нормофлоры биотехнология

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ
ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ
«ВОРОНЕЖСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ
АКАДЕМИЯ ИМЕНИ Н.Н. БУРДЕНКО
ФЕДЕРАЛЬНОГО АГЕНТСТВА ПО ЗДРАВООХРАНЕНИЮ И
СОЦИАЛЬНОМУ РАЗВИТИЮ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ»


ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ


КАФЕДРА ОРГАНИЗАЦИИ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОГО ДЕЛА
И ТЕХНОЛОГИИ ЛЕКАРСТВ

Основы производства и использования
лекарственных препаратов для профилактики и
лечения дисбиотических состояний

Чембарцева И.В., Семенова Е.В., Савостин В.С.



Учебное пособие к практическим занятиям
по биотехнологии для студентов 5 курса
фармацевтического факультета по специальности
060108 (040500) – «фармация»



Воронеж
2010


УДК 615.012/.014:616.34-08-039.71(072)
ББК 54.133+52.82

Чембарцева И.В., Семенова Е.В., Савостин В.С. Основы производства и использования лекарственных препаратов для профилактики и лечения дисбиотических состояний / учебное пособие к практическим занятиям по биотехнологии для студентов 5 курса фармацевтического факультета по специальности 060108 (040500) – «фармация». – Воронеж : Изд-во ВГМА, 2009. – 60 с.

Учебное пособие составлено в соответствии с рабочей программой по биотехнологии для студентов 5 курса фармацевтического факультета по специальности 060108 – «Фармация».
Учебное пособие содержит сведения о составе и функциях нормальной микрофлоры человека, причинах развития дисбактериоза, способах его профилактики и лечения. В пособии рассмотрены принципы подбора микроорганизмов для создания бактериальных препаратов, с целью коррекции микрофлоры, приведены общая и частная схема производства пробиотиков, дана подробная классификация препаратов нормофлоры. Указаны основные направления совершенствования лекарственных препаратов для лечения дисбиотических состояний и разнообразные стороны применения эубиотиков в клинической практике.
Предназначено для студентов 5 курса фармацевтического факультета.

Печатается по решению цикловой методической комиссии
по координации преподавания фармацевтических дисциплин
ВГМА им. Н.Н. Бурденко

УДК 615.012/.014:616.34-08-039.71(072)
ББК 54.133+52.82

Чембарцева И.В., Семенова Е.В., Савостин В.С. ВГМА, 2010.
Содержание


Стр.

ВВЕДЕНИЕ
4

1. Эволюция представлений о роли кишечной микрофлоры
6

2. Качественный и количественный состав основной микрофлоры толстого кишечника у здоровых людей
13

2.1. Облигатная микрофлора
14

2.2. Факультативная микрофлора кишечника
18

3. Роль нормальной микрофлоры в поддержании здоровья человека
19

4. Дисбактериоз: причины возникновения, стадии развития, способы лечения
25

5. Производство препаратов нормофлоры
30

5.1. Требования к микроорганизмам, используемым для создания препаратов пробиотиков
30

5.2. Общая схема технологического процесса производства пробиотиков
33

5.3. Частная технология препаратов нормофлоры
34

5.4. Основные пути создание препаратов эубиотиков нового поколения
38

6. Классификация препаратов нормофлоры
40

6.1. Бифидосодержащие препараты
41

6.2. Лактосодержащие препараты
45

6.3. Колисодержащие препараты
48

6.4. Препараты из апатогенных представителей других таксономических групп или микробных метаболитов
50

