Биотехнология в животноводстве

Стимуляция охоты у овец во внеслучной сезон достигается путем обработки гонадотропными гормонами без предварительной обработки или с предварительной обработкой прогестероном в виде многократных подкожных инъекций прогестерона в масляном растворе или путем использования внутривлагалищных пессариев, пропитанных прогестагеном.
Схема гормональной обработки может быть следующая. Во внеслучной сезон овцам вводят внутривлагалищные пессарии, пропитанные одним из прогестагенов (флюгестерон аустат-ФГА, кронолон, медрокси-прогестерон ацетат-МАП) на 14 дней. Во время удаления пессариев инъецируют 500 и. е. СЖК. Овцы приходят в охоту в течение двух дней после обработки. По меньшей мере 60 % овец, осемененных в июне или июле после такой обработки, дают приплод. При этом важно, чтобы при естественном осеменении было не меньше одного барана на десять обработанных овец и допуск баранов к овцам проведен не ранее чем через 48 ч после окончания обработки.
Лошади. Однократная инъекция кобылам 1,2510 мг простаг-ландина Фга или две внутримышечные инъекции 300600 мкг синтетического аналога простагландина JCJ 79939 вызывают охоту в течение трех дней, если вводятся во время сформированного желтого тела. Как и у коровы, желтое тело кобылы является невосприимчивым к действию простагландинов примерно до 5-дневного возраста и поэтому обработка кобыл простагландином в первые четыре дня полового цикла неэффективна.
Несмотря на то что простагландин хорошо синхронизирует охоту у кобыл в течение 3 дней после обработки, овуляция синхронизируется менее точно (712 дней после обработки) ввиду значительных индивидуальных колебаний продолжительности охоты у этого вида животных. Эти колебания в сроках проявления овуляции, однако, можно в значительной степени уменьшить путем введения ХГ или ГН РГ на 2-й или 3-й день после начала охоты. Внутривенное введение, к примеру, 20002500 и.е. ХГ вызывает овуляцию у 90 % животных через 3648 ч после инъекции ХГ и благодаря этому сокращает число осеменений в одну охоту с 2,7 до 1,8 при одновременном повышении оплодотворяемости с 50 до 56 %.
5.2. КЛЕТОЧНАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ 5.2.1. Трансплантация эмбрионов
Разработка метода искусственного осеменения сельскохозяйственных животных и его практическое применение обеспечили большой успех в области улучшения генетики животных. Использование этого метода в сочетании с длительным хранением семени в замороженном состоянии открыло возможность получения десятков тысяч потомков от одного 200
производителя в год. Этот прием, по существу, решает проблему рационального использования производителей в практике животноводства.
Что касается самок, то традиционные методы разведения животных позволяют получать от них лишь несколько потомков за всю жизнь. Низкий уровень воспроизводства у самок и длительный интервал времени между поколениями (67 лет у крупного рогатого скота) ограничивают генетический процесс в животноводстве. Решение этой проблемы ученые видят в применении метода трансплантации эмбрионов. Суть метода состоит в том, что генетически выдающиеся самки освобождаются от необходимости вынашивания плода и вскармливания потомства. Кроме того, их стимулируют с целью увеличения выхода яйцеклеток, которые затем извлекают на стадии ранних зародышей и пересаживают менее ценным в генетическом отношении реципиентам.
Технология трансплантации эмбрионов включает такие основные звенья, как вызывание суперовуляции, искусственное осеменение донора, извлечение эмбрионов (хирургическое или нехирургическое), оценка их качества, кратковременное или длительное хранение и пересадка.
Стимуляция суперовуляции. Самки млекопитающих рождаются с большим (несколько десятков и даже сотен тысяч) числом половых клеток. Большинство из них постепенно погибают в результате атрезии фолликулов. Только небольшое число примордиальных фолликулов переходят в антральные в процессе роста. Однако практически все растущие фолликулы реагируют на гонадотропную стимуляцию, которая приводит их к конечному созреванию. Обработка самок гонадотропинами в фолликулярной фазе полового цикла или в лютеиновой фазе цикла в сочетании с индуцированием регрессии желтого тела простагландином Ф2 (ПГФ2) или его аналогами приводит к множественной овуляции или так называемой суперовуляции.
Крупный рогатый скот. Индукцию суперовуляции у самок крупного рогатого скота проводят обработкой гонадотропинами, фолликулостимулирующим гормоном (ФСГ) или сывороткой крови жеребой кобылы (СЖК), начиная с 914-го дня полового цикла. Через 23 дня после начала обработки животным вводят простагландин Ф2а или его аналоги, чтобы вызвать регрессию желтого тела.
Проведены многочисленные испытания разных схем гормональной обработки коров и телок с целью индукции полиовуляции. Наиболее широко в этих целях используют СЖК в дозе 2,53,0 тыс. и.е. Известно, что период полужизни эндогенного СЖК у кобыл, установленный гистерек-томией, составляет около 6 дней, а при использовании радиоиммунологического метода выявлено наличие двух комплексов в СЖК один с периодом полужизни 40,051,2 ч, второй118,4129,4 ч.
Это свойство СЖК позволяет ограничиться однократным введением его животным при вызывании суперовуляции и вместе с тем может иметь отрицательный эффект вследствие длительного действия на функцию
201
яичников не только в период, предшествующий охоте, но и после нее. Это приводит к нарушению нормального уровня половых гормонов и особенно их соотношения в организме животных.
Для устранения этого нежелательного свойства СЖК в последнее время применяют антитела к гонадотропину с целью увеличения числа и улучшения качества эмбрионов, полученных при суперовуляции.
Введение во время охоты коровам, обработанным 3000 и.е. СЖК на 10-й день цикла и 37,5 мг ПГФ2 на 12-й день, моноклональных антител или овечьей антисыворотки к СЖК уменьшило число неовулировавших фолл икулов (1,7 и 2,7 против 6,5 фолликула в контроле) и повысило опло-дотворяемость (>80 % против 60 % в контроле). Уровень эстрогенов в крови коров резко понижался вскоре после введения антисыворотки и оставался низким до извлечения эмбрионов, тогда как у контрольных животных уровень эстрогенов не снижался до базального уровня во время охоты и снова увеличивался после охоты (Дж. Мауэрт и др., 1985).
Для стимуляции полиовуляции у коров наряду с СЖК применяют ги-пофизарные гонадотропины. С этой целью используют очищенный ФСГ отдельно или в сочетании с ЛГ. В отличие от СЖК препараты ФСГ и ЛГ вводят дважды в день в течение 45 сут.
Наиболее распространенная схема гормональной обработки коров-доноров, применяемая в коммерческих целях, представлена в табл. 5.2. При этом охота наступает через 4050 ч после первой инъекции ПГФ2с(. Осеменение проводят через 12 и 24 ч после наступления охоты. Эмбрионы извлекают нехирургическим способом через 77,5 дня после осеменения.
Таблица 5.2. Схема обработки коров гонадотропинами (по В. Хансел, Б.А. Хилва, 1985)

