и деградация боковой цепи и др.
��65 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;Ответ к задаче №51
1. Биотрансформация- процесс превращения метаболитов в структурно
родственные соединения с ценными свойствами под влиянием
микроорганизмов или микробных клеток.
Общей чертой всех процессов микробиологической трансформации
является изменение именно молекулярной структуры трансформируемого
вещества, а не синтез молекулы de novo.
Основные процессы микробиологической трансформации —
это
окисление, восстановление, декарбоксилирование, дезаминирование,
гидролиз, метилирование, конденсация, изомеризация и т.д.
В промышленном производстве стероидных препаратов
биотехнологические методы имеют конкретные преимущества перед
методами химического синтеза: возможность реакций, недоступных для
химического синтеза; превращение субстрата в биологически активную
форму соединения в течение одной стадии процесса (в отличие от
многостадийного и весьма затратного химического синтеза); удобство,
экономичность и экологичность производства.
5. В качестве исходного сырья для производства этих препаратов
используются стерины растений (класс фитостеринов). Эргостерин,
стигмастерин, ситостерин.
Биотрансформация стероидов — аэробный процесс глубинной
ферментации, для проведения которой используется оборудование,
отвечающее высокой степени массообмена.
7. Трансформация может осуществляться как растущей на среде культурой,
так и отмытыми от питательной среды клетками микроорганизма. Последний
вариант предпочтительнее, поскольку облегчает выделение и очистку
целевого продукта. Но, как показала производственная практика, не все
микроорганизмы переносят промышленное сепарирование без потери
активности; так, представители мукоровых грибов очень чувствительны к
сепарированию, тогда как представители несовершенных грибов теряют
свою активность незначительно.
Ответ к задаче №52
1. Стероиды — малорастворимые в воде соединения: их растворимость
колеблется от 0,3 г/л (гидрокортизон) до 0,01 г/л (ацетонид
фторкортексолона). Поэтому трансформационные процессы осуществляют
обычно при концентрации субстрата в пределах 1 — 10 г/л, что предполагает
нахождение основной массы стероида в твердой фазе. В этом случае
необходимым условием является высокая степень предварительного
измельчения стероидного субстрата (поступает в среду в
микронизированном виде) с использованием ультразвуковых или
механических измельчителей.

контроль на отсутствие посторонних микроорганизмов,
определение безвредности на лабораторных животных.
Ответ к задаче №50
1. Бифидо - и лактобактерии обладают рядом преимуществ по сравнению с
кишечной палочкой:
являются симбионтами макроорганизма с первых дней жизни;
молочнокислые бактерии являются кислоторезистентными
микроорганизмами, что обеспечивает их высокую выживаемость
при пероральном приеме;
лактобактерии устойчивы к антибиотикам, что позволяет применять
их в курсе антибиотикотерапии.
2. Технологический процесс производства препаратов пробиотиков включает:
- восстановление клеток из состояния анабиоза путем многократных
посевов на твердых питательных средах с оценкой антагонистической
активности;
- культивирование клеток с целью получения биомассы;
- отделение клеток и концентрирование культуральной жидкости
(проводится только при получении препаратов метаболитов пробиотиков)
- сублимационная сушка культуральной суспензии;

оценка качества (контроль);
получение готовых лекарственных форм.
Контроль готового лекарственного препарата Bifidobacterium bifidum
проводят по следующим показателям:
содержание живых микробных клеток, которых в дозе сухого
бифидумбактерина должно быть не менее 10 -10 живых
бирфидобактерий;
отсутствие посторонних микроорганизмов;
антагонистическая активность по отношению к дизентерийным тест-
штаммам Флекснера и Зонне.
4. Производственные штаммы молочнокислых бактерий (Lactobacillus
fermenti и Lactobacillus plantarum) выращивают на питательных средах,
приготовленных на основе гидролизата молока, накопление биомассы
молочнокислых бактерий осуществляйся глубинным методом с.
перемешиванием, но без аэрации, при температуре 37 С.
5. Контроль лекарственного препарата «Лактобактерин» осуществляют по
следующим показателям:
содержание живых лактобактерий;
отсутствие посторонних микроорганизмов;
остаточная влажность не более 4 %;
антагонистическая активность в отношении возбудителей дизентерии,
патогенных энтеробактерий и условно-патогенных микроорганизмов
(гемолитического стафилококка и протея).
��63 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;лучевой терапии с пролонгированием курса лечения после отмены
терапии;
в комплексе профилактических мероприятий у лиц, пребывающих
длительное время в неблагоприятных климатических и экологических
условиях, контактирующих в процессе производства с токсичными
веществами и промышленными отходами.
Хилак-форте - стерильный концентрат продуктов метаболизма
нормальных кишечных симбионтов, образующих молочную
кислоту, а также ряд дополнительных компонентов. Препарат
эффективен при одновременном приеме с антибактериальными
средствами. Выпускается во флаконах но 30 и»100 мл, прием по 40-
60 капель 3 раза в день. Является пребиотиком.
Ответ к задаче №49
1. Процесс получения продуцента включает следующие этапы:
выделение микроорганизмов из мест их естественного обитания.
Наиболее часто микроорганизмы нормальной микрофлоры выделяют
из каловых масс здоровых детей 1 -3 летнего возраста;
оценку антагонистической активности по отношению к
энтеропатогенным микроорганизмам и отсутствия безвредности по
отношению к макроорганизму,
введение клеток в состояние анабиоза с целью сохранения в течение
длительного времени.
2. продуцент для колибактерина- высокоактивный штамм E.coli M-17,
выделенный у здоровых людей и обладающий сильными
антагонистическими свойствами по отношению к патогенным микробам.
3. В начале производственного цикла штамм М —17 кишечной палочки
восстанавливают из состояния анабиоза путем пассажей на жидких и
твердых питательных средах.
4. Для накопления биомассы используют питательные среды на основе
казеина с добавлением 2 % пищевого желатина. Процесс культивирования
микроорганизмов ведут в биореакторах при температуре 37 С в условиях
перемешивания и аэрации. Оптимальные значения рН среды находятся в
пределах 7,2-8,0. Продолжительность процесса накопления биомассы
составляет 6-7 часов.
5. Контроль колибактерина осуществляют постадийно. Поскольку
действующим началом препарата являются живые бактерии, основными
показателями качества являются:
число живых клеток в расчете на дозу. Доза сухого колибактерина
должна содержать не менее 10 млрд. живых клеток;
антагонистическая активность к тест-штаммам возбудителей
дизентерии Флекснера и Зонне.
определение остаточной влажности,
агглютинабельности культуры специфической антисывороткой,
�� &#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;&#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;62 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;Ответ к задаче №47
а, е, ж, з.
В, г, е, и
Ответ к задаче №48
Возникновению дисбактериоза способствуют: применение антибиотиков;
применение консервантов в пищевых продуктах; особенности питания
человека (употребление рафинированной пищи, много углеводов,
недостаток белков и клетчатки), несоответствие количества потребляемой
пищи уровню энергетических затрат; кишечные инфекции; различные
ферментопатии с врожденными или приобретенными дефектами
слизистой оболочки кишечника; хронические заболевания и нарушения
функций ЖКТ; нарушения иммунного статуса; нарушения экологии и
радиация; физические и психические стрессы.
Бифидобактерии, лактобактерии, бактероиды, непатогенная кишечная
палочка, энтерококки. Преобладают бифидобактерии.
Принципы пробиотикотерапии.
Пробиотикотерапия - применение препаратов пробиотиков per os с
целью восстановления нормобиоценоза.
При терапии дисбактериоза необходимо учитывать причины и
степень развития синдрома, выраженность клинических
проявлений, состав высеваемой микрофлоры.
Бифидопрепаратам уделяется важнейшая роль в лечении
дисбактериоза.
Целесообразно сочетание в препаратах пробиотиков
нескольких видов и штаммов бактерий, введение
компонентов, повышающих резистентность макроорганизма
или оказывающих иммуномодулирующее действие (лизоцим,
иммуноглобулины, интерфероны).
Пробиотикотерапия должно комплексно сочетаться с
применением пребиотиков, ферментных препаратов,
иммуномодулирующих лекарственных средств,
энтеросорбентов, витаминов, рациональной фитотерапией,
функциональным питанием.
Пробиотикотерапия необходима:
для коррекции микробиоценоза у детей с первого года жизни,
находящихся на искуственном вскармливании или принимающих
антибактериальные препараты;
при лечении вирусных и бактериальных инфекций респираторного
тракта, бронхолегочной патологии, особенно с частыми рецидивами;
с целью предупреждения дисбактериоза на фоне применения
антибиотиков, гормональных и химиотерапевтических средств,
��61 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;4 стадия — получение гидрата диацетон-2-кето-L-гулоновой кислоты
путем окисления диацетон-L-сорбозы
5 стадия — получение L-аскорбиновой кислоты из гидрата диацетон-2-
кето-L-гулоновой кислоты (деацетонирование, этерификация,
енолизация, лактонизация).
6 стадия — перекриталлизация технической аскорбиновой кислоты до
медицинской.
3.
Микробиологический метод осуществляют уксуснокислые бактерии
рода Асеtоbасtег, культивируемые на питательной среде, состоящей из
В-сорбита и дрожжевого экстракта и гидролизата дрожжей,
выполняющего роль биостимулятора за счет содержания аминокислот
и витаминов группы В.
Использование иммобилизованных клеток Gluconobacter oxydans
предпочтительнее, так как они непосредственно из сорбозы
осуществляют синтез 2-кето-L-гулоновой кислоты.
Для получения сорбозы культуру продуцентов Gluconobacter
выращивают в ферментаторах периодического действия при усиленной
аэрации в течение 20-40 часов. Основными факторами, влияющими на
процесс окисления, являются: состав и качество питательной среды,
аэрация питательной среды кислородом вместо воздуха, герметичность
и высокая стерильность аппаратуры.
4.
Известно, что гидрат диацетон-2-кето-L-гулоновой кислоты можно
получить при совместном культивировании микроорганизмов
Corynebacterium и Erwinica hebricola. Однако технически два этих
организма не могут расти вместе из-за разных культуральных свойств.
С помощью генетических манипуляций удалось совместить в геноме
Erwinica hebricola свойства редуктазы Corynebacterium.
Ответ к задаче №45
Получение глутаминовой кислоты.
В семейство глутаминовой кислоты входят образующиеся из нее
глутамин, пролин, лизин, аргинин.
Метаболическим предшественником при биосинтезе глутаминовой
кислоты является а -кетоглутаровая кислота, возникающая в цикле
Кребса из изолимонной кислоты под действием фермента
изоцитратдегидрогеназы .
При высоком содержании в питательной среде биотина и солей
аммония образуется пролин.
Ответ к задаче №46
При любой антибактериальной терапии должны проводиться
мероприятия по защите нормальной кишечной микрофлоры с
использованием пробиотиков, устойчивых к антимикробным агентам
(лактосодержащие препараты: линекс, лактобактерин, препараты транзитной
микрофлоры: бактисубтил, препараты метаболизма: хилак-форте).
�� &#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;&#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;60 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;недостаток, а именно, нестабильность при хранении на твердых средах
во всем диапазоне температур (от комнатной до температуры
лиофилизации), что выражается в потере способности к сверхсинтезу
витамина. Для сохранения активности штамма постоянно проводится
селекция наиболее окрашенной в оранжевый цвет колонии.
Ответ к задаче №43
Высокое содержание эргостерина характерно для Saccharomyces
cerevisae, которые и являются промышленными продуцентами
эргостерина.
Этап- выделение целевого продукта, обработка клеточной суспензии:
дрожжи после окончания спиртового брожения помещают в
питательную среду и выращивают 12-20 часов. Далее клетки
отделяют от культуральной жидкости, прибавляют антиоксидант,
сушат, обрабатывают УФ-светом для в них получения витамина D2.
Также УФ применяют на этапе — выделение целевого продукта
кристаллизацией: спиртовой экстракт гидролизата биомассы клеток
продуцента сгущают, полученный липидный концентрат омыляют
натрия гидроксидом, перекристаллизуют при температуре 0°С, сушат,
растворяют в эфире и снова облучают УФ-светом для получения
кристаллического витамина D
2
Для получения кристаллического витамина D
биомассу клеток
подвергают гидролизу раствором соляной кислоты при температуре
110°С. Гидролизат обрабатывают этанолом при температуре 75 °С и
после охлаждения фильтруют для получения спиртового экстракт
Перспективно использование в качестве продуцента эргостерина
грибов рода Candida- Candida maltosa, растущих на углеводородных
средах. Сухую биомассу грибов экстрагируют петролейным эфиром,
полученная липидная фракция называется «микробный жир», из
торой может быть выделен не только эргостерин, но и убихиноны и
другие жирорастворимые соединения.
Убихиноны (коферменты Q), участвуют в процессах тканевого
дыхания и окислительного фосфорилирования.
Ответ к задаче №44
Аскорбиновая кислота (вит.С) получают в промышленности по методу
Рейхштейна.
Согласно данному методу, процесс состоит из 6 стадий:
1 стадия — получение D-сорбита из D-глюкозы (полученной из крахмала)
методом каталитического восстановления водородом.
2 стадия — Получение L-сорбозы из D-сорбита методом глубинного
аэробного окисления уксуснокислыми бактериями
(биотехнологическая)
3 стадия - получение диацетон-L-сорбозы из L-сорбозы путем ее
ацетонирования.
��59 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;метилдигоксин (за счет реакции 12-гидроксилирования,
катализируемой ферментом, находящимся в клетках Digitalis lanata).
Ответ к задаче №41
1. Женьшень.
2. Обладает адаптогенным действием. Применяется при гипотонии, усталости,
неврастении, в период реконвалесценции после болезни, сниженной
работоспособности
.
Ответ к задаче №42
Получен витамин
рибофлавин В
.
1.
Технологическая схема получения рибофлавина:
-1. Подготовка биообъекта продуцента: генно-инженерного штамма
Bacillus substilis
-2. Подготовка и стерилизация оборудования и коммуникаций
-3. Подготовка и стерилизация субстрата
-4. Подготовка и стерилизация газового потока
-5. Культивирование биообъекта
-6. Выделение целевого продукта
-6.1. Обработка культуральной суспензии
-6.2. Разделение культуральной суспензии
-6.3. Выделение индивидуального вещества по растворимости в
щелочах и кислотах
-7. Обезвоживание целевого продукта
-8. Анализ целевого продукта
УМО-9. Фасовка, упаковка, маркировка лекарственной субстанции
-10. Биологическая очистка отходов.
2. Методами генной инженерии в России сконструирован штамм
продуцента Bacillus substilis. Для получения штамма с нарушенной
регуляцией синтеза витамина В
отбирали клоны, устойчивые к аналогу
целевого продукта. В качестве аналога использовали розеофлавин.
Штаммы, устойчивые к розеофлавину, обладают способностью к
сверхсинтезу витамина В
. В эти мутанты дополнительно введены
мутантные гены, влияющие на эффективность усвоения углеводов и
пуриновых метаболитов. Штамм Bacillus substili содержит структурные
гены, контролирующие биосинтез витамина В
, и их операторы в
пределах одного оперона. Генно-инженерный штамм Bacillus substilis
синтезирует рибофлавин в три раза быстрее, чем другие продуценты и
более устойчив к экзогенной контаминации.
. Для промышленного получения витамина В
используют также сильные
сверхпродуценты - дрожжеподобные грибы группы аскомицетов
Eremothecium ashbyii , Ashbya gossypii. Ashbya gossypii
усовершенствован методами химического мутагенеза и селекции.
Вместе с тем, культура Ashbya gossypii имеет существенный
�� &#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;&#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;58 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;стимулировать переход к синтезу вторичных метаболитов и
увеличивать их выход.
Суспензионные культуры используют для промышленного получения
вторичных метаболитов. Вещества, продуцируемые растительными
клетками используются в медицине, парфюмерной промышленности,
растениеводстве и других отраслях промышленности. К ним относятся:
алкалоиды, терпеноиды, гликозиды, полифенолы, полисахариды,
эфирные масла, пигменты, антиканцерогены (птотецин, харрингтонин),
пептиды (ингибиторы фитовирусов). В настоящее время в разных
странах около ста видов растений используется в биосинтетической
промышленности для получения экономически важных веществ, среди
них — женьшень, раувольфия змеиная, стевия, табак, наперстянка
шерстистая и пурпурная, диоскорея дельтовидная, воробейник,
беладонна, паслен дольчатый, дурман обыкновенный, ландыш майский,
клещевина, агава, мак снотворный и др.
Ответ к задаче №40
Носители для иммобилизации растительных клеток: альгинат кальция;
агарозные шарики; трехмерные сетчатые структуры из нейлона,
порошкового металла, полиуретана или адсорбируют в них. Носитель с
клетками помещают в питательную среду, клетки при этом остаются
живыми.
Нет, иммобилизованные клетки прекращают рост, но продолжают синтез
метаболитов, выделяя их в среду.
Иммобилизованные клетки растений по сравнению с суспензионными
культурами имеют следующие преимущества:
многократное использование;
четкое отделение биомассы от продуктов метаболизма;
увеличение продолжительности культивирования на стадии активного
биосинтеза;
получение большего количества вторичных метаболитов;
сокращение времени ферментации;
увеличение срока работы клеток (иммобилизованные клетки с низкой
скоростью роста способны к интенсивной выработке метаболитов).
Недифференцированные культуры клеток Digitalis lanata (продуцент)
сами по себе не образуют сердечных гликозидов, но могут
осуществлять реакции биотрансформации субстратов, добавленных в
питательную среду. Растения наперстянки (Digitalis lanata) в большом
количестве синтезируют дигитоксин вместо необходимого дигоксина.
Для соответствующей биотрансформации с успехом используют
недифференцированную суспензионную культуру наперстянки.
Иммобилизованные клетки этой культуры способны долгое время с
постоянной скоростью трансформировать (3-метилдигитоксин в бета-
��57 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;Ответ к задаче №38
Клеточную суспензию получают, помещая каллусную ткань в колбу с
жидкой питательной средой. Суспензия перемешивается в колбе на
качалке, имеющей скорость перемешивания 100 - 120 об/мин. При
первом переносе на свежую среду удаляют крупные кусочки исходного
каллуса и крупные агрегаты, фильтруя через 1 - 2 слоя марли,
нейлоновые сита, шприц с соответствующим отверстием. Для
инициализации суспензионной культуры необходимо 2 - 3г свежей
массы каллусной культуры на 60 - 100 мл жидкой питательной среды.
Однако для каждой линии культуры клеток существует минимальный
объем инокулята, при меньшем размере которого культура не растет.
фазы роста: 1- латентная, или лаг-фаза, где видимый рост не
наблюдается ни по одному из критериев; 2 - экспоненциальная, рост с
ускорением; 3 - линейная, где скорость роста постоянна; 4 - фаза
замедленного роста; 5 - стационарная фаза; 6 - фаза деградации клеток.
Для глубинного культивирования растительных клеток применимы
способы, разработанные в микробиологии. Различают два вида систем
культивирования: открытую и закрытую.
Для закрытой системы характерен периодический режим выращивания.
Клеточная масса (инокулят) помещается в определенный объем среды.
Система закрыта по всем параметрам, кроме газов, до конца
выращивания. Периодически подается свежая питательная среда, а
старая удаляется в том же объеме. Клетки остаются в системе в течение
всего цикла выращивания.
Открытые (проточные) культуры характеризуются поступлением
свежей питательной среды, при котором отбирается не только старая
питательная среда, но и часть урожая клеточной массы.
Наиболее изучено и распространено закрытое глубинное
культивирование. Для аэрации и перешивания используют различную
аппаратуру: роллеры, качалки, магнитные мешалки и т.д. Очень
большое значение для роста и биосинтеза клеток in vitro имеют
технические характеристики систем культивирования. При
масштабировании от небольших по объему культур в колбах до
больших многолитровых ферментеров меняются многие параметры
культивирования, в частности аэрация и перемешиваемость.
Ответ к задаче №39
Накопление вторичных метаболитов возрастает в фазе замедленного
роста клеточной популяции и достигает максимума в стационарной
фазе.
Механизмы и условия, блокирующие активный рост клеток и
клеточную пролиферацию, одновременно активируют ферменты
вторичного метаболизма. Неспецифические стрессовые условия,
воздействующие на клетки в конце экспоненциальной фазы, могут
�� &#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;&#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;56 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;продолжительность действия в зависимости от наличия и размера
кристаллов инсулина. Хумулин Р, Хумулин Н, Хумулин Л, Хумулин У.
Ответ к задаче №36
1. Достоинства пекарских дрожжей как продуцента рекомбинантных белков:
непатогенный микроорганизм,
наличие мощной генетической системы, способной к экспрессии
эукариотических и прокариотических генов;
способность к посттрансляционной модификации РНК
(сплайсингу);
способность гликозилировать белки.
Биотехнологическое производство инсулина по технологии фирмы
Novo (Дания).
Препараты фирмы «Ново Нордиск» поступают на фармацевтический
рынок под различными названиями в зависимости от продолжительности
действия: Актрапид НМ - инсулин растворимый человеческий короткого
действия, Протофан НМ - изофан-инсулин средней продолжительности
действия, Монотард НМ - суспензия средней продолжительности действия,
содержащая 30% аморфного и 70% кристаллического цинк-инсулина,
Ультратард НМ -
суспензия цинк-инсулина длительного действия,
Актрафан НМ -
препарат двухфазного действия, содержащий смесь 30%
растворимого и 70% изофан-инсулина.
Ответ к задаче №37
1. Ген синтеза проинсулина получают ферментативным методом на основе
м-РНК выделенной из клеток островков Лангерганса поджелудочной железы
человека.
2. Так как в качестве вектора используют Scpl -
ухмикронную плазмиду,
содержащую в качестве гена-маркера ген синтеза аминокислоты лейцин, а в
качестве сильного промотора - промотор лактазного оперона. Для
эффективной трансформации рекомбинантной ДНК клетки дрожжей,
ауксотрофные по лейцину, подвергают ферментативному
сферопластированию. Сферопласты Saccharomyces cerevisiae и
рекомбинантные ДНК инкубируют в присутствии полиэтиленгликоля и
кальция хлорида. Селекцию трансформированных сахаромицетов проводят
на питательной среде, не содержащей аминокислоты лейцин, в результате
выживают только те клоны, которые несут интактную плазмиду или усвоили
рекомбинантную ДНК, несущую ген синтеза аминокислоты лейцин.
3.Культивирование продуцентов прекурсора инсулина ведут глубинным
методом на питательной среде с мелассой.
4.Далее проинсулин инсулина подвергают биоконверсии по реакции
транспептидации, используя трипсин и бета-карбоксипептидазу с целью
отщепления пептида С и получения молекулы инсулина.
��55 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;Экстракты разрушенных клеток можно фракционировать, подвергая их
высокоскоростному центрифугированию. При ультрацентрифугировании
различные фракции седиментируют с различной скоростью и образуют
отдельные полосы, которые можно выделить.
Электрофорез – метод разделения белков и нуклеиновых кислот в свободном
водном растворе и пористом матриксе, в качестве которого можно
использовать полисахариды. Биомолекулы обычно несут суммарный
положительный или отрицательный заряд, обусловленный наличием на и
поверхности положительно или отрицательно заряженных групп
аминокислот.
Ответ к задаче №35
Рекомбинантные белки растворяют в растворе мочевины, осветляют на
сепараторе, очищают методами ультрафильтрации и ионообменной
хроматографии.
Химический гидролиз цепей А-бета-галактозидазы и В-бета-
галактозидазы проводят бромцианом, который расщепляет белки по
остатку метионина, то есть цепи А и В отделяют от бета-
галактозидазы. Далее цепи А и В объединяют методом сульфолиза, и
белок подвергают ренатурации.
Производство инсулина по технологии фирмы «Eli lilly» имеет ряд
недостатков:
Escherichia coli - контаминант, что требует контроль и защиту
персонала, стерилизацию отходов и воды;
Escherichia coli образует внутриклеточный предшественник инсулина,
о вызывает необходимость проводить дезинтеграцию клеток,
очистку гомогенизатора клеток от клеточной стенки;
Клеточная стенка Escherichia coli содержит эндокатин, что вызывает
делать тщательную очистку продукта.
4. Технологические приемы, используемые для защиты персонала,
производственного процесса, отходов и окружающей среды от
контаминации клетками Escherichia coli:
В хромосому Escherichia coli вносят дефект (по синтезу витаминов
или аминокислот), присутствие гена-инвалида обеспечивает
размножение микроорганизма на среде, которая создается в
ферментаторе, при попадании в окружающую среду такой
микроорганизм погибает.
Синтез при пониженном давлении (ниже атмосферного), что
препятствует выходу в окружающую среду.
Фильтры на системах выброса.
Стерилизация ферментаторов и системы трубопровода после
каждого технологического цикла.
Препараты фирмы поступают на фармацевтический рынок под
названием Хумулин (Eli lilly, США) и имеют различную
�� &#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;&#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;54 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;для обеспечения устойчивых, воспроизводимых результатов в
аналитических системах. Во-вторых, химическая модификация
ферментов способна приводить к существенным изменениям их
свойств, таких как субстратная специфичность, каталитическая
активность и стабильность. При химической модификации фермента
его активный центр желательно защищать. При сопоставлении
различных приемов иммобилизации химические методы для
крупномасштабных биотехнологических процессов кажутся
малопривлекательными из-за сложности и дороговизны, поэтому в
промышленных процессах обычно используются методы физической
иммобилизации.
Ответ к задаче №3
4
1. Для выделения и очистки продуктов, находящихся внутри клеток
продуцента (например интерферонов, гормонов) вводится стадия разрушения
клеточных оболочек (дезинтеграция биомассы).
2. Освобождение от растворимых веществ производят несколькими
способами:
а. Осаждение – физическое (нагревание, охлаждение, разбавление,
концентрирование) или химическое (с помощью органических и
неорганических веществ). При разных количествах растворителя и разных
значения рН осаждаются разные фракции. Пример: 50% этанол осаждает
80% протеазы и 3-5% амилазы, 70% спирт осаждает 98% амилазы.
б. Высаливание - гидратируются диссоциирующие ионы неорганических
солей. Как наиболее д
ый реагент используют сульфат аммония. Также
применяют сульфаты натрия, магния и фосфат калия.
в. Экстракция. При твердожидкофазной экстракции вещество из твердой
фазы переходит в жидкую, при жидкожидкофазной – из одной жидкости в
другую (например, хлорофилл из спиртовой вытяжки переходит в бензин).
Для извлечения антибиотиков, витаминов, каротиноидов, липидов
применяют жидкожидкофазную экстракцию, когда культуральную жидкость
смешивают с органическими растворителями.
г. Адсорбция – частный случай экстракции, когда экстрагирующий агент –
твердое тело. Адсорбция применяется для веществ, имеющих
функциональные группы, заряженные положительно или отрицательно. В
качестве адсорбента используют иониты на основе целлюлозы: - катионит -
карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ); - анионит - диэтиламиноэтилцеллюлоза
(ДЭАЭ), а также сефадексы на основе декстрана и т.д. Адсорбция идет по
ионообменному механизму.
3. Более тонкую очистку веществ осуществляют несколькими способами:
хроматография на бумаге, хроматография в тонком слое или тонкослойная
хроматография, колоночная хроматография, ионообменная хроматография,
гидрофобная хроматография, хроматография гель-фильтрацией, аффинная
хроматография, высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЖХ).
��53 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;Водный раствор фермента можно включать внутрь микрокапсул,
представляющих собой замкнутые сферические пузырьки с тонкой
полимерной стенкой (микрокапсулирование). При двойном
эмульгировании получается водная эмульсия из капель органического
раствора полимера, содержащих, в свою очередь, еще более мелкие
капли водного раствора фермента. Через некоторое время
растворитель затвердевает, образуя сферические полимерные частицы
с иммобилизованным в них ферментом. Если вместо
водонерастворимого отвердевающего полимера используются жидкие
углеводороды с высокой молекулярной массой, метод называется
иммобилизацией путем включения в жидкие мембраны. К
модификациям метода иммобилизации ферментов с использованием
полупроницаемых оболочек относятся также включение в волокна
(при этом вместо капель, содержащих ферменты, получаются нити)
включение в липосомы. Применение систем мембранного типа
позволяет получать иммобилизованные препараты с высоким
содержанием фермента. Благодаря высокому отношению поверхности
к объему и малой толщине мембраны удается избежать значительных
диффузионных ограничений скорости ферментативных реакций.
Основной недостаток мембранных систем - невозможность
ферментативного превращения высокомолекулярных субстратов.
При иммобилизации ферментов с использование систем двухфазного
типа ограничение свободы перемещения фермента в объеме системы
достигается благодаря его способности растворяться только в одной
из фаз. Природа фаз подбирается таким образом, что продукт
накапливается в той из них, где фермент отсутствует. После
завершения реакции эту фазу отделяют и извлекают из нее продукт, а
фазу, содержащую фермент, вновь используют для проведения
очередного процесса. Одним из важнейших преимуществ систем
двухфазного типа является то, что они позволяют осуществлять
ферментативные превращения макромолекулярных субстратов,
которые невозможны при применении жестких носителей с
ограниченным размером пор.
Главным отличительным признаком химических методов
иммобилизации является то, что путем химического взаимодействия
на структуру фермента в его молекуле создаются новые ковалентные
связи, в частности между белком и носителем. Препараты
иммобилизованных ферментов, полученные с применением
химических методов, обладают по крайней мере двумя важными
достоинствами. Во-первых, ковалентная связь фермента с носителем
обеспечивает высокую прочность образующегося конъюгата. При
широком варьировании таких условий, как рН и температура,
фермент не десорбируется с носителя и не загрязняет целевых
продуктов катализируемой им реакции. Это особенно важно при
реализации процессов медицинского и пищевого назначения, а также
�� &#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;&#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;52 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;4. Суть этого метода иммобилизации путем включения в гели состоит в
том, что молекулы фермента включаются в трехмерную сетку из тесно
переплетенных полимерных цепей, образующих гель. Среднее расстояние
между соседними цепями в геле меньше размера молекулы включенного
фермента, поэтому он не может покинуть полимерную матрицу и выйти в
окружающий раствор, т.е. находится в иммобилизованном состоянии.
Дополнительный вклад в удерживание фермента в сетке геля могут вносить
также ионные и водородные связи между молекулой фермента и
окружающими ее полимерными цепями. Пространство между полимерными
цепями в геле заполнено водой, на долю которой обычно приходится
значительная часть всего объема геля. Например, широко применяемые гели
полимеров акриловой кислоты в зависимости от концентрации полимера и
его природы содержат от 50 до 90% воды.
Ответ к задаче №3
3
Для иммобилизации ферментов в геле существует два основных
способа. При одном из них фермент помещают в водный раствор
мономера, а затем проводят полимеризацию, в результате чего
образуется полимерный гель с включенными в него молекулами
фермента. В реакционную смесь часто добавляют также
бифункциональные (содержащие в молекуле две двойные связи)
сшивающие агенты, которые придают образующемуся полимеру
структуру трехмерной сетки. В другом случае фермент вносят в
раствор готового полимера, который затем каким-либо образом
переводят в гелеобразное состояние. Способ иммобилизации
ферментов путем включения в полимерный гель позволяет создавать
препараты любой геометрической конфигурации, обеспечивая при
этом равномерное распределение биокатализатора в объеме носителя.
Метод универсален, применим для иммобилизации практически
любых ферментов, полиферментных систем, клеточных фрагментов и
клеток. Фермент, включенный в гель, стабилен, надежно защищен от
инактивации вследствие бактериального заражения, так как крупные
клетки бактерий не могут проникнуть в мелкопористую полимерную
матрицу. В то же время, эта матрица может создавать значительные
препятствия для диффузии субстрата к ферменту, снижая
каталитическую эффективность иммобилизованного препарата,
поэтому для высокомолекулярных субстратов данный метод
иммобилизации не применим вообще.
Общий принцип иммобилизации ферментов с использованием
мембран заключается в том, что водный раствор фермента отделяется
от водного раствора субстрата полупроницаемой перегородкой.
Полупроницаемая мембрана легко пропускает небольшие молекулы
субстрата, но непреодолима для крупных молекул фермента.
Существующие модификации этого метода различаются лишь
способами получения полупроницаемой мембраны и ее природой.
��51 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;этапах могут тормозить рост биомассы продуцента, поэтому часто свежая
среда или некоторые
компоненты вводятся в ферментер на стадии
активного роста. Температурный оптимум находится в интервале 22-
С.
В современных технологических процессах ведется непрерывное
автоматическое определение содержания в среде углеводов, количества
образовавшихся метаболитов и концентрации клеток. Данные поступают в
ЭВМ, которая определяет стратегию коррекции процесса и автоматически
регулирует его.
Выделение. В мицелии тр
хсуточной культуры обычно остается не
более 15% ферментов. Остальные выделяются в окружающую клетки
жидкую среду. В этом случае препараты ферментов выделяют из
фильтратов после отделения биомассы.
Получение товарной формы.
Ответ к задаче №3
Существует два основных метода иммобилизации ферментов: физический и
химический.
Физическая иммобилизация ферментов представляет собо
включение фермента в такую среду, в которой для него доступной является
лишь ограниченная часть общего объема. При физической иммобилизации
фермент не связан с носителем ковалентными связями. Существует четыре
типа связывания ферментов:
- адсорбция на нерастворимых носителях;
- включение в поры геля;
- пространственное отделение фермента от остального объема реакционной
системы с помощью полупроницаемой перегородки (мембраны);
- включение в двухфазную среду, где фермент растворим и может находиться
лько в одной из фаз.
Удерживание адсорбированной молекулы фермента на поверхности
носителя может обеспечиваться за счет неспецифических ван-дер-ваальсовых
взаимодействий, водородных связей, электростатических и гидрофобных
взаимодействий между носителем и поверхностными группами белка. Вклад
каждого из типов связывания зависит от химической природы носителя и
функциональных групп на поверхности молекулы фермента.
Преимуществом метода адсорбционной иммобилизации является
доступность и дешевизна сорбентов, выступающих в роли носителей. Им
также можно придать любую конфигурацию и обеспечить требуемую
пористость. Важным фактор - простота применяемых методик. При
адсорбционном связывании можно решить и проблему очистки фермента, так
как связывание белка с носителем во многих случаях достаточно
специфическое. К сожалению, прочность связывания фермента с носителем
не всегда достаточно высока, что ограничивает применение метода. К
недостаткам адсорбционной иммобилизации следует отнести отсутствие
общих рекомендаций, позволяющих сделать правильный выбор носителя и
оптимальных условий иммобилизации конкретного фермента.
�� &#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;&#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;50 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;2. Отделение твердой фазы возможно методом фильтрации. Так как
фильтруемая суспензия склонная к гелеобразованию, то производительность
фильтров быстро падает. Предотвратить это можно добавлением в смесь или
на фильтрующую ткань размолотых вулканических пород, содержащих
оксиды кремния и алюминия, тогда осадки приобретают пористую структуру.
Некоторые виды биомассы отделяют центрифугированием. Осаждение
взвешенных частиц происходит под действием центробежной силы. После
разделения образуется 2 фракции: биомасса (твердая) и культуральная
жидкость.
3. Культуральная жидкость перерабатывается путем экстракции, ионообмена,
кристаллизации или с помощью микро- и ультрафильтрации через
полимерные мембраны со специально подобранным размером пор.
Ответ к задаче №31
.
При глубинном методе микроорганизмы выращиваются в жидкой
питательной среде.
Технически более совершенен, чем поверхностный, так как легко
поддается автоматизации и механизации.
Концентрация фермента в среде при глубинном культивировании
обычно значительно ниже, чем в водных экстрактах поверхностной
культуры. Это вызывает необходимость предварительного
концентрирования фильтрата перед его выделением.
При глубинном культивировании продуцентов ферментов выделяют
следующие этапы:
Приготовление питательных сред. Некоторые предварительно
измельчают, отваривают или гидролитически расщепляют. Готовые к
растворению компоненты подают при постоянном помешивании в емкость
для приготовления среды в определенной последовательности.
Стерилизацию среды проводят либо путем микрофильтрации с
помощью полупроницаемых мембран, либо при помощи высоких
температур. Время обработки в этом случае зависит как от интенсивности
фактора, так и от уровня обсемененности объекта. Стерилизуются также
все коммуникации и аппараты. Воздух очищается до и после аэрирования.
До - потому что содержит частицы пыли органической и неорганической
природы, после - так как несет клетки продуцента.
лучение засевного материала. Для засева питательной среды
материал готовят также глубинным методом. Вид его зависит от
продуцента: для грибов это мицелиальная вегетативная масса, для
бактерий - молодая растущая культура на начальной ста
спорообразования. Получение посевного материала состоит в увеличении
массы продуцента в 3-4 стадии. Объем посевного материала зависит от
физиологических особенностей продуцента.
Производственное культивирование. Биосинтез ферментов в глубинной
культуре протекает в течение 2-4 суток при непрерывной подаче воздуха и
перемешивании. Высокая концентрация питательных веществ на первых
��49 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;стерилизующего агента из питательной среды после гибели микрофлоры до
внесения инокулята. Химические антисептики должны быть не только
высокоэффективны, но и легко разлагаемы при изменении условий после
завершения стерилизации. К числу лучших относится пропиолактон,
обладающий сильным бактерицидным действием и легко гидролизуемый в
молочную кислоту.
4. Нет, метанол, этанол, концентрированная уксусная кислота не требует
стерилизации, так как они сами обладают асептическим действием. В этом
случае ограничиваются стерилизацией прочих элементов питательной среды.