6.5. Пребиотики
51

7. Применение эубиотиков в клинической практике
54

Заключение
57

СПИСОК РЕКОМЕНДУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
59

ВВЕДЕНИЕ

В последние два десятилетия концепция активного участия симбиотической микрофлоры человека в поддержании его здоровья и возникновении многих заболеваний завоевывает все большую популярность.
Микроэкологические аспекты этиопатогенеза современных заболеваний основываются на признании того, что симбиотическая микрофлора является интегральной частью организма, его своеобразным экстракорпоральным органом, включающим в себя миллиарды микроорганизмов (преимущественно анаэробных) и выполняющим как регуляторную функцию, так и вносящим заметный вклад в анатомию и физиологию человека.
За последние годы опубликовано множество работ, посвященных изучению состава, сукцессии симбионтной микрофлоры человека и животных, биохимических реакций, физиологических функций и патологических состояний, связанных с нею, принципов и конкретных приемов коррекции экологической системы «хозяин и его микрофлора». Было выявлено, что в естественных условиях обитания нет ни одного биохимического процесса, ни одной функции живых организмов, которые бы осуществлялись без прямого или опосредованного участия в них симбиотических микроорганизмов. Следовательно, микроорганизмы – являются одним из главных биогенных факторов, определяющим здоровье или развитие заболеваний у человека и животных.
В результате постоянного воздействия на живые организмы антимикробных, противоопухолевых и других препаратов, технологических пищевых добавок, промышленных ядов, пестицидов, радиации, стрессовых агентов иной природы наблюдается нарушение симбиотической микроэкологической системы, что сопровождается разнообразными экологическими и социальными неблагоприятными последствиями (распространение антибиотикорезистентных штаммов, селекция микроорганизмов с атипичными свойствами, формирование новых микробных сообществ, изменение фармакокинетики и биотрансформации лекарств и нутриентов, снижение эффективности химиотерапии и химиопрофилактики, расширение спектра заболеваний, связанных с микробным фактором, увеличение числа лиц со сниженной устойчивостью к инфекциям и т.д.). 
C учетом того, что частота распространения микроэкологического дисбаланса в ходе эволюционного развития человека и общества в целом имеет тенденцию к постоянному увеличению, необходимым является приостановить дальнейшее разрушение микроэкологического статуса населения страны.
В настоящее время практическую реализацию получили такие приемы коррекции микробной экологии человека и животных, как использование специально подобранных микроорганизмов (преимущественно представителей нормальной микрофлоры пищеварительного тракта), их структурных компонентов, метаболитов в различных сочетаниях и соединений, стимулирующих рост представителей нормальной микрофлоры в виде эубиотических лекарственных препаратов, биологически активных пищевых добавок или продуктов питания.
В связи с этим, современному провизору необходимо:
- четко представлять качественный, количественный состав микрофлоры человека и выполняемые ими функции;
- иметь сведения о причинах возникновения дисбактериоза, возможных методах его профилактики и лечения на различных стадиях развития заболевания;
- знать особенности производства, хранения и применения препаратов эубиотиков.
Данный комплекс знаний позволит провизору квалифицированно информировать врачей лечебно-профилактических учреждений и граждан о наиболее перспективных и эффективных лечебных, профилактических эубиотических препаратах.