День обработки

ФСГ


ПГФ2„



доза, мг

время
суток, ч
доза, мг

время суток, ч

1
6

7;
18




::- 2 :
4

7;
18
"
·



з "
·
·
·
·
·
' 2

7;
18

·-
·- 10 '-
·'

7


·'
·' 4 'г>'-
"' 2

7;
18
12

12; 18

В связи с тем, что сроки овуляции у гормонально обработанных животных увеличиваются, изменяется и технология их осеменения. Первоначально рекомендовалось многократное осеменение коров с использованием нескольких доз спермы. Обычно вводят 50 млн. живых сперматозоидов в начале охоты и через 1220 ч осеменение повторяют. Более детальное изучение этого вопроса показало, что высокая эффективность оплодотворения может быть достигнута и при использовании одной дозы семени, если ее вводить через 24 ч после начала охоты.
Овцы. Принципы вызывания суперовуляции у овец те же, что и у крупного рогатого скота: СЖК или ФСГ вводят в конце лютеиновой фазы 202
полового цикла (на 1113-й день) или в лютеиновую фазу цикла вместе с обработкой простагландином или во время окончания обработки прогестагенами. СЖК вводят в дозе 2045 и.е. на кг массы тела, или до 2000 и.е. на одну овцу. Например, аналог простагландина простенол в дозе 100 мкг вводят между 4-м и 13-м днями полового цикла через 2472 ч после обработки СЖК. Охота наступает через 24 дня после обработки простагландином. ФСГ предпочтительнее вводить два раза в день в течение двух дней в уменьшающейся дозе (6,53,2 мг) по сравнению с обработкой равными дозами.
Свиньи. У свиней, являющихся многоплодными животными, большое число эмбрионов может быть получено без гормональной обработки. Однако число овуляций у свиней может быть увеличено после гормональной обработки.
Лошади. Еще не разработаны надежные методы индукции суперовуляции у кобыл, однако получение достаточного числа эмбрионов у них не составляет большого труда ввиду простоты нехирургического извлечения и повторного получения эмбрионов в каждый половой цикл.
Извлечение эмбрионов. Эмбрионы крупного рогатого скота поступают из яйцевода в матку между 4-м и 5-м днем после начала охоты (между 3-м и 4-м днем после овуляции), хотя у суперовулировавших коров небольшая часть эмбрионов остается в яйцеводе до 7-го дня. Сроками продвижения эмбрионов в половом тракте коровы и определяется извлечение их из яйцевода или рогов матки.
В связи с тем, что нехирургическое извлечение возможно только из рогов матки, то эмбрионы извлекают не ранее 5-го дня после начала охоты.
Несмотря на то что при хирургическом извлечении эмбрионов у крупного рогатого скота достигнуты отличные результаты, этот метод неэффективен относительно дорогостоящий, неудобный для применения в условиях производства.
Нехирургическое извлечение эмбрионов состоит в следующем (рис. 5.1). Гибкий катетер с надувной манжеткой вводят во влагалище и через шейку матки в один из рогов матки. Манжетка надувается и закрывает каудальный выход рога матки, тем самым ограничивая промывную полость. Катетер может быть двухканальным, что позволяет проводить проточное прохождение промывной жидкости. При использовании однока-нального катетера промывная жидкость вводится несколько раз (58 раз) и затем вытекает из рога матки. В обоих случаях вводят 200300 мл фосфатного буфера Дюльбекко.
Наиболее оптимальные сроки для извлечения эмбрионов 68-й день после начала охоты, так как ранние бластоцисты этого возраста наиболее пригодны для глубокого замораживания и могут быть с высокой эффективностью пересажены нехирургическим способом. Корову-доно-ра используют 68 раз в год, извлекая по 36 эмбрионов.
203

Рис. 5.1. Схема промывания матки крупного рогатого скота:
/ флакон с физиологической средой; 2 иглы; 3 воздушный фильтр; 4 шприц; 5 двухпози-ционный краник или клапанное устройство; 6 трубки; 7 сосуд для сбора смыва; 8 безманжетный катетер, введенный в рог матки; 9 шейка матки; 10 рог матки; // яичник (стрелками показано направление движения жидкости; А место пережатия рога матки)
У овец и свиней нехирургическое извлечение эмбрионов невозможно ввиду трудности прохождения катетера через шейку в рога матки. Одна ко хирургическая операция у этих видов животных относительно проста и непродолжительна. Доступ к репродуктивному тракту осуществляется лапаротомией по белой линии живота. У свиней 1-, 2- и 4-клеточные эм брионы извлекают из яйцеводов в течение 40 ч после овуляции. При этом стеклянную канюлю вставляют в истмус через маленькое отверстие в верхушке рога матки. Через канюлю вводят 2030 мл промывной жид кости и собирают ее из ампулярного конца яйцевода в чашку Петри. Для извлечения эмбрионов из матки промывают яйцевод и верхушку рога матки. Рог матки пережимают и канюлю вставляют в рог матки. Обычно для вымывания используют среду Дюльбекко с лактатом, пируватом и бычьим сывороточным альбумином. Эмбрионы свиней можно извлекать до 12-го дня после начала охоты. Эффективность извлечения эмбрионов обычно высокая (около 95 %). Можно делать 34 операции на одном жи вотном (С. Полдж, 1982). ;, -.., ,;.. 204