5. Поддержание чистой культуры и получение засевной дозы
В технологическом процессе используются полезные свойства штамма,
следовательно, необходимо сохранять и, если возможно, улучшать его
производственные качества. Поэтому в биотехнологическом производстве
имеется отделение чистой культуры, в задачей которого является постоянное
и надежное воспроизведение полезных свойств продуцента, найденных или
достигнутых в свое время в ходе лабораторных исследований. По мере
необходимости из отделения чистой культуры поступает заданная масса
инокулята, идущая в производство.
Посевные дозы выращиваются последовательно в колбах и бутылях на 10-
литров, находящихся на качалках или просто в термостатируемом
помещении, и далее в последовательности ферментеров объемом (по
необходимости) 10, 100, 500 и 1000 литров, в которых осуществляется
перемешивание, аэрация и термостатирование культуральной жидкости с
клетками.
При периодическом процессе культивирования (при производстве
метаболитов) в отделении чистой культуры готовят засевную дозу клеток для
каждой из операций основного производства. При непрерывном
производстве кормового белка этого не требуется, однако для повышения
качества продукта предпочитают время от времени вводить клетки штамма-
продуцента из отделения чистой культуры. Для этого в отделении имеется
ферментационная часть, где производится выращивание достаточно крупных
партий микроорганизма продуцента.
Ответ к задаче №30.
1. Сахаромицеты (хлебопекарные дрожжи) имеют относительно большие
клетки и способны флотироваться, поэтому после сгущения биомассы
флотацией их отделяют на обычных барабанных вакуум-фильтрах. В
дальнейшем биомассу, снятую с фильтра, подвергают прессованию и
получают продукт с высоким содержанием живых клеток.
Дрожжи же рода Candida плохо флотируются и фильтруются. Поэтому
дрожжи, растущие на углеводородах, а также бактерии-продуценты белка на
основе метана и метанола, на первом этапе сепарируются в несколько
ступеней. Оставшаяся вода удаляется путем выпаривания, а все компоненты
жидкой фазы остаются в конечном продукте.
�� &#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;&#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;48 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;2. Технология приготовления питательных сред для биосинтеза.
Основу питательных сред для культивирования микроорганизмов составляют
источники углерода. Кроме углерода клетки микроорганизмов в процессе
роста испытывают потребность в азоте, фосфоре, макро- и микроэлементах.
Все вещества этого рода находятся в питательных средах в виде солей,
ключение составляют среды, где азот и фосфор могут усваиваться
растущими культурами из органических источников, например автолизатов
или гидролизатов микробного или животного происхождения.
Жидкие и твердые источники углерода обычно вводят в уже готовую
питательную среду непосредственно перед ферментацией, так как это
устраняет опасность заражения посторонней микрофлорой, вероятность
которого возрастает при хранении готовой питательной смеси. При
периодической ферментации в начале процесса инокулят (засевная доза
микроорганизмов) вносится в уже готовую питательную среду, содержащую
все компоненты. Поэтому источники углерода вводят непосредственно перед
засевом или отдельные компоненты среды вводят по мере потребления их
культурой, поддерживая в ферментере некоторую оптимальную их
концентрацию, которая на разных этапах ферментации может меняться по
определенному закону.
3. Важнейшим элементом приготовления питательных сред является
соблюдение требований асептики. Это либо создание заданного значения рН,
еспечивающего подавление посторонних микроорганизмов, либо полная
стерилизация всех подаваемых потоков и самого биореактора.
Для стерилизации газовых потоков (в первую очередь воздуха) используют
процесс фильтрации через специальные волокнистые фильтры с
последовательно расположенными фильтрующими элементами.
Фильтрующий материал периодически стерилизуется подачей острого пара в
отключенный фильтр через заданные промежутки времени.
Метод фильтрации основан на способности полупроницаемых мембран с
крупными порами пропускать жидкую фазу и концентрировать клетки
микроорганизмов. В принципе этот метод является идеальным для
стерилизации термически неустойчивых жидких и газовых средств,
поскольку может осуществляться при низкой температуре и требует лишь
градиента давления по разные стороны мембраны. Основная трудность -
наличие термостойких мембран, способных выдерживать многократную
стерилизацию их самих. В настоящее время эта проблема решается путем
применения термостойких полимеров в производстве мембран.
дкостные потоки стерилизуют различными методами, из которых
практический интерес представляют термический, радиационный,
фильтрационный и химический. Термический - самый распространенный,
при температурах порядка 120-
С. Радиационный -
-излучение,
применяется редко из-за трудностей создания и эксплуатации мощных
источников этого излучения.
В отдельных случаях применяют химические стерилизующие агенты.
Основная проблема в этом случае - необходимость устранения
��47 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;тем, что свойство образовывать избыточные количества антибиотика
достаточно нестойко и легко утрачивается полностью или частично.
3. Необходимо ли учитывать требования GMP при биосинтезе антибиотиков?
- да.
Ответ к задаче №29
.
1. Существует 6 стадий биотехнологического производства:
1. Приготовление и стерилизацию питательных сред;
Приготовление посевного материала;
Культивирование;
Обработку культуральной жидкости;
Выделение и очистку биопрепарата;
Получение готовой продукции.
Две начальные стадии включают подготовку сырья и биологически
действующего начала. В процессах инженерной энзимологии они обычно
состоят из приготовления раствора субстрата с заданными свойствами (рН,
температура, концентрация) и подготовки партии ферментного препарата
данного типа, ферментного или иммобилизованного. При осуществлении
микробиологического синтеза необходимы стадии приготовления
питательной среды и поддержания чистой культуры, которая могла бы
постоянно или по мере необходимости использоваться в процессе.
Поддержание чистой культуры штамма-продуцента - главная задача любого
микробиологического производства, поскольку высокоактивный, не
претерпевший нежелательных изменений штамм может служить гарантией
получения целевого продукта с заданными свойствами.
Третья стадия - стадия ферментации, на которой происходит образование
целевого продукта. На этой стадии идет микробиологическое превращение
компонентов питательной среды сначала в биомассу, затем, если это
необходимо, в целевой метаболит.
На четвертом и пятом этапе из культуральной жидкости выделяют и
очищают целевые продукты. Для промышленных микробиологических
процессов характерно, как правило, образование очень разбавленных
растворов и суспензий, содержащих, помимо целевого, большое количество
других веществ. При этом приходится разделять смеси веществ очень
близкой природы, находящихся в растворе в сравнимых концентрациях,
весьма лабильных, легко подвергающихся термической деструкции.
Заключительная стадия биотехнологического производства - приготовление
товарных форм продуктов. Общим свойством большинства продуктов
микробиологического синтеза является их недостаточная стойкость к
хранению, поскольку они склонны к разложению и в таком виде
представляют прекрасную среду для развития посторонней микрофлоры. Это
заставляет технологов принимать специальные меры для повышения
сохранности препаратов промышленной биотехнологии. Кроме того,
препараты для медицинских целей требуют специальных решений на стадии
расфасовки и укупорки, так должны быть стерильными.
�� &#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;&#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;46 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;определенных условиях многие из зрелых растительных клеток сохраняют
способность делиться, а в некоторых случаях даже вступить на новый путь
развития.
Ответ к задаче №27.
Рифампицин — полусинтетический антибиотик азамициновой
структуры для терапии туберкулеза.
Биотехнологический этап производства: Сверхпродуцент Nocardia
mediterranea помещен в ферментатор на жидкую питательную среду,
содержащую крахмал, соевую муку, кукурузный экстракт, хлорид натрия и
карбонат кальция. После завершения процесса культивирования целевой
продукт извлечен из культуральной жидкости органическим растворителем,
реэктрагирован в водную фазу и подвергнут распылительной сушке.
Химический этап производства: осуществляется в цехе химической
трансформации, в задании не описан.
Биообъект биотехнологического этапа: « … продуцент Nocardia mediterranea
обработан многократно ренгеновскими и ультрафиолетовыми лучами, а
также азотсодержащими веществами с селекцией на каждом этапе.
Ответ к задаче №28
.
Полимиксин В — антибиотик пептидной структуры для терапии грам(-
) инфекции, преимущественно, с поражением ЖКТ.
Продуцент и метод его совершенствования : почвенная споровая
бактерия Bacillus polimyxa обработан многократно ренгеновскими и
ультрафиолетовыми лучами,а также азотсодержащими веществами с
селекцией на каждом этапе, получен сверхпродуцент.
Методы выделения и очистки: Сверхпродуцент помещен в ферментатор на
жидкую питательную среду, содержащую крахмал, соевую муку, кукурузный
экстракт, минеральные соли. После завершения процесса культивирования
целевой продукт извлечен из культуральной жидкости и очищен методом
оинообменной хроматографии.
Способ сушки лекарственной субстанции: Целевой продукт высушен
распылительной сушкой.
1. Для чего стремятся получить сверхпродуцент? Штаммы продуцентов
антибиотиков, полученные в результате скрининга и совершенствованные
методом индуцированного мутагенеза или слиянием протопластов,
приобретают способность синтезировать метаболит в огромном количестве.
Такие промышленные мутантные штаммы носят название
«суперпродуценты» или «сверхпродуценты». Экономически более выгодно
использовать его по сравнению с продуцентом.
2. Свойства сверхпродуцентов: нестабильность высокой
продуктивности и сложный цикл развития.
Особенности хранения сверхпродуцентов: Сверхпродуценты
антибиотиков, созданные любым из описанных выше методов, требуют
особых условий хранения и периодической проверки активности в связи с
Escherichia coli - контаминант, что требует контроль и защиту
персонала, стерилизацию отходов и воды;
Escherichia coli образует внутриклеточный предшественник инсулина,
что вызывает необходимость проводить дезинтеграцию клеток,
очистку гомогенизатора клеток от клеточной стенки;
Клеточная стенка Escherichia coli содержит эндокатин, что вызывает
делать тщательную очистку продукта.
4. Технологические приемы, используемые для защиты персонала,
производственного процесса, отходов и окружающей среды от контаминации
клетками Escherichia coli:
В хромосому Escherichia coli вносят дефект (по синтезу витаминов или
аминокислот), присутствие гена-инвалида обеспечивает размножение
микроорганизма на среде, которая создается в ферментаторе, при
попадании в окружающую среду такой микроорганизм погибает.
Синтез при пониженном давлении (ниже атмосферного), что
препятствует выходу в окружающую среду.
Фильтры на системах выброса.
Стерилизация ферментаторов и системы трубопровода после каждого
технологического цикла.
5. Препараты фирмы поступают на фармацевтический рынок под названием
Хумулин (Eli lilly, США) и имеют различную продолжительность действия в
зависимости от наличия и размера кристаллов инсулина. Хумулин Р,
Хумулин Н, Хумулин Л, Хумулин У.
Ответ к задаче № 26
.
В цикле выращивания каллусной ткани клетки после ряда делений
приступают к росту растяжением, дифференцируются как зрелая каллусная
ткань и деградируют. Для того, чтобы не произошло старения, утраты
способности к делению и дальнейшему росту, а также отмирания каллусных
клеток, первичный каллус переносят на свежую питательную среду через 28 -
30 дней, то есть проводят пассирование или субкультивирование каллусной
ткани.
2. Возникновение физиологических и структурных различий между клетками
и тканями растений, связанное с их функциональной специализацией,
называют процессом
дифференциации
. Понятие «дифференциация» отражает
евращение эмбриональной, меристематической клетки в
специализированную. Меристематические клетки, однотипные по структуре
и функции, начинают развиваться различными путями, создавая ткани разных
органов.
3. У растений почти всякая дифференциация обратима при условии, если
дифференцированная клетка живая, в протопласте сохранилось ядро и не
образовалась вторичная оболочка. Даже такие высокоспециализированные
клетки, как микроспоры, с помощью ряда экспериментальных процедур
можно заставить пролиферировать и дать начало целому растению. Итак, в
�� &#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;&#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;44 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;3. Когда синтез параллелен росту культуры, продуктивность биомассы можно
увеличить методом генной инженерии за счет введения в клетку
многокопийных плазмид, содержащих гены биосинтеза целевой
аминокислоты, т.е. в результате увеличения генов, отвечающих за
ферменты синтеза аминокислот; или расширения потока предшественников
аминокислот. Такие ферментные системы в генноинженерных продуцентах
мобилизуют все ресурсы клетки на образование целевой аминокислоты в
ущерб росту биомассы и синтезу других клеточных компонентов. При этом
побочные продукты автоматически исчезают, продуктивность биомассы и
коэффициент использования субстрата существенно возрастают.
Ответ к задаче № 24
.
Мутуализм. Мутуализм - состояние системы, когда оба штамма в
смешанной культуре растут быстрее, чем в соответствующих чистых
культурах. Мутуализм включает несколько механизмов регуляции:
обмен факторами роста, обмен питательными веществами.
Симбиоз.
Тесные мутуалистически
связи, когда ни один из штаммов не может
существовать без взаимодействия с другим, называется симбиоз.
Комменсализм - состояние системы, когда в смешанной культуре
определенный вид преимущества получает второй вид. Комменсализм
формируется в следующих случаях, когда первый вид связывает вещество,
являющееся токсичным для второго, а второй вид не создает для первого
благоприятных условий или продукция соединений первым видом, которая
увеличивает рост второго вида.
Амменсализм - состояние системы, когда в результате взаимодействия
с первым видом, второй вид оказывается в менее выгодной ситуации, т.е.
рост одного вида подавляется в присутствии другого. Ингибирующий эффект
обусловлен:
синтезом токсичных веществ, что наблюдается у антибиотикопродуцентов;
поглощением незаменимых питательных веществ;
секрецией ферментов, разрушающих полимеры клеточной стенки.
Ответ к задаче № 25
.
Рекомбинантные белки растворяют в растворе мочевины, осветляют
на сепараторе, очищают методами ультрафильтрации и ионообменной
хроматографии.
Химический гидролиз цепей А-бета-галактозидазы и В-бета-
галактозидазы проводят бромцианом, который расщепляет белки по остатку
метионина, то есть цепи А и В отделяют от бета-галактозидазы. Далее цепи А
и В объединяют методом сульфолиза, и белок подвергают ренатурации.
3. Производство инсулина по технологии фирмы «Eli lilly» имеет ряд
недостатков:
��43 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;отдельности ни лизин, ни треонин не ингибируют активности
аспартаткиназы. Данное явление носит название совместное ингибирование.
Биотехнологи добиваются накопления целевой аминокислоты на уровне
управления активностью фермента путем блокирования процессов, ведущих
синтезу побочных аминокислот в разветвленной метаболической цепи.
Методом индуцированного мутагенеза получают мутанты двух типов.
Мутанты первого типа дефектны по структурному гену, детерминирующему
конформацию аспартаткиназы. В результате фермент теряет
чувствительность к высоким концентрациям одного из аллостерических
ингибиторо
- лизина. В мутантных клетках второго типа не синтезируется
гомосериндегидрогеназа, в результате чего блокируется синтез метионина и
треонина. Полученные штаммы микроорганизмов являются ауксотрофами по
треонину (метионину) и гомосерину, поэтому при выращивании мутантных
продуцентов в питательную среду вносят лимитирующие концентрации
треонина и метионина или треонина и гомосерина для накопления биомассы.
В период роста биомассы продуцента, пока эти аминокислоты присутствуют
в питательной среде, синтеза лизина не происходит. После того, как треонин
будет полностью использован на построение клеточных структур и исчерпает
свое влияние на рост биомассы, начинается синтез лизина.
Ответ к задаче №23
.
Продуцент Escherichia coli имеет специфические особенности регуляции
биосинтеза аминокислот. В его клетках отсутствует механизм
согласованного ингибирования, то есть лизин ингибирует активность своих
ферментов, а треонин - ферментов своей цепи. Вместе с тем, имеет место
согласованная репрессия
комплексом треонин - изолейцин, то есть
подавляется синтез комплекса треониновых ферментов Е
, Е
, Е
, Е
. По
отдельности названные аминокислоты не репрессируют комплекс
ферментов. Регуляторная область включает ферменты: Е
1
-
Аспартаткиназа,
-дигидродипиколинатсинтетаза, Е
-
гомосериндегидрогиназа, Е
- треонинсинтетаза, Е
, треониндезаминаза.
Сверхпродукция треонина штаммом кишечной палочки достигается в
результате следующих преобразований в клетке: мутационное изменение
алостерического центра аспартаткиназы, в результате чего фермент утратил
восприимчивость к треонину; либо- снижение в результате мутации
активности фермента Е5, обеспечивающего синтез изолейцина из треонина,
тем самым, вызывая у микроорганизма хроническое голодание по
изолейцину. В результате недостатка изолейцина согласованная репрессия
не включается, несмотря на избыток треонина. Также существует методом
генетической инженерии с включением в геном продуцента
дополнительных плазмид, содержащих выделеные треониновые опероны,
следовательно количество ферментов увеличилось в десятки раз по
сравнению с исходным штаммом.
�� &#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;&#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;42 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;и Propionibacterium shermanii),
Pseudomonas denitrificans, с помощью
метаногенных бактерий и с помощью продуцентов стрептомицетов.
В качестве продуцентов
используют различные мутантные штаммы
Propionibacterium freudenreichii и Propionibacterium shermanii.
Предпочтение отдается штаммам, способным к самостоятельному
синтезу 5,6-диметилбензимидазола. Технологически процесс при этом
является периодическим и состоит из двух стадий. На первой стадии
культуру выращивают в анаэробных условиях до полной утилизации
сахаров. Через 72 часа на второй стадии включают аэрацию и создают
условия для синтеза 5,6-ДМБ или вводят 5,6-ДМБ и соли кобальта в
ательную среду. Питательная среда содержит глюкозу или
инвертированную мелассу, сульфат аммония как источник азота,
кукурузный экстракт, содержащий молочную и пантотеновую кислоты
и усиливающий рост бактерий. Ферментацию ведут в одном
биореакторе, если стадия осуществляется в разных биореакторах, то
анаэробные выросшие клетки отделяют путем центрифугирования и
переводят в другой биореактор с аэрацией. Процесс происходит при
температуре 30°С, рН= 6,5-7. Основными направлениями
совершенствования штаммов микроорганизмов-продуцентов
цианокобаламина являются: увеличение продуктивности штаммов
микроорганизмов методами мутагенеза и селекции; увеличение
продуктивности штаммов микроорганизмов методом слияния
протопластов; увеличение продуктивности штаммов-продуцентов
методом генной инженерии; создание штаммов-продуцентов,
секретирующих витамин в культуральную жидкость; создание
штаммов-продуцентов, растущих на средах из непищевого сырья.
Целевой продукт экстрагируют подкисленной водой при температуре
-90°С и рН = 4,5-5,0 в качестве стабилизатора добавляя нитрит
натрия. Водный раствор витамина охлаждают, доводят рН до
нейтральных значений, коагулируют белки и фильтруют. Очистку
раствора проводят методом ионообменной хроматографии с
последующим элюированием раствором аммиака. Дополнительная
очистка проводится хроматографическим методом на колонках с
окисью алюминия с элюацией цианокобаламина водным раствором
ацетона.
Ответ к задаче №22
Продуценты лизина Согуnebacterium glutamicum и Brevibacterium flavum
лизин, треонин, метионин и промежуточно гомоцистеин, гомосерин
У типичных продуцентов лизина Согуnebacterium glutamicum, Brevibacterium
flavum фермент аспартаткиназа является белком, чувствительным по
принципу обратой связи при совместном действии треонина и лизина. При
накоплении в избыточной концентрации обоих конечных продуктов треонина
и лизина ингибируется фермент и синтез аминокислот останавливается. По
��41 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;1.
Технологическая схема получения рибофлавина:
-1. Подготовка биообъекта продуцента: генно-инженерного штамма
Bacillus substilis
-2. Подготовка и стерилизация оборудования и коммуникаций
-3. Подготовка и стерилизация субстрата
-4. Подготовка и стерилизация газового потока
-5. Культивирование биообъекта
-6. Выделение целевого продукта
-6.1. Обработка культуральной суспензии
-6.2. Разделение культуральной суспензии
-6.3. Выделение индивидуального вещества по растворимости в
щелочах и кислотах
-7. Обезвоживание целевого продукта
-8. Анализ целевого продукта
-9. Фасовка, упаковка, маркировка лекарственной субстанции
-10. Биологическая очистка отходов.
2. Методами генной инженерии в России сконструирован штамм
продуцента Bacillus substilis. Для получения штамма с нарушенной
регуляцией синтеза витамина В
бирали клоны, устойчивые к аналогу
целевого продукта. В качестве аналога использовали розеофлавин.
Штаммы, устойчивые к розеофлавину, обладают способностью к
сверхсинтезу витамина В
. В эти мутанты дополнительно введены
мутантные гены, влияющие на эффективность усвоения углеводов и
пуриновых метаболитов. Штамм Bacillus substili содержит структурные
гены, контролирующие биосинтез витамина В
, и их операторы в
пределах одного оперона. Генно-инженерный штамм Bacillus substilis
синтезирует рибофлавин в три раза быстрее, чем другие продуценты и
более устойчив к экзогенной контаминации.
3. Для промышленного получения витамина В
используют также сильные
сверхпродуценты - дрожжеподобные грибы группы аскомицетов
Eremothecium ashbyii , Ashbya gossypii. Ashbya gossyp
усовершенствован методами химического мутагенеза и селекции.
Вместе с тем, культура Ashbya gossypii имеет существенный
недостаток, а именно, нестабильность при хранении на твердых средах
во всем диапазоне температур (от комнатной до температуры
лиофилизации), что выражается в потере способности к сверхсинтезу
витамина. Для сохранения активности штамма постоянно проводится
селекция наиболее окрашенной в оранжевый цвет колонии.
Ответ к задаче №21.
витамин В
12
- цианокобаламин
нет
Также Витамин В
получают с использованием в качестве
продуцентов
пропионовокислых бактерий ( Propionibacterium freudenreichii
�� &#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;&#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;40 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;Культуры растительных клеток в биореакторах выращивают в одном из двух
режимов:
— периодическое культивирование, при котором по окончании процесса
биосинтеза откачивают и используют всю суспензию клеток;
— полупериодическое культивирование, при котором в биореактор
постоянно добавляют определенный объем свежей питательной среды и
одновременно забирают тот же объем либо клеточной суспензии (открытое
проточное культивирование), либо отработанной питательной среды,
оставляя при этом клеточную массу в реакторе (закрытое проточное
культивирование).
В основном растительные клетки выращивают в периодическом режиме.
Полупериодическое культивирование используют, когда показано, что
нарастание биомассы четко коррелирует с синтезом вторичных метаболитов.
Существуют также две разновидности открытого проточного
культивирования:
• турбидостат — автоматическое поддержание концентрации клеточной
биомассы в реакторе на одном уровне регулировкой скорости протока;
• хемостат — в биореактор с постоянной скоростью подается
питательный раствор при одновременном откачивании с той же скоростью
клеточной суспензии.
5. Активаторами матричной активности ДНК хроматина или активности
РНК–полимеразы являются фитогормоны. Рецепторные для фитогормонов
белки, локализованные в мембранах, по-видимому, оказывают влияние в
присутствии фитогормонов на структуру и функцию мембран. Возможно, это
обуславливает действие фитогормонов на генную активность.
Одним из важнейших гормонов, применяемых при культивировании in vitro
является ауксин, который активирует деление и растяжение клеток. Проникая
в клетки, ИУК связывается со специфическими рецепторами, оказывая
влияние на функциональную активность мембран, полирибосом и работу
ядерного аппарата. Установлено, что в плазмалемме ауксин
индуцирует
работу Н
-помпы, в результате чего матрикс клеточных стенок размягчается,
что является необходимым условием для роста и растяжения клеток.
Включенная Н
-помпа усиливает поглотительную активность тканей,
обогащенных ауксином. Предполагается, что поступление ауксина в клетку
способствует усилению секреции кислых гидролаз и полисахаридов,
необходимых для дальнейшего роста клеточных стенок. Под влиянием
ауксина уменьшается продолжительность различных периодов
митотического цикла.
Общим моментом в действии ауксинов на деление клеток является также
предварительное усиление синтеза и накопление РНК, синтеза и накопление
белка.
Ответ к задаче № 20
.
Получен витамин
рибофлавин В
.
��39 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;4. В зависимости от происхождения и условий выращивания каллусные ткани
бывают:
- рыхлые, сильно оводненные, легко распадающиеся на отдельные клетки;
- средней плотности, с хорошо выраженными меристематическими очагами;
- плотные, с зонами редуцированного камбия и сосудов.
Ответ к задаче № 19
.
1. Суспензионные культуры - отдельные клетки или группы клеток,
выращиваемые во взвешенном состоянии в жидкой среде. Представляют
собой относительно гомогенную популяцию клеток, которую легко
подвергнуть воздействию химических веществ.
2. В настоящее время промышленный синтез вторичных метаболитов на
основе суспензионных культур клеток является перспективным и
рентабельным, так как производство растительного сырья для него не
зависит ни от климатических факторов, ни от повреждения насекомыми.
Каллусные культуры выращивают на малых площадях и в дальнейшем
используют для синтеза соединений практически всех классов. Причем
выход вторичных метаболитов более высок по сравнению с их синтезом в
целых растениях. Использование технологий получения каллусных культур
из растительного сырья дает такие преимущества, как надежность и
стабильность по выходу биомассы и продуктов вторичного метаболизма, а
также возможность использования каллусной системы для иммобилизации с
последующей биотрансформацией. Недостаток только один —
необходимость применения ручного труда. Из сравнения каллусных и
суспензионных культур следует, что выход продуктов вторичного
метаболизма выше именно в каллусных культурах, но при этом управление
процессом культивирования легче осуществлять при работе с
суспензионными культурами.
3. Клеточную суспензию получают, помещая каллусную ткань в колбу с
жидкой питательной средой. Суспензия перемешивается в колбе на качалке,
имеющей скорость перемешивания 100 - 120 об/мин. При первом переносе на
свежую среду удаляют крупные кусочки исходного каллуса и крупные
агрегаты, фильтруя через 1 - 2 слоя марли, нейлоновые сита, шприц с
соответствующим отверстием. Для инициализации суспензионной культуры
необходимо 2 - 3 г свежей массы каллусной культуры на 60 - 100 мл жидкой
питательной среды. Однако для каждой линии культуры клеток существует
минимальный объем инокулята, при меньшем размере которого культура не
растет.
4. При промышленном выращивании суспензионных культур применяют
биореакторы, в которых процессы глубинного культивирования ведут к
увеличению биомассы и синтезу вторичных соединений.
Выделяют биореакторы, в которых суспензионная культура перемешивается
только за счет подачи воздуха, и биореакторы, в которых суспензионная
культура перемешивается механическим способом.
�� &#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;&#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;38 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;2. Каллусная клетка развивается аналогично другим клеткам, проходя
соответственно такие циклы, как деление, растяжение, дифференцировка,
старение и отмирание. Кривая роста каллусной ткани имеет S-образный
характер и включает пять фаз разной длительности у разных растений: 1 —
латентная (лаг-фаза — клетки адаптируются и готовятся к делению); 2 —
линейная (рост каллусной ткани идет с постоянной скоростью); 3 —
экспоненциальная (время максимальной митотической активности; рост
клетки ускорен, масса каллуса увеличивается); 4 — стационарная
(интенсивность деления резко снижается); 5 — отмирания
3. Да, протопласт- «голая» клетка потенциально способна восстанавливать
новую оболочку, делиться, образовывать клеточные агрегаты, из которых
можно получить клеточную культуру с новыми свойствами, а затем новое
растение - регенерант.
4. При получении каллусных культур сначала готовят эксплант — маленькие
— 4 мм) кусочки растительной ткани, не утратившие способность к
репродукции. Этот растительный материал тщательно моют, стерилизуют
96% спиртом или 0,1 % сулемой, а затем снова тщательно промывают
дистиллированной водой и помещают на синтетическую агаризованную
питательную среду. Сосуды закрывают ватно-марлевыми тампонами. Для
образования каллуса и роста ткани сосуды переносят в темное помещение,
где поддерживают определенную температуру (24—26 °С) и влажность (65
— 70%), при этом через 2 — 3 нед на раневой поверхности образуется
рвичный каллус.
Ответ к задаче № 18.
1. Этот метод, названный микроклональным размножением, позволяет от
одной меристемы получить (регенерировать) достаточно большое
количество новых растений, в том числе и в культуре in vitro. Обязательным
условием для микроклонального размножения является идентичность
полученного растительного материала исходному материнскому растению.
Для обеспечения максимальной генетической стабильности клонируемого
материала в качестве исходного экспланта используют молодые
слабодифференцированные ткани, в частности кончики молодых стеблей и
корней, пазушные почки, зародыши, части молодых проростков и другие
меристематические ткани.
2. Каллусная ткань - один из видов клеточной дифференцировки, возникает
путем неорганизованной пролиферации дедифференцированных клеток
органов растения. У растений в природе каллусная ткань возникает в
исключительных обстоятельствах (например, при травмах) и функционирует
непродолжительное время. Эта ткань защищает место поранения, может
накапливать питательные вещества для анатомической регенерации или
регенерации утраченного органа.
3. 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д), a-нафтилуксусную кислоту
(НУК) используют в качестве ауксинов.
��37 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;смеси в большом избытке. После отщепления защитной О-трет-бутильной
группы получают инсулин человека.
3. Преимущества человеческого генно-инженерного инсулина человека:
Улучшение контроля гликемии связанное с отсутствием
инактивирования инсулина под действием антител, циркулирующих в
крови, в результате больному нет необходимости увеличивать дозу,
Уменьшение аллергизации, так как инсулин не воспринимается как
чужеродный белок.
При переводе больного на инъекции инсулина человека с животного
инсулина снижается липотрофия.
Возможность стабильного производства инсулина в неограниченном
количестве.
Возможность изготовления в катриджах или пенфиллах для шприц-
ручек, что позволяет больному вести активный образ жизни.
4. Активность инсулина определяют биологическим методом по способности
понижать содержание глюкозы в крови кроликов или физико-химическим
методом (электрофорез или хроматография на бумаге). За одну единицу
действия (ЕД) или международную единицу (ME) принимают активность
0,04082 мг кристаллического инсулина. 1 мл стерильного раствора или
суспензии инсулина для инъекций содержит 40 или 100 ЕД инсулина.
Ответ к задаче № 16
.
1. Для получения инсулина с использованием методов генетической
инженерии были использованы два подхода. Первый предполагал синтез
проинсулина (или сходного белка, содержащего вместо C-пептида иную
аминокислотную последовательность) и последующую его конверсию в
инсулин химическим путем. Второй подход базировался на получении
отдельно A- и B-цепей и «сборку» из них молекулы инсулина.
2. Биотехнологическое производство инсулина по-технологии фирмы «El
lilly» (США) базировался на получении отдельно A- и B-цепей и «сборку» из
них молекулы инсулина.
3. В биотехнологическом производстве инсулина по-технологии фирмы «Eli
lilly» (США) применяется в продуцент Escherichia coli
.
Технологический процесс биосинтеза цепей А и В ведут раздельно в
двух ферментаторах на питательной среде с лактозой, которая индуцирует
синтез бета-галактозидазы, а вместе с ней и цепей инсулина,
присоединенных через остаток метионина, в течение 12 часов.
Цепи А и В инсулина синтезируется в клетках кишечной палочки
внутриклеточно. Разделение культуральной суспензии осуществляют на про-
точной центрифуге. Клетки подвергают ферментативной или ультразвуковой
дезинтеграции, и гомогенизат клеточной массы отделяют на сепараторах.
Ответ к задаче № 17
.
1. свойство тотипотентности растительных клеток.
�� &#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;&#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;36 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;должны содержать токсинов, пирогенов, что достигается использованием чистого
биологического материала и качественной очисткой готовой продукции.
Контроль лекарственных средств рекомбинантных белков проводят по следующим
показателям:
подлинность и чистота;
биологическая активность;
апирогенность;
отсутствие острой и хронической токсичности;
биологическая и иммунологическая тождественность, которая определяется
по стандартным международным образцам, причем стандартный образец
всегда используется рекомбинантный.
4. В генной инженерии чужеродные гены клонируют в так называемых
челночных векторах. Эти вектора с одинаковым успехом реплицируются в
клетках нескольких хозяев. Векторы были получены комбинацией
in vitro
фрагментов плазмид. Удобно встраивать ген в специальный вектор для
экспрессии, который уже содержит регуляторные элементы, обеспечивающие
активную экспрессию после введения рекомбинантной плазмиды в
бактериальную клетку. К таким эффективным регуляторным участкам
относится, например, сильный промотор гена бэта-лактамазы (ген
устойчивости к пенициллину, входящий в состав плазмиды pBR 322).
5. Удобство доставки гена - проблема доставки чужеродной ДНК in vitro
практически решена, а ее доставка в клетки-мишени разных тканей in vivo
успешно решается (главным образом путем создания конструкций, несущих
рецепторные белки, в том числе и антигены, специфичные для тех или иных
тканей), то другие характеристики существующих векторных систем -
стабильность интеграции, регулируемая экспрессия, безопасность — все еще
нуждаются в серьезных доработках.
Существует два типа генотерапии:
заместительная
корректирующая
Заместительная генотерапия заключается во вводе в клетку неповрежденного
гена. Внесенная копия заменит по функциям сохранившийся в геноме
больного дефектный ген. Все проводимые сегодня клинические испытания
используют внесение в клетку дополнительных количеств ДНК.
При корректирующей терапии предполагается замена дефектного гена
нормальным в результате рекомбинации. Пока этот метод на стадии
лабораторных испытаний, так как эффективность его еще очень низка.
Ответ к задаче № 15.
1. Получение инсулина из тканей свиней является методом
полусинтетическим.
2. В настоящее время инсулин человека модификацией свиного инсулина
получают синтетико-ферментативным методом. Свиной инсулин отличается
от инсулина человека одной заменой на С-конце В-цепи Ala30Thr. Замену
аланина на треонин осуществляют путем катализируемого ферментом
отщепления аланина и присоединение вместо него защищенного по
карбоксильной группе остатка треонина, присутствующего в реакционной
��35 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;2.
Молекула инсулина - полипептид, состоящий из двух цепей: А и В; цепи
инсулина ковалентно связаны между собой двумя дисульфидными связями
-В7 и А20-В19. Также в молекуле инсулина имеется еще одна
дисульфидная связь у А-цепи: А6-А11. Локализация всех трех дисульфидных
мостиков постоянна, а А- и В-цепи у представителей большинства видов
имеют по 21 и 30 аминокислотных остатков соответственно.
3. Проинсулин синтезируется в шероховатом эндоплазматическом ретикулуме
b-клеток островков Лангерганса поджелудочной железы в виде
предшественника - препроинсулина (молекулярная масса 11500 Da).
Молекула проинсулина (молекулярная масса 9000 Da), принимает
конформацию, необходимую для правильного образования дисульфидных
мостиков. Затем проинсулин расщепляется на инсулин, С-пептид и два
дипептида (катионные пары, узнающиеся трипсиноподобным ферментом) и
депонируется в секреторных гранулах. Далее содержимое этих гранул
секретируется в печеночную вену. Нормальные b-клетки секретируют,
помимо инсулина, эквимолярное количество С-пептида. До попадания в
периферическую кровеносную систему, инсулин и С-пептид попадают в
печень, где деградирует 50 % инсулина, в то время как С-пептид не
подвергается никаким воздействиям.
4. Можно выделить следующие недостатки производства и применения инсулинов
из животного сырья: большой объем производства требует наличия здоровых
животных; сложность выделения, хранения и транспортировки сырья; антигенные
свойства в связи с отличием на одну аминокислоту в свином инсулине; не
достигается полная очистка от проинсулина за исключением производства
высокоочищенных препаратов; наличие чужеродных белков приводит к
образованию антител, формированию инсулинорезистентности, что выражается в
развитии у больных липодистрофии.
вет к задаче № 14.
1. Под рекомбинантными понимают ДНК, образованные объединением in
vitro (в пробирке) двух или более фрагментов ДНК, выделенных из
различных биологических источников.
2. Ферменты, применяемые при конструировании рекомбинантных ДНК,
можно разделить на несколько групп:
- ферменты, с помощью которых получают фрагменты ДНК (рестриктазы);
- ферменты, синтезирующие ДНК на матрице ДНК (полимеразы) или РНК
(обратные транскриптазы);
- ферменты, соединяющие фрагменты ДНК (лигазы);
- ферменты, позволяющие осуществить изменение структуры концов
фрагментов ДНК.
3. Контроль качества генно-инженерных препаратов имеет свои особенности.
Лекарственные средства, полученные по рекомбинантной технологии, должны быть
тождественны структурам организма человека и содержать минимум допустимых
примесей во избежание иммунологических и аллергических реакций, также не
�� &#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;&#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;34 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;экспрессии генов, имеется плазмида, так называемый собственный-вектор на
основе которой созданы химерные плазмиды, содержащие гены-маркеры
устойчивости к антибиотикам.
Bacillus subtilis (сенная палочка) - грамположительный спорообразующий
непатогенный микроорганизм, способный адсорбировать и поглощать
молекулы ДНК из внешней среды и секретировать из клеток в культуральную
жидкость большие количества белков.
Pseudomonas (псевдомонады) - грамотрицательные условно-патогенные и
патогенные палочки, способные к накоплению рекомбинантных белков, в
отличие от кишечной палочки, в растворенном состоянии за счет
специфических окислительно-восстановительных потенциалов цитоплазмы
клеток.