1. Эволюция представлений о роли кишечной микрофлоры

Симбиоз многоклеточных организмов с одноклеточными древнейшее явление в эволюции. Оно возникло в тот момент, когда появились многоклеточные организмы. В соответствии с научными представлениями при возникновении жизни на Земле (3 - 4 млрд. лет назад) первыми живыми существами были микроорганизмы. По некоторым данным их эволюция продолжалась около миллиарда лет. Именно за это время сформировалось все многообразие биохимических реакций, которые лежат в основе центрального метаболизма всех живых существ. Известно, что многоклеточные организмы возникли на основе одноклеточных в мировом океане (в одной и той же экологической нише) и симбиоз многоклеточных организмов с одноклеточными наблюдался с самого начала их возникновения. В процессе эволюции у многоклеточных организмов сформировались механизмы, обеспечивающие переменчивость внутренней среды, и типы взаимодействия многоклеточных организмов с одноклеточными.
На сегодня известны следующие формы симбиоза (совместного сожительства):
- мутуализм взаимовыгодный симбиоз;
- паразитизм один из партнеров получает одностороннюю выгоду за счет другого;
- комменсализм один из партнеров получает одностороннюю выгоду, не нанося при этом никакого ущерба другому организму;
- нейтрализм партнеры не оказывают заметного влияния один на другого.
Все эти формы наблюдаются при рассмотрении симбиоза одноклеточных микроорганизмов с многоклеточными. Говоря о симбиозе человека с микроорганизмами, подразумевается, что кожные покровы, слизистые оболочки и полости человеческого тела, сообщающиеся с внешней средой, заселены огромным количеством микроорганизмов симбионтов. Примеры: желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) от полости рта до прямой кишки; органы дыхания от носоглотки до альвеол и т.д.
Впервые о своих наблюдениях относительно бактерий и других микроорганизмов, обнаруженных в человеческих фекалиях, сообщил голландский исследователь Антони ван Левенгук, который и выдвинул гипотезу о совместном существовании различных видов бактерий в желудочно-кишечном тракте. В 1850 году Луи Пастер развил концепцию о функциональной роли бактерий в ферментативном процессе. Роберт Кох впоследствии предложил методику выделения чистых культур, позволяющую идентифицировать специфичные бактериальные штаммы и разграничивать болезнетворные и полезные микроорганизмы.
Учение о роли симбионтной микробной флоры для организма человека связано с именем великого русского ученого, основоположника сравнительной патологии, эволюционной эмбриологии и иммунологии Ильи Ильича Мечникова, лауреата Нобелевской премии за 1908 год (совместно с Паулем Эрлихом). На Сицилии, в маленькой самодельной лаборатории в Мессине, И.И. Мечников открыл явление фагоцитоза и тем самым инициировал новое видение проблемы инфекции: существование механизмов защиты хозяина. В 1888 году Илья Мечников, работая в Институте Пастера, обосновал теорию о том, что в кишечнике человека обитает комплекс микроорганизмов, которые оказывают на организм «аутоинтоксикационный эффект». Он полагал, что введение в желудочно-кишечный тракт «здравословных» бактерий способно модифицировать действие кишечной микрофлоры и противодействовать интоксикации.
В работе «Этюды оптимизма» (1911 г.) И.И. Мечников писал о том, что многочисленные ассоциации микробов, населяющих кишечник человека, в значительной мере определяют его духовное и физическое здоровье, а кожа и слизистые человека покрыты в виде перчатки биопленкой, состоящей из сотен видов микробов. Он высказал гипотезу о том, что давно установленная большая продолжительность жизни некоторых народов, таких как болгары, турки и армяне, связана с особенностями диеты, а именно потреблением за сутки большого количества сброженного молока, являющегося прообразом йогурта. И.И. Мечников идентифицировал две бактерии в этом продукте: Streptococcus thermophilus и Lactobacillus bulgaricus, которым он и приписал указанные заслуги в области продления жизни. Он считал, что долголетие человека связано с удалением условно-патогенных микроорганизмов из кишечника и предложил проводить с этой целью заселение пищеварительного тракта болгарской молочно-кислой палочкой. В это же время был создан первый кисломолочный продукт «Простокваша Мечникова».
В начале XX века И.И. Мечниковым было выдвинуто предположение о связи ряда соматических заболеваний, в том числе и онкологических, с деятельностью микроорганизмов, то есть имеющих инфекционную природу. Он писал, что «...со временем, вероятно, удастся открыть паразитов не только при болезнях типично инфекционного характера, но и при болезнях совершенно другого рода», и предсказывал открытие паразитов злокачественных опухолей, а также микробов-возбудителей сахарной болезни. В настоящее время это предположение превратилось в хорошо аргументированную гипотезу об ассоциации ранее считавшихся неинфекционными болезнями с бактериями и вирусами.
В монографии «Этюды о природе человека» И.И. Мечников изложил концептуальный взгляд о взаимоотношениях человека и его микрофлоры. Вот некоторые выдержки из этой работы, позволяющие оценить уровень представлений почти столетней давности:
«Усилить сопротивление благородных клеток и превратить дикую кишечную флору человека в культивированную таковы достижимые средства для того, чтобы старость стала более физиологической, чем теперь, и, вероятно, также для продления жизни человеческой».
«Присутствие большого количества молочных микробов неизбежно должно мешать размножению гнилостных микробов, что одно уже очень полезно для организма».
«Итак, совершенно ясно, что с целью сократить эти медленные отравления, ослабляющие сопротивление наших благородных элементов и усиливающее фагоциты, следует вводить в пищевой режим кефир и, еще лучше, кислое молоко».
«По нашему мнению, лучше всего употреблять кислое молоко, приготовленное при помощи чистых культур молочнокислых бактерий, а также эти культуры в виде мягкой мази, которую можно смешивать с вареньем».
«Среди молочных бактерий лучше других «болгарская палочка» и «стрептобациллы».
И.И. Мечников был убежден в том, что «дикие и вредные бактерии в кишечнике» могут и должны быть «удалены» при помощи простокваши и содержащихся в ней молочнокислых бактерий.
На исходе XIX столетия французский педиатр Анри Тиссье доказал, что у детей, находящихся на грудном вскармливании, основным компонентом кишечной микрофлоры являются бифидобактерии.
Первое промышленное производство кисломолочного продукта питания йогурта, в основе создания которого были научные достижения И.И. Мечникова, было начато в 1919 году испанцем Исааком Карассо, который приобрел йогуртовую закваску в Пастеровском институте. А уже его сын Даниэль (от его имени произошло название компании «Данон») добился признания йогурта во всей Европе.