: Рис. 5.2. Схема нехирургической пересадки эмбрионов корове: / прямая кишка; 2 тело матки; 3 яичники; 4 шейка матки; 5 катетер
При извлечении эмбрионов у овец в ампулярный конец яйцевода вводят стеклянную или полиэтиленовую канюлю и промывают из рога матки в яйцевод. Независимо от времени вымывания поле охоты эффективность извлечения эмбрионов составляет около 80 %.
Пересадка эмбрионов. Параллельно с разработкой хирургического метода извлечения эмбрионов у крупного рогатого скота значительный прогресс был достигнут и в нехирургической пересадке эмбрионов (рис. 5.2). В пайету набирают свежую питательную среду (столбик длиной 1,01,3 см), затем небольшой пузырек воздуха (0,5 см) и далее основной объем среды с эмбрионом (23 см). После этого засасывают немного воздуха (0,5 см) и питательную среду (1,01,5 см). Пайету с эмбрионом помещают в катетер Кассу и до момента пересадки хранят в термостате при 37°С. Далее под ректальным контролем катетер пропускают через шейку матки и осторожно вводят в рог матки на расстоянии 57 см от ее тела. Нажатием на шток катетера выдавливают содержимое пайеты вместе с эмбрионом в рог матки.
Эффективность пересадки эмбрионов в значительной степени определяется синхронностью проявления охоты у донора и реципиента. У крупного рогатого скота максимальное число беременностей получают после синхронной пересадки.
Введение эмбрионов в оба рога матки обеспечивает высокую эффек тивность пересадки. Этот прием успешно используют для получения двойневости. Процедура получения двойневости включает пересадку 7-дневных эмбрионов осемененному животному в рог, противополож ный яичнику с желтым телом. , ,, ;;. ..
·
·
·.-
205
Нехирургическая пересадка эмбрионов разработана также для кобыл. Высокая эффективность нехирургической пересадки эмбрионов у лошадей была достигнута между 6-м и 8-м днями после овуляции.
У овец и свиней пересадку эмбрионов проводят только хирургическим способом. У реципиентов используется аналогичный хирургический подход, как и у доноров. Эмбрионы пересаживают в яйцевод или матку в зависимости от стадии развития.
Эмбрионы овцы, извлеченные на 14-й день после охоты, пересаживают в яйцевод, а эмбрионы более старшего возраста в матку. Прижив-ляемость составляет 7075 %.
У свиней приживляемость эмбрионов не снижается, если двухклеточ-ные эмбрионы извлекают из яйцевода и пересаживают в матку реципиента на той же стадии развития. Эмбрионы свиньи рекомендуется пересаживать только в один рог матки, так как они мигрируют и распределяются в обоих рогах матки. После пересадки 25-дневных эмбрионов приживляемость составляет 6070 %. Пересадка эмбрионов свиней на более поздних стадиях развития (78-дневных) сопровождается либо отсутствием беременности, либо значительным снижением приживляемости (С. Полдж, 1982).
Хранение эмбрионов. Применение метода трансплантации эмбрионов потребовало разработки эффективных методов их хранения в период между извлечением и пересадкой. В производственных условиях эмбрионы обычно извлекают утром, а пересаживают в конце дня. Для хранения эмбрионов в течение этого времени используют фосфатный буфер с некоторыми модификациями при добавлении эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота и при комнатной температуре или температуре 37°С.
Наблюдения показывают, что эмбрионы крупного рогатого скота можно культивировать in vitro до 24 ч без заметного снижения их последующей приживляемости.
Пересадка эмбрионов свиней, культивируемых 24 ч, сопровождается нормальной приживляемостью.
Выживаемость эмбрионов в определенной степени может быть увеличена охлаждением их ниже температуры тела. Чувствительность эмбрионов к охлаждению зависит от вида животного.
Эмбрионы свиней особенно чувствительны к охлаждению. Пока не удалось сохранить жизнеспособность эмбрионов свиней на ранних стадиях развития после охлаждения их ниже 1015°С (С. Полдж, 1982).
Эмбрионы крупного рогатого скота на ранних стадиях развития также очень чувствительны к охлаждению до 0°С. Однако на более поздних стадиях развития, таких как морула или бластоциста, они хорошо выдерживают охлаждение.
Эмбрионы овец хорошо переносят охлаждение до 0°С на любых стадиях развития, от одно-, двухклеточной стадии до бластоцисты. Пониже-206
ние температуры хранения эмбрионов от 37°С до 10° и 0°С угнетает или останавливает их развитие, но обменные процессы протекают на уровне, обеспечивающем хранение до 56 сут. Для длительного хранения эмбрионов необходимо не только затормозить их развитие, но и значительно снизить или полностью остановить обменные процессы. Такое состояние эмбрионов достигается при температуре 195°С или ниже.
Эксперименты последних лет позволили определить оптимальные соотношения между скоростью охлаждения и оттаивания эмбрионов крупного рогатого скота. Установлено, что если эмбрионы охлаждают медленно (1°С/мин) до очень низкой температуры (ниже 50°С) с последующим переносом в жидкий азот, то они требуют и медленного оттаивания (25°С/мин или медленнее). Быстрое оттаивание таких эмбрионов может вызвать осмотическую регидратацию и разрушение. Если эмбрионы замораживают медленно (1°С/мин) только до - 25 и 40°С с последующим переносом в жидкий азот, то их можно оттаивать очень быстро (300°С/мин). В этом случае остаточная вода при переносе в жидкий азот трансформируется в стекловидное состояние (С. Вилладсен, 1980).
Выявление этих факторов привело к упрощению процедуры замораживания и оттаивания эмбрионов крупного рогатого скота. В частности, оттаивают эмбрионы, как и сперму, в теплой воде при 35°С в течение 20 с непосредственно перед пересадкой без применения специального оборудования с заданной скоростью повышения температуры.
В последние годы установлено, что замороженные и оттаявшие эмбрионы могут быть успешно разбавлены одноступенчато в пайете, где они были заморожены. Сущность метода состоит в следующем. Заморо-женно-оттаянные эмбрионы переносят одноступенчато из раствора криопротектора, в частности 1,5 М глицерина в фосфатном буфере, в котором они были заморожены, в среду, содержащую гипертонический раствор не проникающего в клетку соединения, каким является сахароза. Это обеспечивает постепенное удаление криопротектора из эмбриона без нарушения осмотического равновесия в 0,02 мл 1,5 М глицерина.
С помощью воздушных пузырьков пайету делят натри камеры: в первой раствор криопротектора; во второй эмбрион в растворе криопротектора; в третьей растворитель (1,08 М раствор сахарозы). После замораживания и оттаивания содержимое пайеты перемешивают встряхиванием. Затем эмбрион может быть пересажен из пайеты нехирургическим способом реципиенту. Этот метод позволяет пересаживать заморо-женно-оттаянные эмбрионы по типу искусственного осеменения. Сравнение методов одноступенчатого и многоступенчатого оттаивания эмбрионов показало, что оба они дают одинаковые результаты.
Успешное замораживание и оттаивание эмбрионов овец впервые было проведено С. Вилладсен и др. (1974). Эмбрионы медленно охлаждали (от 0,3 до 2,0°С/мин) и медленно оттаивали (от 4 до 25°С/ мин). В качестве криопротектора применяли ДМСО. Позднее установлено, что при
207
использовании 1,5 М ДМСО в фосфатном буфере замораживание со скоростью 1°С/мин до - 120°С сопровождалось выживаемостью эмбрионов только в том случае, если применялось быстрое оттаивание (360°С/мин). Однако при замораживании со скоростью 0,3°С/мин была сохранена выживаемость эмбрионов как при быстром, так и при медленном оттаивании (10 или 4°С/мин). При дальнейшем уменьшении скорости замораживания до 0,1°С/мин в интервале температур между - 30 и - 60°С медленное оттаивание было обязательным.
Первый жеребенок был получен после пересадки 11 замороженно-от-таянных эмбрионов, извлеченных на 6-й день после овуляции. Сообщалось о получении двух жеребят после хирургической пересадки четырех шестидневных замороженных эмбрионов трем реципиентам.
Таким образом, установлено, что эмбрионы крупного рогатого скота в первые дни развития особенно чувствительны к охлаждению, но когда они достигают стадии бластоцисты, то устойчивы к охлаждению в более широком диапазоне стадий развития. У свиней ни на одной стадии развития эмбрионы не выживают после охлаждения их до температуры ниже 1015°С. Достигнуто успешное замораживание до - 196°С и оттаивание эмбрионов крупного рогатого скота, овец и лошадей на стадиях морулы и бластоцисты с получением живого потомства у всех трех видов животных. На практике этот прием используют пока при разведении крупного рогатого скота.
5.2.2. Оплодотворение яйцеклеток вне организма животного
Разработка системы оплодотворения и обеспечения ранних стадий развития эмбрионов млекопитающих вне организма животного (in vitro) имеет огромное значение в решении ряда научных задач и практических вопросов, направленных на повышение эффективности разведения животных.
Система оплодотворения in vitro может быть использована прежде всего как ценный аналитический инструмент для изучения биохимических и физиологических факторов, включающихся в процесс оплодотворения, соединения мужской и женской гамет. Только с освоением техники оплодотворения вне организма появилась реальная возможность для широкого развертывания исследований по генной и клеточной инженерии и особенно сельскохозяйственных животных. Для этих целей необходимы эмбрионы на ранних стадиях развития, которые можно извлечь только хирургическими методами из яйцеводов, что является трудоемким и не дает достаточного числа зародышей для проведения этой работы. К тому же существующие методы гормональной регуляции воспроизводительной функции у сельскохозяйственных животных не позволяют достичь высокой точности контроля времени овуляции и вследствие это-208
го получить достаточное число эмбрионов на желаемой стадии развития. Методы клеточной и генной инженерии на животных предусматривают также проведение длительных манипуляций с гаметами и эмбрионами вне организма. Все эти проблемы могут быть решены в значительной степени с использованием системы оплодотворения яйцеклеток млекопитающих вне организма.
Оплодотворение яйцеклеток млекопитающих in vitro включает следующие основные этапы: созревание ооцитов, капацитацию сперматозоидов, оплодотворение и обеспечение ранних стадий развития.
Созревание ооцитов in vitro. Большое число половых клеток в яичниках млекопитающих, в частности у крупного рогатого скота, овец и свиней с высоким генетическим потенциалом, представляет источник огромного потенциала воспроизводительной способности этих животных в ускорении генетического прогресса по сравнению с использованием возможностей нормальной овуляции. У этих видов животных, как и других млекопитающих, число ооцитов, овулирующих спонтанно во время охоты, составляет только незначительную часть от тысяч ооцитов, находящихся в яичнике при рождении животного. Остальные ооциты регенерируют внутри яичника или, как говорят обычно, подвергаются атрезии. Естественно возникал вопрос, нельзя ли выделить ооциты из яичников путем соответствующей обработки и провести их дальнейшее оплодотворение вне организма животного. В настоящее время не разработаны методы использования всего запаса ооцитов в яичниках животных, но значительное число ооцитов может быть получено из полостных фолликулов для дальнейшего их созревания и оплодотворения вне организма.
Явление спонтанного возобновления мейоза ооцитов, выделенных из фолликулов кролика и помещенных в культуральную среду, было впервые открыто Г. Пинкусом и Н. Энзманом (1935).
Известно, что после выделения ооцита из фолликула, как и после выброса эндогенного ЛГ в организме животного перед овуляцией, ооцит освобождается из состояния мейотического торможения, что сопровождается так называемым разрывом зародышевого пузырька. В организме крупного рогатого скота разрыв зародышевого пузырька происходит примерно через 5 ч после выброса ЛГ, ооцит достигает метафазы I через 12 ч и метафазы II через 2425 ч. Вне организма ядерная мембрана зародышевого пузырька крупного рогатого скота также исчезает через 56 ч, через 12 ч хромосомы достигают метафазы I и через 2024 ч метафазы II.
Видовые различия в проявлении мейотического созревания ооцитов у коров, овец и свиней показаны в табл. 5.3.
Хотя большинство ооцитов, извлеченных из фолликулов яичников, возобновляют мейоз и достигают метафазы II, оплодотворение их часто не обеспечивает полноценного развития зародышей. Предполагают, что основной причиной этого является неполноценное созревание ооцитов.
209