Сахаромицеты (пекарские дрожжи - Saccaromyces cerevisiae и пивные дрожжи
- Saccaromyces carlsbergensis) - эукариотиче-ские клетки, способные к
посттрансляционной модификации белков и содержащие 2 микронную
дрожжевую плазмиду с селективным геном-маркером, кодирующим синтез
лейцина. Сахаромицеты способны к ферментативной модификации белков и
экскреции рекомбинантных продуктов из клетки. Кроме сахаромицетов
используют другие виды дрожжей. Наиболее эффективными продуцентами
полноценных белков являются метилотрофные дрожжи Pichia pastoris и
Hansenula pofymorpha, способные использовать метанол как единственный
источник углерода и энергии.
Культуры клеток животной ткани, которые в отличии от культур
микроорганизмов, способны осуществлять более детальную модификацию
белков. Используются следующие культуры клеток:
культура клеток китайского хомячка CCL-2 (СНО);
- культура клеток почки обезьяны;
HLM- культура клеток печени эмбриона человека;
- культура клеток соединительной ткани мышц.
5. Вектор - самореплицирующаяся молекула ДНК ( например, бактериальная
плазмида), используемая в генной инженерии для переноса генов от
организма донора к организму реципиента, а также, для клонирования
нуклеотидных последовательностей.
Ответ к задаче №13.
1. Инсулин является полипептидным гормоном. Общая характеристика
функции инсулина состоит в том, что в мышцах, печени и жировой ткани он
усиливает анаболитические и ингибирует катаболитические процессы. В
частности, инсулин повышает скорость синтеза гликогена, жирных кислот,
белков, а также стимулирует гликолиз. Важное значение имеет стимуляция
проникновения глюкозы, ряда других сахаров, а также аминокислот в клетки
мышц и жировой ткани. Способствуя входу глюкозы в указанные клетки,
гормон снижает ее содержание в крови (так называемый гипогликемический
эффект). Инсулин ингибирует такие катаболические процессы, как распад
гликогена и нейтрального жира.
��33 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;Иммобилизация клеток путем включения в различные гели, мембраны,
волокна основана на химических и физических взаимодействиях.
Химические методы используются реже по сравнению с другими методами и
малопригодны для иммобилизации живых клеток. Гораздо большее
распространение получило включение клеток в состав гелей, мембран и
волокон. При таком способе иммобилизации клетки могут сохранять
жизнеспособность и в присутствии питательной среды размножаться в
приповерхностных слоях гелей.
Ответ к задаче № 12
.
1. Наиболее распространенным методом генной инженерии является метод
получения рекомбинантных плазмид, которые представляют собой
кольцевые, двухцепочечные молекулы ДНК, состоящие из нескольких пар
нуклеотидов. Каждая бактерия помимо основной, не покидающей клетку
молекулы ДНК (5*10
пар нуклеотидов), может содержать несколько
различных плазмид, которыми она обменивается с другими бактериями.
Плазмиды являются автономными генетическими элементами,
реплицирующимися в бактериальной клетке не в то же время, что основная
молекула ДНК. Плазмиды несут важные для бактерии гены, как гены
лекарственной устойчивости. Разные плазмиды содержат разные гены
устойчивости к антибактериальным препаратам. При действии
опред
ного антибиотика на бактериальные клетки плазмиды, придающие
устойчивость к нему, быстро распространяются среди бактерий, сохраняя им
жизнь.
2. Бактериальные клетки вырабатывают рестриктазы для разрушения
инородной (фаговой) ДНК, что необходимо для ограничения вирусной
инфекции. Рестриктазы узнают опред
ные последовательности
нуклеотидов (сайты – участки узнавания) и вносят симметричные,
расположенные наискось друг от друга разрывы в цепях ДНК на равных
расстояниях от центра сайта. В результате на концах каждого фрагмента
рестриктированной ДНК образуются короткие одноцепочечные «хвосты»,
которые называют липкими концами.
3. Для получения рекомбинантной плазмиды ДНК одной из плазмид
расщепляется выбранной рестриктазой. Ген, который нужно ввести в
бактериальную клетку, расщепляют из ДНК хромосом человека с помощью
рестриктазы, поэтому его «липкие» концы являются комплементарными
нуклеотидным последовательностям на концах плазмид. Ферментом лигазой
«склеивают» оба куска ДНК в результате получается рукомбинантная
кольцевоя плазмида, которую вводят в бактерию, например, E. coli. Все
потомки этой бактерии (клоны) содержат в плазмидах чужеродный ген. Весь
этот процесс называют клонированием.
4. В качестве продуцентов различных рекомбинантных белков используют:
Escherichia coli (кишечная палочка)- грамотрицательная условно-патогенная
палочка, у которой в настоящее время детальна изучен геном и механизмы
�� &#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;&#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;32 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;Ответ к задаче № 11
.
1. В пищевой промышленности с участием иммобилизованных ферментов
идут процессы получения глюкозо-фруктовых сиропов, глюкозы, яблочной и
аспарагиновой кислоты, оптически активных L- аминокислот, диетического
безлактозного молока, сахаров из молочной сыворотки и др.
2. В медицине иммобилизованные ферменты открыли путь к созданию
лекарственных препаратов пролонгированного действия со сниженной
токсичностью и аллергенностью. Иммобилизационные подходы
способствуют решению проблемы направленного транспорта лекарств в
организме. В медицине иммобилизованные ферменты используются также
как лекарственные препараты, особенно в тех случаях, когда необходимо
локальное воздействие. Кроме того, биокатализаторы широко используются в
различных аппаратах для перфузионной очистки различных биологических
жидкостей. Возможности и перспективы использования в медицине
ферментов в иммобилизованном состоянии гораздо шире, чем достигнутые
на сегодняшний день, именно на этом пути медицину ждет создание новых
высокоэффективных методов лечения.
3. Иммобилизованные клетки имеют ряд преимуществ, как перед
иммобилизованными ферментами, так и перед свободными клетками:
- отсутствие затрат на выделение и очистку ферментов;
- снижение затрат на выделение и очистку продуктов реакции;
- более высокая активность и стабильность;
- возможность создания непрерывных и полунепрерывных
автоматизированных процессов;
- способность к длительному функционированию полиферментных систем
без экзогенных кофакторов.
4. Для иммобилизации могут быть использованы клетки в различном
состоянии: живые и поврежденные в различной степени. Одностадийные
реакции могут осуществлять и живые, и поврежденные клетки.
Полиферментные реакции проводят с применением живых клеток, которые
могут длительное время регенерировать АТФ и коферменты (НАДФ, НАД).
Иммобилизовать можно не только клетки микроорганизмов, но и клетки
растительных и животных тканей, используя их для синтеза физиологически
активных соединений. Интересные возможность открываются и при
иммобилизации клеточных органелл как активных полиферментных систем.
Все это свидетельствует о перспективности развития одного из направлений
биотехнологии, связанного с изучением и применением иммобилизованных
клеток.
5. Химический метод основан на образовании ковалентных связей с
активированным носителем, на поперечной сшивке клеток за счет активных
групп в клеточной оболочке с бифункциональными реагентами (например,
глутаровым альдегидом)
К физическим методам относятся адсорбция и агрегация.
��31 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;4. Классификация носителей для иммобилизованных ферментов

Следует отметить, что органические носители (как низко-, так и
высокомолекулярные) могут быть природного или синтетического
происхождения. Природные полимерные органические носители делят в
соответствии с их биохимической классификацией на 3 группы:
полисахаридные, белковые и липидные.
Синтетические полимеры также можно разделить на группы в связи с
химическим строением основной цепи макромолекул: полиметиленовые,
полиамидные, полиэфирные.
5. Наиболее часто для иммобилизации используются такие полисахариды,
как целлюлоза, декстран, агароза и их производные. Для увеличения
механической прочности целлюлозу гранулируют путем частичного
гидролиза, в результате которого разрушаются аморфные участки. На их
место для сохранения пористости между кристаллическими участками
вводят химические сшивки. Гранулированную целлюлозу довольно легко
превратить в различные ионообменные производные, такие как ДЭАЭ-
целлюлоза, КМЦ и т.д.
Широко распространены носители на основе декстрана, выпускаемые под
названием "сефадексы". При высушивании они легко сжимаются, в водном
растворе сильно набухают. В этих носителях размер пор в геле регулируется
степенью сшитости. К группе декстранов относят и крахмал. Химически
модифицированный крахмал сшивается агентами, такими как формальдегид.
Таким способом был получен губчатый крахмал, обладающий повышенной
устойчивостью по отношению к ферментам, гидролизу.
6. Хорошим носителем считается агар. Его свойства улучшаются после
химической сшивки, например, диэпоксидными соединениями. Такой агар
становится устойчивым к нагреванию, прочен, легко модифицируется.
7. Белки в качестве носителей обладают рядом достоинств: вместительны,
способны к биодеградации, могут применяться в качестве тонкой (толщиной
80 мкм) мембраны. Иммобилизацию ферментов на белковых носителях
можно проводить как в отсутствие, так и в присутствии сшивающих агентов.
К недостаткам белков в качестве носителей относят их высокую
иммуногенность (за исключением коллагена и фибрина). Наиболее для
иммобилизации используются структурные (кератин, фибрин, коллаген),
двигательные (миозин) и транспортные (альбумин) белки.
�� &#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;&#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;30 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;3. Реакции, катализируемые биокатализатором: 12 —
дегидроксилирование
Носители для иммобилизации: кальция альгинат, нейлон, полиуретан
Методы имобилизации биокатализатора: включение в структуру геля
Виды биореакторов для процесса с применением иммобилизованного
биокатализатора: в зависимости от состояния системы
«имобилизизованные клетки — полимер» могут быть использованы
биореакторы с циркуляционным перемещиванием гранул и насадкой, с
механическим перемешиванием и фильтром, «корзиночного типа» для
гранулированной системы, со стимуляцией газообмена для системы в
виде геля.
Ответ к задаче № 10
.
Решить эти проблемы помогает создание в 1916г иммобилизованных
ферментов.
Преимущества иммобилизованных ферментов перед нативными
предшественниками:
Гетерогенный катализатор легко отделим от реакционной среды, что
дает возможность остановить реакцию в любой момент, использовать
фермент повторно, а также получать чистый от фермента продукт.
Ферментативный процесс с использованием иммобилизованных
ферментов можно проводить непрерывно, регулируя скорость
катализируемой реакции и выход продукта.
Модификация фермента целенаправленно изменяет его свойства, такие
как специфичность (особенно в отношении макромолекулярного
субстрата), зависимость каталитической активности от рН, ионного
состава и других параметров среды, стабильность к денатурирующим
воздействиям.
Можно регулировать каталитическую активность иммобилизованных
ферментов путем изменения свойств носителя действием физических
факторов, таких как свет и звук. Иммобилизовать ферменты можно как
путем связывания на нерастворимых носителях, так и путем
внутримолекулярной или межмолекулярной сшивки белковых молекул
низкомолекулярными бифункциональными соединениями, а также
путем присоединения
3. К носителям предъявляются следующие требования (Дж.Порат, 1974):
- высокая химическая и биологическая стойкость;
- высокая химическая прочность;
- достаточная проницаемость для фермента и субстратов, пористость,
большая удельная поверхность;
- возможность получения удобных в технологическом отношении форм
(гранул, мембран);
- легкая активация;
- высокая гидрофильность;
- невысокая стоимость.
��29 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;5. Основную часть ферментов, получаемых промышленным способом,
составляют гидролазы.
Ответ к задаче № 8.
1. При поверхностном методе культура растет на поверхности твердой
увлажненной питательной среды. Мицелий полностью обволакивает частицы
субстрата. Поскольку для дыхания клетки используют кислород, то среда
должна быть рыхлой, а слой культуры-продуцента небольшим.
2. Преимущества поверхностной культуры: значительно более высокая
конечная концентрация фермента на единицу массу среды, поверхностная
культура относительно легко высушивается, легко переводится в товарную
форму.
3. Посевной материал может быть тр
х видов:
- культура, выросшая на твердой питательной среде;
- споровый материал;
- мицелиальная культура, выращенная глубинным способом.
4. Схема очистки сводится к следующему:
- освобождение от нерастворимых веществ;
- освобождение от сопутствующих растворимых веществ;
- фракционирование (как правило, хроматографическими методами).
Для выделения фермента из поверхностной культуры необходима экстракция.
Как правило, экстраген - вода. При этом в раствор переходят сахара,
продукты гидролиза пектиновых веществ и целлюлозы. Стадию выделения и
очистки завершает сушка. После сушки препарат должен содержать не более
6-8% влаги, тогда он может в герметичной упаковке храниться до года без
потери активности.
5. Стандартизация ферментного препарата - доводка активности фермента до
стандартной, соответствующей требованиям ГОСТ. Для этого используются
различные нейтральные наполнители - крахмал, лактоза и др.
Ответ к задаче № 9.
биообъект-
окатализатор: ферменты клеток Digitalis lanata
Источник получения: культура клеток Digitalis lanata, которая из-за
изменения типа питания с фотоавтотрофного (у растений) на гетеротрофный
(у культуры клеток) и путей метаболизма утратила способность
образовывать сердечные гликозиды, но сохранила метаболический путь
присоединения -ОН группы в 12 положении
циклопентанпергидрофенантрена.
Цели и преимущества использования иммобилизованных клеток
растений в качестве биокатализатора в данном процессе: цель —
повышение выхода целевого продукта и времени функционирования
биокатализатора; преимущества: многократное использование
биокатализатора, четкое отделение биокатализатора от целевого
продукта, увеличение времени функционирования биокатализатора.
�� &#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;&#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;28 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;Ответ к задаче № 7.
1. Существует ряд факторов, влияющих на биосинтез ферментов. В первую
очередь, к ним относится генетический. Состав и количество синтезируемых
ферментов наследственно детерминированы. Применяя мутагены можно
изменить генетические свойства микроорганизмов и получить штаммы с
ценными для промышленности свойствами. К мутагенным факторам
относятся ионизирующее и неионизирующее излучения, изотопы,
антибиотики, другие химические соединения, преобразующие
наследственные элементы клетки. Несмотря на определяющую роль
генетического фактора в биосинтезе ферментов, производительность
биотехнологических процессов зависит и от состава питательной среды,
соблюдения условий культивирования (рН, степень аэрации, терморежим,
влажность). При этом важно не только наличие источников основных
питательных веществ, но и веществ, играющих роль индукторов или
репрессоров биосинтеза данного конкретного фермента или их групп.
Для интенсификации процесса роста и синтеза ферментов добавляют
различные факторы роста, например, аминокислоты, пуриновые основания и
их производные, РНК и продукты е
гидролиза. В качестве источника
углерода используют крахмал, кукурузный экстракт, соевую муку,
гидролизаты биомассы дрожжей. Микроорганизмы могут утилизировать и
минеральные источники азота. В состав питательных сред входят и ионы MG,
Mn, Zn, Fe, Cu и др. металлов. Механизм действия большинства из них
неизвестен. Некоторые входят в состав фермента. Ионы Ca повышают
устойчивость a-амилазы, ионы Fe и Mg активизируют и стабилизируют
протеолитические ферменты.
2. При разработке процесса биосинтеза a-амилазы культурой Asp.oryzae
замена сахарозы (как источника углерода) на крахмал увеличила активность
фермента в 3 раза, добавление солодового экстракта (из проросших семян
злаковых) ещ
в 10 раз, а повышение концентрации основных элементов
питательной среды на 50% -
2 раза.
3. Оптимальный состав питательной среды для каждого продуцента может
быть определен двумя способами: эмпирический и построение
математической модели с использованием компьютера.
4. По решению Международного биохимического союза активность решено
определять при t = 30
С по начальной скорости реакции, когда концентрация
насыщения фермента и временная зависимость близка к кинетике реакции
нулевого порядка. Остальные параметры реакции индивидуальны для
каждого фермента. Активность ферментного препарата выражается в
микромолях субстрата, прореагировавшего под действием 1 мл ферментного
раствора или 1 грамма препарата в оптимальных условиях за 1 минуту. Если
ферментный препарат не содержит балласта, то его активность выражается в
тех же стандартных единицах на 1 мг фермента. Если же есть балласт, то
активность считается на 1 мг белка в ферментном препарате. Активность
выпускаемого препарата - важнейший нормируемый показатель качества.
��27 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;2.Химические методы: обработка клеток толуолом, бутанолом.
3.Химико-ферментативные методы: обработка клеток грам(-) лизоцимом в
присутствии ЭДТА; обработка дрожжей зимолазой; обработка ПАВ;
обработка клеток бактерий антибиотиками; заражение бактериофагами.
Ответ к задаче № 6.
1. Общими свойствами ферментов и небиологических катализаторов
является то, что они:
катализируют только энергетически возможные реакции
никогда не изменяют направления реакции
не изменяют равновесия обратимой реакции, а лишь ускоряют его
наступление
не расходуются в процессе реакции
Но ферменты, как катализаторы биологического происхождения имеют свои
особые свойства:
высокая активность
специфичность (селективность) действия
регулируемая активность в зависимости от условий среды
катализ реакций в «мягких» условиях
зависимость скорости реакции от количества фермента
катализируют скорость реакций, принадлежащих к различным
классам.
2. Активный центр фермента — высоко специфичный участок молекулы
фермента, вступающий в контакт с субстратом в фермент-субстратном
комплексе.
Аллостерический центр фермента — участок молекулы фермента, удаленный
от активного центра фермента, активность которого регулируется не
субстратами, а другими веществами, но изменения аллостерического центра
ведут к изменениям в структуре активного центра фермента.
3. Биообъкты-катализаторы — биологические объекты на основе ферментов
или мультиферментных комплексов клеток, катализирующие процессы
биотрансформации и биокатализа.
4. Ферменты подразделяют на 6 групп в зависимости от катализируемых
реакций:
окисление/восстановление (оксиредуктазы)
перенос групп от одного субстрата к другому (трансферазы)
гидролиз (гидролазы)
реакции по двойным связям (разрыв связей и присоединение к ним
химических групп без присоединения молекулы воды или окисления)
(лиазы)
изомеризация (изомеразы)
синтез сложных соединений (синтетазы или лигазы).
�� &#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;&#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;26 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;к кислороду. При использовании аэробных культур ферментационное
оборудование и нормы технологического режима подбираются таким
образом, чтобы массообмен (перенос кислорода из газовой в жидкую фазу)
обеспечивал поступление кислорода к клеткам в количествах, необходимых и
оптимальных для данной культуры в данной фазе роста. Промышленное
использование факультативных анаэробов не ставит задачи абсолютного
исключения кислорода из среды. В начальной фазе этих процессов требуется
лишь удалить кислород из газовой фазы над культуральной жидкостью, что
может быть достигнуто введением инертного газа или просто вытеснением
воздуха углекислотой, выделяемой клетками при метаболизме.
Технологическое оформление строго анаэробных процессов сложнее, чем для
процессов брожения, так как в этом случае необходимо полностью
исключить возможность попадания кислорода в газовую, а оттуда и в жидкую
среду.
Биореакторы подразделяют на три основные группы:
реакторы с механическим перемешиванием;
барботажные колонны, через которые для перемешивания
содержимого пропускают воздух;
эрлифтные реакторы с внутренней или внешней циркуляцией;
перемешивание и циркуляция культуральной среды в них
обеспечивается потоком воздуха, за счет которого между верхним и
нижним слоями культуральной среды возникает градиент плотности.
4. Простейшим вариантом управления стадией ферментации в
периодическом режиме является изменение концентраций компонентов
среды и
рН, а также введение необходимых добавок по заранее
разработанной программе, реализуемой технологом в каждом цикле
ферментации. Важно также поддерживать определенный состав питательной
среды. В непрерывных процессах биосинтеза задача технолога сводится к
поддержанию концентрации всех питательных веществ (и кислорода) и
дозированному введению кислоты или щелочи для рН-статирования системы
на заданном уровне.
Ответ к задаче № 5
.
Последовательность стадий технологического процесса: 10,2, 3, 1, 9, 13,
операции: 5, 4, 7, отделение экстракта от разрушенных клеток, 8, 11, 6, 12,
14.
Операция «Дезинтеграция (разрушение клеток)» осуществляется при
выделении внутриклеточного метаболита (целевого продукта)
физическими, химическими, химико-ферментативными методами в
реакторах-дезинтеграторах с мешалкой, шаровых мельницах,
холодильных установках и т. д.
Физические методы: обработка ультразвуком (с помощью вращающихся
лопастей; продавливанием через узкое отверстие под давлением;
раздавливанием замороженной клеточной массы; осмотическим
шоком; замораживанием-оттаиванием; декомпрессией)
��25 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;подвергаться ферментативной инактивации или вступать во взаимодействие
с другими макромолекулами клетки.
3. Таргетный скрининг сформирован как новая стратегия в области
скрининга антагонистов патогенов и созданием инновационных
антимикробных лекарственных средств, обладающих принципиально иным
механизмом действия, чем антибиотики, отбираемые при первичном
скрининге по активности на лабораторных питательных средах.
Отличительной особенностью новой стратегии является то, что поисковая
работа начинается не с ингибиторов того или иного метаболического
процесса патогена, а с возможных мишеней для потенциальных
антимикробных агентов с применением знаний о геноме и гене.
4. В дальнейшем значение конкретного гена для жизнедеятельности и
размножения патогенного микроорганизма определяется при его трансляции
в живом орган
Ответ к задаче № 4.
Поверхностная и глубинная ферментация.
Ферментация проходит в специальных емкостях, называемых
ферментерами или биореакторами. Основными элементами
ферментера являются двойные стенки, промежуток между которыми
заполняется охлаждающей или нагревающей жидкостью, входные
отверстия для газовых и жидких потоков, система контроля за
составом питательной среды и условиями внутри реактора.
3. Технологическое оформление процессов промышленной биотехнологии
в значительной мере определяется отношением микроорганизма-продуцента
�� &#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;&#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;24 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;Ответ
к задаче №2.
В результате катаболитной репрессии генов ферментов биосинтеза
антибиотиков. Катаболитная репрессия - подавление синтеза
определенных ферментов продуктами катаболизма глюкозы и других
легкоокисляемых веществ. Применительно к синтезу антибиотиков
глюкоза, фруктоза, сахароза, галактоза являются сильными
репрессорами синтеза ферментов, ответственных за биосинтез
антибиотиков. Данное явление получило название «глюкозный
эффект».
Существуют общие закономерности, которые необходимо учитывать
при культивировании большинства продуцентов вторичных
метаболитов: углеродкатаболитная регуляция; содержание фосфатов в
среде; азоткатаболитная регуляция; влияние первичных метаболитов;
влияние кислорода воздуха.
Медленно утилизируемые полисахариды, такие как крахмал более
благоприятны для биосинтеза антибиотиков. Репрессором биосинтеза
не является и лактоза, которая утилизируется медленно. При гидролизе
ктозы высвобождается глюкоза, которая репрессирует фермент р-
галактозидазу, в результате гидролиз лактозы и, следовательно,
появление в среде глюкозы замедляется.
Ответ к задаче №3.
В данном примере применяется таргетный скрининг.
Последовательные этапы таргетного скрининга:
1) Выбор гена. На первой стадии осуществляется выбор гена с
использованием данных биоинформатики о роли гена и значении его
продукта экспрессии в метаболизме клетки, а также структурной и
сравнительной геномики.
2) Амплификация гена. На втором этапе ДНК выбранного гена
амплифицируют (преумножают) с помощью полимеразной цепной реакции
(ПЦР) с целью получения достаточного для дальнейших исследований
количества гена. Наработанная матрица ДНК подвергается транскрипции и
трансляции в бесклеточной рибосомно-матричной системе с целью
получения достаточного количества генного продукта (таргета).
3) Определение специфической активности таргета в бесклеточной системе.
Природные метаболиты и синтетические вещества с антимикробным
действием из библиотек антимикробных агентов испытываются на
способность подавлять активность таргета.
4) Выбор антимикробного агента, обладающего наиболее высокой
аффинностью (избирательностью) к таргету.
5) Исследование механизма взаимодействия отобранного антимикробного
агента с целой микробной клеткой. Важный этап исследования, так как на
практике антимикробное вещество может не проникать в клетку,
��23 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;ОТВЕТЫ К СИТУАЦИОННЫМ ЗАДАЧАМ
вет к задаче №1.
Антимикробное действие макролидов обусловлено нарушением
синтеза белка на этапе трансляции в клетках чувствительных
микроорганизмов. Молекула антибиотика способна обратимо
связываться с каталитическим пептидил-трансферазным центром
рибосомальной 50S-субъединицы и вызывать отщепление комплекса
пептидил-тРНК (представляющего собой растущую пептидную цепь)
от рибосомы. В результате приостанавливается процесс формирования
и наращивания пептидной цепи. Связывание макролидов с 50S-
субъединицей возможно на любой стадии рибосомального цикла.
Характер антимикробного действия макролидов обычно является
бактериостатическим. Тем не менее в определенной степени он зависит
от концентрации антибиотика в очаге инфекции, вида микроорганизма,
фазы его развития и степени микробной обсемененности. В высоких
концентрациях (в 2-4 раза превышающих МПК) и особенно в
отношении тех микроорганизмов, которые находятся в фазе роста,
макролиды могут оказывать бактерицидное действие. Подобным
образом они действуют на
-гемолитический стрептококк группы А,
пневмококк, менингококк, возбудителей коклюша и дифтерии. В то же
время против золотистого стафилококка макролиды в большинстве
случаев проявляют бактериостатический эффект.
Связывание с 50S-субъединицами рибосом характерно также для таких
антибиотиков, как линкозамиды, стрептомицин и хлорамфеникол.
Несмотря на то, что по особенностям связывания с доменами
пептидил-трансферазного центра данные антибиотики отличаются от
макролидов, при одновременном назначении между ними возможна
конкуренция и ослабление антимикробного эффекта.
В последние годы значение определения чувствительности
микроорганизмов к макролидным антибиотикам
in vitro
возрастает.
Современные стандартизированные методы определения
чувствительности к антибиотикам подразделяются на методы серийных
разведении (в агаре и бульоне, метод микроразведений) и
диффузионные (диско-диффузионный метод и метод Е-тестов). Методы
серийных разведении и Е-тесты позволяют получить количественную
характеристику чувствительности микроорганизмов - МПК
антибиотика в отношении данного возбудителя, а диско-диффузионный
метод является полуколичественным и позволяет подразделить все
штаммы на три категории - чувствительные, умеренно-резистентные и
резистентные, но при регистрации и анализе диаметра зон он в ряде
случаев приближается к количественным методам.
�� &#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;&#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;22 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;3. Принцип работы теста для ранней диагностики беременности с помощью
моноклональных антител.
Задача № 60
Проанализируйте описание технологического процесса по следующей схеме:
название иммунотропного лекарственного средства;
класс и группа препаратов, к которым относится данное средство;
достоинства и недостатки данного иммунотропного средства;
основные этапы получения;
показатели качества;
условия хранения и транспортирования;
влияние на иммунитет и применение.
«из плазмы или сыворотки крови доноров-добровольцев, иммунизированных
вакциной против клещевого энцефалита, выделяют фракцию Ig
фракционированием этанолом при температуре ниже 0
С глобулиновой части
белков крови. Далее про водят лиофилизацию, изготовление 10% раствора,
стерилизующую фильтрацию и ампyлирование по 1 мл (1 доза)»
��21 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;Задача № 56
Успешное лечение любого заболевания зависит от своевременной и
точной идентификации патогенного фактора (возбудителя болезни, опухолевой
клетки и др.). Методы, основанные на образовании комплексов антител с
антигенами или гаптенами, называют иммуноанализом или
иммунодиагностикой. Во всех случаях иммуноанализа первостепенной задачей
является превращение анализируемого объекта в комплекс антиген-антитело с
последующим определением его количества.
Основные требования к диагностическим тестам.
Какие два типа диагностикумов используются в иммуноанализе?
Радиоиммунологический (радиоиммунный) метод, принцип. Достоинства
и недостатки.
Иммуноферментный анализ-ИФА, преимущества по сравнению с РИА.
В зависимости от чего классифицируют ИФА на на гомогенный и
гетерогенный варианты?
Задача № 57
Успешное лечение любого заболевания зависит от своевременной и
точной идентификации патогенного фактора (возбудителя болезни, опухолевой
клетки и др.). Методы, основанные на образовании комплексов антител с
антигенами или гаптенами, называют иммуноанализом или
иммунодиагностикой. Во всех случаях иммуноанализа первостепенной задачей
является превращение анализируемого объекта в комплекс антиген-антитело с
последующим определением его количества.
Гомогенный вид иммуноферментного анализа.
Прямой конкурентный метод ELISA для определения антигенов.
Метод последовательного насыщения ELISA.
Метод ингибирования ELISA с использованием двойных антител.
Прямой конкурентный метод ELISA для определения антител.
Иммунометрический вид ИФА («Сендвич»-анализ), его этапы.
Задача № 58
Многие исследователи пытались отыскать способы получения антител с
узкой специфичностью.
Какие этапы включает процедура получения моноклональных антител?
значение процесса иммунизации животных при получении
моноклональных антител.
Какие клетки используют для гибридизации in vivo при производстве
моноклонольных антител?
Задача № 59
Многие исследователи пытались отыскать способы получения антител с
узкой специфичностью.
Иммунизация in vitro при производстве моноклональных антител,
преимущества.
Клонирование гибридомных клеток, известные вам методы клонирования.
�� &#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;&#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;20 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;7. Трансформация может осуществляться как растущей на среде культурой,
к и отмытыми от питательной среды клетками микроорганизма. Какой
из вариантов предпочтительнее, есть ли исключения?
Задача №52
В настоящее время возможности и достоинства использования
биотрансформации проявились наиболее ярко в области превращений
стероидных соединений. Сложность молекул стероидов затрудняет даже
незначительные их модификации химическим путем.
В процессе промышленного производства стероидов необходимым
условием является высокая степень предварительного измельчения
стероидного субстрата. С какой целью и чем это обусловлено?
Методы, повышающие водорастворимость стероидов, когда
растворимость стероидного субстрата слишком мала для проявления
присущей микроорганизму ферментативной активности.
Что представляет из себя «вещество S», его применение.
Задача №53
Главным препятствием, стоящим на пути развития промышленного
микробиологического гидроксилирования стероидов является низкая
производительность ферментации, несмотря на высокий процентный выход по
субстрату.
Причины низкой производительности ферментации при
микробиологическом гидроксилировании стероидов.
Актинобактерии, роль в процессах биоконверсии стероидов.
Род Согупеbacterium, роль в процессах биоконверсии стероидов.
Задача №5
4
Иммунная система, совместно с нервной, эндокринной, сердечно -
сосудистой и другими системами, обеспечивает постоянство внутренней среды
организма, или гомеостаз.
Активирующие агенты иммунной системы (определение).
Какие компоненты иммунной системы Вы знаете?
К какому из компонентов иммунной системы относится
иммуноглобулины? Какие клетки в организме вырабатывают
иммуноглобулины? Классы иммуноглобулинов.
Задача №55
Иммунная система, совместно с нервной, эндокринной, сердечно -
сосудистой и другими системами, обеспечивает постоянство внутренней среды
организма, или гомеостаз.
Что представляет генетический компонент иммунной системы? Принцип
его функционирования.
Первичная иммунная недостаточность, определение. Способы терапии.
Вторичная иммунная недостаточность, определение, причины.
��19 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;4. Что представляет препарат Хил
-форте? Является ли он
пробиотиком?
Задача №49
Большинство препаратов пробиотиков представляют собой биомассу
микроорганизмов.
Какие этапы включает процесс получения продуцента для препаратов
нормофлоры?
Продуцент при получении колибактерина.
Каким образом продуцент — кишечную палочку, восстанавливают из
состояния анабиоза?
Перечислите оптимальные условия для культивирования кишечной
палочки с целью накопления биомассы.
Контроль препарата колибактерина.
Задача №50
Технология производства препаратов бифидо- и лактобактерии аналогична
технологии колибактерина. Различия относятся к составу питательных сред и
условиям культивирования в соответствии с физиологическими особенностями
бактерий.
Какими преимуществами обладают бифидо - и лактобактерии для
производства и применения в качестве лекарственных препаратов по
сравнению с кишечной палочкой?
Какие стадии присутствуют в технологическом процессе производства
препаратов пробиотиков?
По каким показателям проводят контроль готового лекарственного
препарата Bifidobacterium bifidum?
Какой способ производственного культивирования в биореакторе
предпочтительнее для накопления биомассы молочнокислых бактерий.
По каким показателям осуществляют контроль лекарственного
препарата «Лактобактерин» ?
Задача №51
Стероидные гормоны (кортикостероиды, прогестогены, половые
гормоны) участвуют во многих жизненно важных функциях организма. В основе
получения стероидных гормонов лежат методы биотрансформации
(биоконверсии).
Сущность процесса биотрансформации.
Каким образом осуществляется синтез молекулы стероида в процессе
биоконверсии?
Основные процессы микробиологической трансформации.
Преимущества биотехнологических методов производства стероидов
перед методами химического синтеза.
Что используется в качестве исходного сырья для производства
стероидных препаратов в биотехнологическом производстве?
Какой тип ферментации применяют при биотрансформации стероидов?
�� &#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;&#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;18 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;3. Что ожидается при высоком содержании в питательной среде
биотина и солей аммония при культивировании бактерий родов
Согуnebacterium и Brevibacterium на углеводном сырье.
Схематически изобразите данный процесс.
Задача №46
Предложите посетителю аптеки лекарственные препараты на основе
пробиотиков, прием которых можно совмещать с приемом пероральных
препаратов антибиотиков.
Задача №47
Даны следующие лекарственные препараты
а-Ацилакт сухой
б-Бактисубтил
в-Бификол сухой
г-Бифилиз сухой
д-Колибактернн сухой
е-Линекс
ж-Нормофлор
з-Нутролин В
и-Пробифор
к-Хилак-форте
Выделите среди перечисленных препаратов содержащие
лактобактерии.
Выделите среди перечисленных препаратов содержащие
бифидобактерии.
Выделите среди перечисленных препаратов содержащие кишечную
палочку.
Задача №48
Даны следующие лекарственные препараты:
а-Пробифор
б-Колибактерин сухой
в-Бификол сухой
г-Бифилиз сухой
д- Бактисубтил
е-Линекс
ж-Нормофлор
з-Нутролин В
и- Ацилакт сухой
к-Хилак-форте
Факторы, вызывающие развитие дисбактериоза.
Представители резидентной микрофлоры ЖКТ человека. Кто
преобладает?
Принципы пробиотикотерапии. Опеределение.
��17 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;2. Метод совершенствования выбранного продуцента и отбора
сверхпродуцента
Какие еще продуценты данного вещества вам известны, их достоинства и
недостатки.
Задача №43
Известно, что провитамин D
(эргостерин)
продуцируют дрожжи-
сахаромицеты в аэробных условиях при избытке углеводов в питательной
среде, сниженном количестве азота и оптимальном содержании кислорода
(максимум 2%).
Назовите промышленный продуцент для провитамина D
2
Необходим ли УФ-свет для процесса образования целевого продукта?
Если да, то для чего и на каком этапе технологического процесса.
Для чего в промышленном производстве витамина D
2
применяют
гидролиз? Как используют полученный гидролизат?
Как используют грибы рода Candida в качестве продуцента D
2
Какие коферменты можно получить с использованием грибов рода
Candida в качестве продуцента D2? Роль в организме данных веществ.
Задача №44
Процесс промышленного производства данного витамина осуществляется в
виде нескольких стадий, лишь одна
из которых является биотехнологической,
остальные- химические превращения. По химическим свойствам данный
витамин является L-кислотой.
Исходным веществом для промышленного
производства служит крахмал.
Что за витамин производится подобным способом? Название метода
промышленного производства.
Перечислите стадии производства, отметьте среди ни
биотехнологическую.
Продуценты биотехнологической стадии, их особенности.
Что вам известно о синтезе предшественника данного витамина -
гидрат диацетон-2-кето-L-гулоновой кислоты- какой микроорганизм
может использоваться для синтеза данного вещества-
предшественника, метод его совершенствования
?
Задача №45
Из изолимонной кислоты цикла Кребса при культивировании бактерий
родов Согуnebacterium и Brevibacterium на углеводном сырье (гидролизат
крахмала, тросниковая или свекловичная меласса) в условиях при дефиците
биотина с подавлением активности фермента глутаматдегидрогеназы
синтезируется …1...?.
Предшественником каких других аминокислот является полученное
вещество?
Метаболический предшественник при биосинтезе данной
аминокислоты.
�� &#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;&#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;16 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;вторичного метаболизма, индукции ферментов и экспрессии генов,
деградации чужеродных соединений, цитологических исследований и др.
Накопление вторичных метаболитов возрастает в фазе
замедленного роста клеточной популяции, а в стационарной фаз?
Как влияют на синтез вторичных метаболитов стрессовые
условия, воздействующие на клетки в конце экспоненциальной
фазы?
Использование суспензионных культур в промышленности.
Примеры растений, применяемых в медицине для создания
лекарственных препаратов.
Задача №
Существуют также технологии получения вторичных метаболитов с
помощью иммобилизованных клеток каллусной культуры (в частности, такие
системы используются для иммобилизации каллусной культуры клеток
Digitalis lanata).
Носители для иммобилизации клеток растений.
Способны ли иммобилизованные клетки расти?
Преимущества иммобилизованных клеток растений по сравнению с
суспензионными культурами.
Процесс получения дигоксина из дигитоксина, применяемый продуцент,
сущность процесса биотрансформации.