Многочисленные исследования последних десятилетий убедительно показали, что продукты питания содержат природные компоненты, обладающие не только пищевой ценностью для организма, но и регулирующие его многочисленные функции, в том числе и состав микрофлоры.
Значительный вклад в развитие микробиологии и микроэкологии человека внес германский ученый Альфред Ниссле, который с 1912 года активно занимался изучением антагонистического действия бактерий. Им же в 1916 году был впервые введен термин «дисбактериоз» для обозначения снижения антагонистических функций кишечной микрофлоры. А. Ниссле удалось установить, что колибактерии могут подавлять патогенные штаммы своего же вида.
В начале XX века были выработаны два различных терапевтических принципа, в которых учитывалось «хорошее» и «плохое» влияние микроорганизмов на здоровье и заболевания человека:
принцип иммунотерапии (воздействие на иммунную систему для профилактики и терапии, для ее тренировки);
принцип воздействия на микрофлору и использования антагонизма некоторых видов микроорганизмов, чтобы нейтрализовать или удалить патогенные бактерии.
Большую роль в развитии учения о симбионтной кишечной микрофлоре человека сыграли работы Германского микробиотического общества. В 1922 году А. Беккер начал опыты по использованию комплексной вакцины из флоры кишечника в лечебных целях. Он полагал, что состав микробной флоры слизистых оболочек человеческого организма различной локализации тесно взаимосвязан. Совместно с коллегами X. Кольбом и Х.-П. Рушем им были созданы первые препараты на основе энтерококков и Escherichia coli.
Х.-П. Руш считал, что симбиоз бактерий существует у всех видов организмов, как высших, так и низших. То есть, речь идет о симбиозе между одноклеточными и многоклеточными организмами, утрата которого ведет к тем или иным нарушениям здоровья, а большая часть участвующих в процессах жизнедеятельности бактерий имеют физиологический характер.
Его современник Х.С. Ланштайн показал, что микробиологическая терапия требует принципиально нового отношения к самому понятию бактерии. В настоящее время накоплены знания, показывающие, что многие бактерии имеют физиологический характер за счет своей локализации на слизистых оболочках хозяина, тем самым, образуя внутреннюю среду организма. Основатели этого направления воспринимали различные слизистые оболочки как части одной более крупной системы слизистых оболочек. За десятилетия до того, как возникло понятие ассоциированной со слизистыми оболочками иммунной системы, существовала концепция о «едином слизистом органе» и «взаимодействии сил» между организмом и микроорганизмами. Цель терапии была однозначно установлена как «стимуляция собственного иммунитета». Основатели микробиологической терапии наблюдали феномен снижения иммунитета после антибактериальной терапии.
По мнению X. Кольба, применение антибиотиков создает благоприятную почву для рецидивов, а нежелательные последствия антибактериальной терапии можно предотвратить за счет применения пробиотиков. «Пробиотики дают нам возможность проводить биологическую антисептическую обработку, тем более эффективную, чем более поверхностной является воспалительная реакция, вызванная патогенными бактериями» писал Х.-П. Руш. При такой формулировке понимается то неоценимое преимущественное действие, которое оказывается только на патогенные, а не на физиологические организмы. Второе преимущество заключается в том, что при этом не поражаются, а поддерживаются клетки за счет методов, не ослабляющих, а усиливающих конституцию». Данная методика в противоположность антибактериальной терапии была названа «пробиотическим лечением».
Непосредственно термин «пробиотик» впервые ввел в литературу в 1954 году Фердинанд Виржин. Для автора этого термина греческие корни «pro» «содействующий» и «bios» «жизнь» означали, что такие вещества способствуют жизни в самом широком смысле в противоположность антибиотикам с их отрицательными побочными эффектами.
В отечественной литературе в 4050 годах двадцатого столетия вопросу нарушения микроэкологии кишечника большое внимание уделял известный микробиолог Л.Г. Перетц. Дисбактериоз кишечника он рассматривал как:
уменьшение общего количества микроорганизмов нормальных обитателей макроорганизма;
изменение их соотношений, ферментативных и биохимических свойств;
приобретение отдельными ее представителями факторов патогенности (продукция гемотоксинов, гиалуронидазы);
ослабление антагонистической активности;
появление или увеличение пропорции потенциально патогенных микроорганизмов.
В. Коллат в 1954 году использовал термин «пробиотик», понимая под ним все важные для жизни организмы, в отличие от опасных «антибиотиков». Основатели же направления микробиологической терапии вкладывали в определение все «культуры симбионтов» или «бактериальных препаратов», используемые в виде вакцин для перорального и парентерального применения, а позднее и готовые препараты физиологических бактерий. Лишь много позже противопоставление «пробиотики антибиотики» стало использоваться в более широком смысле. Была установлена связь иммунитета с микрофлорой организма, при этом не было потерено из виду главное: в центре внимания всегда оставался пациент, его история болезни, клинические симптомы и их динамика под действием проводимой терапии. Был сделан вывод, что микрофлора на коже и слизистых является важным компонентом системы симбиоза человека и микроорганизмов. Но ученые того времени не стали придавать флоре кишечника чрезмерно большое значение. Они весьма четко сформулировали положение, согласно которому цель микробиологической терапии заключается в создании «косметики для флоры кишечника», чтобы нормализовать исключительно показатели анализов кала.
Почти десять лет спустя, в 1965 году Д. Лилли и Р. Стилуэлл опубликовали результаты своих исследований в журнале «Science» и показали, что пробиотики выделяют факторы, способствующие росту прочих микроорганизмов. Собственно, и сам термин «пробиотики» в современной трактовке стал применяться по их предложению.
Первыми отечественными лечебными препаратами на основе анаэробных бактерий стали бифидобактерин, созданный Г.И. Гончаровой и соавт. (1972) и лактобактерин, разработанный И.Б. Тарасовой (1970). Однако необходимо отметить, что, несмотря на значительные успехи в изучении микрофлоры человека, многие проблемы еще далеки от своего разрешения. Тем не менее, в настоящее время разработка и внедрение новых пробиотиков в клиническую практику, является наиболее перспективным направлением в терапии широкого круга заболеваний.