Одной из причин может быть то, что при созревании ооцита in vitro в цитоплазме не вырабатывается в достаточной мере фактор, контролирующий формирование и развитие мужского пронуклеуса. Считают, что для появления в цитоплазме ооцита фактора, вызывающего созревание мужского пронуклеуса, необходимо обеспечить индуктивное влияние нормального окружения ооцита в фолликуле в течение не менее 6 ч после начала мейотического созревания.
Таблица 5.3. Временные параметры проявления стадий мейоза ядра ооцитов разных видов животных на пре.ювуля горный выброс гонадотропинов
(Хантер, 1980)

Вид
Латентный период после стимуляции, ч
Стадии мейотического созревания, ч

животного


метафаза I
анафаза
телофаза
метафаза 11

Корова Овца Свинья
1012 1011 1718
1421 1220 2634
22 21
35 i;':
23 22 -' 36
24 24
37 "

Это было подтверждено в опытах по оплодотворению in vitro ооцитов свиней, извлеченных из фолликулов на разных стадиях мейоза. С про-грессированием стадии развития в момент извлечения ооцита из фолликула повышался процент нормально оплодотворенных зародышей: нормальное оплодотворение имело место у 31,7; 51,6 и 78,2 % культивируемых ооцитов со стадии зародышевого пузырька, диакинеза и метафазы I соответственно.
Установлено, что стероидные гормоны не требуются для запуска мейоза у млекопитающих, но необходимы для полного физиологического созревания ооцита.
В связи с тем что стероидные гормоны и другие факторы, вырабатываемые фолликулярными клетками, оказывают влияние на созревание ооцитов, было сделано предположение, что культивирование ооцитов с фолликулярными клетками может повысить их способность к нормальному оплодотворению и последующему эмбриональному развитию. Многие явления внутри фолликула, включая биосинтез стероидов и синтез белков, регулируют гонадотропные гормоны. Поэтому при культивировании ооцитов внутри фолликулов или с фолликулярными клетками гонадотропины должны быть обязательной составной частью среды.
Необходимость прямого контакта между соматическими (фолликулярными) клетками и половыми клетками обусловлена целым рядом причин. Фолликулярные клетки играют важную роль в питании ооцита. Они обеспечивают энергетический субстрат ооциту, участвуют в переносе некоторых предшественников аминокислот, нуклеотидов и фосфолипидов в ооцит, генерируют инструктивные сигналы, которые влияют на ядро и прямой синтез определенных структурных белков. Инструктивные сигналы, требуемые для созревания ооцитов, как было показано выше, наиболее важны в первые 68 ч после инициации. 210
.» В настоящее время применение на практике нашло созревание in vitro только ооцитов крупного рогатого скота. Ооциты получают из яичников коров после убоя животных и путем прижизненного извлечения, 12 раза в неделю. В первом случае яичники берут от животных после убоя, доставляют в лабораторию в термостатированном контейнере в течение 1,52,0 ч. В лаборатории яичники дважды промывают свежим фосфатным буфером. Ооциты извлекают из фолликулов, диаметр которых 26 мм, путем отсасывания или разрезания яичника на пластинки. Ооциты собирают в среду ТСМ 199 с добавлением 10 % сыворотки крови от коровы в охоте, затем дважды промывают и отбирают для дальнейшего созревания in vitro только ооциты с компактным кумулюсом и однородной цитоплазмой.
В последнее время разработан способ прижизненного извлечения ооцитов из яичников коров с помощью ультразвукового прибора или лапароскопа. При этом ооциты отсасывают из фолликулов, диаметр которых не менее 2 мм, 12 раза в неделю от одного и того же животного. В среднем получают однократно 56 ооцитов на животное. Менее 50 % ооцитов пригодны для созревания in vitro.
Несмотря на низкий выход ооцитов, при каждом извлечении возможность многократного использования животного, с учетом информации о происхождении полученных ооцитов, открывает новые перспективы применения метода оплодотворения in vitro в практических целях.
Отобранные ооциты с компактным кумулюсом созревают в течение 24 ч в среде ТСМ 199 с добавлением 20 %-ной обработанной теплом сыворотки крови от коровы в охоте, гранулезных клеток (35
· 106 клеток в 1 мл) и небольшого количества антибиотиков (50 и.е. пенициллина, 50 мкг стрептомицина на 1 мл). Гранулезные клетки собирают из среды, в которой ооциты отделяют от фолликулов и центрифугируют дважды по 5 мин при 500g. Осадок гранулезных клеток суспендируется в среде для созревания. Сокультивирование ооцитов и гранулезных клеток проводят при 38,5°С в атмосфере 5 % СОг в чашках Петри в 2 мл среды.
Капацитация сперматозоидов. Важным этапом в разработке метода оплодотворения у млекопитающих было открытие явления капацитации спермиев. В 1951 г. М.К. Чанг и одновременно с ним Г.Р. Аустин установили, что оплодотворение у млекопитающих наступает только в том случае, если спермин в течение нескольких часов до овуляции находятся в яйцеводе животного. Основываясь на наблюдениях по изучению проникновения спермиев яйцеклетки крысы в различные сроки после спаривания Аустин ввел термин капацитации. Он означает, что в спермин должны произойти некоторые физиологические изменения до того, как сперматозоид приобретет способность к оплодотворению.
В последующих исследованиях в лаборатории М.К. Чанга были не только определены оптимальные условия капацитации спермиев в половом тракте самки, но и продемонстрирована возможность декапацитации
211
спермиев кролика, извлеченных из матки, обработанной семенной плазмой кролика, человека и быка, рекапацитации этих спермиев при внесении их в яйцеводы и, наконец, удаления декапацитирующего фактора из семенной плазмы центрифугированием.
Капацитация включает начальное изменение мембраны спермия, что позволяет ему пройти вторую фазу (акросомную реакцию), а также слияние плазменной и внешней акросомной мембран. В настоящее время первую фазу обозначают как собственно капацитацию, а вторую как акросомную реакцию.
Показано, что у спермиев крупного рогатого скота происходит акро-сомная реакция исключительно в ампуле яйцевода, расположенной ипси-латериально к стороне яичника с овуляцией, и только во время или непосредственно после овуляции. Эти наблюдения дают основание предполагать, что капацитация происходит преимущественно в яйцеводе, расположенном на той же стороне, что и яичник с овулирующим фолликулом. Установлено также, что содержимое, извлеченное из яйцевода во время эструса, но не в лютеиновую фазу полового цикла у овец, вызывает капацитацию и акросомную реакцию спермиев быка.
Глюкозоаминоглюканы in vitro вызывают акросомную реакцию или капацитацию бычьих эпидидимальных спермиев. При анализе глюкозоа-миноклюканов в смывах яйцеводов крупного рогатого скота выявлена концентрация гепариноподобного материала.
В опытах in vitro установлено, что гепарин наиболее потенциальный глюкозоаминоглюкан по способности взывать акросомную реакцию у эпидидимальных спермиев быка и капацитацию эякулированных спермиев.
В организме коровы все спермин, прикрепленные к прозрачной оболочке, были с акросомной реакцией. Кроме того, с помощью электронной микроскопии обнаружено, что спермин быка, найденные в окружении и непосредственно в кумулюсной массе, в яйцеводе сохранили акросомы в полном объеме и только спермин, прикрепленные к прозрачной оболочке, имели акросомную реакцию. Эти данные свидетельствуют о том, что спермин быка капацитируются в яйцеводе, а оплодотворяющий спермий завершает акросомную реакцию около или в прозрачной оболочке.
Разработано несколько методов капацитации эякулированных спермиев домашних животных. Для удаления белков с поверхности спермиев, которые, по-видимому, тормозят капацитацию спермиев, была использована среда с высокой ионной силой.
Однако наибольшее признание получил способ капацитации сперматозоидов с использованием гепарина (Дж. Парриш и др., 1985). Пайеты с замороженным семенем быка оттаивают в водяной бане при 39°С в течение 3040 с. Примерно 250 мкл оттаянного семени подслаивают под 1 мл среды для капацитации. Среда для капацитации состоит из модифицированной среды Тиройда, без ионов кальция. После инкубации в тече-212
ние одного часа верхний слой среды объемом 0,50,8 мл, содержащий большинство подвижных сперматозоидов, удаляют из пробирки и промывают дважды центрифугированием при 500 g в течение 710 мин. После 15 мин инкубации с гепарином (200 мкг/мл) суспензию разбавляют до концентрации 50 миллионов сперматозоидов в мл.
В Биотехцентре (Н.М. Сураева) было показано, что концентрация спермиев при всплывании стабилизируется уже в первые 5 мин и не меняется в течение последующего часа (табл. 5.4).
Таблица 5.4. Эффективность всплывания спермиев в зависимости от продолжительное ги инкубации