Задача №
Данный биопродукт из культуры изолированных клеток разработан в
лаборатории культуры тканей Института физиологии растений РАН на основе
высокопродуктивного клеточного штамма культуры растительных клеток и
используется для изготовления лосьонов, кремов, а также тонизирующих
препаратов. Экстракт из клеток данного растения обладает
радиопротекторным, иммуностимулирующим и другими эффектами.
О клетках какого растения идет речь?
Показания к применению.
Задача №42
Определите лекарственную субстанцию по описанию
технологического процесса: «Штамм сконструирован методом генной
инженерии. Отбор высокопродуктивных клонов проведен по устойчивости к
аналогу целевого продукта. В качестве аналога использован розеофлавин.
Сверхпродуцент культивируют на питательной среде с мелассой и
дрожжевым экстрактом в течение 25-35 ч. при температуре 37
С в условиях
аэрации. Целевой продукт секрктируется в культуральную жидкость в
количестве 3,4-4,0 г/л целевого продукта. Лекарственную субстанцию
выделяют из культуральной жидкости по растворимости в щелочах и
кислотах и низкой растворимости в органичных жидкостях.
Составьте технологическую схему получения данного соединения.
��15 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;2. Какая фирма применяет пекарские дрожжи Saccharomyces cerevisiae в
качестве продуцента рекомбинантного человеческого инсулина?
Препараты инсулина, полученного благодаря методам генетической
инженерии с использованием Saccharomyces cerevisiae, на
фармацевтическом рынке России.
Задача №37.
В качестве продуцента рекомбинантного человеческого инсулина
используют также пекарские дрожжи Saccharomyces cerevisiae, так как они
обладают рядом преимуществ перед другими изученными и
культивируемыми в промышленном масштабе микроорганизмами.
Тип нуклеиновой кислоты, применяемой для переноса в геном
(построения вектора), в производстве рекомбинантного инсулина.
источник ее получения.
Селекцию трансформированных сахаромицетов при производстве
рекомбинантного инсулина проводят на питательной среде, не
содержащей аминокислоты лейцин. Почему?
Метод культивирования продуцента Saccharomyces cerevisiae при
производстве рекомбинантного инсулина.
Культуральную суспензию Saccharomyces cerevisiae разделяют
центрифугированием, целевой продукт выделяют из культуральной
жидкости и очищают методами ионообменной и гель-хроматографии.
Далее его подвергают биоконверсии по реакции транспептидации,
используя трипсин и бета-карбоксипептидазу. С какой целью
производится реакция транспептидации?
Задача №38.
Суспензионные культуры - отдельные клетки или группы клеток,
выращиваемые во взвешенном состоянии в жидкой среде. Представляют
собой относительно гомогенную популяцию клеток, которую легко
подвергнуть воздействию химических веществ. Суспензионные культуры
широко используются в качестве модельных систем для изучения путей
вторичного метаболизма, индукции ферментов и экспрессии генов,
деградации чужеродных соединений, цитологических исследований и др.
Получение суспензионной культуры из каллусной ткани.
Фазы роста суспензионной культуры.
Какие два вида систем культивирования при глубинном
культивировании растительных клеток применяют?
Задача №39
Суспензионные культуры - отдельные клетки или группы клеток,
выращиваемые во взвешенном состоянии в жидкой среде. Представляют
собой относительно гомогенную популяцию клеток, которую легко
подвергнуть воздействию химических веществ. Суспензионные культуры
широко используются в качестве модельных систем для изучения путей
�� &#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;&#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;14 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;2. В чем заключается принцип иммобилизации ферментов с
использованием мембран? Микрокапсулирование. Включение в
волокна и включение в липосомы.
Метод иммобилизации ферментов с использование систем двухфазного
типа.
Методы химической иммобилизации, отличия от физической
иммобилизации.
Задача №34.
Продукты микробного синтеза поступают из биореактора в виде водных
суспензий или растворов, при этом характерно невысокое содержание
основного компонента и наличие многих примесных веществ. В большинстве
промышленных производств на первом этапе переработки культуральной
жидкости производят отделение массы продуцента от жидкой фазы –
сепарацию.
Как называют способ выделения и очистки продуктов, находящихся
внутри клеток продуцента?
Какие способы освобождение от растворимых веществ вам известны?
Перечислите известные вам методы тонкой очистки и разделения
препаратов.
Задача №35.
Создание и производство рекомбинантных человеческих инсулинов
существенно повысило эффективность лечения сахарного диабета и
обеспечило повышение качество жизни больных.
Методы очистки полученных рекомбинантных белков-
предшественников цепей А и В в биотехнологическом производстве
инсулина по технологии фирмы «Eli lilly»?
Процесс выделения А и В цепей, их соединение в молекулу инсулина.
Недостатки метода и продуцента при производстве инсулина по
технологии фирмы «Eli lilly».
Технологические приемы, используемые для защиты персонала,
производственного процесса, отходов и окружающей среды от
контаминации клетками Escherichia coli.
Перечислите препараты рекомбинантного инсулина, выпускаемого по
технологии фирмы «Eli lilly».
Задача №36.
В качестве продуцента рекомбинантного человеческого инсулина
используют также пекарские дрожжи Saccharomyces cerevisiae, так как они
обладают рядом преимуществ перед другими изученными и
культивируемыми в промышленном масштабе микроорганизмами.
Достоинства пекарских дрожжей как продуцента рекомбинантных
белков.
��13 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;5. Поддержание чистой культуры и получение засевной дозы. Отделение
чистой культуры. Особенности при периодическом процессе
культивирования и при непрерывном.
Задача №30.
Продукты микробного синтеза поступают из биореактора в виде водных
суспензий или растворов, при этом характерно невысокое содержание
основного компонента и наличие многих примесных веществ. В большинстве
промышленных производств на первом этапе переработки культуральной
жидкости производят отделение массы продуцента от жидкой фазы –
сепарацию.
Как технологические приемы, используемые для отделения клеток
от среды, зависят от природы продуцента? Поясните на примере
сравнении выделения продуцента у сахаромицетов и дрожжей
рода Candida.
Роль фильтрации и центрифугирования при отделении твердой
фазы.
Какие способы обработки культуральной жидкости вам известны?
Задача №31.
Глубинный метод культивирования продуцентов ферментов.
При глубинном методе культура растет на поверхности твердой или
в жидкой питательной среде?
Какой из методов технически более совершенен - поверхностный
или глубинный, почему?
Для чего при глубинном методе осуществляют концентрирование
фильтрата перед его выделением?
Этапы при глубинном культивировании продуцентов ферментов.
Сущность каждого этапа.
Задача №32.
Какие два основных метода иммобилизации ферментов Вы знаете?
Что представляет физическая иммобилизация ферментов? Типы
связывания ферментов.
Удерживание адсорбированной молекулы фермента на поверхности
носителя может обеспечиваться за счет …?
Преимущества и недостатки метода адсорбционной иммобилизации.
Суть этого метода иммобилизации путем включения в гели.
Задача №33.
Какие два основных метода иммобилизации ферментов Вы знаете?
Какие два основных способа для иммобилизации ферментов в геле вам
известны?
�� &#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;&#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;12 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;Задача №29
общем виде система биотехнологического производства продуктов микробного
синтеза представлена на схеме:
Сколько стадий биотехнологического производства Вы знаете?
Назовите их и охарактеризуйте происходящие в них процессы.
Расскажите о технологии приготовления питательных сред для
микробиологического синтеза вещества. Что входит в состав
питательной среды? Особенности введения в среду источников
углерода.
Асептика при приготовлении питательной среды в процессе
микробиологического синтез. Стерилизация газовых и жидкостных
потоков. Требования к химическим антисептикам.
Требует ли стерилизации среда, в которой субстратами служат метанол,
этанол или концентрированная уксусная кислота? Почему? Как
достигается соблюдение асептики в данном случае?
��11 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;3. Недостатки метода и продуцента при производстве инсулина по
технологии фирмы «Eli lilly».
Технологические приемы, используемые для защиты персонала,
производственного процесса, отходов и окружающей среды от
контаминации клетками Escherichia coli.
Перечислите препараты рекомбинантного инсулина, выпускаемого по
технологии фирмы «Eli lilly».
Задача №26
Культуры клеток и тканей для массового размножения растений и
оздоровления посадочного материала, в том числе лекарственных растений,
нашли широкое применение в растениеводстве.
С какой целью при выращивании каллусной ткани проводят пассирование
или субкультивирование?
Понятие и сущность дифференциации меристематической клетки.
Может ли у растений процесс дифференциации быть обратимым, при
каких условиях
Задача №27
Определите лекарственную субстанцию по описанию технологического
процесса, выделите биотехнологические и химические этапы производства,
назовите биообъекты биотехнологических этапов:
« … продуцент Nocardia mediterranea обработан многократно ренгеновскими и
ультрафиолетовыми лучами, а также азотсодержащими веществами с селекцией
на каждом этапе. Сверхпродуцент помещен в ферментатор на жидкую
питательную среду, содержащую крахмал, соевую муку, кукурузный экстракт,
хлорид натрия и карбонат кальция. После завершения процесса
культивирования целевой продукт извлечен из культуральной жидкости
органическим растворителем, реэктрагирован в водную фазу и подвергнут
распылительной сушке. Полупродукт передан в цех химической
трансформации....»
Задача №28
Определите лекарственную субстанцию по описанию технологического
процесса, назовите продуцент и метод его совершенствования, методы
выделения и очистки, способ сушки лекарственной субстанции:
« … продуцент Bacillus polimyxa обработан многократно рентгеновскими и
ультрафиолетовыми лучами,а также азотсодержащими веществами с селекцией
на каждом этапе. Сверхпродуцент помещен в ферментатор на жидкую
питательную среду, содержащую крахмал, соевую муку, кукурузный экстракт,
минеральные соли. После завершения процесса культивирования целевой
продукт извлечен из культуральной жидкости и очищен методом ионообменной
хроматографии. Целевой продукт высушен распылительной сушкой.
Выпускается в таблетках по 500 000 ЕД..»
1. Для чего стремятся получить сверхпродуцент?
2. Их своиства, особенности хранения.
3. Необходимо ли учитывать требования GMP при биосинтезе антибиотиков?
�� &#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;&#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;10 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;5. Методы экстракции и очистки целевого продукта при получении данного
витамина с помощью Propionibacterium freudenreichii и Propionibacterium
shermanii
Задача №22.
В клетках микроорганизмов рода Согуnebacterium и Brevibacterium в процессе
микробиологического синтеза из аспарагиновой кислоты в синтезируется три
аминокислоты, в том числе лизин, имеющий промышленное значение.
Биообъект для данного процесса.
Какие еще аминокислоты образуются в клетках микроорганизмов рода
Согуnebacterium и Brevibacterium из аспарагиновой кислоты наряду с
лизином?
Какой фермент открывает данный метаболический путь, особенности
данного фермента. Понятие «совместное ингибирование».
Метод совершенствования биообъекта, применяемый при синтезе лизина.
Понятия мутанты первого и второго типов, их предназначение и
использование их особенностей.
Задача №23.
В процессе микробиологического синтеза с применением кишечной
палочки получают аминокислоту треонин.
Биообъект, его особенности при регуляции биосинтеза аминокислот.
Строение регуляторной области.
Методы совершенствования биообъекта.
Метод отбора сверхпродуцента.
Задача №24.
При взаимоотношениях аэробных бактерий и фотосинтезирующих
водорослей наблюдаем следующее - бактерии утилизируют О
и углеводы,
выделяя СО
и факторы роста; водоросли используя квант света превращают СО
в О
2
и углеводы.
Определите вид данного взаимоотношения. Определение данного вида
взаимодействия между микроорганизмами.
Как называют такое взаимодействие, когда ни один из штаммов не может
быть без взаимодействия с другим?
Что понимают под комменсализмом?
Сущность амменсализма.
Задача №25
Создание и производство рекомбинантных человеческих инсулинов
существенно повысило эффективность лечения сахарного диабета и обеспечило
повышение качество жизни больных.
Методы очистки полученных рекомбинантных белков- предшественников
цепей А и В в биотехнологическом производстве инсулина по технологии
фирмы «Eli lilly»?
Процесс выделения А и В цепей, их соединение в молекулу инсулина.
��9 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;Задача №19.
Суспензионные культуры широко используются в качестве модельных
систем для изучения путей вторичного метаболизма, индукции ферментов и
экспрессии генов, деградации чужеродных соединений, цитологических
исследований и др.
Дайте определение суспензионной культуры.
Сравните каллусные и суспензионные культуры, указав достоинства и
недостатки для биотехнологии.
Способ получения суспензионной культуры из каллусной ткани.
Культивирование суспензионной культуры в биореакторах. Виды
биореакторов по типу перемешивания. Режимы культивирования
растительных клеток в промышленности.
Предназначение фитогормонов, механизм действия.
Задача №20.
Определите лекарственную субстанцию по описанию технологического
процесса: «Штамм сконструирован методом генной инженерии. Отбор
высокопродуктивных клонов проведен по устойчивости к аналогу целевого
продукта. В качестве аналога использован розеофлавин. Сверхпродуцент
культивируют на питательной среде с мелассой и дрожжевым экстрактом в
течение 25-35 ч. при температуре 37
С в условиях аэрации. Целевой продукт
секретируется в культуральную жидкость в количестве 3,4-4,0 г/л целевого
продукта. Лекарственную субстанцию выделяют из культуральной жидкости по
растворимости в щелочах и кислотах и низкой растворимости в органичных
жидкостях.
Составьте технологическую схему получения данного соединения.
Метод совершенствования выбранного продуцента и отбора
сверхпродуцента
Какие еще продуценты данного вещества вам известны, их достоинства
и недостатки.
Задача №21
Данный витамин является активным гемопоэтическим фактором
млекопитающих и ростовым фактором многих микроорганизмов, состоит из
двух циклических структур и линейного участка. В молекуле данного витамина
металл кобальт связан с первым макроциклом (корриновое ядро). Вторая
кольцевая структура - 5,6-диметилбензимидазол (5,6-ДМБ), связанная с первой
кольцевой структурой гетерогенной боковой цепью, состоящей из изопропанола,
связанного с основанием 5.6- ДМБ М-гликозидной связью.
О каком витамине идет речь?
Используются ли в производстве данного витамина дрожжи и
мицелярные грибы?
Какие продуценты данного витамина вам известны?
Метод совершенствования биообъекта и метод отбора сверхпродуцента
для получения данного витамина с помощью Propionibacterium
freudenreichii и Propionibacterium shermanii
�� &#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;&#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;8 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;1. Какие два подхода для получения инсулина с использованием методов
генетической инженерии вы знаете?
Какой из этих подходов применяется в биотехнологическом
производстве инсулина по технологии фирмы «Eli lilly» (США)?
Какой продуцент применяется в биотехнологическом производстве
инсулина по технологии фирмы «Eli lilly»?
Процесс ферментации при биотехнологическом производстве инсулина
по технологии фирмы «Eli lilly».
Для чего применима дезинтеграция клеток продуцента при
биотехнологическом производстве инсулина по-технологии фирмы
«Eli lilly» (США)?
Задача №1
7.
Культивируемые клетки высших растений могут рассматриваться как
типичные микрообъекты. В основе культивирования растительных клеток
лежит свойство, благодаря которому соматические клетки растения
способны полностью реализовать наследственную информацию, то есть
обеспечить развитие всего растения.
Какое название носит данное свойство растительных клеток?
Какие циклы развития проходит каллусная клетка за весь период
своей жизнедеятельности? Кривая роста и фазы роста каллусной
ткани.
Протопласт - это клетка, лишенная оболочки. Способна ли она к
делению?
При получении каллусных культур сначала готовят маленькие (2—
мм) кусочки растительной ткани, не утратившие способность к
репродукции. Их название. Этапы получения первичного каллуса.
Задача №1
8.
Культуры клеток и тканей для массового размножения растений и
оздоровления посадочного материала, в том числе лекарственных растений,
нашли широкое применение в растениеводстве.
Какой метод позволяет от одной меристемы получить (регенерировать)
достаточно большое количество новых растений, в том числе и в
культуре in vitro? Для осуществления данного метода более подходят
слабодифференцированные или высоко дифференцированные ткани
растения?
Каллусная ткань, определение, биологическая роль.
3. В качестве чего при культивировании растительных клеток используют
2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д), aльфа-нафтилуксусную
кислоту (НУК) ?
4. Какими в зависимости от происхождения и условий выращивания
каллусные ткани бывают по степени плотности?
��7 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;5. Понятие вектора в генной инженерии.
Задача №13.
Важное значение среди гормонов поджелудочной железы играет инсулин. В
настоящий момент расширяются возможности создания рекомбинантного
инсулина.
Биологические функции инсулина
в организме человека.
Строение инсулина.

Биосинтез молекулы инсулина в организме человека из проинсулина.
Какие недостатки производства и применения инсулинов из животного
сырья вы знаете?
Задача №14.
Важной составной частью биотехнологии является генетическая инженерия.
Методы генной инженерии преобразуют клетки бактерий, дрожжей и
млекопитающих в "фабрики" для масштабного производства любого
рекомбинантного белка.
Дайте определение рекомбинантной ДНК.
Какие вы знаете ферменты, применяемые при конструировании
рекомбинантных ДНК?
Особенности контроля качества генно-инженерных препаратов,
показатели качества.
Роль вектора в генной инженерии.
Характеристики векторных систем, важные для переноса необходимых
генов в клетки млекопитающих.
Задача №15.
Исторически первым способом получения инсулина для терапевтических
целей является выделение аналогов этого гормона из природных источников
(островков поджелудочной железы крупного рогатого скота и свиней). В 20-
годах прошлого века было установлено, что бычий и свиной инсулины
(которые являются наиболее близкими к инсулину человека по своему
строению и аминокислотной последовательности) проявляют в организме
человека активность, сравнимую с инсулином человека.
Получение инсулина из тканей свиней является методом
синтетическим или полусинтетическим?
Опишите метод получения инсулина из тканей свиней.
Преимущества человеческого генно-инженерного инсулина
человека по сравнению с произведенным из тканей животного.
Как по международному стандарту определяют активность
инсулина?
Задача №1
6.
Создание и производство рекомбинантных человеческих инсулинов
существенно повысило эффективность лечения сахарного диабета и
обеспечило повышение качество жизни больных.
�� &#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;&#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;6 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;Задача №10.
Ферменты - вещества белковой природы и поэтому неустойчивы при
хранении. Кроме того, ферменты не могут быть использованы многократно из-за
трудностей в отделении их от реагентов и продуктов реакции. В 1916 году
Дж.Нельсон и Е.Гриффин адсорбировали на угле инвертазу и показали, что она
сохраняет в таком виде каталитическую активность.
Изобретение какого процесса воздействия на ферменты с целью
повышения их устойчивости и возможности многократного применения
произошло в 1916г?
Преимущества иммобилизованных ферментов перед нативными.
Основные к требования носителям для получения иммобилизованных
ферментов.
Классификация носителей для получения иммобилизованных ферментов.
Перечислите наиболее распространенные носители из класса углеводов,
известные вам. Назовите основные достоинства и недостатки белков в
качестве носителей для иммобилизации ферментов, наиболее часто
применяемые с этой целью белки.
Задача № 11.
Ощутимый вклад процессы иммобилизации ферментов и клеток внесли в
тонкий органический синтез, в анализ, в медицину, в процессы конверсии
энергии, в пищевую и фармацевтическую промышленности.
Общие направления и достижения применения иммобилизованных
ферментов в пищевой промышленности.
Общие направления и достижения применения иммобилизованных
ферментов в медицине.
Преимущества иммобилизованных клеток перед иммобилизованными
ферментами, перед свободными клетками.
Какие клетки подходят для иммобилизации? Одностадийные и
полиферментные реакции.
Химические и физические методы иммобилизации КЛЕТОК, возможности
применения.
Задача №12.
Генная инженерия появилась благодаря работам многих исследователей в
разных отраслях биохимии и молекулярной генетики. Генная инженерия-
совокупность методов, позволяющих в пробирке переносить генетическую
информацию из одного организма в другой. Перенос генов да
т возможность
преодолевать межвидовые барьеры и передавать отдельные наследственные
признаки одних организмов другим. ЦЕЛЬ - получение клеток, в промышленных
масштабах нарабатывать некоторые белки.
Что представляют из себя плазмиды, их роль в генной инженерии.
Для чего бактериальные клетки вырабатывают рестриктазы?
Сущность процесса клонирования для получения рекомбинантной ДНК с
применением плазмид и рестриктаз.
Основные продуценты, используемые в построении рекомбинантных
белков.
��5 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;1. Назовите основные свойства ферментов, сравните со свойствами
небиологических катализаторов.
Активный и аллостерический центр фермента.
Биообъекты-биокатализаторы.
Классификация ферментов и катализируемых реакций.
Задача № 7.
Фермент липаза почти не синтезируется грибом Asp.awamori на среде без
индуктора, добавление жира кашалота усиливает биосинтез фермента в сотни
раз. При добавлении же в среду крахмала и при полном исключении
минерального фосфора интенсивно синтезируется фосфатаза.
Какие факторы, влияющие на биосинтез ферментов, ВЫ знаете?
Что произойдет при биосинтезе aльфа-амилазы культурой Asp.oryzae в
случае замены сахарозы (как источника углерода) на крахмал, добавления
солодового экстракта (из проросших семян злаковых), или при повышении
концентрации основных элементов питательной среды на 50%?
Какими двумя способами может быть определен оптимальный состав
питательной среды для каждого продуцента?
Каким образом и для чего принято определять активность ферментного
препарата?
Какой класс ферментов зависимости от катализируемых реакций
составляет основную часть среди ферментов, получаемых промышленным
способом?
Задача № 8.
Поверхностный метод культивирования продуцентов ферментов.
При поверхностном методе культура растет на поверхности твердой или
жидкой питательной среде? За счет чего обеспечивается аэрация при этом
способе?
Основные преимущества поверхностной культуры.
Виды посевного материала при поверхностном культивировании
продуцентов ферментов.
Схема очистки при поверхностном культивировании продуцентов
ферментов.
Стандартизация ферментного препарата, определение.
Задача №9.
Рассмотрим процесс биотрансформации дигитоксина в дигоксин за счет
дегидроксилирования углерода-12.
1. Применяются ли при этом иммобилизованные ферменты? Биообъект-
биокатализатор, источники получения
Цели и преимущества использования иммобилизованных клеток растений
в качестве биокатализатора в данном процессе
Реакции, катализируемые биокатализатором
Носители для иммобилизации. Методы имобилизации биокатализатора
Виды биореакторов для процесса с применением иммобилизованного
биокатализатора.
�� &#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;&#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;4 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;микробную клетку исходного микроорганизма, вызвав выраженное подавление
ее жизнедеятельности.
Определите вид скрининга антимикробной структуры для конкретного
патогенна.
Выделите основные этапы скрининга, определите их значение в ходе
скрининга .
Для чего применяется данный вид скрининга антимикробной
структуры.
Что послужит продолжением указанного процесса?
Задача №4.
Стадия ферментации - центральная среди этапов промышленного
производства. Под ферментацией понимают всю совокупность последовательных
операций от внесения в заранее приготовленную и термостатированную среду
инокулята до завершения процессов роста, биосинтеза или биотрансформации.
Какие два вида ферментации вам известны?
С помощью какого оборудования осуществляется ферментация? Его
основные элементы, схематическое изображение.
Как технологическое оформление процессов промышленной
биотехнологии зависти от отношения микроорганизма-продуцента к
кислороду? Три группы биореакторов.
Способы управления процессом ферментации.
Задача № 5.
Установите правильную последовательность стадий и операций
технологического процесса, представленных на схеме, заполните недостающие
операции стадии «Выделение целевого продукта». Предложите методы и
аппаратурное оснащение операции «Дезинтеграция клеток».
Подготовка и стерилизация газового потока
Подготовка и стерилизация оборудования и коммуникаций
Подготовка и стерилизация субстрата
Разделение культуральной суспензии
Обработка культуральной суспензии
Анализ целевого продукта
Дезинтеграция клеток
Выделение индивидуального вещества
Культивирование биообъекта
Подготовка биообъекта
Сушка целевого продукта
Фасовка, упаковка, маркировка лекарственной субстанции
Выделение целевого продукта
Биологическая очистка отходов
Задача № 6.
Ферменты — биологические катализаторы биохимических реакций в живых
клетках.
��3 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;СИТУАЦИОННЫЕ ЗАДАЧИ
Задача №1.
Эритромицин, являющийся "золотым стандартом" среди антибиотиков
класса макролидов, обладает высокой активностью прежде всего против
грамположительных кокков, таких как
-гемолитический стрептококк группы A
S.pyogenes
), пневмококк (
S.pneumoniae
), золотистый стафилококк (
S.aureus
),
исключая метициллинорезистентные штаммы последнего. Кроме того, он
хорошо действует на возбудителя коклюша (
B.pertussis
), дифтерийную палочку
C.diphtheriae
), моракселлу (
M.catarrhalis
), легионеллы (
Legionella
spp.),
кампилобактеры (
Campylobacter
spp.), листерии (
Listeria
spp.), хламидии
C.trachomatis, C.pneumoniae
), микоплазмы (
M.pneumoniae
), уреаплазмы
U.urealyticum
Эритромицин умеренно активен против гемофильной палочки (
H.influenzae
),
боррелий (
B.burgdorferi
) и некоторых бактероидов, включая
B.fragilis
. В то же
время он практически не действует на грамотрицательные бактерии семейства
Enterobacteriaceae, Pseudomonas
spp. и
Acinetobacter
spp., поскольку не проникает
через оболочку клеток данных микроорганизмов.
Механизм и характер антимикробного действия макролидов.
Каков характер антимикробного действия макролидов.
Для каких еще групп антибиотиков характерно также связывание с 50S-
субъединицами рибосом микроорганизма? Возможно ли их совместное
назначение?
Какие методы определения чувствительности микроорганизмов к
макролидам Вы знаете?
Задача №2.
В процессе биосинтеза антибиотика из группы аминогликозидов при
культивировании продуцента состав питательной среды включал соевую муку,
кукурузный экстракт, повышающий эффективность ферментации и соли. Подача
газового потока, источники фосфатов и азота соответствовали требованиям. При
добавлении в среду некоторого количества глюкозы биосинтез был ослаблен.
В результате чего добавление в среду глюкозы снизило эффективность
биосинтеза антибиотика? Какое название носит данный эффект, его
сущность?
Какие общие закономерности необходимо учитывать при культивировании
большинства продуцентов вторичных метаболитов?
Какие углеводороды наиболее благоприятны для биосинтеза
антибиотиков?
Задача №3.
В процессе биотехнологического процесса из ядра клетки патогенного для
человека микроорганизма выделен геном, в котором был выбран определенный
ген (участок нуклеиновой кислоты микроорганизма). Данный ген размножен с
применением ПЦР. В базе антимикробных агентов выбран один,
взаимодействие с которым подавило активность гена наиболее эффективно.
Затем выбранный из антимикробный агент был опробован в действии на целую
�� &#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;&#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;2 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;УДК 615.12 (076)
52.82
Б 63
Биотехнология
:
. ситуационных задач с эталонами ответов для студентов
5 курса, обучающихся по спец. 060108 – фармация / сост.
Гребенникова,
В. Хамцова. – Красноярск : тип. КрасГМУ, 2011. – 73
Составители:
д.м.н. профессор Гребенникова В.В.
ассистент Хамцова И.В.
Ситуационные задачи с эталонами ответов полностью соответствуют
требованиям Государственного образовательного стандарта (2000) высшего
профессионального образования по специальности 060108 – Фармация;
адаптированы к образовательным технологиям с учетом специфики обучения
по специальности 060108 – Фармация.
Рецензенты
зав. кафедрой биологической химии с курсом медицинской,
фармацевтической и токсикологической химии
ГОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого,
д.м.н., профессор Салмина А.Б.
зав. кафедрой патологической физиологии
им. профессора В.В. Иванова ГОУ ВПО КрасГМУ
им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого, д.м.н. Рукша Т.Г.
Утверждено к печати ЦКМС КрасГМУ (протокол №
от 28.04.
)
КрасГМУ
2011
ГОУ ВПО
«Красноярский государственный медицинский
университет
им. проф. В.Ф. Войно
Ясенецкого
Министерства здравоохранения и
социального
развития Рос
сийской Федерации
Кафедра фармакологии с курсами клинической фармакологии,
фармацевтической технологии и ПО
БИОТЕХНОЛОГИЯ
сборник ситуационных задач с эталонами ответов для студентов 5 курса,
обучающихся по специальности 060108 – Фармация
Красноярск
2011


Типография КрасГМУ
Подписано в печать 31.
5.11. Заказ № 1
756
Тираж
660022, г.Красноярск, ул.П.Железняка, 1
пассивный иммунитет возникает через несколько часов после
инъекции и длится до двух недель.
Недостатки:
малая длительность иммунитета;
необходимость контроля доноров-добровольцев на отсутствие
антител к вирусам иммунодефицита человека ВИЧ-1 и ВИЧ-2,
гепатита С , поверхностного антигена вируса гепатита В.
Основные этапы получения:
Иммунизация доноров-добровольцев вакциной против
клещевого энцефалита.
Заготовка крови доноров и получение плазмы.
выделение γ-глубина, стерилизующая фильтрация и
ампулирование.
Контроль качества
Заготовка крови доноров и получение плазмы методом плазмофереза.
Кровь донора собирают в стерильные емкости из полимерного материала,
содержащие раствор антикоагулянта (5% раствор натрия цитрата) для
предотвращения свертывания крови; центрифугируют кровь, при этом
отделяется плазма и осаждаются клетки, которые возвращаются донору, что
значительно снижает возможность возникновения неблагоприятных
последствий в организм донора.
Выделение γ-глобулиновой части белков крови осуществляют
фракционированием 8-26% этанолом при температуре ниже 0
С. В этих
условиях денатурирующие действие этанола на белки крови незначительно и
выделяемая γ-глобулиновая фракция сохраняет растворимость.
Лиофилизация γ-глобулина осуществляется методом лиофильной
сушки. Далее следует изготовление 10% раствора γ-глобулина,
стерилизующая фильтрация и ампулирование.
Контроль качества проводится по следующим показателям:
- стерильность;
-апирогенность;
-содержание белка;
-безвредность;
-специфическая активность.
Условия хранения и транспортирования: в сухом, защищенном от света месте
при температуре 6±4
Влияние на иммунитет: специфическое взаимодействие с антигенами,
создание искусственного пассивного иммунитета.
Применение: экстренная профилактика и лечение клещевого энцефалита у не
привитых людей, отметивших присасывание клеща в районах, эндемичных
по клещевому энцефалиту.

легко проверять факторы, влияющие на эффективность иммунизации.
2. Клонирование осуществляется для выделения стабильных клонов
гибридомных клеток. Для недавно образованных гибридомных клеток
характерна высокая нестабильность, связанная с утратой хромосом. При
культивировании могут появляться клетки, потерявшие способность
продуцировать антитела и они могут перерастать антителообразующие
гибридные клетки.
К основным методам клонирования клеток относятся клонирование методом
лимитирующих разведений, клонирование в полужидком агаре и
клонирование с помощью прибора – проточного цитофлуориметра.
3. Принцип работы теста для ранней диагностики беременности. На
поверхности индикаторной полоски иммобилизованы антитела к
хорионическому гонадотропину. В тестовой и контрольной зонах нанесены
моноклональные меченые антитела. В контрольной зоне также нанесено
минимальное количество антигена - гонадотропина хорионического. При
проведении анализа полоску опускают в исследуемый образец мочи д
отмеченного на полоске уровня. В процессе движения жидкости вверх по
полоске определяемый антиген взаимодействует с иммобилизованными
антителами, вызывая их постепенное насыщение. При наличии в моче
хорионического гонадотропина в концентрации выше 25 мг/мл в тестовой
зоне - образуется «сендвич» антитело - определяемый антиген - меченое
антитело и появляется полоса розового цвета. При отсутствии в пробе
гонадотропина хорионического окраски в тестовой зоне не наблюдается. В
контрольной зоне, расположенной выше тестовой зоны, образуется
«сендвич» антитело-стандартный антиген-меченное антитело» и появляется
полоса розового цвета. Таким образом, при наличии двух розовых полос на
тесте концентрация гонадотропина в моче превышает уровень 25 мг/мл и с
достоверностью близкой к 100 % можно говорить об установлении факта
беременности. Наличие только одной розовой полосы в контрольной зоне
свидетельствует об отсутствии беременности.
Ответ к задаче №
Название иммунотропного лекарственного средства
иммуноглобулин
человека против клещевого энцефалита.
Класс и группа
препаратов,
которым относит
ое средство:
эндогенные специфические иммуностимуляторы, иммуноглобулины
(поликлональные антитела).
Достоинства:
обеспечивают высокий титр антител благодаря концентрированию
целевого продукта;
освобождены от балластных белков, что снижает количество
аллергических реакций и осложнений;
современная технология получения гарантирует гибель вируса
инфекционного гепатита;
��71 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;использовании моноклональных антител, которые обладают высокой
специфичностью и реагируют с определенной детерминантой антигена.
Использование моноклональных антител позволяет объединять
иммобилизованные и меченые антитела на одной подложке и,
следовательно, уменьшать количество стадий анализа и промывок.
«Сендвич» - анализ включает следующие этапы:
1.Инкубация определяемого антигена анализируемой пробы с
иммобилизованными антителами и промывка несвязавшихся
компонентов.
2.Введение меченных антител, инкубация и отмывка.
3.Детекция ферментативной активности. Ферментативная активность
твердой фазы пропорциональная количеству антигена в пробе.
Ответ к задаче №
1. Процедура получения моноклональных антител включает в себя
следующие этапы:
иммунизация животных
подготовка клеток к слиянию
слияние
отбор индуцирующих специфические антитела клонов
клонирование и реклонирование
массовая наработка гибридомных клеток
получение культуральной жидкости или асцита, содержащих антитела
выделение антител.
Обычно вся процедура от момента начала иммунизации до выделения
антител занимает 3-4 месяца.
Назначение процесса иммунизации состоит в том, чтобы увеличить
долю клеток, продуцирующих антитела заданной специфичности, и
перевести эти клетки в функциональное состояние, при котором они
способны сливаться и образовывать антителообразующие гибридные клетки.
Экспериментально установлено, что для гибридизации необходимы
выделять селезеночные клетки животных через 3-4 суток после последнего
введения антигена, то есть тогда, когда в лимфоидных органах много активно
пролиферирующих клеток.
Ответ к задаче №
1. В последнее время активно развиваются методы полной иммунизации вне
организма с целью получения гибридомы. Иммунизация in vitro имеет ряд
существенных преимуществ:
укорачивается период иммунизации до 4-5 суток;
требуется существенно меньшее количество антигена;
ко многим антигенам можно получить более выраженный иммунный
ответ (частично за счет снижения вклада толерантности и супрессии);
повышается процент отвечающих клеток;
�� &#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;&#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;70 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;Метод основан на возможности антител модулировать активность фермента,
связанного с измеряемым веществом (антигеном). Изменение активности
фермента происходит из-за создаваемых антителом в процессе реакции с
конъюгированным антигеном пространственных затруднений для субстрата в
результате изменения конформации. В качестве ферментов в гомогенном
ИФА используют дегидрогеназы, а субстратов - кофакторы.
Прямой конкурентный метод ELISA (гетерогенный метод ИФА) для
определения антигенов выполняется в том случае, когда антитела
иммобилизованы на твердой фазе, а меченный и не меченный
антигены, добавленные одновременно, конкурируют друг с другом за
связывание с антителом. В связи с тем, что количество антител на
твердой фазе ограниченно, меченного конъюгата образуется тем
меньше, чем выше концентрация анализируемого антигена в пробе.
Метод последовательного насыщения ELISA применяют для
определения антигенов в том случае, если исследуемый образец влияет
на маркер или если константы связывания обоих компонентов с
антителами различны. На первом этапе с антителами инкубируют обра-
зец, затем удаляют в результате промывки несвязавшиеся компоненты,
и на следующем этапе добавляют меченый антиген. Ферментативная
активность твердой фазы обратно пропорциональна содержанию
антигена в анализируемой пробе.
. Метод ингибирования ELISA с использованием двойных антител
основан на конкуренции свободных антител с антигеном,
предварительно фиксированном на носителе, и определяемым
антигеном, находящимся в растворе. Маркер введен во второе
антитело. Ферментативная активность твердой фазы прямо
пропорциональна содержанию антигена в анализируемой пробе.
Определение антител осуществляют: прямым конкурентным методом;
методом с использованием меченого антигена; непрямым методом.
Прямой конкурентный метод ELISA для определения антител основан
на фиксации антигена на твердой фазе и конкуренции между мечеными
антителами (конъюгатами) и антителами опытной пробы. Конъюгат с
фиксированным антигеном связывается тем меньше, чем больше
антител в пробе, и, следовательно, ферментативная активность твердой
фазы, определяемая после промывки, обратно пропорциональна
содержанию антител в анализируемой пробе.
Иммунометрический вид ИФА («сендвич» - анализ) заключается в
том, что на твердой фазе иммобилизован избыток антител, с которыми
инкубируют антиген. После удаления несвязавшихся компонентов в
систему добавляют избыток меченых ферментом антител, которые
взаимодействуют с антигеном. Образуется «сендвич» - комплекс, в
котором между двумя антителами находится антиген, имеющий две
детерминанты, расположенные на достаточном расстоянии друг от
друга. «Сендвич» - анализ выполняют как с поликлональными, так и
моноклональными антителами. Более точные результаты получают при
простота.