Продолжительность
Число опытов
Число спермиев в 1 мл

инкубации, мин



5
5
(3,3 ± 0,46) 106

15
6
·:-
·,
·.-
(3,8 ±0,53)-10*

зо '
·
·
·
·-
5
·
· -'
·
(1,0 + 0,75)- 106


·
·:
· :
·:. 45
·
·"
·)-

·
·: 5 '
·'
· >J"">V"
(2,8 ± 0,72) 106
·


.... >
· 6
(3,0 ±0,41)- 106

Таким образом, согласно табл. 5.4, можно значительно сократить продолжительность всплывания с 4560 до 515 мин, что, в свою очередь, ускоряет, а значит, и облегчает оплодотворение. Были проведены опыты по оплодотворению вне организма яйцеклеток крупного рогатого скота спермой, подвергшейся процедуре всплывания в течение 15 и 60 мин. Эксперименты с использованием двух интервалов инкубации показали, что продолжительность инкубации заметно не влияет на эффективность дробления оплодотворенных вне организма яйцеклеток крупного рогатого скота.
Полученные результаты открывают перспективы повышения выхода живых спермиев из одной дозы размороженной спермы, так как появилась возможность проведения процедуры всплывания спермиев с одним и тем же осадком несколько раз без потери их жизнеспособности.
Используя прием многократной смены среды, можно в несколько раз (в наших опытах в пять раз) увеличить эффективность использования одной порции эякулята, что особенно важно при применении спермы от высокоценных быков-производителей.
Оплодотворение in vitro и обеспечение ранних стадий развития эмбрионов. Оплодотворение яйцеклеток у млекопитающих осуществляется в яйцеводах. Это затрудняет доступ исследователя к изучению условий среды, в которой происходит процесс оплодотворения. Поэтому система оплодотворения in vitro была бы ценным аналитическим инструментом для изучения биохимических и физиологических факторов, включающихся в процесс успешного соединения гамет. Более того,
213
предполагалось, что эта система найдет применение в технологии разведения животных.
Крупный рогатый скот. Применяют следующую схему оплодотворения in vitro и культивирования ранних эмбрионов крупного рогатого скота. Оплодотворение in vitro проводят в капле модифицированной среды Тироида. После созревания in vitro ооциты частично очищают от окружающих экспандированных кумулюсных клеток и переносят в микрокапле по пять ооцитов в каждой. Суспензия сперматозоидов объемом 25 мкл добавляется к среде с ооцитами, чтобы достичь концентрации сперматозоидов в каплях 11,5 млн/мл. Через 4448 ч после осеменения определяют наличие дробления ооцитов. Затем эмбрионы помещают на монослой эпителиальных клеток для дальнейшего развития в течение 5 дней.
Овцы. Оплодотворение у овец исследовали двумя путями: in vitro и введением фолликулярных ооцитов в яйцевод осемененной овцы. Как и у крупного рогатого скота, число оплодотворенных яйцеклеток было больше в том случае, когда фолликулярные и овулировавшие ооциты помещали в яйцевод со спермиями. При использовании системы оплодотворения in vitro таких клеток было меньше.
Ооциты культивировали в среде ТСМ 199 с 10 %-ной инактивирован-ной фетальной сывороткой с добавлением гонадотропинов (ЛГ и ФСГ) и эстрадиола 17р. Затем ооциты оплодотворяют in vitro эякулированными спермиями, капацитированными в течение 8 ч в модифицированной среде ДМ с добавлением 10 мМ буфера Хепеса. Хирургическим путем переносят 24-клеточные эмбрионы в яйцеводы ложнобеременным кроликам. Через три дня ооциты из яйцевода кролика извлекают и пересаживают в матку постоянного реципиента.
С в и н ь и . К настоящему времени не известны какие-либо данные об оплодотворении in vitro ооцитов свиней. Вместе с тем некоторые исследователи наблюдали проникновение спермиев в ооциты свиней после созревания их in vitro и пересадки осемененной эстральной свиньи, но ни один ооцит не продолжал развитие и у многих из них проявилась полиспермия.
Другие авторы сообщили о нормальном оплодотворении и развитии в аналогичной системе ооцитов, полученных из яичников свиней, обработанных ХГ за 12 ч до ожидаемой овуляции. Можно полагать, что только после полного созревания ооцита в организме животного происходит блокирование полиспермии, нормальное оплодотворение и дальнейшее развитие эмбрионов этого вида.
Более успешные результаты достигнуты при культивировании ранних эмбрионов свиней in vitro. Так, после 48 ч культивирования 14-кле-точных эмбрионов свиней и последующей их хирургической пересадки были получены беременности у двух из 13 свиней. После культивирования 8-клеточных эмбрионов в течение 48 ч до стадии бластоцисты и затем 214
пересадки 19 свиньям-реципиентам 10 животных были беременны во время убоя через 21 день, но только 51 из 229 эмбрионов были представлены живыми плодами.
5.2.3. Межвидовые пересадки эмбрионов и получение химерных животных
Принято считать, что успешная пересадка эмбрионов может быть осуществлена только между самками одного вида. Пересадка эмбрионов, например, овец козам и наоборот сопровождается их приживляемостью, но не завершается рождением потомства. Во всех случаях межвидовых беременностей непосредственной причиной абортов является нарушение функции плаценты, по-видимому, за счет иммунологической реакции материнского организма на инородные антигены плода. Эта несовместимость может быть преодолена получением химерных эмбрионов с помощью микрохирургии.
Сначала были получены химерные животные путем объединения бластомеров из эмбрионов одного вида. С этой целью получали сложные химерные эмбрионы овец объединением 2-, 4-, 8-клеточных эмбрионов. Каждый сложный объединенный эмбрион состоял из равного числа бластомеров эмбрионов от 28 родителей. При этом общее число клеток колебалось от четырех- до восьмикратного увеличения нормального числа клеток. Эмбрионы вводили в агар и переносили в лигатированные яйцеводы овец для развития до стадии ранней бластоцисты. Нормально развивающиеся бластоцисты пересаживали реципиентам и получили живых ягнят, большинство из которых оказались химерными по данным анализа крови и внешним признакам.
Получены химерные овцы путем инъекций внутренней клеточной массы, выделенной иммунохирургическим путем из эмбрионов доноров в бластоцисты эмбрионов реципиентов. Зону пеллюциду у бластоцист доноров удаляли инкубированием в 0,5 %-ной проназе и пипетированием.
Для восстановления их функции после обработки проназой эмбрионы культивировали в течение 3 ч. Затем эмбрионы без прозрачной оболочки культивировали в течение 1 ч в антисыворотке к клеткам печени овцы, три раза отмывали и помещали в раствор (1:4) сыворотки крови морской свинки на 1 ч. Лизированные клетки трофобласта удаляли пипетированием, а изолированную внутреннюю клеточную массу вводили проколом инъекционной пипетки через зону пеллюциду в трофобласт бластоцисты реципиента. После пересадки этих бластоцист получены химерные ягнята как по признакам групп крови, так и по внешним признакам.
Получены химеры и у крупного рогатого скота (Г. Брем и др., 1985) соединением половинок 56,5-дневных эмбрионов. Пять из семи телят, полученных после нехирургической пересадки агрегированных эмбрионов, не имели признаков химеризма. Один теленок был химерой двух по-
215
род бурой швицкой и голштинофризской. Однако масть бурой швиц-кой породы доминировала. Анализ крови этого теленка показал присутствие групп крови только от родителей голштинофризской породы. Другой теленок был химерой неопределенного происхождения.
Показана высокая эффективность получения химер крупного рогатого скота объединением морул без зоны пеллюциды. Авторы получили химеры крупного рогатого скота с «двойной мускулатурой». В этих исследованиях показано, что передача химерам родительского типа имеет случайный характер, т. е. потомство может развиваться из клеток, происходящих или от любого эмбриона, или от сочетания эмбрионов. Половина всех химер представляет собой интерес.
Наиболее показательно получение химер от объединенных частей эмбрионов разных видов, например, овцы и козы.
Исследования СВ. Фехилли и др. (1984) показали, что бластомеры овцы и козы, заключенные в агар и помещенные на 45 сут в лигатиро-ванный яйцевод овцы, могут формировать комбинированные бластоци-сты. Эти бластоцисты жизнеспособны и могут развиваться до рождения нормального потомства. В первом опыте в результате объединения по одному бластомеру из 4-клеточных эмбрионов овцы и козы получено 17 бластоцист, пересадка которых завершилась получением семи потомков. Все потомки были похожи в основном на ягнят, но у трех из них руно имело поперечные валики и лоскуты волос, резко контрастирующие с плотно вьющейся шерстью.
" 5.2.4. Клонирование животных
Число потомков от одной особи, как правило, у высших животных бывает небольшим, а специфический комплекс генов, определяющий высокую продуктивность, возникает редко и в последующих поколениях претерпевает значительные изменения.
Вместе с тем известно, что ядро соматической клетки обладает полной генетической информацией о данном организме, и если создать условия для реализации этой информации, то можно получить практически неограниченное число генетических копий (клонов) определенной особи. Поскольку ядра большинства соматических клеток находятся в дифференцированном состоянии, то эту задачу на первом этапе решали, используя эмбриональные клетки на определенной стадии развития зародыша, когда еще не произошла их дифференциация. Пересадка ядер (бластомеров) в зрелые ооциты дает такую возможность, потому что цитоплазма ооцитов содержит специфические факторы, способные репро-граммировать пересаженное ядро и запускать программу развития нового эмбриона.
Получение однояйцовых близнецов имеет большое значение для животноводства. С одной стороны, увеличивается выход телят от одного 216
донора, а с другой появляются генетически идентичные двойни. Получение идентичных двоен в большом количестве могло бы облегчить оценку быков по качеству потомства, уменьшить стоимость спермопро-дукции, ускорить и удешевить тестирование препаратов и упростить исследования в области кормления животных.
Возможность микрохирургического разделения эмбрионов млекопитающих на ранних стадиях развития на две и более части, чтобы каждая в последующем развивалась в отдельный организм, была высказана несколько десятилетий назад. Первое потомство однояйцовых мышей было получено из механически изолированных бластомеров двухклеточных эмбрионов в 1970 г. Используя ту же технику разделения, но с применением метода заключения в агар, СМ. Вилладсен (1979) описал получение однояйцовых двоен у овец разделением 2-клеточных эмбрионов. Последующие эксперименты показали, что одинаковые двойни могут быть также получены из 4- и 8-клеточных эмбрионов разделением бластомеров на две группы (СМ. Вилладсен, 1980). Половинки из 2-, 4- и 8-клеточных эмбрионов так же жизнеспособны, как и нормальные эмбрионы овец. Их можно хранить в замороженном состоянии, что позволило применить их в эксперименте для получения монозиготных двоен разного возраста.
Выживаемость четвертей эмбрионов клетки или 8-клеточных эмбрионов на четыре пары клеток ниже, чем нормальных. Выживаемость эмбрионов, полученных из отдельных бластомеров 8-клеточных эмбрионов, почти нулевая.
Установлено, что бластоцисты, полученные из половинок эмбрионов, состоят из 32 клеток, т. е. составляют лишь 50 % нормального числа клеток. Отдельные бластомеры из 4-клеточного эмбриона также способны развиться в бластоцисту. Однако бластоциста из такой четверти состоит из 16 клеток и меньше.
На 8-клеточной стадии каждый бластомер имеет потенциальную возможность развиваться в бластоцисту, но очень маленького размера, примерно из восьми клеток. При пересадке таких бластоцист менее 10 % из них развиваются до стадии рождения.
На основе этих исследований можно предположить, что резкое уменьшение числа клеток эмбриона является основным фактором, понижающим способность этих эмбрионов развиваться в жизнеспособные бластоцисты, хотя стадия развития, на которой происходит разделение, имеет малое значение.
После того как для эмбрионов большинство животных заканчивается компактизация морулы, защита со стороны зоны пеллюциды становится несущественной. Поэтому последующие разработки по получению монозиготных двоен были направлены на использование поздних морул и бластоцист.
В настоящее время применяют простую технику разделения эмбрионов на различной стадии развития (от поздней морулы до вылупившейся
217
бластоцисты) на две равные части одновременно с разрезом зоны пеллю-циды. При этом не выявлена существенная роль присутствия зоны пел-люциды для эффективности развития разделенных бластоцист.
Использование эмбрионов на более поздних стадиях развития у крупного рогатого скота для получения однояйцовых близнецов облегчается тем, что их извлекают нехирургическим способом.
Простая техника разделения разработана и для 6-дневных эмбрионов свиней. При этом стеклянной иглой разрезают внутреннюю клеточную массу эмбриона и примерно 40 % зоны пеллюцида. Затем разрезают слой трофоэктодермы внутри зоны пеллюциды. Одну половинку эмбриона в собственной зоне пеллюциды, а другую без зоны пеллюциды пересаживают в рог матки 6-дневного реципиента на расстоянии 5 см от маточ-но-трубного соединения.
Техника разделения на половинки эмбрионов успешно применяется на овцах и на козах.
Деление на стадии поздней бластоцисты считается более удобным, так как блестящая оболочка тоньше и цитоплазма эластичнее, чем у ранней бластоцисты.
При разработке оптимальных условий получения монозиготных близнецов большое внимание уделялось продолжительности культивирования in vitro после разделения и трансплантации половинок эмбрионов, а также их хранению в замороженном состоянии.