Наиболее существенные недостатки РИА:
радиоактивные изотопы являются короткоживущими,
испускающими высокоэнергетическое излучение, что ограничивает
время их использования и требует специального оборудования;
радиоактивное повреждение меченого реагента приводит к потере
активности в иммунологических реакциях;
необходимость проведения исследований в специально
оборудованной лаборатории для работы с радиоактивными
изотопами с использованием громоздкой и дорогостоящей
аппаратуры для регистрации результатов исследований;
необходимость существования централизованной системы
распределения радиоиммунных диагностических наборов,
безопасной утилизации отходов (проб анализа) и неиспользованных
тест-систем по истечении их срока годности;
сложность утилизации радиоактивных отходов
затратность.
Иммуноферментный анализ-ИФА получил широкое применение
благодаря особым преимуществам ферментной метки, которая не только
позволяет выявить комплекс «антиген-антитело», но и обладает
следующими положительными свойствами:
многократное усиление сигнала за счет того, что в присутствии
одной молекулы фермента за короткое время образуются миллионы
и миллиарды молекул продукта реакции, катализируемой данным
энзимом;
проведение анализа в ряде случаев без разделения вошедших в
комплекс и не связавшихся компонентов;
возможность регулирования каталитической активности.
Благодаря перечисленным преимуществам ферментной метки, а также
экологической чистоте метода иммуноферментный анализ практически
вытеснил РИА.
Одним из важных моментов в проведении ИФА является разделение
свободных и связанных с антителами меченых компонентов. В зависимости
от принципа разделения ИФА подразделяется на гомогенный и гетерогенный
вариант иммуноанализа.
Ответ к задаче №57
. Гомогенный вид иммуноферментного анализа (EMIT - Enzyme
multiplied Immunoassay Technique) - иммуноаналитический метод с
регуляцией ферментативной активности) осуществляется без
разделения компонентов и заключается в построении такой системы,
при которой активность фермента изменяется в процессе иммунной
реакции.
�� &#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;&#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;68 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ; 3. Вторичные иммунодефициты (вторичная иммунная недостаточность) -
клинико-лабораторный синдром недостаточности эффекторных функций
иммунокомпетентных клеток, сочетающийся с осложненным течением
воспалительных заболеваний и травм, повышенным риском развития
аутоиммунных, аллергических заболеваний и новообразований.
Вторичные иммунодефициты развиваются в результате:
длительного применения иммунодепрессантов при аутоиммунных
заболеваниях;
хронических и рецедивирующих аллергических заболеваний;
злокачественных новообразований и их лучевой и химиотерапии;
выраженного нарушения обмена веществ,
длительного проживания в экологически неблагоприятных
районах;
генерализованных инфекционных заболеваний;
тяжелых и обширных травм и хирургических вмешательств;
хронического стресса и старения организма.
Ответ к задаче №
1. Диагностический тест должен отвечать следующим требованиям:
воспроизводимость; правильность; высокая чувствительность при выявлении
очень малых количеств молекулы-мишени, высокая специфичность в
отношении молекулы-мишени; высокая точность; простота метода
определения (возможность получать однозначные результаты при небольших
затратах времени и при отсутствии сложного оборудования).
2. Иммуноанализ используется в двух вариантах:
для определения определенных антигенов с помощью специфических к
этим антигенам антител (диагностикумы на основе антител);
для детекции антител определенной специфичности с помощью
соответствующих антигенов (диагностикумы на основе антигенов).
3. Радиоиммунологический (радиоиммунный) метод -РИА- заключается во
введении в систему «антиген-антитело» меченого радиоактивным изотопом
антигена, в результате происходит связывание определяемого и меченого
антигена с ограниченным количеством стандартных антител. Реакция
антиген-антитело приводит к состоянию равновесия между свободным и
связанным антигеном. Меченые и немеченые антигены конкурируют за
ограниченное число участков связывания антител. Количество меченого
антигена, включившегося в состав иммунных комплексов, обратно
пропорционально количеству немеченого антигена в пробе.
РИА характеризуется следующими достоинствами:
высокая точность;
высокая специфичность;
высокая чувствительность определения малых концентраций
соединений при наличии в пробах примесей с близкой структурой и
сходной биологической активностью;
��67 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;3. Для дегидрирования в положении 1,2 в основном применяют Согупеbacterium
simplex. Для изомеризации с одновременным окислением 3-оксигруппы в 3-
кетогруппу широко используются штаммы Corynebacterium mediolanum (sin.
Flavobacterium dehydrogenans). Отметим важность этой реакции, поскольку
источники сырья (диосгенин, соласодин) содержат Збета-оксигруппу, тогда
как активные стероидные препараты должны иметь 3-кетогруппу.
Ответ к задаче №
Активирующие агенты иммунной системы (антигены) - это клетки
микроорганизмов, вирусы, белки, нуклеиновые кислоты, антибиотики,
пестициды и другие ксенобиотики, а также ошибочно измененные
клетки самого организма.
Компоненты иммунной системы подразделяют на следующие виды:
Клеточный компонент.
Молекулярный компонент.
Генетический компонент.
3. Молекулярный компонент - это иммуноглобулины (антитела),
вырабатываемые дифференцированными В - лимфоцитами. Известно 5
классов иммуноглобулинов IgA, IgD, IgE, IgG, IgM.
Ответ к задаче №55
1. Генетический компонент иммунной системы включает множество
генов, кодирующих синтез главного комплекса гистосовместимости и синтез
иммуноглобулинов, определяющих индивидуальную чувствительность
организма к заболеваниям благодаря регулированию силы ответа на
соответствующие антигены. Каждая из четырех белковых цепей мономерных
молекул антитела кодируется двумя структурными генами. Гены главного
комплекса гистосовместимости объединяют 15 генов, расположенных в 6
паре хромосом.
В результате перенесенной инфекции в организме сохраняются
субпопуляции специфических (сенсебилизированных) В - и Т-лимфоцитов,
которые при повторном инфицировании могут размножаться, синтезировать
специфические макромолекулы и обеспечивать устойчивость организма к
данном) патогену. Такое состояние организма называют приобретенным
иммунитетом.
2. Первичная иммунная недостаточность или первичный иммунодефицит -
это совокупность патологических состояний, обусловленных генетическим
дефектами эффекторных звеньев иммунной системы и приводящих к
нарушению элиминации антигенов: возбудителей инфекционных
заболеваний, аутоантигенов, аллергенов, антигенов опухолевой природы.
Врожденные иммунодефициты передаются по наследству по рецессивному
типу и проявляются вскоре после рождения. Лечение первичных
имунодефицитов осуществляется путем трансплантации костного мозга,
заместительной терапии и иммунокоррекции.
�� &#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;&#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;66 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;2. В случае, когда растворимость стероидного субстрата слишком мала для
проявления присущей микроорганизму ферментативной активности,
задействуют методы, повышающие водорастворимость стероидов.
Первый — подача стероида в растворителе, смешивающемся с водой
(ацетоне, метаноле, этаноле, диметилформамиде, диметилсульфоксиде и др.)
Ограничением для применения этого метода является токсичность
определенных концентраций растворителей.
Второй — использование водорастворимых форм стероидов в виде
натриевых солей 2,1-гемисукцинатов или фосфатов. Осложняющим
моментом для широкого использования таких модификаций является
высокая степень избирательности по отношению к ним со стороны
микроорганизмов, например для дегидрирующего микроорганизма
Corynebacterium simplex эти формы стероидов оказались недоступны.
Третий метод — заключение стероидов в растворимый комплекс с
циклодекстрином. Использование комплекса стероидов с циклодекстрином
не имеет ограничений предыдущих методов.
Микробиологическое гидроксилирование — наиболее часто применяемый
метод получения стероидных препаратов, так как присутствие
гидроксильных групп в 3, 11, 16, 17-положениях молекулы стероида
обусловливает, как правило, физиологическую активность для большинства
гормональных стероидных препаратов.
Широко используется в промышленности микробиологический синтез
одного из основных кортикостероидов — гидрокортизона (кортизола) и его
синтетических аналогов: преднизолона и дексаметазона. В этом случае
исходным продуктом для 11(3-гидроксилирования может служить вещество
Рейхштейна (кортексолон), которое для краткости принято называть
«вещество S». Само по себе «вещество S» является модифицированным
продуктом биотрансформации (с помощью культуры Corynebacterium
mediolanum) моноацетата «вещества R».
Ответ к задаче №53
Причины низкой производительности ферментации при
микробиологическом гидроксилировании стероидов:практическая
нерастворимость стероидных субстратов в воде и токсичность применяемых
растворителей и, следовательно, невозможность использования достаточно
высоких концентраций субстрата.
Актинобактерии являются эффективными биокатализаторами многих
процессов биоконверсии стероидов, имеющих важное значение для синтеза
фармацевтических гормональных препаратов. Биокаталитический потенциал
этих микроорганизмов в отношении широкого ряда стероидных субстратов
позволяет прогнозировать их эффективное использование для создания
новых технологий получения стероидных фармсубстанций: в отношении
различных реакций трансформации стероидов, таких, как гидроксилирование,
введение и восстановление двойной связи, окисление стероидных спиртов,
восстановление кетонов, деэтерификация и деградация боковой цепи и др.
��65 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;Ответ к задаче №51
1. Биотрансформация- процесс превращения метаболитов в структурно
родственные соединения с ценными свойствами под влиянием
микроорганизмов или микробных клеток.
Общей чертой всех процессов микробиологической трансформации
является изменение именно молекулярной структуры трансформируемого
вещества, а не синтез молекулы de novo.
Основные процессы микробиологической трансформации — это
кисление, восстановление, декарбоксилирование, дезаминирование,
гидролиз, метилирование, конденсация, изомеризация и т.д.
В промышленном производстве стероидных препаратов
биотехнологические методы имеют конкретные преимущества перед
методами химического синтеза: возможность реакций, недоступных для
химического синтеза; превращение субстрата в биологически активную
форму соединения в течение одной стадии процесса (в отличие от
многостадийного и весьма затратного химического синтеза); удобство,
экономичность и экологичность производства.
5. В качестве исходного сырья для производства этих препаратов
используются стерины растений (класс фитостеринов). Эргостерин,
стигмастерин, ситостерин.
Биотрансформация стероидов — аэробный процесс глубинной
ферментации, для проведения которой используется оборудование,
отвечающее высокой степени массообмена.
7. Трансформация может осуществляться как растущей на среде культурой,
так и отмытыми от питательной среды клетками микроорганизма. Последний
вариант предпочтительнее, поскольку облегчает выделение и очистку
целевого продукта. Но, как показала производственная практика, не все
микроорганизмы переносят промышленное сепарирование без потери
активности; так, представители мукоровых грибов очень чувствительны к
сепарированию, тогда как представители несовершенных грибов теряют
свою активность незначительно.
Ответ к задаче №52
1. Стероиды — малорастворимые в воде соединения: их растворимость
колеблется от 0,3 г/л (гидрокортизон) до 0,01 г/л (ацетонид
фторкортексолона). Поэтому трансформационные процессы осуществляют
обычно при концентрации субстрата в пределах 1 — 10 г/л, что предполагает
нахождение основной массы стероида в твердой фазе. В этом случае
необходимым условием является высокая степень предварительного
измельчения стероидного субстрата (поступает в среду в
микронизированном виде) с использованием ультразвуковых или
механических измельчителей.

контроль на отсутствие посторонних микроорганизмов,
определение безвредности на лабораторных животных.
Ответ к задаче №50
1. Бифидо - и лактобактерии обладают рядом преимуществ по сравнению с
кишечной палочкой:
являются симбионтами макроорганизма с первых дней жизни;
молочнокислые бактерии являются кислоторезистентными
микроорганизмами, что обеспечивает их высокую выживаемость
при пероральном приеме;
лактобактерии устойчивы к антибиотикам, что позволяет применять
их в курсе антибиотикотерапии.
2. Технологический процесс производства препаратов пробиотиков включает:
- восстановление клеток из состояния анабиоза путем многократных
посевов на твердых питательных средах с оценкой антагонистической
активности;
- культивирование клеток с целью получения биомассы;
- отделение клеток и концентрирование культуральной жидкости
(проводится только при получении препаратов метаболитов пробиотиков)
- сублимационная сушка культуральной суспензии;

оценка качества (контроль);
получение готовых лекарственных форм.
Контроль готового лекарственного препарата Bifidobacterium bifidum
проводят по следующим показателям:
содержание живых микробных клеток, которых в дозе сухого
бифидумбактерина должно быть не менее 10 -10 живых
бирфидобактерий;
отсутствие посторонних микроорганизмов;
антагонистическая активность по отношению к дизентерийным тест-
штаммам Флекснера и Зонне.
4. Производственные штаммы молочнокислых бактерий (Lactobacillus
fermenti и Lactobacillus plantarum) выращивают на питательных средах,
приготовленных на основе гидролизата молока, накопление биомассы
молочнокислых бактерий осуществляйся глубинным методом с.
перемешиванием, но без аэрации, при температуре 37 С.
5. Контроль лекарственного препарата «Лактобактерин» осуществляют по
следующим показателям:
содержание живых лактобактерий;
отсутствие посторонних микроорганизмов;
остаточная влажность не более 4 %;
антагонистическая активность в отношении возбудителей дизентерии,
патогенных энтеробактерий и условно-патогенных микроорганизмов
(гемолитического стафилококка и протея).
��63 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;лучевой терапии с пролонгированием курса лечения после отмены
терапии;
в комплексе профилактических мероприятий у лиц, пребывающих
длительное время в неблагоприятных климатических и экологических
условиях, контактирующих в процессе производства с токсичными
веществами и промышленными отходами.
Хилак-форте - стерильный концентрат продуктов метаболизма
нормальных кишечных симбионтов, образующих молочную
кислоту, а также ряд дополнительных компонентов. Препарат
эффективен при одновременном приеме с антибактериальными
средствами. Выпускается во флаконах но 30 и»100 мл, прием по 40-
60 капель 3 раза в день. Является пребиотиком.
Ответ к задаче №49
1. Процесс получения продуцента включает следующие этапы:
выделение микроорганизмов из мест их естественного обитания.
Наиболее часто микроорганизмы нормальной микрофлоры выделяют
из каловых масс здоровых детей 1 -3 летнего возраста;
оценку антагонистической активности по отношению к
энтеропатогенным микроорганизмам и отсутствия безвредности по
отношению к макроорганизму,
введение клеток в состояние анабиоза с целью сохранения в течение
длительного времени.
2. продуцент для колибактерина- высокоактивный штамм E.coli M-17,
выделенный у здоровых людей и обладающий сильными
антагонистическими свойствами по отношению к патогенным микробам.
3. В начале производственного цикла штамм М —17 кишечной палочки
восстанавливают из состояния анабиоза путем пассажей на жидких и
твердых питательных средах.
4. Для накопления биомассы используют питательные среды на основе
казеина с добавлением 2 % пищевого желатина. Процесс культивирования
микроорганизмов ведут в биореакторах при температуре 37 С в условиях
перемешивания и аэрации. Оптимальные значения рН среды находятся в
пределах 7,2-8,0. Продолжительность процесса накопления биомассы
составляет 6-7 часов.
5. Контроль колибактерина осуществляют постадийно. Поскольку
действующим началом препарата являются живые бактерии, основными
показателями качества являются:
число живых клеток в расчете на дозу. Доза сухого колибактерина
должна содержать не менее 10 млрд. живых клеток;
антагонистическая активность к тест-штаммам возбудителей
дизентерии Флекснера и Зонне.
определение остаточной влажности,
агглютинабельности культуры специфической антисывороткой,
�� &#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;&#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;62 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;Ответ к задаче №47
а, е, ж, з.
В, г, е, и
Ответ к задаче №48
Возникновению дисбактериоза способствуют: применение антибиотиков;
применение консервантов в пищевых продуктах; особенности питания
человека (употребление рафинированной пищи, много углеводов,
недостаток белков и клетчатки), несоответствие количества потребляемой
пищи уровню энергетических затрат; кишечные инфекции; различные
ферментопатии с врожденными или приобретенными дефектами
слизистой оболочки кишечника; хронические заболевания и нарушения
функций ЖКТ; нарушения иммунного статуса; нарушения экологии и
радиация; физические и психические стрессы.
Бифидобактерии, лактобактерии, бактероиды, непатогенная кишечная
палочка, энтерококки. Преобладают бифидобактерии.
Принципы пробиотикотерапии.
Пробиотикотерапия - применение препаратов пробиотиков per os с
целью восстановления нормобиоценоза.
При терапии дисбактериоза необходимо учитывать причины и
степень развития синдрома, выраженность клинических
проявлений, состав высеваемой микрофлоры.
Бифидопрепаратам уделяется важнейшая роль в лечении
дисбактериоза.
Целесообразно сочетание в препаратах пробиотиков
нескольких видов и штаммов бактерий, введение
компонентов, повышающих резистентность макроорганизма
или оказывающих иммуномодулирующее действие (лизоцим,
иммуноглобулины, интерфероны).
Пробиотикотерапия должно комплексно сочетаться с
применением пребиотиков, ферментных препаратов,
иммуномодулирующих лекарственных средств,
энтеросорбентов, витаминов, рациональной фитотерапией,
функциональным питанием.
Пробиотикотерапия необходима:
для коррекции микробиоценоза у детей с первого года жизни,
находящихся на искуственном вскармливании или принимающих
антибактериальные препараты;
при лечении вирусных и бактериальных инфекций респираторного
тракта, бронхолегочной патологии, особенно с частыми рецидивами;
с целью предупреждения дисбактериоза на фоне применения
антибиотиков, гормональных и химиотерапевтических средств,
��61 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;4 стадия — получение гидрата диацетон-2-кето-L-гулоновой кислоты
путем окисления диацетон-L-сорбозы
5 стадия — получение L-аскорбиновой кислоты из гидрата диацетон-2-
кето-L-гулоновой кислоты (деацетонирование, этерификация,
енолизация, лактонизация).
6 стадия — перекриталлизация технической аскорбиновой кислоты до
медицинской.
3.
Микробиологический метод осуществляют уксуснокислые бактерии
рода Асеtоbасtег, культивируемые на питательной среде, состоящей из
В-сорбита и дрожжевого экстракта и гидролизата дрожжей,
выполняющего роль биостимулятора за счет содержания аминокислот
и витаминов группы В.
Использование иммобилизованных клеток Gluconobacter oxydans
предпочтительнее, так как они непосредственно из сорбозы
осуществляют синтез 2-кето-L-гулоновой кислоты.
Для получения сорбозы культуру продуцентов Gluconobacter
выращивают в ферментаторах периодического действия при усиленной
аэрации в течение 20-40 часов. Основными факторами, влияющими на
процесс окисления, являются: состав и качество питательной среды,
аэрация питательной среды кислородом вместо воздуха, герметичность
и высокая стерильность аппаратуры.
4.
Известно, что гидрат диацетон-2-кето-L-гулоновой кислоты можно
получить при совместном культивировании микроорганизмов
Corynebacterium и Erwinica hebricola. Однако технически два этих
организма не могут расти вместе из-за разных культуральных свойств.
С помощью генетических манипуляций удалось совместить в геноме
Erwinica hebricola свойства редуктазы Corynebacterium.
Ответ к задаче №45
Получение глутаминовой кислоты.
В семейство глутаминовой кислоты входят образующиеся из нее
глутамин, пролин, лизин, аргинин.
Метаболическим предшественником при биосинтезе глутаминовой
кислоты является а -кетоглутаровая кислота, возникающая в цикле
Кребса из изолимонной кислоты под действием фермента
изоцитратдегидрогеназы .
При высоком содержании в питательной среде биотина и солей
аммония образуется пролин.
Ответ к задаче №46
При любой антибактериальной терапии должны проводиться
мероприятия по защите нормальной кишечной микрофлоры с
использованием пробиотиков, устойчивых к антимикробным агентам
(лактосодержащие препараты: линекс, лактобактерин, препараты транзитной
микрофлоры: бактисубтил, препараты метаболизма: хилак-форте).
�� &#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;&#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;60 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;недостаток, а именно, нестабильность при хранении на твердых средах
во всем диапазоне температур (от комнатной до температуры
лиофилизации), что выражается в потере способности к сверхсинтезу
витамина. Для сохранения активности штамма постоянно проводится
селекция наиболее окрашенной в оранжевый цвет колонии.
Ответ к задаче №43
Высокое содержание эргостерина характерно для Saccharomyces
cerevisae, которые и являются промышленными продуцентами
эргостерина.
Этап- выделение целевого продукта, обработка клеточной суспензии:
дрожжи после окончания спиртового брожения помещают в
питательную среду и выращивают 12-20 часов. Далее клетки
отделяют от культуральной жидкости, прибавляют антиоксидант,
сушат, обрабатывают УФ-светом для в них получения витамина D2.
Также УФ применяют на этапе — выделение целевого продукта
кристаллизацией: спиртовой экстракт гидролизата биомассы клеток
продуцента сгущают, полученный липидный концентрат омыляют
натрия гидроксидом, перекристаллизуют при температуре 0°С, сушат,
растворяют в эфире и снова облучают УФ-светом для получения
кристаллического витамина D
2
Для получения кристаллического витамина D
биомассу клеток
подвергают гидролизу раствором соляной кислоты при температуре
110°С. Гидролизат обрабатывают этанолом при температуре 75 °С и
после охлаждения фильтруют для получения спиртового экстракт
Перспективно использование в качестве продуцента эргостерина
грибов рода Candida- Candida maltosa, растущих на углеводородных
средах. Сухую биомассу грибов экстрагируют петролейным эфиром,
полученная липидная фракция называется «микробный жир», из
торой может быть выделен не только эргостерин, но и убихиноны и
другие жирорастворимые соединения.
Убихиноны (коферменты Q), участвуют в процессах тканевого
дыхания и окислительного фосфорилирования.
Ответ к задаче №44
Аскорбиновая кислота (вит.С) получают в промышленности по методу
Рейхштейна.
Согласно данному методу, процесс состоит из 6 стадий:
1 стадия — получение D-сорбита из D-глюкозы (полученной из крахмала)
методом каталитического восстановления водородом.
2 стадия — Получение L-сорбозы из D-сорбита методом глубинного
аэробного окисления уксуснокислыми бактериями
(биотехнологическая)
3 стадия - получение диацетон-L-сорбозы из L-сорбозы путем ее
ацетонирования.
��59 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;метилдигоксин (за счет реакции 12-гидроксилирования,
катализируемой ферментом, находящимся в клетках Digitalis lanata).
Ответ к задаче №41
1. Женьшень.
2. Обладает адаптогенным действием. Применяется при гипотонии, усталости,
неврастении, в период реконвалесценции после болезни, сниженной
работоспособности
.
Ответ к задаче №42
Получен витамин
рибофлавин В
.
1.
Технологическая схема получения рибофлавина:
-1. Подготовка биообъекта продуцента: генно-инженерного штамма
Bacillus substilis
-2. Подготовка и стерилизация оборудования и коммуникаций
-3. Подготовка и стерилизация субстрата
-4. Подготовка и стерилизация газового потока
-5. Культивирование биообъекта
-6. Выделение целевого продукта
-6.1. Обработка культуральной суспензии
-6.2. Разделение культуральной суспензии
-6.3. Выделение индивидуального вещества по растворимости в
щелочах и кислотах
-7. Обезвоживание целевого продукта
-8. Анализ целевого продукта
УМО-9. Фасовка, упаковка, маркировка лекарственной субстанции
-10. Биологическая очистка отходов.
2. Методами генной инженерии в России сконструирован штамм
продуцента Bacillus substilis. Для получения штамма с нарушенной
регуляцией синтеза витамина В
отбирали клоны, устойчивые к аналогу
целевого продукта. В качестве аналога использовали розеофлавин.
Штаммы, устойчивые к розеофлавину, обладают способностью к
сверхсинтезу витамина В
. В эти мутанты дополнительно введены
мутантные гены, влияющие на эффективность усвоения углеводов и
пуриновых метаболитов. Штамм Bacillus substili содержит структурные
гены, контролирующие биосинтез витамина В
, и их операторы в
пределах одного оперона. Генно-инженерный штамм Bacillus substilis
синтезирует рибофлавин в три раза быстрее, чем другие продуценты и
более устойчив к экзогенной контаминации.
. Для промышленного получения витамина В
используют также сильные
сверхпродуценты - дрожжеподобные грибы группы аскомицетов
Eremothecium ashbyii , Ashbya gossypii. Ashbya gossypii
усовершенствован методами химического мутагенеза и селекции.
Вместе с тем, культура Ashbya gossypii имеет существенный
�� &#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;&#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;58 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;стимулировать переход к синтезу вторичных метаболитов и
увеличивать их выход.
Суспензионные культуры используют для промышленного получения
вторичных метаболитов. Вещества, продуцируемые растительными
клетками используются в медицине, парфюмерной промышленности,
растениеводстве и других отраслях промышленности. К ним относятся:
алкалоиды, терпеноиды, гликозиды, полифенолы, полисахариды,
эфирные масла, пигменты, антиканцерогены (птотецин, харрингтонин),
пептиды (ингибиторы фитовирусов). В настоящее время в разных
странах около ста видов растений используется в биосинтетической
промышленности для получения экономически важных веществ, среди
них — женьшень, раувольфия змеиная, стевия, табак, наперстянка
шерстистая и пурпурная, диоскорея дельтовидная, воробейник,
беладонна, паслен дольчатый, дурман обыкновенный, ландыш майский,
клещевина, агава, мак снотворный и др.
Ответ к задаче №40
Носители для иммобилизации растительных клеток: альгинат кальция;
агарозные шарики; трехмерные сетчатые структуры из нейлона,
порошкового металла, полиуретана или адсорбируют в них. Носитель с
клетками помещают в питательную среду, клетки при этом остаются
живыми.
Нет, иммобилизованные клетки прекращают рост, но продолжают синтез
метаболитов, выделяя их в среду.
Иммобилизованные клетки растений по сравнению с суспензионными
культурами имеют следующие преимущества:
многократное использование;
четкое отделение биомассы от продуктов метаболизма;
увеличение продолжительности культивирования на стадии активного
биосинтеза;
получение большего количества вторичных метаболитов;
сокращение времени ферментации;
увеличение срока работы клеток (иммобилизованные клетки с низкой
скоростью роста способны к интенсивной выработке метаболитов).
Недифференцированные культуры клеток Digitalis lanata (продуцент)
сами по себе не образуют сердечных гликозидов, но могут
осуществлять реакции биотрансформации субстратов, добавленных в
питательную среду. Растения наперстянки (Digitalis lanata) в большом
количестве синтезируют дигитоксин вместо необходимого дигоксина.
Для соответствующей биотрансформации с успехом используют
недифференцированную суспензионную культуру наперстянки.
Иммобилизованные клетки этой культуры способны долгое время с
постоянной скоростью трансформировать (3-метилдигитоксин в бета-
��57 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;Ответ к задаче №38
Клеточную суспензию получают, помещая каллусную ткань в колбу с
жидкой питательной средой. Суспензия перемешивается в колбе на
качалке, имеющей скорость перемешивания 100 - 120 об/мин. При
первом переносе на свежую среду удаляют крупные кусочки исходного
каллуса и крупные агрегаты, фильтруя через 1 - 2 слоя марли,
нейлоновые сита, шприц с соответствующим отверстием. Для
инициализации суспензионной культуры необходимо 2 - 3г свежей
массы каллусной культуры на 60 - 100 мл жидкой питательной среды.
Однако для каждой линии культуры клеток существует минимальный
объем инокулята, при меньшем размере которого культура не растет.
фазы роста: 1- латентная, или лаг-фаза, где видимый рост не
наблюдается ни по одному из критериев; 2 - экспоненциальная, рост с
ускорением; 3 - линейная, где скорость роста постоянна; 4 - фаза
замедленного роста; 5 - стационарная фаза; 6 - фаза деградации клеток.
Для глубинного культивирования растительных клеток применимы
способы, разработанные в микробиологии. Различают два вида систем
культивирования: открытую и закрытую.
Для закрытой системы характерен периодический режим выращивания.
Клеточная масса (инокулят) помещается в определенный объем среды.
Система закрыта по всем параметрам, кроме газов, до конца
выращивания. Периодически подается свежая питательная среда, а
старая удаляется в том же объеме. Клетки остаются в системе в течение
всего цикла выращивания.
Открытые (проточные) культуры характеризуются поступлением
свежей питательной среды, при котором отбирается не только старая
питательная среда, но и часть урожая клеточной массы.
Наиболее изучено и распространено закрытое глубинное
культивирование. Для аэрации и перешивания используют различную
аппаратуру: роллеры, качалки, магнитные мешалки и т.д. Очень
большое значение для роста и биосинтеза клеток in vitro имеют
технические характеристики систем культивирования. При
масштабировании от небольших по объему культур в колбах до
больших многолитровых ферментеров меняются многие параметры
культивирования, в частности аэрация и перемешиваемость.
Ответ к задаче №39
Накопление вторичных метаболитов возрастает в фазе замедленного
роста клеточной популяции и достигает максимума в стационарной
фазе.
Механизмы и условия, блокирующие активный рост клеток и
клеточную пролиферацию, одновременно активируют ферменты
вторичного метаболизма. Неспецифические стрессовые условия,
воздействующие на клетки в конце экспоненциальной фазы, могут
�� &#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;&#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;56 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;продолжительность действия в зависимости от наличия и размера
кристаллов инсулина. Хумулин Р, Хумулин Н, Хумулин Л, Хумулин У.
Ответ к задаче №36
1. Достоинства пекарских дрожжей как продуцента рекомбинантных белков:
непатогенный микроорганизм,
наличие мощной генетической системы, способной к экспрессии
эукариотических и прокариотических генов;
способность к посттрансляционной модификации РНК
(сплайсингу);
способность гликозилировать белки.
Биотехнологическое производство инсулина по технологии фирмы
Novo (Дания).
Препараты фирмы «Ново Нордиск» поступают на фармацевтический
рынок под различными названиями в зависимости от продолжительности
действия: Актрапид НМ - инсулин растворимый человеческий короткого
действия, Протофан НМ - изофан-инсулин средней продолжительности
действия, Монотард НМ - суспензия средней продолжительности действия,
содержащая 30% аморфного и 70% кристаллического цинк-инсулина,
Ультратард НМ -
суспензия цинк-инсулина длительного действия,
Актрафан НМ -
препарат двухфазного действия, содержащий смесь 30%
растворимого и 70% изофан-инсулина.
Ответ к задаче №37
1. Ген синтеза проинсулина получают ферментативным методом на основе
м-РНК выделенной из клеток островков Лангерганса поджелудочной железы
человека.
2. Так как в качестве вектора используют Scpl -
ухмикронную плазмиду,
содержащую в качестве гена-маркера ген синтеза аминокислоты лейцин, а в
качестве сильного промотора - промотор лактазного оперона. Для
эффективной трансформации рекомбинантной ДНК клетки дрожжей,
ауксотрофные по лейцину, подвергают ферментативному
сферопластированию. Сферопласты Saccharomyces cerevisiae и
рекомбинантные ДНК инкубируют в присутствии полиэтиленгликоля и
кальция хлорида. Селекцию трансформированных сахаромицетов проводят
на питательной среде, не содержащей аминокислоты лейцин, в результате
выживают только те клоны, которые несут интактную плазмиду или усвоили
рекомбинантную ДНК, несущую ген синтеза аминокислоты лейцин.
3.Культивирование продуцентов прекурсора инсулина ведут глубинным
методом на питательной среде с мелассой.
4.Далее проинсулин инсулина подвергают биоконверсии по реакции
транспептидации, используя трипсин и бета-карбоксипептидазу с целью
отщепления пептида С и получения молекулы инсулина.
��55 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;Экстракты разрушенных клеток можно фракционировать, подвергая их
высокоскоростному центрифугированию. При ультрацентрифугировании
различные фракции седиментируют с различной скоростью и образуют
отдельные полосы, которые можно выделить.
Электрофорез – метод разделения белков и нуклеиновых кислот в свободном
водном растворе и пористом матриксе, в качестве которого можно
использовать полисахариды. Биомолекулы обычно несут суммарный
положительный или отрицательный заряд, обусловленный наличием на и
поверхности положительно или отрицательно заряженных групп
аминокислот.
Ответ к задаче №35
Рекомбинантные белки растворяют в растворе мочевины, осветляют на
сепараторе, очищают методами ультрафильтрации и ионообменной
хроматографии.
Химический гидролиз цепей А-бета-галактозидазы и В-бета-
галактозидазы проводят бромцианом, который расщепляет белки по
остатку метионина, то есть цепи А и В отделяют от бета-
галактозидазы. Далее цепи А и В объединяют методом сульфолиза, и
белок подвергают ренатурации.
Производство инсулина по технологии фирмы «Eli lilly» имеет ряд
недостатков:
Escherichia coli - контаминант, что требует контроль и защиту
персонала, стерилизацию отходов и воды;
Escherichia coli образует внутриклеточный предшественник инсулина,
о вызывает необходимость проводить дезинтеграцию клеток,
очистку гомогенизатора клеток от клеточной стенки;
Клеточная стенка Escherichia coli содержит эндокатин, что вызывает
делать тщательную очистку продукта.
4. Технологические приемы, используемые для защиты персонала,
производственного процесса, отходов и окружающей среды от
контаминации клетками Escherichia coli:
В хромосому Escherichia coli вносят дефект (по синтезу витаминов
или аминокислот), присутствие гена-инвалида обеспечивает
размножение микроорганизма на среде, которая создается в
ферментаторе, при попадании в окружающую среду такой
микроорганизм погибает.
Синтез при пониженном давлении (ниже атмосферного), что
препятствует выходу в окружающую среду.
Фильтры на системах выброса.
Стерилизация ферментаторов и системы трубопровода после
каждого технологического цикла.
Препараты фирмы поступают на фармацевтический рынок под
названием Хумулин (Eli lilly, США) и имеют различную
�� &#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;&#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;54 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;для обеспечения устойчивых, воспроизводимых результатов в
аналитических системах. Во-вторых, химическая модификация
ферментов способна приводить к существенным изменениям их
свойств, таких как субстратная специфичность, каталитическая
активность и стабильность. При химической модификации фермента
его активный центр желательно защищать. При сопоставлении
различных приемов иммобилизации химические методы для
крупномасштабных биотехнологических процессов кажутся
малопривлекательными из-за сложности и дороговизны, поэтому в
промышленных процессах обычно используются методы физической
иммобилизации.
Ответ к задаче №3
4
1. Для выделения и очистки продуктов, находящихся внутри клеток
продуцента (например интерферонов, гормонов) вводится стадия разрушения
клеточных оболочек (дезинтеграция биомассы).
2. Освобождение от растворимых веществ производят несколькими
способами:
а. Осаждение – физическое (нагревание, охлаждение, разбавление,
концентрирование) или химическое (с помощью органических и
неорганических веществ). При разных количествах растворителя и разных
значения рН осаждаются разные фракции. Пример: 50% этанол осаждает
80% протеазы и 3-5% амилазы, 70% спирт осаждает 98% амилазы.
б. Высаливание - гидратируются диссоциирующие ионы неорганических
солей. Как наиболее д
ый реагент используют сульфат аммония. Также
применяют сульфаты натрия, магния и фосфат калия.
в. Экстракция. При твердожидкофазной экстракции вещество из твердой
фазы переходит в жидкую, при жидкожидкофазной – из одной жидкости в
другую (например, хлорофилл из спиртовой вытяжки переходит в бензин).
Для извлечения антибиотиков, витаминов, каротиноидов, липидов
применяют жидкожидкофазную экстракцию, когда культуральную жидкость
смешивают с органическими растворителями.
г. Адсорбция – частный случай экстракции, когда экстрагирующий агент –
твердое тело. Адсорбция применяется для веществ, имеющих
функциональные группы, заряженные положительно или отрицательно. В
качестве адсорбента используют иониты на основе целлюлозы: - катионит -
карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ); - анионит - диэтиламиноэтилцеллюлоза
(ДЭАЭ), а также сефадексы на основе декстрана и т.д. Адсорбция идет по
ионообменному механизму.
3. Более тонкую очистку веществ осуществляют несколькими способами:
хроматография на бумаге, хроматография в тонком слое или тонкослойная
хроматография, колоночная хроматография, ионообменная хроматография,
гидрофобная хроматография, хроматография гель-фильтрацией, аффинная
хроматография, высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЖХ).
��53 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;Водный раствор фермента можно включать внутрь микрокапсул,
представляющих собой замкнутые сферические пузырьки с тонкой
полимерной стенкой (микрокапсулирование). При двойном
эмульгировании получается водная эмульсия из капель органического
раствора полимера, содержащих, в свою очередь, еще более мелкие
капли водного раствора фермента. Через некоторое время
растворитель затвердевает, образуя сферические полимерные частицы
с иммобилизованным в них ферментом. Если вместо
водонерастворимого отвердевающего полимера используются жидкие
углеводороды с высокой молекулярной массой, метод называется
иммобилизацией путем включения в жидкие мембраны. К
модификациям метода иммобилизации ферментов с использованием
полупроницаемых оболочек относятся также включение в волокна
(при этом вместо капель, содержащих ферменты, получаются нити)
включение в липосомы. Применение систем мембранного типа
позволяет получать иммобилизованные препараты с высоким
содержанием фермента. Благодаря высокому отношению поверхности
к объему и малой толщине мембраны удается избежать значительных
диффузионных ограничений скорости ферментативных реакций.
Основной недостаток мембранных систем - невозможность
ферментативного превращения высокомолекулярных субстратов.