Установлено, что продолжительность культивирования половинок эмбрионов более 4 ч снижает результативность их последующей приживляемое™. Культивирование in vitro половинок эмбрионов крупного рогатого скота в течение 24 ч снижает их приживляемость примерно в три раза по сравнению с культивированием in vitro в течение 46 ч.
Разделенные эмбрионы коров могут храниться в замороженном состоянии.
Клонирование эмбрионов путем пересадки ядер эмбриональных клеток в энуклеированные яйцеклетки. После пересадки ядер эмбриональных клеток в энуклеированные яйцеклетки ядро репрограммируется таким образом, что начинает развиваться новый эмбрион. Теоретически все бластомеры из эмбриона донора имеют одну и ту же генетическую основу и, таким образом, способны обеспечить развитие идентичных особей. Эмбрионы, развившиеся после пересадки ядер, в свою очередь, могут быть использованы как доноры ядер. После нескольких генераций создается возможность получения сотен и даже тысяч идентичных эмбрионов.
Клонирование эмбрионов путем пересадки ядра включает три основных этапа: выделение интактного ядра донора, энуклеацию ооцита, пересадку ядра в энуклеированную яйцеклетку. В отличие от амфибий пересадка ядра у млекопитающих не стимулирует ооцит. Поэтому требуется четвертый этап активация ооцита и слияние мембран яйца и ооцита. 218
Под действием электрического импульса происходит активация ооцита и слияние мембран между ядром клетки донора и энуклеированным ооци-том-реципиентом. Технология пересадки ядер клетки способствовала успешному получению клонированных живых кроликов, мышей, овец, коз, крупного рогатого скота и свиней. Было показано, что только эмбрионы на предимплантационной стадии являются тотипотентными, но эффективность этой технологии пока низка. У крупного рогатого скота была продемонстрирована следующая эффективность этой технологии на каждом этапе (%): энуклеация 7080, развитие морулы-бластоцисты клонированных эмбрионов 2030. В исследованиях К.Р. Вондиоли (1991) 190 эмбрионов с пересаженными ядрами были получены из одного эмбриона путем многократной пересадки ядер из последовательно клонированных эмбрионов. Однако последовательные пересадки ядер после четвертого цикла сопровождались высокими эмбриональными потерями в матке. В итоге не удалось получить телят от пересадки эмбрионов, полученных после третьего цикла клонирования.
При использовании в качестве доноров ядер более продвинутых в развитии эмбрионов крупного рогатого скота 6-дневного возраста (4768 бластомеров), по сравнению с использованием малоклеточных эмбрионов того же возраста (около 30 бластомеров), достигается более высокая эффективность слияния бластомера и ооцита, дробления эмбрионов и развития до стадии бластоцисты (В.И. Захарченко и др., 1996). Эффективность развития клонированных эмбрионов крупного рогатого скота выше при использовании в качестве источника бластомеров морул на стадии прекавитации. При этом свежевымытые морулы являются лучшими донорами ядер, чем развившиеся in vitro.
Осложняет пересадку ядер эмбриональных клеток получение телят с большой живой массой примерно на 1530 % больше, чем у контрольных животных. Это приводит к тяжелым родам (рождение мертворожденных телят, задержке выхода последа).
Пересадка ядер эмбриональных клеток в энуклеированные яйцеклетки имеет много преимуществ по сравнению с технологией разделения эмбрионов. Эти преимущества следующие: отдельные эмбриональные клетки, полученные из эмбриона на стадии до 64 клеток, могут быть ре-программированы в одноклеточные зиготы и давать множественные копии генетически одинаковых животных; повторное клонирование путем пересадки ядер от клонированных эмбрионов повышает потенциальные возможности технологии в производстве большего числа клонов.
Клонирование животных путем пересадки ядер соматических клеток в энуклеированные яйцеклетки. Накопленный опыт клонирования эмбрионов путем пересадки ядер тотипотентных клеток из эмбрионов в энуклеированные яйцеклетки послужил базой для разработки метода клонирования животных путем пересадки ядер соматических клеток в энуклеированные яйцеклетки. Принципиальное отличие состоит в том,
219
Ill
что клонирование путем пересадки ядер эмбриональных клеток обеспечивает получение идентичных животных между собой, тогда как пересадка ядер соматических клеток взрослого животного обеспечивает получение не только одинаковых между собой животных, но и идентичных по генотипу с животным-донором соматических клеток. Это открывает возможность получать неограниченное число генетически идентичных потомков уже в первом поколении. Нет необходимости объяснять, насколько революционным может быть этот прием в селекции и разведении сельскохозяйственных животных.
Возможность получения клонов животных с использованием ядер соматических клеток была впервые продемонстрирована в 1977 г. получением овцы Долли (Wilmul et al., 1997). Вильмут с коллегами трансплантировали ядра клеток молочной железы в энуклеированные яйцеклетки овцы.
С этого момента работы многих лабораторий мира была направлена на исследование способности репрограммирования клеток плода и взрослого животного.
Talbot et al. (1998) получили культуру фетальных фибропластов 100-дневного плода коровы и использовали для трансплантации ядер. Получены четыре стельных реципиента (7 %), которые впоследствии абортировали.
Heyman et al. (1998) получили двух телят из клонированных эмбрионов с ядрами фибропластов, взятых на мышцы и кожи плода. Однако эффективность развития клонированных эмбрионов до стадии бластоцисты была очень низкой (38 %).
В опытах Zakhartcheto et al. (1999) эпителиальные клетки молочной железы и фибробластно-подобные клетки уха были получены от 23-летних симментальских коров и культивировались в среде ДМЕМ с 10 %-ной фетальной сывороткой теленка. После одного-пяти пассажей концентрация фетальной сыворотки уменьшалась с 10 до 0,5 % в течение 46 дней, чтобы вызвать голодание. Созревание ооцитов проводили по обычной методике (Stojkovic et al., 1995). Комулюсные клетки удаляли через 1820 ч после созревания путем микропипетирования или обработкой гиалуронидазой. Ооциты с полярным тельцем энуклеировали путем удаления минимального цитоплазматического объема. Через 2022 ч отдельные донорские клетки сливали с энуклеированными ооцитами, используя двойной электрический импульс, 2,1 kv/см в течение 10 с. Через 24 ч слившиеся кариопласт-цитопласт комплексы активировались 5-минутной инкубацией в 7 %-ном этаноле с последующим 5-часовым культивированием в 10 мкг/мл цитоксимида и 5 мкг/мл цитохалазина В. Конструированные эмбрионы культивировали в среде CRJ (Rosenkrans a. First, 1991) с добавкой 10 %-ной эстральной сыворотки коровы в течение 7 дней. . „
·>
·,. , ь. : ..... : ,. ... ...к-. ,. .. , .
· ,
·.,, .:
220
Таблица 5.5. Развитие in vitro эмбрионов с пересаженными ядрами, полученными из клеток взрослых животных (по Zakharteheto et al., 1999)