При иммобилизации ферментов с использование систем двухфазного
типа ограничение свободы перемещения фермента в объеме системы
достигается благодаря его способности растворяться только в одной
из фаз. Природа фаз подбирается таким образом, что продукт
накапливается в той из них, где фермент отсутствует. После
завершения реакции эту фазу отделяют и извлекают из нее продукт, а
фазу, содержащую фермент, вновь используют для проведения
очередного процесса. Одним из важнейших преимуществ систем
двухфазного типа является то, что они позволяют осуществлять
ферментативные превращения макромолекулярных субстратов,
которые невозможны при применении жестких носителей с
ограниченным размером пор.
Главным отличительным признаком химических методов
иммобилизации является то, что путем химического взаимодействия
на структуру фермента в его молекуле создаются новые ковалентные
связи, в частности между белком и носителем. Препараты
иммобилизованных ферментов, полученные с применением
химических методов, обладают по крайней мере двумя важными
достоинствами. Во-первых, ковалентная связь фермента с носителем
обеспечивает высокую прочность образующегося конъюгата. При
широком варьировании таких условий, как рН и температура,
фермент не десорбируется с носителя и не загрязняет целевых
продуктов катализируемой им реакции. Это особенно важно при
реализации процессов медицинского и пищевого назначения, а также
�� &#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;&#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;52 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;4. Суть этого метода иммобилизации путем включения в гели состоит в
том, что молекулы фермента включаются в трехмерную сетку из тесно
переплетенных полимерных цепей, образующих гель. Среднее расстояние
между соседними цепями в геле меньше размера молекулы включенного
фермента, поэтому он не может покинуть полимерную матрицу и выйти в
окружающий раствор, т.е. находится в иммобилизованном состоянии.
Дополнительный вклад в удерживание фермента в сетке геля могут вносить
также ионные и водородные связи между молекулой фермента и
окружающими ее полимерными цепями. Пространство между полимерными
цепями в геле заполнено водой, на долю которой обычно приходится
значительная часть всего объема геля. Например, широко применяемые гели
полимеров акриловой кислоты в зависимости от концентрации полимера и
его природы содержат от 50 до 90% воды.
Ответ к задаче №3
3
Для иммобилизации ферментов в геле существует два основных
способа. При одном из них фермент помещают в водный раствор
мономера, а затем проводят полимеризацию, в результате чего
образуется полимерный гель с включенными в него молекулами
фермента. В реакционную смесь часто добавляют также
бифункциональные (содержащие в молекуле две двойные связи)
сшивающие агенты, которые придают образующемуся полимеру
структуру трехмерной сетки. В другом случае фермент вносят в
раствор готового полимера, который затем каким-либо образом
переводят в гелеобразное состояние. Способ иммобилизации
ферментов путем включения в полимерный гель позволяет создавать
препараты любой геометрической конфигурации, обеспечивая при
этом равномерное распределение биокатализатора в объеме носителя.
Метод универсален, применим для иммобилизации практически
любых ферментов, полиферментных систем, клеточных фрагментов и
клеток. Фермент, включенный в гель, стабилен, надежно защищен от
инактивации вследствие бактериального заражения, так как крупные
клетки бактерий не могут проникнуть в мелкопористую полимерную
матрицу. В то же время, эта матрица может создавать значительные
препятствия для диффузии субстрата к ферменту, снижая
каталитическую эффективность иммобилизованного препарата,
поэтому для высокомолекулярных субстратов данный метод
иммобилизации не применим вообще.
Общий принцип иммобилизации ферментов с использованием
мембран заключается в том, что водный раствор фермента отделяется
от водного раствора субстрата полупроницаемой перегородкой.
Полупроницаемая мембрана легко пропускает небольшие молекулы
субстрата, но непреодолима для крупных молекул фермента.
Существующие модификации этого метода различаются лишь
способами получения полупроницаемой мембраны и ее природой.
��51 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;этапах могут тормозить рост биомассы продуцента, поэтому часто свежая
среда или некоторые
компоненты вводятся в ферментер на стадии
активного роста. Температурный оптимум находится в интервале 22-
С.
В современных технологических процессах ведется непрерывное
автоматическое определение содержания в среде углеводов, количества
образовавшихся метаболитов и концентрации клеток. Данные поступают в
ЭВМ, которая определяет стратегию коррекции процесса и автоматически
регулирует его.
Выделение. В мицелии тр
хсуточной культуры обычно остается не
более 15% ферментов. Остальные выделяются в окружающую клетки
жидкую среду. В этом случае препараты ферментов выделяют из
фильтратов после отделения биомассы.
Получение товарной формы.
Ответ к задаче №3
Существует два основных метода иммобилизации ферментов: физический и
химический.
Физическая иммобилизация ферментов представляет собо
включение фермента в такую среду, в которой для него доступной является
лишь ограниченная часть общего объема. При физической иммобилизации
фермент не связан с носителем ковалентными связями. Существует четыре
типа связывания ферментов:
- адсорбция на нерастворимых носителях;
- включение в поры геля;
- пространственное отделение фермента от остального объема реакционной
системы с помощью полупроницаемой перегородки (мембраны);
- включение в двухфазную среду, где фермент растворим и может находиться
лько в одной из фаз.
Удерживание адсорбированной молекулы фермента на поверхности
носителя может обеспечиваться за счет неспецифических ван-дер-ваальсовых
взаимодействий, водородных связей, электростатических и гидрофобных
взаимодействий между носителем и поверхностными группами белка. Вклад
каждого из типов связывания зависит от химической природы носителя и
функциональных групп на поверхности молекулы фермента.
Преимуществом метода адсорбционной иммобилизации является
доступность и дешевизна сорбентов, выступающих в роли носителей. Им
также можно придать любую конфигурацию и обеспечить требуемую
пористость. Важным фактор - простота применяемых методик. При
адсорбционном связывании можно решить и проблему очистки фермента, так
как связывание белка с носителем во многих случаях достаточно
специфическое. К сожалению, прочность связывания фермента с носителем
не всегда достаточно высока, что ограничивает применение метода. К
недостаткам адсорбционной иммобилизации следует отнести отсутствие
общих рекомендаций, позволяющих сделать правильный выбор носителя и
оптимальных условий иммобилизации конкретного фермента.
�� &#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;&#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;50 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;2. Отделение твердой фазы возможно методом фильтрации. Так как
фильтруемая суспензия склонная к гелеобразованию, то производительность
фильтров быстро падает. Предотвратить это можно добавлением в смесь или
на фильтрующую ткань размолотых вулканических пород, содержащих
оксиды кремния и алюминия, тогда осадки приобретают пористую структуру.
Некоторые виды биомассы отделяют центрифугированием. Осаждение
взвешенных частиц происходит под действием центробежной силы. После
разделения образуется 2 фракции: биомасса (твердая) и культуральная
жидкость.
3. Культуральная жидкость перерабатывается путем экстракции, ионообмена,
кристаллизации или с помощью микро- и ультрафильтрации через
полимерные мембраны со специально подобранным размером пор.
Ответ к задаче №31
.
При глубинном методе микроорганизмы выращиваются в жидкой
питательной среде.
Технически более совершенен, чем поверхностный, так как легко
поддается автоматизации и механизации.
Концентрация фермента в среде при глубинном культивировании
обычно значительно ниже, чем в водных экстрактах поверхностной
культуры. Это вызывает необходимость предварительного
концентрирования фильтрата перед его выделением.
При глубинном культивировании продуцентов ферментов выделяют
следующие этапы:
Приготовление питательных сред. Некоторые предварительно
измельчают, отваривают или гидролитически расщепляют. Готовые к
растворению компоненты подают при постоянном помешивании в емкость
для приготовления среды в определенной последовательности.
Стерилизацию среды проводят либо путем микрофильтрации с
помощью полупроницаемых мембран, либо при помощи высоких
температур. Время обработки в этом случае зависит как от интенсивности
фактора, так и от уровня обсемененности объекта. Стерилизуются также
все коммуникации и аппараты. Воздух очищается до и после аэрирования.
До - потому что содержит частицы пыли органической и неорганической
природы, после - так как несет клетки продуцента.
лучение засевного материала. Для засева питательной среды
материал готовят также глубинным методом. Вид его зависит от
продуцента: для грибов это мицелиальная вегетативная масса, для
бактерий - молодая растущая культура на начальной ста
спорообразования. Получение посевного материала состоит в увеличении
массы продуцента в 3-4 стадии. Объем посевного материала зависит от
физиологических особенностей продуцента.
Производственное культивирование. Биосинтез ферментов в глубинной
культуре протекает в течение 2-4 суток при непрерывной подаче воздуха и
перемешивании. Высокая концентрация питательных веществ на первых
��49 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;стерилизующего агента из питательной среды после гибели микрофлоры до
внесения инокулята. Химические антисептики должны быть не только
высокоэффективны, но и легко разлагаемы при изменении условий после
завершения стерилизации. К числу лучших относится пропиолактон,
обладающий сильным бактерицидным действием и легко гидролизуемый в
молочную кислоту.
4. Нет, метанол, этанол, концентрированная уксусная кислота не требует
стерилизации, так как они сами обладают асептическим действием. В этом
случае ограничиваются стерилизацией прочих элементов питательной среды.
5. Поддержание чистой культуры и получение засевной дозы
В технологическом процессе используются полезные свойства штамма,
следовательно, необходимо сохранять и, если возможно, улучшать его
производственные качества. Поэтому в биотехнологическом производстве
имеется отделение чистой культуры, в задачей которого является постоянное
и надежное воспроизведение полезных свойств продуцента, найденных или
достигнутых в свое время в ходе лабораторных исследований. По мере
необходимости из отделения чистой культуры поступает заданная масса
инокулята, идущая в производство.
Посевные дозы выращиваются последовательно в колбах и бутылях на 10-
литров, находящихся на качалках или просто в термостатируемом
помещении, и далее в последовательности ферментеров объемом (по
необходимости) 10, 100, 500 и 1000 литров, в которых осуществляется
перемешивание, аэрация и термостатирование культуральной жидкости с
клетками.
При периодическом процессе культивирования (при производстве
метаболитов) в отделении чистой культуры готовят засевную дозу клеток для
каждой из операций основного производства. При непрерывном
производстве кормового белка этого не требуется, однако для повышения
качества продукта предпочитают время от времени вводить клетки штамма-
продуцента из отделения чистой культуры. Для этого в отделении имеется
ферментационная часть, где производится выращивание достаточно крупных
партий микроорганизма продуцента.
Ответ к задаче №30.
1. Сахаромицеты (хлебопекарные дрожжи) имеют относительно большие
клетки и способны флотироваться, поэтому после сгущения биомассы
флотацией их отделяют на обычных барабанных вакуум-фильтрах. В
дальнейшем биомассу, снятую с фильтра, подвергают прессованию и
получают продукт с высоким содержанием живых клеток.
Дрожжи же рода Candida плохо флотируются и фильтруются. Поэтому
дрожжи, растущие на углеводородах, а также бактерии-продуценты белка на
основе метана и метанола, на первом этапе сепарируются в несколько
ступеней. Оставшаяся вода удаляется путем выпаривания, а все компоненты
жидкой фазы остаются в конечном продукте.
�� &#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;&#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;48 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;2. Технология приготовления питательных сред для биосинтеза.
Основу питательных сред для культивирования микроорганизмов составляют
источники углерода. Кроме углерода клетки микроорганизмов в процессе
роста испытывают потребность в азоте, фосфоре, макро- и микроэлементах.
Все вещества этого рода находятся в питательных средах в виде солей,
ключение составляют среды, где азот и фосфор могут усваиваться
растущими культурами из органических источников, например автолизатов
или гидролизатов микробного или животного происхождения.
Жидкие и твердые источники углерода обычно вводят в уже готовую
питательную среду непосредственно перед ферментацией, так как это
устраняет опасность заражения посторонней микрофлорой, вероятность
которого возрастает при хранении готовой питательной смеси. При
периодической ферментации в начале процесса инокулят (засевная доза
микроорганизмов) вносится в уже готовую питательную среду, содержащую
все компоненты. Поэтому источники углерода вводят непосредственно перед
засевом или отдельные компоненты среды вводят по мере потребления их
культурой, поддерживая в ферментере некоторую оптимальную их
концентрацию, которая на разных этапах ферментации может меняться по
определенному закону.
3. Важнейшим элементом приготовления питательных сред является
соблюдение требований асептики. Это либо создание заданного значения рН,
еспечивающего подавление посторонних микроорганизмов, либо полная
стерилизация всех подаваемых потоков и самого биореактора.
Для стерилизации газовых потоков (в первую очередь воздуха) используют
процесс фильтрации через специальные волокнистые фильтры с
последовательно расположенными фильтрующими элементами.
Фильтрующий материал периодически стерилизуется подачей острого пара в
отключенный фильтр через заданные промежутки времени.
Метод фильтрации основан на способности полупроницаемых мембран с
крупными порами пропускать жидкую фазу и концентрировать клетки
микроорганизмов. В принципе этот метод является идеальным для
стерилизации термически неустойчивых жидких и газовых средств,
поскольку может осуществляться при низкой температуре и требует лишь
градиента давления по разные стороны мембраны. Основная трудность -
наличие термостойких мембран, способных выдерживать многократную
стерилизацию их самих. В настоящее время эта проблема решается путем
применения термостойких полимеров в производстве мембран.
дкостные потоки стерилизуют различными методами, из которых
практический интерес представляют термический, радиационный,
фильтрационный и химический. Термический - самый распространенный,
при температурах порядка 120-
С. Радиационный -
-излучение,
применяется редко из-за трудностей создания и эксплуатации мощных
источников этого излучения.
В отдельных случаях применяют химические стерилизующие агенты.
Основная проблема в этом случае - необходимость устранения
��47 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;тем, что свойство образовывать избыточные количества антибиотика
достаточно нестойко и легко утрачивается полностью или частично.
3. Необходимо ли учитывать требования GMP при биосинтезе антибиотиков?
- да.
Ответ к задаче №29
.
1. Существует 6 стадий биотехнологического производства:
1. Приготовление и стерилизацию питательных сред;
Приготовление посевного материала;
Культивирование;
Обработку культуральной жидкости;
Выделение и очистку биопрепарата;
Получение готовой продукции.
Две начальные стадии включают подготовку сырья и биологически
действующего начала. В процессах инженерной энзимологии они обычно
состоят из приготовления раствора субстрата с заданными свойствами (рН,
температура, концентрация) и подготовки партии ферментного препарата
данного типа, ферментного или иммобилизованного. При осуществлении
микробиологического синтеза необходимы стадии приготовления
питательной среды и поддержания чистой культуры, которая могла бы
постоянно или по мере необходимости использоваться в процессе.
Поддержание чистой культуры штамма-продуцента - главная задача любого
микробиологического производства, поскольку высокоактивный, не
претерпевший нежелательных изменений штамм может служить гарантией
получения целевого продукта с заданными свойствами.
Третья стадия - стадия ферментации, на которой происходит образование
целевого продукта. На этой стадии идет микробиологическое превращение
компонентов питательной среды сначала в биомассу, затем, если это
необходимо, в целевой метаболит.
На четвертом и пятом этапе из культуральной жидкости выделяют и
очищают целевые продукты. Для промышленных микробиологических
процессов характерно, как правило, образование очень разбавленных
растворов и суспензий, содержащих, помимо целевого, большое количество
других веществ. При этом приходится разделять смеси веществ очень
близкой природы, находящихся в растворе в сравнимых концентрациях,
весьма лабильных, легко подвергающихся термической деструкции.
Заключительная стадия биотехнологического производства - приготовление
товарных форм продуктов. Общим свойством большинства продуктов
микробиологического синтеза является их недостаточная стойкость к
хранению, поскольку они склонны к разложению и в таком виде
представляют прекрасную среду для развития посторонней микрофлоры. Это
заставляет технологов принимать специальные меры для повышения
сохранности препаратов промышленной биотехнологии. Кроме того,
препараты для медицинских целей требуют специальных решений на стадии
расфасовки и укупорки, так должны быть стерильными.
�� &#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;&#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;46 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;определенных условиях многие из зрелых растительных клеток сохраняют
способность делиться, а в некоторых случаях даже вступить на новый путь
развития.
Ответ к задаче №27.
Рифампицин — полусинтетический антибиотик азамициновой
структуры для терапии туберкулеза.
Биотехнологический этап производства: Сверхпродуцент Nocardia
mediterranea помещен в ферментатор на жидкую питательную среду,
содержащую крахмал, соевую муку, кукурузный экстракт, хлорид натрия и
карбонат кальция. После завершения процесса культивирования целевой
продукт извлечен из культуральной жидкости органическим растворителем,
реэктрагирован в водную фазу и подвергнут распылительной сушке.
Химический этап производства: осуществляется в цехе химической
трансформации, в задании не описан.
Биообъект биотехнологического этапа: « … продуцент Nocardia mediterranea
обработан многократно ренгеновскими и ультрафиолетовыми лучами, а
также азотсодержащими веществами с селекцией на каждом этапе.
Ответ к задаче №28
.
Полимиксин В — антибиотик пептидной структуры для терапии грам(-
) инфекции, преимущественно, с поражением ЖКТ.
Продуцент и метод его совершенствования : почвенная споровая
бактерия Bacillus polimyxa обработан многократно ренгеновскими и
ультрафиолетовыми лучами,а также азотсодержащими веществами с
селекцией на каждом этапе, получен сверхпродуцент.
Методы выделения и очистки: Сверхпродуцент помещен в ферментатор на
жидкую питательную среду, содержащую крахмал, соевую муку, кукурузный
экстракт, минеральные соли. После завершения процесса культивирования
целевой продукт извлечен из культуральной жидкости и очищен методом
оинообменной хроматографии.
Способ сушки лекарственной субстанции: Целевой продукт высушен
распылительной сушкой.
1. Для чего стремятся получить сверхпродуцент? Штаммы продуцентов
антибиотиков, полученные в результате скрининга и совершенствованные
методом индуцированного мутагенеза или слиянием протопластов,
приобретают способность синтезировать метаболит в огромном количестве.
Такие промышленные мутантные штаммы носят название
«суперпродуценты» или «сверхпродуценты». Экономически более выгодно
использовать его по сравнению с продуцентом.
2. Свойства сверхпродуцентов: нестабильность высокой
продуктивности и сложный цикл развития.
Особенности хранения сверхпродуцентов: Сверхпродуценты
антибиотиков, созданные любым из описанных выше методов, требуют
особых условий хранения и периодической проверки активности в связи с
Escherichia coli - контаминант, что требует контроль и защиту
персонала, стерилизацию отходов и воды;
Escherichia coli образует внутриклеточный предшественник инсулина,
что вызывает необходимость проводить дезинтеграцию клеток,
очистку гомогенизатора клеток от клеточной стенки;
Клеточная стенка Escherichia coli содержит эндокатин, что вызывает
делать тщательную очистку продукта.
4. Технологические приемы, используемые для защиты персонала,
производственного процесса, отходов и окружающей среды от контаминации
клетками Escherichia coli:
В хромосому Escherichia coli вносят дефект (по синтезу витаминов или
аминокислот), присутствие гена-инвалида обеспечивает размножение
микроорганизма на среде, которая создается в ферментаторе, при
попадании в окружающую среду такой микроорганизм погибает.
Синтез при пониженном давлении (ниже атмосферного), что
препятствует выходу в окружающую среду.
Фильтры на системах выброса.
Стерилизация ферментаторов и системы трубопровода после каждого
технологического цикла.
5. Препараты фирмы поступают на фармацевтический рынок под названием
Хумулин (Eli lilly, США) и имеют различную продолжительность действия в
зависимости от наличия и размера кристаллов инсулина. Хумулин Р,
Хумулин Н, Хумулин Л, Хумулин У.
Ответ к задаче № 26
.
В цикле выращивания каллусной ткани клетки после ряда делений
приступают к росту растяжением, дифференцируются как зрелая каллусная
ткань и деградируют. Для того, чтобы не произошло старения, утраты
способности к делению и дальнейшему росту, а также отмирания каллусных
клеток, первичный каллус переносят на свежую питательную среду через 28 -
30 дней, то есть проводят пассирование или субкультивирование каллусной
ткани.
2. Возникновение физиологических и структурных различий между клетками
и тканями растений, связанное с их функциональной специализацией,
называют процессом
дифференциации
. Понятие «дифференциация» отражает
евращение эмбриональной, меристематической клетки в
специализированную. Меристематические клетки, однотипные по структуре
и функции, начинают развиваться различными путями, создавая ткани разных
органов.
3. У растений почти всякая дифференциация обратима при условии, если
дифференцированная клетка живая, в протопласте сохранилось ядро и не
образовалась вторичная оболочка. Даже такие высокоспециализированные
клетки, как микроспоры, с помощью ряда экспериментальных процедур
можно заставить пролиферировать и дать начало целому растению. Итак, в
�� &#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;&#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;44 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;3. Когда синтез параллелен росту культуры, продуктивность биомассы можно
увеличить методом генной инженерии за счет введения в клетку
многокопийных плазмид, содержащих гены биосинтеза целевой
аминокислоты, т.е. в результате увеличения генов, отвечающих за
ферменты синтеза аминокислот; или расширения потока предшественников
аминокислот. Такие ферментные системы в генноинженерных продуцентах
мобилизуют все ресурсы клетки на образование целевой аминокислоты в
ущерб росту биомассы и синтезу других клеточных компонентов. При этом
побочные продукты автоматически исчезают, продуктивность биомассы и
коэффициент использования субстрата существенно возрастают.
Ответ к задаче № 24
.
Мутуализм. Мутуализм - состояние системы, когда оба штамма в
смешанной культуре растут быстрее, чем в соответствующих чистых
культурах. Мутуализм включает несколько механизмов регуляции:
обмен факторами роста, обмен питательными веществами.
Симбиоз.
Тесные мутуалистически
связи, когда ни один из штаммов не может
существовать без взаимодействия с другим, называется симбиоз.
Комменсализм - состояние системы, когда в смешанной культуре
определенный вид преимущества получает второй вид. Комменсализм
формируется в следующих случаях, когда первый вид связывает вещество,
являющееся токсичным для второго, а второй вид не создает для первого
благоприятных условий или продукция соединений первым видом, которая
увеличивает рост второго вида.
Амменсализм - состояние системы, когда в результате взаимодействия
с первым видом, второй вид оказывается в менее выгодной ситуации, т.е.
рост одного вида подавляется в присутствии другого. Ингибирующий эффект
обусловлен:
синтезом токсичных веществ, что наблюдается у антибиотикопродуцентов;
поглощением незаменимых питательных веществ;
секрецией ферментов, разрушающих полимеры клеточной стенки.
Ответ к задаче № 25
.
Рекомбинантные белки растворяют в растворе мочевины, осветляют
на сепараторе, очищают методами ультрафильтрации и ионообменной
хроматографии.
Химический гидролиз цепей А-бета-галактозидазы и В-бета-
галактозидазы проводят бромцианом, который расщепляет белки по остатку
метионина, то есть цепи А и В отделяют от бета-галактозидазы. Далее цепи А
и В объединяют методом сульфолиза, и белок подвергают ренатурации.
3. Производство инсулина по технологии фирмы «Eli lilly» имеет ряд
недостатков:
��43 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;отдельности ни лизин, ни треонин не ингибируют активности
аспартаткиназы. Данное явление носит название совместное ингибирование.
Биотехнологи добиваются накопления целевой аминокислоты на уровне
управления активностью фермента путем блокирования процессов, ведущих
синтезу побочных аминокислот в разветвленной метаболической цепи.
Методом индуцированного мутагенеза получают мутанты двух типов.
Мутанты первого типа дефектны по структурному гену, детерминирующему
конформацию аспартаткиназы. В результате фермент теряет
чувствительность к высоким концентрациям одного из аллостерических
ингибиторо
- лизина. В мутантных клетках второго типа не синтезируется
гомосериндегидрогеназа, в результате чего блокируется синтез метионина и
треонина. Полученные штаммы микроорганизмов являются ауксотрофами по
треонину (метионину) и гомосерину, поэтому при выращивании мутантных
продуцентов в питательную среду вносят лимитирующие концентрации
треонина и метионина или треонина и гомосерина для накопления биомассы.
В период роста биомассы продуцента, пока эти аминокислоты присутствуют
в питательной среде, синтеза лизина не происходит. После того, как треонин
будет полностью использован на построение клеточных структур и исчерпает
свое влияние на рост биомассы, начинается синтез лизина.
Ответ к задаче №23
.
Продуцент Escherichia coli имеет специфические особенности регуляции
биосинтеза аминокислот. В его клетках отсутствует механизм
согласованного ингибирования, то есть лизин ингибирует активность своих
ферментов, а треонин - ферментов своей цепи. Вместе с тем, имеет место
согласованная репрессия
комплексом треонин - изолейцин, то есть
подавляется синтез комплекса треониновых ферментов Е
, Е
, Е
, Е
. По
отдельности названные аминокислоты не репрессируют комплекс
ферментов. Регуляторная область включает ферменты: Е
1
-
Аспартаткиназа,
-дигидродипиколинатсинтетаза, Е
-
гомосериндегидрогиназа, Е
- треонинсинтетаза, Е
, треониндезаминаза.
Сверхпродукция треонина штаммом кишечной палочки достигается в
результате следующих преобразований в клетке: мутационное изменение
алостерического центра аспартаткиназы, в результате чего фермент утратил
восприимчивость к треонину; либо- снижение в результате мутации
активности фермента Е5, обеспечивающего синтез изолейцина из треонина,
тем самым, вызывая у микроорганизма хроническое голодание по
изолейцину. В результате недостатка изолейцина согласованная репрессия
не включается, несмотря на избыток треонина. Также существует методом
генетической инженерии с включением в геном продуцента
дополнительных плазмид, содержащих выделеные треониновые опероны,
следовательно количество ферментов увеличилось в десятки раз по
сравнению с исходным штаммом.
�� &#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;&#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;42 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;и Propionibacterium shermanii),
Pseudomonas denitrificans, с помощью
метаногенных бактерий и с помощью продуцентов стрептомицетов.
В качестве продуцентов
используют различные мутантные штаммы
Propionibacterium freudenreichii и Propionibacterium shermanii.
Предпочтение отдается штаммам, способным к самостоятельному
синтезу 5,6-диметилбензимидазола. Технологически процесс при этом
является периодическим и состоит из двух стадий. На первой стадии
культуру выращивают в анаэробных условиях до полной утилизации
сахаров. Через 72 часа на второй стадии включают аэрацию и создают
условия для синтеза 5,6-ДМБ или вводят 5,6-ДМБ и соли кобальта в
ательную среду. Питательная среда содержит глюкозу или
инвертированную мелассу, сульфат аммония как источник азота,
кукурузный экстракт, содержащий молочную и пантотеновую кислоты
и усиливающий рост бактерий. Ферментацию ведут в одном
биореакторе, если стадия осуществляется в разных биореакторах, то
анаэробные выросшие клетки отделяют путем центрифугирования и
переводят в другой биореактор с аэрацией. Процесс происходит при
температуре 30°С, рН= 6,5-7. Основными направлениями
совершенствования штаммов микроорганизмов-продуцентов
цианокобаламина являются: увеличение продуктивности штаммов
микроорганизмов методами мутагенеза и селекции; увеличение
продуктивности штаммов микроорганизмов методом слияния
протопластов; увеличение продуктивности штаммов-продуцентов
методом генной инженерии; создание штаммов-продуцентов,
секретирующих витамин в культуральную жидкость; создание
штаммов-продуцентов, растущих на средах из непищевого сырья.
Целевой продукт экстрагируют подкисленной водой при температуре
-90°С и рН = 4,5-5,0 в качестве стабилизатора добавляя нитрит
натрия. Водный раствор витамина охлаждают, доводят рН до
нейтральных значений, коагулируют белки и фильтруют. Очистку
раствора проводят методом ионообменной хроматографии с
последующим элюированием раствором аммиака. Дополнительная
очистка проводится хроматографическим методом на колонках с
окисью алюминия с элюацией цианокобаламина водным раствором
ацетона.
Ответ к задаче №22
Продуценты лизина Согуnebacterium glutamicum и Brevibacterium flavum
лизин, треонин, метионин и промежуточно гомоцистеин, гомосерин
У типичных продуцентов лизина Согуnebacterium glutamicum, Brevibacterium
flavum фермент аспартаткиназа является белком, чувствительным по
принципу обратой связи при совместном действии треонина и лизина. При
накоплении в избыточной концентрации обоих конечных продуктов треонина
и лизина ингибируется фермент и синтез аминокислот останавливается. По
��41 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;1.
Технологическая схема получения рибофлавина:
-1. Подготовка биообъекта продуцента: генно-инженерного штамма
Bacillus substilis
-2. Подготовка и стерилизация оборудования и коммуникаций
-3. Подготовка и стерилизация субстрата
-4. Подготовка и стерилизация газового потока
-5. Культивирование биообъекта
-6. Выделение целевого продукта
-6.1. Обработка культуральной суспензии
-6.2. Разделение культуральной суспензии
-6.3. Выделение индивидуального вещества по растворимости в
щелочах и кислотах
-7. Обезвоживание целевого продукта
-8. Анализ целевого продукта
-9. Фасовка, упаковка, маркировка лекарственной субстанции
-10. Биологическая очистка отходов.
2. Методами генной инженерии в России сконструирован штамм
продуцента Bacillus substilis. Для получения штамма с нарушенной
регуляцией синтеза витамина В
бирали клоны, устойчивые к аналогу
целевого продукта. В качестве аналога использовали розеофлавин.
Штаммы, устойчивые к розеофлавину, обладают способностью к
сверхсинтезу витамина В
. В эти мутанты дополнительно введены
мутантные гены, влияющие на эффективность усвоения углеводов и
пуриновых метаболитов. Штамм Bacillus substili содержит структурные
гены, контролирующие биосинтез витамина В
, и их операторы в
пределах одного оперона. Генно-инженерный штамм Bacillus substilis
синтезирует рибофлавин в три раза быстрее, чем другие продуценты и
более устойчив к экзогенной контаминации.
3. Для промышленного получения витамина В
используют также сильные
сверхпродуценты - дрожжеподобные грибы группы аскомицетов
Eremothecium ashbyii , Ashbya gossypii. Ashbya gossyp
усовершенствован методами химического мутагенеза и селекции.
Вместе с тем, культура Ashbya gossypii имеет существенный
недостаток, а именно, нестабильность при хранении на твердых средах
во всем диапазоне температур (от комнатной до температуры
лиофилизации), что выражается в потере способности к сверхсинтезу
витамина. Для сохранения активности штамма постоянно проводится
селекция наиболее окрашенной в оранжевый цвет колонии.
Ответ к задаче №21.
витамин В
12
- цианокобаламин
нет
Также Витамин В
получают с использованием в качестве
продуцентов
пропионовокислых бактерий ( Propionibacterium freudenreichii
�� &#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;&#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;40 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;Культуры растительных клеток в биореакторах выращивают в одном из двух
режимов:
— периодическое культивирование, при котором по окончании процесса
биосинтеза откачивают и используют всю суспензию клеток;
— полупериодическое культивирование, при котором в биореактор
постоянно добавляют определенный объем свежей питательной среды и
одновременно забирают тот же объем либо клеточной суспензии (открытое
проточное культивирование), либо отработанной питательной среды,
оставляя при этом клеточную массу в реакторе (закрытое проточное
культивирование).
В основном растительные клетки выращивают в периодическом режиме.
Полупериодическое культивирование используют, когда показано, что
нарастание биомассы четко коррелирует с синтезом вторичных метаболитов.
Существуют также две разновидности открытого проточного
культивирования:
• турбидостат — автоматическое поддержание концентрации клеточной
биомассы в реакторе на одном уровне регулировкой скорости протока;
• хемостат — в биореактор с постоянной скоростью подается
питательный раствор при одновременном откачивании с той же скоростью
клеточной суспензии.
5. Активаторами матричной активности ДНК хроматина или активности
РНК–полимеразы являются фитогормоны. Рецепторные для фитогормонов
белки, локализованные в мембранах, по-видимому, оказывают влияние в
присутствии фитогормонов на структуру и функцию мембран. Возможно, это
обуславливает действие фитогормонов на генную активность.
Одним из важнейших гормонов, применяемых при культивировании in vitro
является ауксин, который активирует деление и растяжение клеток. Проникая
в клетки, ИУК связывается со специфическими рецепторами, оказывая
влияние на функциональную активность мембран, полирибосом и работу
ядерного аппарата. Установлено, что в плазмалемме ауксин
индуцирует
работу Н
-помпы, в результате чего матрикс клеточных стенок размягчается,
что является необходимым условием для роста и растяжения клеток.
Включенная Н
-помпа усиливает поглотительную активность тканей,
обогащенных ауксином. Предполагается, что поступление ауксина в клетку
способствует усилению секреции кислых гидролаз и полисахаридов,
необходимых для дальнейшего роста клеточных стенок. Под влиянием
ауксина уменьшается продолжительность различных периодов
митотического цикла.
Общим моментом в действии ауксинов на деление клеток является также
предварительное усиление синтеза и накопление РНК, синтеза и накопление
белка.
Ответ к задаче № 20
.
Получен витамин
рибофлавин В
.
��39 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;4. В зависимости от происхождения и условий выращивания каллусные ткани
бывают:
- рыхлые, сильно оводненные, легко распадающиеся на отдельные клетки;
- средней плотности, с хорошо выраженными меристематическими очагами;
- плотные, с зонами редуцированного камбия и сосудов.
Ответ к задаче № 19
.
1. Суспензионные культуры - отдельные клетки или группы клеток,
выращиваемые во взвешенном состоянии в жидкой среде. Представляют
собой относительно гомогенную популяцию клеток, которую легко
подвергнуть воздействию химических веществ.
2. В настоящее время промышленный синтез вторичных метаболитов на
основе суспензионных культур клеток является перспективным и
рентабельным, так как производство растительного сырья для него не
зависит ни от климатических факторов, ни от повреждения насекомыми.
Каллусные культуры выращивают на малых площадях и в дальнейшем
используют для синтеза соединений практически всех классов. Причем
выход вторичных метаболитов более высок по сравнению с их синтезом в
целых растениях. Использование технологий получения каллусных культур
из растительного сырья дает такие преимущества, как надежность и
стабильность по выходу биомассы и продуктов вторичного метаболизма, а
также возможность использования каллусной системы для иммобилизации с
последующей биотрансформацией. Недостаток только один —
необходимость применения ручного труда. Из сравнения каллусных и
суспензионных культур следует, что выход продуктов вторичного
метаболизма выше именно в каллусных культурах, но при этом управление
процессом культивирования легче осуществлять при работе с
суспензионными культурами.
3. Клеточную суспензию получают, помещая каллусную ткань в колбу с
жидкой питательной средой. Суспензия перемешивается в колбе на качалке,
имеющей скорость перемешивания 100 - 120 об/мин. При первом переносе на
свежую среду удаляют крупные кусочки исходного каллуса и крупные
агрегаты, фильтруя через 1 - 2 слоя марли, нейлоновые сита, шприц с
соответствующим отверстием. Для инициализации суспензионной культуры
необходимо 2 - 3 г свежей массы каллусной культуры на 60 - 100 мл жидкой
питательной среды. Однако для каждой линии культуры клеток существует
минимальный объем инокулята, при меньшем размере которого культура не
растет.
4. При промышленном выращивании суспензионных культур применяют
биореакторы, в которых процессы глубинного культивирования ведут к
увеличению биомассы и синтезу вторичных соединений.
Выделяют биореакторы, в которых суспензионная культура перемешивается
только за счет подачи воздуха, и биореакторы, в которых суспензионная
культура перемешивается механическим способом.
�� &#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;&#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;38 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;2. Каллусная клетка развивается аналогично другим клеткам, проходя
соответственно такие циклы, как деление, растяжение, дифференцировка,
старение и отмирание. Кривая роста каллусной ткани имеет S-образный
характер и включает пять фаз разной длительности у разных растений: 1 —
латентная (лаг-фаза — клетки адаптируются и готовятся к делению); 2 —
линейная (рост каллусной ткани идет с постоянной скоростью); 3 —
экспоненциальная (время максимальной митотической активности; рост
клетки ускорен, масса каллуса увеличивается); 4 — стационарная
(интенсивность деления резко снижается); 5 — отмирания
3. Да, протопласт- «голая» клетка потенциально способна восстанавливать
новую оболочку, делиться, образовывать клеточные агрегаты, из которых
можно получить клеточную культуру с новыми свойствами, а затем новое
растение - регенерант.
4. При получении каллусных культур сначала готовят эксплант — маленькие
— 4 мм) кусочки растительной ткани, не утратившие способность к
репродукции. Этот растительный материал тщательно моют, стерилизуют
96% спиртом или 0,1 % сулемой, а затем снова тщательно промывают
дистиллированной водой и помещают на синтетическую агаризованную
питательную среду. Сосуды закрывают ватно-марлевыми тампонами. Для
образования каллуса и роста ткани сосуды переносят в темное помещение,
где поддерживают определенную температуру (24—26 °С) и влажность (65
— 70%), при этом через 2 — 3 нед на раневой поверхности образуется
рвичный каллус.
Ответ к задаче № 18.
1. Этот метод, названный микроклональным размножением, позволяет от
одной меристемы получить (регенерировать) достаточно большое
количество новых растений, в том числе и в культуре in vitro. Обязательным
условием для микроклонального размножения является идентичность
полученного растительного материала исходному материнскому растению.
Для обеспечения максимальной генетической стабильности клонируемого
материала в качестве исходного экспланта используют молодые
слабодифференцированные ткани, в частности кончики молодых стеблей и
корней, пазушные почки, зародыши, части молодых проростков и другие
меристематические ткани.
2. Каллусная ткань - один из видов клеточной дифференцировки, возникает
путем неорганизованной пролиферации дедифференцированных клеток
органов растения. У растений в природе каллусная ткань возникает в
исключительных обстоятельствах (например, при травмах) и функционирует
непродолжительное время. Эта ткань защищает место поранения, может
накапливать питательные вещества для анатомической регенерации или
регенерации утраченного органа.
3. 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д), a-нафтилуксусную кислоту
(НУК) используют в качестве ауксинов.
��37 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;смеси в большом избытке. После отщепления защитной О-трет-бутильной
группы получают инсулин человека.
3. Преимущества человеческого генно-инженерного инсулина человека:
Улучшение контроля гликемии связанное с отсутствием
инактивирования инсулина под действием антител, циркулирующих в
крови, в результате больному нет необходимости увеличивать дозу,
Уменьшение аллергизации, так как инсулин не воспринимается как
чужеродный белок.
При переводе больного на инъекции инсулина человека с животного
инсулина снижается липотрофия.
Возможность стабильного производства инсулина в неограниченном
количестве.
Возможность изготовления в катриджах или пенфиллах для шприц-
ручек, что позволяет больному вести активный образ жизни.
4. Активность инсулина определяют биологическим методом по способности
понижать содержание глюкозы в крови кроликов или физико-химическим
методом (электрофорез или хроматография на бумаге). За одну единицу
действия (ЕД) или международную единицу (ME) принимают активность
0,04082 мг кристаллического инсулина. 1 мл стерильного раствора или
суспензии инсулина для инъекций содержит 40 или 100 ЕД инсулина.
Ответ к задаче № 16
.
1. Для получения инсулина с использованием методов генетической
инженерии были использованы два подхода. Первый предполагал синтез
проинсулина (или сходного белка, содержащего вместо C-пептида иную
аминокислотную последовательность) и последующую его конверсию в
инсулин химическим путем. Второй подход базировался на получении
отдельно A- и B-цепей и «сборку» из них молекулы инсулина.
2. Биотехнологическое производство инсулина по-технологии фирмы «El
lilly» (США) базировался на получении отдельно A- и B-цепей и «сборку» из
них молекулы инсулина.
3. В биотехнологическом производстве инсулина по-технологии фирмы «Eli
lilly» (США) применяется в продуцент Escherichia coli
.
Технологический процесс биосинтеза цепей А и В ведут раздельно в
двух ферментаторах на питательной среде с лактозой, которая индуцирует
синтез бета-галактозидазы, а вместе с ней и цепей инсулина,
присоединенных через остаток метионина, в течение 12 часов.
Цепи А и В инсулина синтезируется в клетках кишечной палочки
внутриклеточно. Разделение культуральной суспензии осуществляют на про-
точной центрифуге. Клетки подвергают ферментативной или ультразвуковой
дезинтеграции, и гомогенизат клеточной массы отделяют на сепараторах.
Ответ к задаче № 17
.
1. свойство тотипотентности растительных клеток.
�� &#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;&#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;36 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;должны содержать токсинов, пирогенов, что достигается использованием чистого
биологического материала и качественной очисткой готовой продукции.
Контроль лекарственных средств рекомбинантных белков проводят по следующим
показателям:
подлинность и чистота;
биологическая активность;
апирогенность;
отсутствие острой и хронической токсичности;
биологическая и иммунологическая тождественность, которая определяется
по стандартным международным образцам, причем стандартный образец
всегда используется рекомбинантный.
4. В генной инженерии чужеродные гены клонируют в так называемых
челночных векторах. Эти вектора с одинаковым успехом реплицируются в
клетках нескольких хозяев. Векторы были получены комбинацией
in vitro
фрагментов плазмид. Удобно встраивать ген в специальный вектор для
экспрессии, который уже содержит регуляторные элементы, обеспечивающие
активную экспрессию после введения рекомбинантной плазмиды в
бактериальную клетку. К таким эффективным регуляторным участкам
относится, например, сильный промотор гена бэта-лактамазы (ген
устойчивости к пенициллину, входящий в состав плазмиды pBR 322).
5. Удобство доставки гена - проблема доставки чужеродной ДНК in vitro
практически решена, а ее доставка в клетки-мишени разных тканей in vivo
успешно решается (главным образом путем создания конструкций, несущих
рецепторные белки, в том числе и антигены, специфичные для тех или иных
тканей), то другие характеристики существующих векторных систем -
стабильность интеграции, регулируемая экспрессия, безопасность — все еще
нуждаются в серьезных доработках.
Существует два типа генотерапии:
заместительная
корректирующая
Заместительная генотерапия заключается во вводе в клетку неповрежденного
гена. Внесенная копия заменит по функциям сохранившийся в геноме
больного дефектный ген. Все проводимые сегодня клинические испытания
используют внесение в клетку дополнительных количеств ДНК.
При корректирующей терапии предполагается замена дефектного гена
нормальным в результате рекомбинации. Пока этот метод на стадии
лабораторных испытаний, так как эффективность его еще очень низка.
Ответ к задаче № 15.
1. Получение инсулина из тканей свиней является методом
полусинтетическим.
2. В настоящее время инсулин человека модификацией свиного инсулина
получают синтетико-ферментативным методом. Свиной инсулин отличается
от инсулина человека одной заменой на С-конце В-цепи Ala30Thr. Замену
аланина на треонин осуществляют путем катализируемого ферментом
отщепления аланина и присоединение вместо него защищенного по
карбоксильной группе остатка треонина, присутствующего в реакционной
��35 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;2.
Молекула инсулина - полипептид, состоящий из двух цепей: А и В; цепи
инсулина ковалентно связаны между собой двумя дисульфидными связями
-В7 и А20-В19. Также в молекуле инсулина имеется еще одна
дисульфидная связь у А-цепи: А6-А11. Локализация всех трех дисульфидных
мостиков постоянна, а А- и В-цепи у представителей большинства видов
имеют по 21 и 30 аминокислотных остатков соответственно.
3. Проинсулин синтезируется в шероховатом эндоплазматическом ретикулуме
b-клеток островков Лангерганса поджелудочной железы в виде
предшественника - препроинсулина (молекулярная масса 11500 Da).
Молекула проинсулина (молекулярная масса 9000 Da), принимает
конформацию, необходимую для правильного образования дисульфидных
мостиков. Затем проинсулин расщепляется на инсулин, С-пептид и два
дипептида (катионные пары, узнающиеся трипсиноподобным ферментом) и
депонируется в секреторных гранулах. Далее содержимое этих гранул
секретируется в печеночную вену. Нормальные b-клетки секретируют,
помимо инсулина, эквимолярное количество С-пептида. До попадания в
периферическую кровеносную систему, инсулин и С-пептид попадают в
печень, где деградирует 50 % инсулина, в то время как С-пептид не
подвергается никаким воздействиям.
4. Можно выделить следующие недостатки производства и применения инсулинов
из животного сырья: большой объем производства требует наличия здоровых
животных; сложность выделения, хранения и транспортировки сырья; антигенные
свойства в связи с отличием на одну аминокислоту в свином инсулине; не
достигается полная очистка от проинсулина за исключением производства
высокоочищенных препаратов; наличие чужеродных белков приводит к
образованию антител, формированию инсулинорезистентности, что выражается в
развитии у больных липодистрофии.
вет к задаче № 14.
1. Под рекомбинантными понимают ДНК, образованные объединением in
vitro (в пробирке) двух или более фрагментов ДНК, выделенных из
различных биологических источников.
2. Ферменты, применяемые при конструировании рекомбинантных ДНК,
можно разделить на несколько групп:
- ферменты, с помощью которых получают фрагменты ДНК (рестриктазы);
- ферменты, синтезирующие ДНК на матрице ДНК (полимеразы) или РНК
(обратные транскриптазы);
- ферменты, соединяющие фрагменты ДНК (лигазы);
- ферменты, позволяющие осуществить изменение структуры концов
фрагментов ДНК.
3. Контроль качества генно-инженерных препаратов имеет свои особенности.
Лекарственные средства, полученные по рекомбинантной технологии, должны быть
тождественны структурам организма человека и содержать минимум допустимых
примесей во избежание иммунологических и аллергических реакций, также не
�� &#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;&#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;34 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;экспрессии генов, имеется плазмида, так называемый собственный-вектор на
основе которой созданы химерные плазмиды, содержащие гены-маркеры
устойчивости к антибиотикам.
Bacillus subtilis (сенная палочка) - грамположительный спорообразующий
непатогенный микроорганизм, способный адсорбировать и поглощать
молекулы ДНК из внешней среды и секретировать из клеток в культуральную
жидкость большие количества белков.
Pseudomonas (псевдомонады) - грамотрицательные условно-патогенные и
патогенные палочки, способные к накоплению рекомбинантных белков, в
отличие от кишечной палочки, в растворенном состоянии за счет
специфических окислительно-восстановительных потенциалов цитоплазмы
клеток.
Сахаромицеты (пекарские дрожжи - Saccaromyces cerevisiae и пивные дрожжи
- Saccaromyces carlsbergensis) - эукариотиче-ские клетки, способные к
посттрансляционной модификации белков и содержащие 2 микронную
дрожжевую плазмиду с селективным геном-маркером, кодирующим синтез
лейцина. Сахаромицеты способны к ферментативной модификации белков и
экскреции рекомбинантных продуктов из клетки. Кроме сахаромицетов
используют другие виды дрожжей. Наиболее эффективными продуцентами
полноценных белков являются метилотрофные дрожжи Pichia pastoris и
Hansenula pofymorpha, способные использовать метанол как единственный
источник углерода и энергии.
Культуры клеток животной ткани, которые в отличии от культур
микроорганизмов, способны осуществлять более детальную модификацию
белков. Используются следующие культуры клеток:
культура клеток китайского хомячка CCL-2 (СНО);
- культура клеток почки обезьяны;
HLM- культура клеток печени эмбриона человека;
- культура клеток соединительной ткани мышц.
5. Вектор - самореплицирующаяся молекула ДНК ( например, бактериальная
плазмида), используемая в генной инженерии для переноса генов от
организма донора к организму реципиента, а также, для клонирования
нуклеотидных последовательностей.
Ответ к задаче №13.
1. Инсулин является полипептидным гормоном. Общая характеристика
функции инсулина состоит в том, что в мышцах, печени и жировой ткани он
усиливает анаболитические и ингибирует катаболитические процессы. В
частности, инсулин повышает скорость синтеза гликогена, жирных кислот,
белков, а также стимулирует гликолиз. Важное значение имеет стимуляция
проникновения глюкозы, ряда других сахаров, а также аминокислот в клетки
мышц и жировой ткани. Способствуя входу глюкозы в указанные клетки,
гормон снижает ее содержание в крови (так называемый гипогликемический
эффект). Инсулин ингибирует такие катаболические процессы, как распад
гликогена и нейтрального жира.
��33 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;Иммобилизация клеток путем включения в различные гели, мембраны,
волокна основана на химических и физических взаимодействиях.
Химические методы используются реже по сравнению с другими методами и
малопригодны для иммобилизации живых клеток. Гораздо большее
распространение получило включение клеток в состав гелей, мембран и
волокон. При таком способе иммобилизации клетки могут сохранять
жизнеспособность и в присутствии питательной среды размножаться в
приповерхностных слоях гелей.
Ответ к задаче № 12
.
1. Наиболее распространенным методом генной инженерии является метод
получения рекомбинантных плазмид, которые представляют собой
кольцевые, двухцепочечные молекулы ДНК, состоящие из нескольких пар
нуклеотидов. Каждая бактерия помимо основной, не покидающей клетку
молекулы ДНК (5*10
пар нуклеотидов), может содержать несколько
различных плазмид, которыми она обменивается с другими бактериями.
Плазмиды являются автономными генетическими элементами,
реплицирующимися в бактериальной клетке не в то же время, что основная
молекула ДНК. Плазмиды несут важные для бактерии гены, как гены
лекарственной устойчивости. Разные плазмиды содержат разные гены
устойчивости к антибактериальным препаратам. При действии
опред
ного антибиотика на бактериальные клетки плазмиды, придающие
устойчивость к нему, быстро распространяются среди бактерий, сохраняя им
жизнь.
2. Бактериальные клетки вырабатывают рестриктазы для разрушения
инородной (фаговой) ДНК, что необходимо для ограничения вирусной
инфекции. Рестриктазы узнают опред
ные последовательности
нуклеотидов (сайты – участки узнавания) и вносят симметричные,
расположенные наискось друг от друга разрывы в цепях ДНК на равных
расстояниях от центра сайта. В результате на концах каждого фрагмента
рестриктированной ДНК образуются короткие одноцепочечные «хвосты»,
которые называют липкими концами.
3. Для получения рекомбинантной плазмиды ДНК одной из плазмид
расщепляется выбранной рестриктазой. Ген, который нужно ввести в
бактериальную клетку, расщепляют из ДНК хромосом человека с помощью
рестриктазы, поэтому его «липкие» концы являются комплементарными
нуклеотидным последовательностям на концах плазмид. Ферментом лигазой
«склеивают» оба куска ДНК в результате получается рукомбинантная
кольцевоя плазмида, которую вводят в бактерию, например, E. coli. Все
потомки этой бактерии (клоны) содержат в плазмидах чужеродный ген. Весь
этот процесс называют клонированием.
4. В качестве продуцентов различных рекомбинантных белков используют:
Escherichia coli (кишечная палочка)- грамотрицательная условно-патогенная
палочка, у которой в настоящее время детальна изучен геном и механизмы
�� &#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;&#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;32 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;Ответ к задаче № 11
.
1. В пищевой промышленности с участием иммобилизованных ферментов
идут процессы получения глюкозо-фруктовых сиропов, глюкозы, яблочной и
аспарагиновой кислоты, оптически активных L- аминокислот, диетического
безлактозного молока, сахаров из молочной сыворотки и др.
2. В медицине иммобилизованные ферменты открыли путь к созданию
лекарственных препаратов пролонгированного действия со сниженной
токсичностью и аллергенностью. Иммобилизационные подходы
способствуют решению проблемы направленного транспорта лекарств в
организме. В медицине иммобилизованные ферменты используются также
как лекарственные препараты, особенно в тех случаях, когда необходимо
локальное воздействие. Кроме того, биокатализаторы широко используются в
различных аппаратах для перфузионной очистки различных биологических
жидкостей. Возможности и перспективы использования в медицине
ферментов в иммобилизованном состоянии гораздо шире, чем достигнутые
на сегодняшний день, именно на этом пути медицину ждет создание новых
высокоэффективных методов лечения.
3. Иммобилизованные клетки имеют ряд преимуществ, как перед
иммобилизованными ферментами, так и перед свободными клетками:
- отсутствие затрат на выделение и очистку ферментов;
- снижение затрат на выделение и очистку продуктов реакции;
- более высокая активность и стабильность;
- возможность создания непрерывных и полунепрерывных
автоматизированных процессов;
- способность к длительному функционированию полиферментных систем
без экзогенных кофакторов.
4. Для иммобилизации могут быть использованы клетки в различном
состоянии: живые и поврежденные в различной степени. Одностадийные
реакции могут осуществлять и живые, и поврежденные клетки.
Полиферментные реакции проводят с применением живых клеток, которые
могут длительное время регенерировать АТФ и коферменты (НАДФ, НАД).
Иммобилизовать можно не только клетки микроорганизмов, но и клетки
растительных и животных тканей, используя их для синтеза физиологически
активных соединений. Интересные возможность открываются и при
иммобилизации клеточных органелл как активных полиферментных систем.
Все это свидетельствует о перспективности развития одного из направлений
биотехнологии, связанного с изучением и применением иммобилизованных
клеток.
5. Химический метод основан на образовании ковалентных связей с
активированным носителем, на поперечной сшивке клеток за счет активных
групп в клеточной оболочке с бифункциональными реагентами (например,
глутаровым альдегидом)
К физическим методам относятся адсорбция и агрегация.
��31 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;4. Классификация носителей для иммобилизованных ферментов

Следует отметить, что органические носители (как низко-, так и
высокомолекулярные) могут быть природного или синтетического
происхождения. Природные полимерные органические носители делят в
соответствии с их биохимической классификацией на 3 группы:
полисахаридные, белковые и липидные.
Синтетические полимеры также можно разделить на группы в связи с
химическим строением основной цепи макромолекул: полиметиленовые,
полиамидные, полиэфирные.
5. Наиболее часто для иммобилизации используются такие полисахариды,
как целлюлоза, декстран, агароза и их производные. Для увеличения
механической прочности целлюлозу гранулируют путем частичного
гидролиза, в результате которого разрушаются аморфные участки. На их
место для сохранения пористости между кристаллическими участками
вводят химические сшивки. Гранулированную целлюлозу довольно легко
превратить в различные ионообменные производные, такие как ДЭАЭ-
целлюлоза, КМЦ и т.д.
Широко распространены носители на основе декстрана, выпускаемые под
названием "сефадексы". При высушивании они легко сжимаются, в водном
растворе сильно набухают. В этих носителях размер пор в геле регулируется
степенью сшитости. К группе декстранов относят и крахмал. Химически
модифицированный крахмал сшивается агентами, такими как формальдегид.
Таким способом был получен губчатый крахмал, обладающий повышенной
устойчивостью по отношению к ферментам, гидролизу.
6. Хорошим носителем считается агар. Его свойства улучшаются после
химической сшивки, например, диэпоксидными соединениями. Такой агар
становится устойчивым к нагреванию, прочен, легко модифицируется.
7. Белки в качестве носителей обладают рядом достоинств: вместительны,
способны к биодеградации, могут применяться в качестве тонкой (толщиной
80 мкм) мембраны. Иммобилизацию ферментов на белковых носителях
можно проводить как в отсутствие, так и в присутствии сшивающих агентов.
К недостаткам белков в качестве носителей относят их высокую
иммуногенность (за исключением коллагена и фибрина). Наиболее для
иммобилизации используются структурные (кератин, фибрин, коллаген),
двигательные (миозин) и транспортные (альбумин) белки.
�� &#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;&#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;30 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;3. Реакции, катализируемые биокатализатором: 12 —
дегидроксилирование
Носители для иммобилизации: кальция альгинат, нейлон, полиуретан
Методы имобилизации биокатализатора: включение в структуру геля
Виды биореакторов для процесса с применением иммобилизованного
биокатализатора: в зависимости от состояния системы
«имобилизизованные клетки — полимер» могут быть использованы
биореакторы с циркуляционным перемещиванием гранул и насадкой, с
механическим перемешиванием и фильтром, «корзиночного типа» для
гранулированной системы, со стимуляцией газообмена для системы в
виде геля.
Ответ к задаче № 10
.
Решить эти проблемы помогает создание в 1916г иммобилизованных
ферментов.
Преимущества иммобилизованных ферментов перед нативными
предшественниками:
Гетерогенный катализатор легко отделим от реакционной среды, что
дает возможность остановить реакцию в любой момент, использовать
фермент повторно, а также получать чистый от фермента продукт.
Ферментативный процесс с использованием иммобилизованных
ферментов можно проводить непрерывно, регулируя скорость
катализируемой реакции и выход продукта.
Модификация фермента целенаправленно изменяет его свойства, такие
как специфичность (особенно в отношении макромолекулярного
субстрата), зависимость каталитической активности от рН, ионного
состава и других параметров среды, стабильность к денатурирующим
воздействиям.
Можно регулировать каталитическую активность иммобилизованных
ферментов путем изменения свойств носителя действием физических
факторов, таких как свет и звук. Иммобилизовать ферменты можно как
путем связывания на нерастворимых носителях, так и путем
внутримолекулярной или межмолекулярной сшивки белковых молекул
низкомолекулярными бифункциональными соединениями, а также
путем присоединения
3. К носителям предъявляются следующие требования (Дж.Порат, 1974):
- высокая химическая и биологическая стойкость;
- высокая химическая прочность;
- достаточная проницаемость для фермента и субстратов, пористость,
большая удельная поверхность;
- возможность получения удобных в технологическом отношении форм
(гранул, мембран);
- легкая активация;
- высокая гидрофильность;
- невысокая стоимость.
��29 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;5. Основную часть ферментов, получаемых промышленным способом,
составляют гидролазы.
Ответ к задаче № 8.
1. При поверхностном методе культура растет на поверхности твердой
увлажненной питательной среды. Мицелий полностью обволакивает частицы
субстрата. Поскольку для дыхания клетки используют кислород, то среда
должна быть рыхлой, а слой культуры-продуцента небольшим.
2. Преимущества поверхностной культуры: значительно более высокая
конечная концентрация фермента на единицу массу среды, поверхностная
культура относительно легко высушивается, легко переводится в товарную
форму.
3. Посевной материал может быть тр
х видов:
- культура, выросшая на твердой питательной среде;
- споровый материал;
- мицелиальная культура, выращенная глубинным способом.
4. Схема очистки сводится к следующему:
- освобождение от нерастворимых веществ;
- освобождение от сопутствующих растворимых веществ;
- фракционирование (как правило, хроматографическими методами).
Для выделения фермента из поверхностной культуры необходима экстракция.
Как правило, экстраген - вода. При этом в раствор переходят сахара,
продукты гидролиза пектиновых веществ и целлюлозы. Стадию выделения и
очистки завершает сушка. После сушки препарат должен содержать не более
6-8% влаги, тогда он может в герметичной упаковке храниться до года без
потери активности.
5. Стандартизация ферментного препарата - доводка активности фермента до
стандартной, соответствующей требованиям ГОСТ. Для этого используются
различные нейтральные наполнители - крахмал, лактоза и др.
Ответ к задаче № 9.
биообъект-
окатализатор: ферменты клеток Digitalis lanata
Источник получения: культура клеток Digitalis lanata, которая из-за
изменения типа питания с фотоавтотрофного (у растений) на гетеротрофный
(у культуры клеток) и путей метаболизма утратила способность
образовывать сердечные гликозиды, но сохранила метаболический путь
присоединения -ОН группы в 12 положении
циклопентанпергидрофенантрена.
Цели и преимущества использования иммобилизованных клеток
растений в качестве биокатализатора в данном процессе: цель —
повышение выхода целевого продукта и времени функционирования
биокатализатора; преимущества: многократное использование
биокатализатора, четкое отделение биокатализатора от целевого
продукта, увеличение времени функционирования биокатализатора.
�� &#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;&#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;28 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;Ответ к задаче № 7.
1. Существует ряд факторов, влияющих на биосинтез ферментов. В первую
очередь, к ним относится генетический. Состав и количество синтезируемых
ферментов наследственно детерминированы. Применяя мутагены можно
изменить генетические свойства микроорганизмов и получить штаммы с
ценными для промышленности свойствами. К мутагенным факторам
относятся ионизирующее и неионизирующее излучения, изотопы,
антибиотики, другие химические соединения, преобразующие
наследственные элементы клетки. Несмотря на определяющую роль
генетического фактора в биосинтезе ферментов, производительность
биотехнологических процессов зависит и от состава питательной среды,
соблюдения условий культивирования (рН, степень аэрации, терморежим,
влажность). При этом важно не только наличие источников основных
питательных веществ, но и веществ, играющих роль индукторов или
репрессоров биосинтеза данного конкретного фермента или их групп.
Для интенсификации процесса роста и синтеза ферментов добавляют
различные факторы роста, например, аминокислоты, пуриновые основания и
их производные, РНК и продукты е
гидролиза. В качестве источника
углерода используют крахмал, кукурузный экстракт, соевую муку,
гидролизаты биомассы дрожжей. Микроорганизмы могут утилизировать и
минеральные источники азота. В состав питательных сред входят и ионы MG,
Mn, Zn, Fe, Cu и др. металлов. Механизм действия большинства из них
неизвестен. Некоторые входят в состав фермента. Ионы Ca повышают
устойчивость a-амилазы, ионы Fe и Mg активизируют и стабилизируют
протеолитические ферменты.
2. При разработке процесса биосинтеза a-амилазы культурой Asp.oryzae
замена сахарозы (как источника углерода) на крахмал увеличила активность
фермента в 3 раза, добавление солодового экстракта (из проросших семян
злаковых) ещ
в 10 раз, а повышение концентрации основных элементов
питательной среды на 50% -
2 раза.
3. Оптимальный состав питательной среды для каждого продуцента может
быть определен двумя способами: эмпирический и построение
математической модели с использованием компьютера.
4. По решению Международного биохимического союза активность решено
определять при t = 30
С по начальной скорости реакции, когда концентрация
насыщения фермента и временная зависимость близка к кинетике реакции
нулевого порядка. Остальные параметры реакции индивидуальны для
каждого фермента. Активность ферментного препарата выражается в
микромолях субстрата, прореагировавшего под действием 1 мл ферментного
раствора или 1 грамма препарата в оптимальных условиях за 1 минуту. Если
ферментный препарат не содержит балласта, то его активность выражается в
тех же стандартных единицах на 1 мг фермента. Если же есть балласт, то
активность считается на 1 мг белка в ферментном препарате. Активность
выпускаемого препарата - важнейший нормируемый показатель качества.
��27 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;2.Химические методы: обработка клеток толуолом, бутанолом.
3.Химико-ферментативные методы: обработка клеток грам(-) лизоцимом в
присутствии ЭДТА; обработка дрожжей зимолазой; обработка ПАВ;
обработка клеток бактерий антибиотиками; заражение бактериофагами.
Ответ к задаче № 6.
1. Общими свойствами ферментов и небиологических катализаторов
является то, что они:
катализируют только энергетически возможные реакции
никогда не изменяют направления реакции
не изменяют равновесия обратимой реакции, а лишь ускоряют его
наступление
не расходуются в процессе реакции
Но ферменты, как катализаторы биологического происхождения имеют свои
особые свойства:
высокая активность
специфичность (селективность) действия
регулируемая активность в зависимости от условий среды
катализ реакций в «мягких» условиях
зависимость скорости реакции от количества фермента
катализируют скорость реакций, принадлежащих к различным
классам.
2. Активный центр фермента — высоко специфичный участок молекулы
фермента, вступающий в контакт с субстратом в фермент-субстратном
комплексе.
Аллостерический центр фермента — участок молекулы фермента, удаленный
от активного центра фермента, активность которого регулируется не
субстратами, а другими веществами, но изменения аллостерического центра
ведут к изменениям в структуре активного центра фермента.
3. Биообъкты-катализаторы — биологические объекты на основе ферментов
или мультиферментных комплексов клеток, катализирующие процессы
биотрансформации и биокатализа.
4. Ферменты подразделяют на 6 групп в зависимости от катализируемых
реакций:
окисление/восстановление (оксиредуктазы)
перенос групп от одного субстрата к другому (трансферазы)
гидролиз (гидролазы)
реакции по двойным связям (разрыв связей и присоединение к ним
химических групп без присоединения молекулы воды или окисления)
(лиазы)
изомеризация (изомеразы)
синтез сложных соединений (синтетазы или лигазы).
�� &#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;&#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;26 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;к кислороду. При использовании аэробных культур ферментационное
оборудование и нормы технологического режима подбираются таким
образом, чтобы массообмен (перенос кислорода из газовой в жидкую фазу)
обеспечивал поступление кислорода к клеткам в количествах, необходимых и
оптимальных для данной культуры в данной фазе роста. Промышленное
использование факультативных анаэробов не ставит задачи абсолютного
исключения кислорода из среды. В начальной фазе этих процессов требуется
лишь удалить кислород из газовой фазы над культуральной жидкостью, что
может быть достигнуто введением инертного газа или просто вытеснением
воздуха углекислотой, выделяемой клетками при метаболизме.
Технологическое оформление строго анаэробных процессов сложнее, чем для
процессов брожения, так как в этом случае необходимо полностью
исключить возможность попадания кислорода в газовую, а оттуда и в жидкую
среду.
Биореакторы подразделяют на три основные группы:
реакторы с механическим перемешиванием;
барботажные колонны, через которые для перемешивания
содержимого пропускают воздух;
эрлифтные реакторы с внутренней или внешней циркуляцией;
перемешивание и циркуляция культуральной среды в них
обеспечивается потоком воздуха, за счет которого между верхним и
нижним слоями культуральной среды возникает градиент плотности.
4. Простейшим вариантом управления стадией ферментации в
периодическом режиме является изменение концентраций компонентов
среды и
рН, а также введение необходимых добавок по заранее
разработанной программе, реализуемой технологом в каждом цикле
ферментации. Важно также поддерживать определенный состав питательной
среды. В непрерывных процессах биосинтеза задача технолога сводится к
поддержанию концентрации всех питательных веществ (и кислорода) и
дозированному введению кислоты или щелочи для рН-статирования системы
на заданном уровне.
Ответ к задаче № 5
.
Последовательность стадий технологического процесса: 10,2, 3, 1, 9, 13,
операции: 5, 4, 7, отделение экстракта от разрушенных клеток, 8, 11, 6, 12,
14.
Операция «Дезинтеграция (разрушение клеток)» осуществляется при
выделении внутриклеточного метаболита (целевого продукта)
физическими, химическими, химико-ферментативными методами в
реакторах-дезинтеграторах с мешалкой, шаровых мельницах,
холодильных установках и т. д.
Физические методы: обработка ультразвуком (с помощью вращающихся
лопастей; продавливанием через узкое отверстие под давлением;
раздавливанием замороженной клеточной массы; осмотическим
шоком; замораживанием-оттаиванием; декомпрессией)
��25 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;подвергаться ферментативной инактивации или вступать во взаимодействие
с другими макромолекулами клетки.
3. Таргетный скрининг сформирован как новая стратегия в области
скрининга антагонистов патогенов и созданием инновационных
антимикробных лекарственных средств, обладающих принципиально иным
механизмом действия, чем антибиотики, отбираемые при первичном
скрининге по активности на лабораторных питательных средах.
Отличительной особенностью новой стратегии является то, что поисковая
работа начинается не с ингибиторов того или иного метаболического
процесса патогена, а с возможных мишеней для потенциальных
антимикробных агентов с применением знаний о геноме и гене.
4. В дальнейшем значение конкретного гена для жизнедеятельности и
размножения патогенного микроорганизма определяется при его трансляции
в живом орган
Ответ к задаче № 4.
Поверхностная и глубинная ферментация.
Ферментация проходит в специальных емкостях, называемых
ферментерами или биореакторами. Основными элементами
ферментера являются двойные стенки, промежуток между которыми
заполняется охлаждающей или нагревающей жидкостью, входные
отверстия для газовых и жидких потоков, система контроля за
составом питательной среды и условиями внутри реактора.
3. Технологическое оформление процессов промышленной биотехнологии
в значительной мере определяется отношением микроорганизма-продуцента
�� &#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;&#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;24 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;Ответ
к задаче №2.
В результате катаболитной репрессии генов ферментов биосинтеза
антибиотиков. Катаболитная репрессия - подавление синтеза
определенных ферментов продуктами катаболизма глюкозы и других
легкоокисляемых веществ. Применительно к синтезу антибиотиков
глюкоза, фруктоза, сахароза, галактоза являются сильными
репрессорами синтеза ферментов, ответственных за биосинтез
антибиотиков. Данное явление получило название «глюкозный
эффект».
Существуют общие закономерности, которые необходимо учитывать
при культивировании большинства продуцентов вторичных
метаболитов: углеродкатаболитная регуляция; содержание фосфатов в
среде; азоткатаболитная регуляция; влияние первичных метаболитов;
влияние кислорода воздуха.
Медленно утилизируемые полисахариды, такие как крахмал более
благоприятны для биосинтеза антибиотиков. Репрессором биосинтеза
не является и лактоза, которая утилизируется медленно. При гидролизе
ктозы высвобождается глюкоза, которая репрессирует фермент р-
галактозидазу, в результате гидролиз лактозы и, следовательно,
появление в среде глюкозы замедляется.
Ответ к задаче №3.
В данном примере применяется таргетный скрининг.
Последовательные этапы таргетного скрининга:
1) Выбор гена. На первой стадии осуществляется выбор гена с
использованием данных биоинформатики о роли гена и значении его
продукта экспрессии в метаболизме клетки, а также структурной и
сравнительной геномики.
2) Амплификация гена. На втором этапе ДНК выбранного гена
амплифицируют (преумножают) с помощью полимеразной цепной реакции
(ПЦР) с целью получения достаточного для дальнейших исследований
количества гена. Наработанная матрица ДНК подвергается транскрипции и
трансляции в бесклеточной рибосомно-матричной системе с целью
получения достаточного количества генного продукта (таргета).
3) Определение специфической активности таргета в бесклеточной системе.
Природные метаболиты и синтетические вещества с антимикробным
действием из библиотек антимикробных агентов испытываются на
способность подавлять активность таргета.
4) Выбор антимикробного агента, обладающего наиболее высокой
аффинностью (избирательностью) к таргету.
5) Исследование механизма взаимодействия отобранного антимикробного
агента с целой микробной клеткой. Важный этап исследования, так как на
практике антимикробное вещество может не проникать в клетку,
��23 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;ОТВЕТЫ К СИТУАЦИОННЫМ ЗАДАЧАМ
вет к задаче №1.
Антимикробное действие макролидов обусловлено нарушением
синтеза белка на этапе трансляции в клетках чувствительных
микроорганизмов. Молекула антибиотика способна обратимо
связываться с каталитическим пептидил-трансферазным центром
рибосомальной 50S-субъединицы и вызывать отщепление комплекса
пептидил-тРНК (представляющего собой растущую пептидную цепь)
от рибосомы. В результате приостанавливается процесс формирования
и наращивания пептидной цепи. Связывание макролидов с 50S-
субъединицей возможно на любой стадии рибосомального цикла.
Характер антимикробного действия макролидов обычно является
бактериостатическим. Тем не менее в определенной степени он зависит
от концентрации антибиотика в очаге инфекции, вида микроорганизма,
фазы его развития и степени микробной обсемененности. В высоких
концентрациях (в 2-4 раза превышающих МПК) и особенно в
отношении тех микроорганизмов, которые находятся в фазе роста,
макролиды могут оказывать бактерицидное действие. Подобным
образом они действуют на
-гемолитический стрептококк группы А,
пневмококк, менингококк, возбудителей коклюша и дифтерии. В то же
время против золотистого стафилококка макролиды в большинстве
случаев проявляют бактериостатический эффект.
Связывание с 50S-субъединицами рибосом характерно также для таких
антибиотиков, как линкозамиды, стрептомицин и хлорамфеникол.
Несмотря на то, что по особенностям связывания с доменами
пептидил-трансферазного центра данные антибиотики отличаются от
макролидов, при одновременном назначении между ними возможна
конкуренция и ослабление антимикробного эффекта.
В последние годы значение определения чувствительности
микроорганизмов к макролидным антибиотикам
in vitro
возрастает.
Современные стандартизированные методы определения
чувствительности к антибиотикам подразделяются на методы серийных
разведении (в агаре и бульоне, метод микроразведений) и
диффузионные (диско-диффузионный метод и метод Е-тестов). Методы
серийных разведении и Е-тесты позволяют получить количественную
характеристику чувствительности микроорганизмов - МПК
антибиотика в отношении данного возбудителя, а диско-диффузионный
метод является полуколичественным и позволяет подразделить все
штаммы на три категории - чувствительные, умеренно-резистентные и
резистентные, но при регистрации и анализе диаметра зон он в ряде
случаев приближается к количественным методам.
�� &#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;&#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;22 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;3. Принцип работы теста для ранней диагностики беременности с помощью
моноклональных антител.
Задача № 60
Проанализируйте описание технологического процесса по следующей схеме:
название иммунотропного лекарственного средства;
класс и группа препаратов, к которым относится данное средство;
достоинства и недостатки данного иммунотропного средства;
основные этапы получения;
показатели качества;
условия хранения и транспортирования;
влияние на иммунитет и применение.
«из плазмы или сыворотки крови доноров-добровольцев, иммунизированных
вакциной против клещевого энцефалита, выделяют фракцию Ig
фракционированием этанолом при температуре ниже 0
С глобулиновой части
белков крови. Далее про водят лиофилизацию, изготовление 10% раствора,
стерилизующую фильтрацию и ампyлирование по 1 мл (1 доза)»
��21 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;Задача № 56
Успешное лечение любого заболевания зависит от своевременной и
точной идентификации патогенного фактора (возбудителя болезни, опухолевой
клетки и др.). Методы, основанные на образовании комплексов антител с
антигенами или гаптенами, называют иммуноанализом или
иммунодиагностикой. Во всех случаях иммуноанализа первостепенной задачей
является превращение анализируемого объекта в комплекс антиген-антитело с
последующим определением его количества.
Основные требования к диагностическим тестам.
Какие два типа диагностикумов используются в иммуноанализе?
Радиоиммунологический (радиоиммунный) метод, принцип. Достоинства
и недостатки.
Иммуноферментный анализ-ИФА, преимущества по сравнению с РИА.
В зависимости от чего классифицируют ИФА на на гомогенный и
гетерогенный варианты?
Задача № 57
Успешное лечение любого заболевания зависит от своевременной и
точной идентификации патогенного фактора (возбудителя болезни, опухолевой
клетки и др.). Методы, основанные на образовании комплексов антител с
антигенами или гаптенами, называют иммуноанализом или
иммунодиагностикой. Во всех случаях иммуноанализа первостепенной задачей
является превращение анализируемого объекта в комплекс антиген-антитело с
последующим определением его количества.
Гомогенный вид иммуноферментного анализа.
Прямой конкурентный метод ELISA для определения антигенов.
Метод последовательного насыщения ELISA.
Метод ингибирования ELISA с использованием двойных антител.
Прямой конкурентный метод ELISA для определения антител.
Иммунометрический вид ИФА («Сендвич»-анализ), его этапы.