Клетки доноры
Слилось, %
Дробилось, %
Бластоцист, %
Вылупившихся бластоцист, %

Клетки молочной железы Клетки из уха
Раб < 0,05
93/147(63) 177/244(73)
65(70) 135(76)
32(34)" 92(52)6
23(25)" 84(48)6

После пересадки бластоцист, полученных из клеток молочной железы и уха, соответственно 100 % (2/2) и 42 % (5/12) исследованных реципиентов были беременны на 42-й день. Во время публикации два реципиента имели беременность более 4 месяцев (клетки молочной железы) и пять реципиентов от 1,5 до 3 месяцев (клетки из уха) (табл. 5.5). Результаты показывают, что взрослые клетки крупного рогатого скота могут быть успешно использованы для пересадки ядер, но клеточные линии, используемые в этих исследованиях, отличаются по потенциальным возможностям и развитию. Различия в способности быть программированными, наблюдаемые с этими двумя линиями клеток могут быть из-за их импринтинга (отпечатка) или модификации хроматина.
Целью исследований Wells et al. (1999) было проклонировать последнюю оставшуюся островную корову в Исландии на острове Индерби с целью сохранения генетики самок этой эндогенной породы крупного рогатого скота, приспособленного к субтропическим условиям. Несмотря на то что семя от девяти уже не живущих быков было заморожено, попытки в последние шесть лет добиться воспроизводства у этой коровы завершились рождением одного бычка, который был получен в результате оплодотворения in vitro прижизненно извлеченных ооцитов. Качество яйцеклеток этой коровы было низкое, возможно связанное с ее возрастом (13 лет) или генетикой. Поэтому клонирование взрослого животного, возможно, являлось единственным приемом получения самок, которые потом могут быть осеменены семенем исландского быка и создания возможности дальнейшей племенной работы с этой породой.
Клеточная линия была получена из гранулезных клеток, собранных путем аспирации фолликулов, используя ультразвуковой прибор. Клетки культивировали в OMEM/F12, содержащей 10 % фетальной сыворотки, и использовали для пересадки ядра между 4 и 8 пассажами. Донорские клетки были индуцированы голоданием сыворотки крови в течение 923 дней и подвергнуты электрическому слиянию с энуклеированными

Приложенные файлы

  • doc 8841840
    Размер файла: 502 kB Загрузок: 0

Добавить комментарий