Задача № 58
Многие исследователи пытались отыскать способы получения антител с
узкой специфичностью.
Какие этапы включает процедура получения моноклональных антител?
значение процесса иммунизации животных при получении
моноклональных антител.
Какие клетки используют для гибридизации in vivo при производстве
моноклонольных антител?
Задача № 59
Многие исследователи пытались отыскать способы получения антител с
узкой специфичностью.
Иммунизация in vitro при производстве моноклональных антител,
преимущества.
Клонирование гибридомных клеток, известные вам методы клонирования.
�� &#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;&#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;20 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;7. Трансформация может осуществляться как растущей на среде культурой,
к и отмытыми от питательной среды клетками микроорганизма. Какой
из вариантов предпочтительнее, есть ли исключения?
Задача №52
В настоящее время возможности и достоинства использования
биотрансформации проявились наиболее ярко в области превращений
стероидных соединений. Сложность молекул стероидов затрудняет даже
незначительные их модификации химическим путем.
В процессе промышленного производства стероидов необходимым
условием является высокая степень предварительного измельчения
стероидного субстрата. С какой целью и чем это обусловлено?
Методы, повышающие водорастворимость стероидов, когда
растворимость стероидного субстрата слишком мала для проявления
присущей микроорганизму ферментативной активности.
Что представляет из себя «вещество S», его применение.
Задача №53
Главным препятствием, стоящим на пути развития промышленного
микробиологического гидроксилирования стероидов является низкая
производительность ферментации, несмотря на высокий процентный выход по
субстрату.
Причины низкой производительности ферментации при
микробиологическом гидроксилировании стероидов.
Актинобактерии, роль в процессах биоконверсии стероидов.
Род Согупеbacterium, роль в процессах биоконверсии стероидов.
Задача №5
4
Иммунная система, совместно с нервной, эндокринной, сердечно -
сосудистой и другими системами, обеспечивает постоянство внутренней среды
организма, или гомеостаз.
Активирующие агенты иммунной системы (определение).
Какие компоненты иммунной системы Вы знаете?
К какому из компонентов иммунной системы относится
иммуноглобулины? Какие клетки в организме вырабатывают
иммуноглобулины? Классы иммуноглобулинов.
Задача №55
Иммунная система, совместно с нервной, эндокринной, сердечно -
сосудистой и другими системами, обеспечивает постоянство внутренней среды
организма, или гомеостаз.
Что представляет генетический компонент иммунной системы? Принцип
его функционирования.
Первичная иммунная недостаточность, определение. Способы терапии.
Вторичная иммунная недостаточность, определение, причины.
��19 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;4. Что представляет препарат Хил
-форте? Является ли он
пробиотиком?
Задача №49
Большинство препаратов пробиотиков представляют собой биомассу
микроорганизмов.
Какие этапы включает процесс получения продуцента для препаратов
нормофлоры?
Продуцент при получении колибактерина.
Каким образом продуцент — кишечную палочку, восстанавливают из
состояния анабиоза?
Перечислите оптимальные условия для культивирования кишечной
палочки с целью накопления биомассы.
Контроль препарата колибактерина.
Задача №50
Технология производства препаратов бифидо- и лактобактерии аналогична
технологии колибактерина. Различия относятся к составу питательных сред и
условиям культивирования в соответствии с физиологическими особенностями
бактерий.
Какими преимуществами обладают бифидо - и лактобактерии для
производства и применения в качестве лекарственных препаратов по
сравнению с кишечной палочкой?
Какие стадии присутствуют в технологическом процессе производства
препаратов пробиотиков?
По каким показателям проводят контроль готового лекарственного
препарата Bifidobacterium bifidum?
Какой способ производственного культивирования в биореакторе
предпочтительнее для накопления биомассы молочнокислых бактерий.
По каким показателям осуществляют контроль лекарственного
препарата «Лактобактерин» ?
Задача №51
Стероидные гормоны (кортикостероиды, прогестогены, половые
гормоны) участвуют во многих жизненно важных функциях организма. В основе
получения стероидных гормонов лежат методы биотрансформации
(биоконверсии).
Сущность процесса биотрансформации.
Каким образом осуществляется синтез молекулы стероида в процессе
биоконверсии?
Основные процессы микробиологической трансформации.
Преимущества биотехнологических методов производства стероидов
перед методами химического синтеза.
Что используется в качестве исходного сырья для производства
стероидных препаратов в биотехнологическом производстве?
Какой тип ферментации применяют при биотрансформации стероидов?
�� &#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;&#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;18 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;3. Что ожидается при высоком содержании в питательной среде
биотина и солей аммония при культивировании бактерий родов
Согуnebacterium и Brevibacterium на углеводном сырье.
Схематически изобразите данный процесс.
Задача №46
Предложите посетителю аптеки лекарственные препараты на основе
пробиотиков, прием которых можно совмещать с приемом пероральных
препаратов антибиотиков.
Задача №47
Даны следующие лекарственные препараты
а-Ацилакт сухой
б-Бактисубтил
в-Бификол сухой
г-Бифилиз сухой
д-Колибактернн сухой
е-Линекс
ж-Нормофлор
з-Нутролин В
и-Пробифор
к-Хилак-форте
Выделите среди перечисленных препаратов содержащие
лактобактерии.
Выделите среди перечисленных препаратов содержащие
бифидобактерии.
Выделите среди перечисленных препаратов содержащие кишечную
палочку.
Задача №48
Даны следующие лекарственные препараты:
а-Пробифор
б-Колибактерин сухой
в-Бификол сухой
г-Бифилиз сухой
д- Бактисубтил
е-Линекс
ж-Нормофлор
з-Нутролин В
и- Ацилакт сухой
к-Хилак-форте
Факторы, вызывающие развитие дисбактериоза.
Представители резидентной микрофлоры ЖКТ человека. Кто
преобладает?
Принципы пробиотикотерапии. Опеределение.
��17 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;2. Метод совершенствования выбранного продуцента и отбора
сверхпродуцента
Какие еще продуценты данного вещества вам известны, их достоинства и
недостатки.
Задача №43
Известно, что провитамин D
(эргостерин)
продуцируют дрожжи-
сахаромицеты в аэробных условиях при избытке углеводов в питательной
среде, сниженном количестве азота и оптимальном содержании кислорода
(максимум 2%).
Назовите промышленный продуцент для провитамина D
2
Необходим ли УФ-свет для процесса образования целевого продукта?
Если да, то для чего и на каком этапе технологического процесса.
Для чего в промышленном производстве витамина D
2
применяют
гидролиз? Как используют полученный гидролизат?
Как используют грибы рода Candida в качестве продуцента D
2
Какие коферменты можно получить с использованием грибов рода
Candida в качестве продуцента D2? Роль в организме данных веществ.
Задача №44
Процесс промышленного производства данного витамина осуществляется в
виде нескольких стадий, лишь одна
из которых является биотехнологической,
остальные- химические превращения. По химическим свойствам данный
витамин является L-кислотой.
Исходным веществом для промышленного
производства служит крахмал.
Что за витамин производится подобным способом? Название метода
промышленного производства.
Перечислите стадии производства, отметьте среди ни
биотехнологическую.
Продуценты биотехнологической стадии, их особенности.
Что вам известно о синтезе предшественника данного витамина -
гидрат диацетон-2-кето-L-гулоновой кислоты- какой микроорганизм
может использоваться для синтеза данного вещества-
предшественника, метод его совершенствования
?
Задача №45
Из изолимонной кислоты цикла Кребса при культивировании бактерий
родов Согуnebacterium и Brevibacterium на углеводном сырье (гидролизат
крахмала, тросниковая или свекловичная меласса) в условиях при дефиците
биотина с подавлением активности фермента глутаматдегидрогеназы
синтезируется …1...?.
Предшественником каких других аминокислот является полученное
вещество?
Метаболический предшественник при биосинтезе данной
аминокислоты.
�� &#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;&#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;16 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;вторичного метаболизма, индукции ферментов и экспрессии генов,
деградации чужеродных соединений, цитологических исследований и др.
Накопление вторичных метаболитов возрастает в фазе
замедленного роста клеточной популяции, а в стационарной фаз?
Как влияют на синтез вторичных метаболитов стрессовые
условия, воздействующие на клетки в конце экспоненциальной
фазы?
Использование суспензионных культур в промышленности.
Примеры растений, применяемых в медицине для создания
лекарственных препаратов.
Задача №
Существуют также технологии получения вторичных метаболитов с
помощью иммобилизованных клеток каллусной культуры (в частности, такие
системы используются для иммобилизации каллусной культуры клеток
Digitalis lanata).
Носители для иммобилизации клеток растений.
Способны ли иммобилизованные клетки расти?
Преимущества иммобилизованных клеток растений по сравнению с
суспензионными культурами.
Процесс получения дигоксина из дигитоксина, применяемый продуцент,
сущность процесса биотрансформации.
Задача №
Данный биопродукт из культуры изолированных клеток разработан в
лаборатории культуры тканей Института физиологии растений РАН на основе
высокопродуктивного клеточного штамма культуры растительных клеток и
используется для изготовления лосьонов, кремов, а также тонизирующих
препаратов. Экстракт из клеток данного растения обладает
радиопротекторным, иммуностимулирующим и другими эффектами.
О клетках какого растения идет речь?
Показания к применению.
Задача №42
Определите лекарственную субстанцию по описанию
технологического процесса: «Штамм сконструирован методом генной
инженерии. Отбор высокопродуктивных клонов проведен по устойчивости к
аналогу целевого продукта. В качестве аналога использован розеофлавин.
Сверхпродуцент культивируют на питательной среде с мелассой и
дрожжевым экстрактом в течение 25-35 ч. при температуре 37
С в условиях
аэрации. Целевой продукт секрктируется в культуральную жидкость в
количестве 3,4-4,0 г/л целевого продукта. Лекарственную субстанцию
выделяют из культуральной жидкости по растворимости в щелочах и
кислотах и низкой растворимости в органичных жидкостях.
Составьте технологическую схему получения данного соединения.
��15 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;2. Какая фирма применяет пекарские дрожжи Saccharomyces cerevisiae в
качестве продуцента рекомбинантного человеческого инсулина?
Препараты инсулина, полученного благодаря методам генетической
инженерии с использованием Saccharomyces cerevisiae, на
фармацевтическом рынке России.
Задача №37.
В качестве продуцента рекомбинантного человеческого инсулина
используют также пекарские дрожжи Saccharomyces cerevisiae, так как они
обладают рядом преимуществ перед другими изученными и
культивируемыми в промышленном масштабе микроорганизмами.
Тип нуклеиновой кислоты, применяемой для переноса в геном
(построения вектора), в производстве рекомбинантного инсулина.
источник ее получения.
Селекцию трансформированных сахаромицетов при производстве
рекомбинантного инсулина проводят на питательной среде, не
содержащей аминокислоты лейцин. Почему?
Метод культивирования продуцента Saccharomyces cerevisiae при
производстве рекомбинантного инсулина.
Культуральную суспензию Saccharomyces cerevisiae разделяют
центрифугированием, целевой продукт выделяют из культуральной
жидкости и очищают методами ионообменной и гель-хроматографии.
Далее его подвергают биоконверсии по реакции транспептидации,
используя трипсин и бета-карбоксипептидазу. С какой целью
производится реакция транспептидации?
Задача №38.
Суспензионные культуры - отдельные клетки или группы клеток,
выращиваемые во взвешенном состоянии в жидкой среде. Представляют
собой относительно гомогенную популяцию клеток, которую легко
подвергнуть воздействию химических веществ. Суспензионные культуры
широко используются в качестве модельных систем для изучения путей
вторичного метаболизма, индукции ферментов и экспрессии генов,
деградации чужеродных соединений, цитологических исследований и др.
Получение суспензионной культуры из каллусной ткани.
Фазы роста суспензионной культуры.
Какие два вида систем культивирования при глубинном
культивировании растительных клеток применяют?
Задача №39
Суспензионные культуры - отдельные клетки или группы клеток,
выращиваемые во взвешенном состоянии в жидкой среде. Представляют
собой относительно гомогенную популяцию клеток, которую легко
подвергнуть воздействию химических веществ. Суспензионные культуры
широко используются в качестве модельных систем для изучения путей
�� &#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;&#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;14 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;2. В чем заключается принцип иммобилизации ферментов с
использованием мембран? Микрокапсулирование. Включение в
волокна и включение в липосомы.
Метод иммобилизации ферментов с использование систем двухфазного
типа.
Методы химической иммобилизации, отличия от физической
иммобилизации.
Задача №34.
Продукты микробного синтеза поступают из биореактора в виде водных
суспензий или растворов, при этом характерно невысокое содержание
основного компонента и наличие многих примесных веществ. В большинстве
промышленных производств на первом этапе переработки культуральной
жидкости производят отделение массы продуцента от жидкой фазы –
сепарацию.
Как называют способ выделения и очистки продуктов, находящихся
внутри клеток продуцента?
Какие способы освобождение от растворимых веществ вам известны?
Перечислите известные вам методы тонкой очистки и разделения
препаратов.
Задача №35.
Создание и производство рекомбинантных человеческих инсулинов
существенно повысило эффективность лечения сахарного диабета и
обеспечило повышение качество жизни больных.
Методы очистки полученных рекомбинантных белков-
предшественников цепей А и В в биотехнологическом производстве
инсулина по технологии фирмы «Eli lilly»?
Процесс выделения А и В цепей, их соединение в молекулу инсулина.
Недостатки метода и продуцента при производстве инсулина по
технологии фирмы «Eli lilly».
Технологические приемы, используемые для защиты персонала,
производственного процесса, отходов и окружающей среды от
контаминации клетками Escherichia coli.
Перечислите препараты рекомбинантного инсулина, выпускаемого по
технологии фирмы «Eli lilly».
Задача №36.
В качестве продуцента рекомбинантного человеческого инсулина
используют также пекарские дрожжи Saccharomyces cerevisiae, так как они
обладают рядом преимуществ перед другими изученными и
культивируемыми в промышленном масштабе микроорганизмами.
Достоинства пекарских дрожжей как продуцента рекомбинантных
белков.
��13 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;5. Поддержание чистой культуры и получение засевной дозы. Отделение
чистой культуры. Особенности при периодическом процессе
культивирования и при непрерывном.
Задача №30.
Продукты микробного синтеза поступают из биореактора в виде водных
суспензий или растворов, при этом характерно невысокое содержание
основного компонента и наличие многих примесных веществ. В большинстве
промышленных производств на первом этапе переработки культуральной
жидкости производят отделение массы продуцента от жидкой фазы –
сепарацию.
Как технологические приемы, используемые для отделения клеток
от среды, зависят от природы продуцента? Поясните на примере
сравнении выделения продуцента у сахаромицетов и дрожжей
рода Candida.
Роль фильтрации и центрифугирования при отделении твердой
фазы.
Какие способы обработки культуральной жидкости вам известны?
Задача №31.
Глубинный метод культивирования продуцентов ферментов.
При глубинном методе культура растет на поверхности твердой или
в жидкой питательной среде?
Какой из методов технически более совершенен - поверхностный
или глубинный, почему?
Для чего при глубинном методе осуществляют концентрирование
фильтрата перед его выделением?
Этапы при глубинном культивировании продуцентов ферментов.
Сущность каждого этапа.
Задача №32.
Какие два основных метода иммобилизации ферментов Вы знаете?
Что представляет физическая иммобилизация ферментов? Типы
связывания ферментов.
Удерживание адсорбированной молекулы фермента на поверхности
носителя может обеспечиваться за счет …?
Преимущества и недостатки метода адсорбционной иммобилизации.
Суть этого метода иммобилизации путем включения в гели.
Задача №33.
Какие два основных метода иммобилизации ферментов Вы знаете?
Какие два основных способа для иммобилизации ферментов в геле вам
известны?
�� &#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;&#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;12 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;Задача №29
общем виде система биотехнологического производства продуктов микробного
синтеза представлена на схеме:
Сколько стадий биотехнологического производства Вы знаете?
Назовите их и охарактеризуйте происходящие в них процессы.
Расскажите о технологии приготовления питательных сред для
микробиологического синтеза вещества. Что входит в состав
питательной среды? Особенности введения в среду источников
углерода.
Асептика при приготовлении питательной среды в процессе
микробиологического синтез. Стерилизация газовых и жидкостных
потоков. Требования к химическим антисептикам.
Требует ли стерилизации среда, в которой субстратами служат метанол,
этанол или концентрированная уксусная кислота? Почему? Как
достигается соблюдение асептики в данном случае?
��11 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;3. Недостатки метода и продуцента при производстве инсулина по
технологии фирмы «Eli lilly».
Технологические приемы, используемые для защиты персонала,
производственного процесса, отходов и окружающей среды от
контаминации клетками Escherichia coli.
Перечислите препараты рекомбинантного инсулина, выпускаемого по
технологии фирмы «Eli lilly».
Задача №26
Культуры клеток и тканей для массового размножения растений и
оздоровления посадочного материала, в том числе лекарственных растений,
нашли широкое применение в растениеводстве.
С какой целью при выращивании каллусной ткани проводят пассирование
или субкультивирование?
Понятие и сущность дифференциации меристематической клетки.
Может ли у растений процесс дифференциации быть обратимым, при
каких условиях
Задача №27
Определите лекарственную субстанцию по описанию технологического
процесса, выделите биотехнологические и химические этапы производства,
назовите биообъекты биотехнологических этапов:
« … продуцент Nocardia mediterranea обработан многократно ренгеновскими и
ультрафиолетовыми лучами, а также азотсодержащими веществами с селекцией
на каждом этапе. Сверхпродуцент помещен в ферментатор на жидкую
питательную среду, содержащую крахмал, соевую муку, кукурузный экстракт,
хлорид натрия и карбонат кальция. После завершения процесса
культивирования целевой продукт извлечен из культуральной жидкости
органическим растворителем, реэктрагирован в водную фазу и подвергнут
распылительной сушке. Полупродукт передан в цех химической
трансформации....»
Задача №28
Определите лекарственную субстанцию по описанию технологического
процесса, назовите продуцент и метод его совершенствования, методы
выделения и очистки, способ сушки лекарственной субстанции:
« … продуцент Bacillus polimyxa обработан многократно рентгеновскими и
ультрафиолетовыми лучами,а также азотсодержащими веществами с селекцией
на каждом этапе. Сверхпродуцент помещен в ферментатор на жидкую
питательную среду, содержащую крахмал, соевую муку, кукурузный экстракт,
минеральные соли. После завершения процесса культивирования целевой
продукт извлечен из культуральной жидкости и очищен методом ионообменной
хроматографии. Целевой продукт высушен распылительной сушкой.
Выпускается в таблетках по 500 000 ЕД..»
1. Для чего стремятся получить сверхпродуцент?
2. Их своиства, особенности хранения.
3. Необходимо ли учитывать требования GMP при биосинтезе антибиотиков?
�� &#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;&#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;10 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;5. Методы экстракции и очистки целевого продукта при получении данного
витамина с помощью Propionibacterium freudenreichii и Propionibacterium
shermanii
Задача №22.
В клетках микроорганизмов рода Согуnebacterium и Brevibacterium в процессе
микробиологического синтеза из аспарагиновой кислоты в синтезируется три
аминокислоты, в том числе лизин, имеющий промышленное значение.
Биообъект для данного процесса.
Какие еще аминокислоты образуются в клетках микроорганизмов рода
Согуnebacterium и Brevibacterium из аспарагиновой кислоты наряду с
лизином?
Какой фермент открывает данный метаболический путь, особенности
данного фермента. Понятие «совместное ингибирование».
Метод совершенствования биообъекта, применяемый при синтезе лизина.
Понятия мутанты первого и второго типов, их предназначение и
использование их особенностей.
Задача №23.
В процессе микробиологического синтеза с применением кишечной
палочки получают аминокислоту треонин.
Биообъект, его особенности при регуляции биосинтеза аминокислот.
Строение регуляторной области.
Методы совершенствования биообъекта.
Метод отбора сверхпродуцента.
Задача №24.
При взаимоотношениях аэробных бактерий и фотосинтезирующих
водорослей наблюдаем следующее - бактерии утилизируют О
и углеводы,
выделяя СО
и факторы роста; водоросли используя квант света превращают СО
в О
2
и углеводы.
Определите вид данного взаимоотношения. Определение данного вида
взаимодействия между микроорганизмами.
Как называют такое взаимодействие, когда ни один из штаммов не может
быть без взаимодействия с другим?
Что понимают под комменсализмом?
Сущность амменсализма.
Задача №25
Создание и производство рекомбинантных человеческих инсулинов
существенно повысило эффективность лечения сахарного диабета и обеспечило
повышение качество жизни больных.
Методы очистки полученных рекомбинантных белков- предшественников
цепей А и В в биотехнологическом производстве инсулина по технологии
фирмы «Eli lilly»?
Процесс выделения А и В цепей, их соединение в молекулу инсулина.
��9 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;Задача №19.
Суспензионные культуры широко используются в качестве модельных
систем для изучения путей вторичного метаболизма, индукции ферментов и
экспрессии генов, деградации чужеродных соединений, цитологических
исследований и др.
Дайте определение суспензионной культуры.
Сравните каллусные и суспензионные культуры, указав достоинства и
недостатки для биотехнологии.
Способ получения суспензионной культуры из каллусной ткани.
Культивирование суспензионной культуры в биореакторах. Виды
биореакторов по типу перемешивания. Режимы культивирования
растительных клеток в промышленности.
Предназначение фитогормонов, механизм действия.
Задача №20.
Определите лекарственную субстанцию по описанию технологического
процесса: «Штамм сконструирован методом генной инженерии. Отбор
высокопродуктивных клонов проведен по устойчивости к аналогу целевого
продукта. В качестве аналога использован розеофлавин. Сверхпродуцент
культивируют на питательной среде с мелассой и дрожжевым экстрактом в
течение 25-35 ч. при температуре 37
С в условиях аэрации. Целевой продукт
секретируется в культуральную жидкость в количестве 3,4-4,0 г/л целевого
продукта. Лекарственную субстанцию выделяют из культуральной жидкости по
растворимости в щелочах и кислотах и низкой растворимости в органичных
жидкостях.
Составьте технологическую схему получения данного соединения.
Метод совершенствования выбранного продуцента и отбора
сверхпродуцента
Какие еще продуценты данного вещества вам известны, их достоинства
и недостатки.
Задача №21
Данный витамин является активным гемопоэтическим фактором
млекопитающих и ростовым фактором многих микроорганизмов, состоит из
двух циклических структур и линейного участка. В молекуле данного витамина
металл кобальт связан с первым макроциклом (корриновое ядро). Вторая
кольцевая структура - 5,6-диметилбензимидазол (5,6-ДМБ), связанная с первой
кольцевой структурой гетерогенной боковой цепью, состоящей из изопропанола,
связанного с основанием 5.6- ДМБ М-гликозидной связью.
О каком витамине идет речь?
Используются ли в производстве данного витамина дрожжи и
мицелярные грибы?
Какие продуценты данного витамина вам известны?
Метод совершенствования биообъекта и метод отбора сверхпродуцента
для получения данного витамина с помощью Propionibacterium
freudenreichii и Propionibacterium shermanii
�� &#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;&#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;8 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;1. Какие два подхода для получения инсулина с использованием методов
генетической инженерии вы знаете?
Какой из этих подходов применяется в биотехнологическом
производстве инсулина по технологии фирмы «Eli lilly» (США)?
Какой продуцент применяется в биотехнологическом производстве
инсулина по технологии фирмы «Eli lilly»?
Процесс ферментации при биотехнологическом производстве инсулина
по технологии фирмы «Eli lilly».
Для чего применима дезинтеграция клеток продуцента при
биотехнологическом производстве инсулина по-технологии фирмы
«Eli lilly» (США)?
Задача №1
7.
Культивируемые клетки высших растений могут рассматриваться как
типичные микрообъекты. В основе культивирования растительных клеток
лежит свойство, благодаря которому соматические клетки растения
способны полностью реализовать наследственную информацию, то есть
обеспечить развитие всего растения.
Какое название носит данное свойство растительных клеток?
Какие циклы развития проходит каллусная клетка за весь период
своей жизнедеятельности? Кривая роста и фазы роста каллусной
ткани.
Протопласт - это клетка, лишенная оболочки. Способна ли она к
делению?
При получении каллусных культур сначала готовят маленькие (2—
мм) кусочки растительной ткани, не утратившие способность к
репродукции. Их название. Этапы получения первичного каллуса.
Задача №1
8.
Культуры клеток и тканей для массового размножения растений и
оздоровления посадочного материала, в том числе лекарственных растений,
нашли широкое применение в растениеводстве.
Какой метод позволяет от одной меристемы получить (регенерировать)
достаточно большое количество новых растений, в том числе и в
культуре in vitro? Для осуществления данного метода более подходят
слабодифференцированные или высоко дифференцированные ткани
растения?
Каллусная ткань, определение, биологическая роль.
3. В качестве чего при культивировании растительных клеток используют
2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д), aльфа-нафтилуксусную
кислоту (НУК) ?
4. Какими в зависимости от происхождения и условий выращивания
каллусные ткани бывают по степени плотности?
��7 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;5. Понятие вектора в генной инженерии.
Задача №13.
Важное значение среди гормонов поджелудочной железы играет инсулин. В
настоящий момент расширяются возможности создания рекомбинантного
инсулина.
Биологические функции инсулина
в организме человека.
Строение инсулина.

Биосинтез молекулы инсулина в организме человека из проинсулина.
Какие недостатки производства и применения инсулинов из животного
сырья вы знаете?
Задача №14.
Важной составной частью биотехнологии является генетическая инженерия.
Методы генной инженерии преобразуют клетки бактерий, дрожжей и
млекопитающих в "фабрики" для масштабного производства любого
рекомбинантного белка.
Дайте определение рекомбинантной ДНК.
Какие вы знаете ферменты, применяемые при конструировании
рекомбинантных ДНК?
Особенности контроля качества генно-инженерных препаратов,
показатели качества.
Роль вектора в генной инженерии.
Характеристики векторных систем, важные для переноса необходимых
генов в клетки млекопитающих.
Задача №15.
Исторически первым способом получения инсулина для терапевтических
целей является выделение аналогов этого гормона из природных источников
(островков поджелудочной железы крупного рогатого скота и свиней). В 20-
годах прошлого века было установлено, что бычий и свиной инсулины
(которые являются наиболее близкими к инсулину человека по своему
строению и аминокислотной последовательности) проявляют в организме
человека активность, сравнимую с инсулином человека.
Получение инсулина из тканей свиней является методом
синтетическим или полусинтетическим?
Опишите метод получения инсулина из тканей свиней.
Преимущества человеческого генно-инженерного инсулина
человека по сравнению с произведенным из тканей животного.
Как по международному стандарту определяют активность
инсулина?
Задача №1
6.
Создание и производство рекомбинантных человеческих инсулинов
существенно повысило эффективность лечения сахарного диабета и
обеспечило повышение качество жизни больных.
�� &#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;&#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;6 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;Задача №10.
Ферменты - вещества белковой природы и поэтому неустойчивы при
хранении. Кроме того, ферменты не могут быть использованы многократно из-за
трудностей в отделении их от реагентов и продуктов реакции. В 1916 году
Дж.Нельсон и Е.Гриффин адсорбировали на угле инвертазу и показали, что она
сохраняет в таком виде каталитическую активность.
Изобретение какого процесса воздействия на ферменты с целью
повышения их устойчивости и возможности многократного применения
произошло в 1916г?
Преимущества иммобилизованных ферментов перед нативными.
Основные к требования носителям для получения иммобилизованных
ферментов.
Классификация носителей для получения иммобилизованных ферментов.
Перечислите наиболее распространенные носители из класса углеводов,
известные вам. Назовите основные достоинства и недостатки белков в
качестве носителей для иммобилизации ферментов, наиболее часто
применяемые с этой целью белки.
Задача № 11.
Ощутимый вклад процессы иммобилизации ферментов и клеток внесли в
тонкий органический синтез, в анализ, в медицину, в процессы конверсии
энергии, в пищевую и фармацевтическую промышленности.
Общие направления и достижения применения иммобилизованных
ферментов в пищевой промышленности.
Общие направления и достижения применения иммобилизованных
ферментов в медицине.
Преимущества иммобилизованных клеток перед иммобилизованными
ферментами, перед свободными клетками.
Какие клетки подходят для иммобилизации? Одностадийные и
полиферментные реакции.
Химические и физические методы иммобилизации КЛЕТОК, возможности
применения.
Задача №12.
Генная инженерия появилась благодаря работам многих исследователей в
разных отраслях биохимии и молекулярной генетики. Генная инженерия-
совокупность методов, позволяющих в пробирке переносить генетическую
информацию из одного организма в другой. Перенос генов да
т возможность
преодолевать межвидовые барьеры и передавать отдельные наследственные
признаки одних организмов другим. ЦЕЛЬ - получение клеток, в промышленных
масштабах нарабатывать некоторые белки.
Что представляют из себя плазмиды, их роль в генной инженерии.
Для чего бактериальные клетки вырабатывают рестриктазы?
Сущность процесса клонирования для получения рекомбинантной ДНК с
применением плазмид и рестриктаз.
Основные продуценты, используемые в построении рекомбинантных
белков.
��5 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;1. Назовите основные свойства ферментов, сравните со свойствами
небиологических катализаторов.
Активный и аллостерический центр фермента.
Биообъекты-биокатализаторы.
Классификация ферментов и катализируемых реакций.
Задача № 7.
Фермент липаза почти не синтезируется грибом Asp.awamori на среде без
индуктора, добавление жира кашалота усиливает биосинтез фермента в сотни
раз. При добавлении же в среду крахмала и при полном исключении
минерального фосфора интенсивно синтезируется фосфатаза.
Какие факторы, влияющие на биосинтез ферментов, ВЫ знаете?
Что произойдет при биосинтезе aльфа-амилазы культурой Asp.oryzae в
случае замены сахарозы (как источника углерода) на крахмал, добавления
солодового экстракта (из проросших семян злаковых), или при повышении
концентрации основных элементов питательной среды на 50%?
Какими двумя способами может быть определен оптимальный состав
питательной среды для каждого продуцента?
Каким образом и для чего принято определять активность ферментного
препарата?
Какой класс ферментов зависимости от катализируемых реакций
составляет основную часть среди ферментов, получаемых промышленным
способом?
Задача № 8.
Поверхностный метод культивирования продуцентов ферментов.
При поверхностном методе культура растет на поверхности твердой или
жидкой питательной среде? За счет чего обеспечивается аэрация при этом
способе?
Основные преимущества поверхностной культуры.
Виды посевного материала при поверхностном культивировании
продуцентов ферментов.
Схема очистки при поверхностном культивировании продуцентов
ферментов.
Стандартизация ферментного препарата, определение.
Задача №9.
Рассмотрим процесс биотрансформации дигитоксина в дигоксин за счет
дегидроксилирования углерода-12.
1. Применяются ли при этом иммобилизованные ферменты? Биообъект-
биокатализатор, источники получения
Цели и преимущества использования иммобилизованных клеток растений
в качестве биокатализатора в данном процессе
Реакции, катализируемые биокатализатором
Носители для иммобилизации. Методы имобилизации биокатализатора
Виды биореакторов для процесса с применением иммобилизованного
биокатализатора.
�� &#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;&#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;4 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;микробную клетку исходного микроорганизма, вызвав выраженное подавление
ее жизнедеятельности.
Определите вид скрининга антимикробной структуры для конкретного
патогенна.
Выделите основные этапы скрининга, определите их значение в ходе
скрининга .
Для чего применяется данный вид скрининга антимикробной
структуры.
Что послужит продолжением указанного процесса?
Задача №4.
Стадия ферментации - центральная среди этапов промышленного
производства. Под ферментацией понимают всю совокупность последовательных
операций от внесения в заранее приготовленную и термостатированную среду
инокулята до завершения процессов роста, биосинтеза или биотрансформации.
Какие два вида ферментации вам известны?
С помощью какого оборудования осуществляется ферментация? Его
основные элементы, схематическое изображение.
Как технологическое оформление процессов промышленной
биотехнологии зависти от отношения микроорганизма-продуцента к
кислороду? Три группы биореакторов.
Способы управления процессом ферментации.
Задача № 5.
Установите правильную последовательность стадий и операций
технологического процесса, представленных на схеме, заполните недостающие
операции стадии «Выделение целевого продукта». Предложите методы и
аппаратурное оснащение операции «Дезинтеграция клеток».
Подготовка и стерилизация газового потока
Подготовка и стерилизация оборудования и коммуникаций
Подготовка и стерилизация субстрата
Разделение культуральной суспензии
Обработка культуральной суспензии
Анализ целевого продукта
Дезинтеграция клеток
Выделение индивидуального вещества
Культивирование биообъекта
Подготовка биообъекта
Сушка целевого продукта
Фасовка, упаковка, маркировка лекарственной субстанции
Выделение целевого продукта
Биологическая очистка отходов
Задача № 6.
Ферменты — биологические катализаторы биохимических реакций в живых
клетках.
��3 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;СИТУАЦИОННЫЕ ЗАДАЧИ
Задача №1.
Эритромицин, являющийся "золотым стандартом" среди антибиотиков
класса макролидов, обладает высокой активностью прежде всего против
грамположительных кокков, таких как
-гемолитический стрептококк группы A
S.pyogenes
), пневмококк (
S.pneumoniae
), золотистый стафилококк (
S.aureus
),
исключая метициллинорезистентные штаммы последнего. Кроме того, он
хорошо действует на возбудителя коклюша (
B.pertussis
), дифтерийную палочку
C.diphtheriae
), моракселлу (
M.catarrhalis
), легионеллы (
Legionella
spp.),
кампилобактеры (
Campylobacter
spp.), листерии (
Listeria
spp.), хламидии
C.trachomatis, C.pneumoniae
), микоплазмы (
M.pneumoniae
), уреаплазмы
U.urealyticum
Эритромицин умеренно активен против гемофильной палочки (
H.influenzae
),
боррелий (
B.burgdorferi
) и некоторых бактероидов, включая
B.fragilis
. В то же
время он практически не действует на грамотрицательные бактерии семейства
Enterobacteriaceae, Pseudomonas
spp. и
Acinetobacter
spp., поскольку не проникает
через оболочку клеток данных микроорганизмов.
Механизм и характер антимикробного действия макролидов.
Каков характер антимикробного действия макролидов.
Для каких еще групп антибиотиков характерно также связывание с 50S-
субъединицами рибосом микроорганизма? Возможно ли их совместное
назначение?
Какие методы определения чувствительности микроорганизмов к
макролидам Вы знаете?
Задача №2.
В процессе биосинтеза антибиотика из группы аминогликозидов при
культивировании продуцента состав питательной среды включал соевую муку,
кукурузный экстракт, повышающий эффективность ферментации и соли. Подача
газового потока, источники фосфатов и азота соответствовали требованиям. При
добавлении в среду некоторого количества глюкозы биосинтез был ослаблен.
В результате чего добавление в среду глюкозы снизило эффективность
биосинтеза антибиотика? Какое название носит данный эффект, его
сущность?
Какие общие закономерности необходимо учитывать при культивировании
большинства продуцентов вторичных метаболитов?
Какие углеводороды наиболее благоприятны для биосинтеза
антибиотиков?
Задача №3.
В процессе биотехнологического процесса из ядра клетки патогенного для
человека микроорганизма выделен геном, в котором был выбран определенный
ген (участок нуклеиновой кислоты микроорганизма). Данный ген размножен с
применением ПЦР. В базе антимикробных агентов выбран один,
взаимодействие с которым подавило активность гена наиболее эффективно.
Затем выбранный из антимикробный агент был опробован в действии на целую
�� &#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;&#x/Att;¬he; [/; ott;&#xom ];&#x/Typ; /P; gin; tio;&#xn 00;2 &#x/MCI; 0 ;&#x/MCI; 0 ;УДК 615.12 (076)
52.82
Б 63
Биотехнология
:
. ситуационных задач с эталонами ответов для студентов
5 курса, обучающихся по спец. 060108 – фармация / сост.
Гребенникова,
В. Хамцова. – Красноярск : тип. КрасГМУ, 2011. – 73
Составители:
д.м.н. профессор Гребенникова В.В.
ассистент Хамцова И.В.
Ситуационные задачи с эталонами ответов полностью соответствуют
требованиям Государственного образовательного стандарта (2000) высшего
профессионального образования по специальности 060108 – Фармация;
адаптированы к образовательным технологиям с учетом специфики обучения
по специальности 060108 – Фармация.
Рецензенты
зав. кафедрой биологической химии с курсом медицинской,
фармацевтической и токсикологической химии
ГОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого,
д.м.н., профессор Салмина А.Б.
зав. кафедрой патологической физиологии
им. профессора В.В. Иванова ГОУ ВПО КрасГМУ
им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого, д.м.н. Рукша Т.Г.
Утверждено к печати ЦКМС КрасГМУ (протокол №
от 28.04.
)
КрасГМУ
2011
ГОУ ВПО
«Красноярский государственный медицинский
университет
им. проф. В.Ф. Войно
Ясенецкого
Министерства здравоохранения и
социального
развития Рос
сийской Федерации
Кафедра фармакологии с курсами клинической фармакологии,
фармацевтической технологии и ПО
БИОТЕХНОЛОГИЯ
сборник ситуационных задач с эталонами ответов для студентов 5 курса,
обучающихся по специальности 060108 – Фармация
Красноярск
2011

Приложенные файлы

  • pdf 8841711
    Размер файла: 969 kB Загрузок: 2

Добавить комментарий