2. Качественный и количественный состав основной микрофлоры толстого кишечника у здоровых людей

Нормальная микрофлора человека (нормофлора) – это качественное и количественное разнообразие микроорганизмов отдельных органов и систем, поддерживающее биохимическое, метаболическое и иммунное равновесие макроорганизма, необходимое для сохранения здоровья человека.
Согласно современным представлениям основу нормальной микрофлоры человека составляют облигатные анаэробные бактерии, количество которых достигает 1013 – 1014 , что на 1–2 порядка превышает количество эукариотических клеток всех тканей и органов человека вместе взятых. О чрезвычайной сложности населяющей человека и животных микрофлоры говорит хотя бы тот факт, что 1 г содержимого слепой кишки содержит более 2 биллионов микробных клеток – представителей 17 семейств, 45 родов и свыше 400 видов. Эти эволюционно сложившиеся сложные симбиотические сообщества микроорганизмов (микробиоценозы) специфичны для той или иной области кожи и слизистых оболочек человека и животных.
Процесс формирования кишечной микрофлоры происходит в первые дни жизни ребенка. В нем выделяют три фазы. I фаза – асептическая – длится 10-20 часов после рождения. Затем наступает II фаза – транзиторная - заселение желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) кокками и другими микроорганизмами (первые 2-4 дня после рождения). Постоянная микрофлора в это время ещё не сформирована. III фаза – трансплантации, когда бифидофлора становится основой микробного пейзажа. Важнейшим фактором формирования нормофлоры является естественное вскармливание, особенно раннее (в первые часы после рождения) прикладывание к груди. Грудное молоко (в первую очередь – молозиво) чрезвычайно богато пребиотическими бифидогенными факторами: лактоза грудного молока,
·-галактозилфруктоза, бифидус-фактор I (N-ацетил-
·-глюкозамин) и бифидус-фактор II, левулёза. Важную защитную роль играют также лизоцим и иммуноглобулины женского молока, обеспечивающие пассивный иммунитет новорождённых и детей первых месяцев жизни. Все бифидогенные факторы женского молока термолабильны, после термической обработки их активность значительно снижается.
Нормофлора кишечника колонизирует как просвет кишечника – полостная (П-микрофлора), так и поверхность слизистой оболочки – пристеночная или мукозная (М-микрофлора). Основные представители микрофлоры кишечника представлены в табл. 1.
Вся микрофлора кишечника подразделяется на облигатную (главную), факультативную (условно-патогенную и сапрофитную) и транзиторную (случайная).

2.1. Облигатная микрофлора

Бифидобактерии являются наиболее значимыми представителями облигатных бактерий в кишечнике детей и взрослых. Это анаэробы, они не образуют спор и морфологически представляют собой крупные грамположительные палочки ровной или слегка изогнутой формы. Концы палочек у большинства бифидобактерии раздвоены, но могут быть также утонченными или утолщенными в виде шаровидных вздутий.
Большая часть популяции бифидобактерий располагается в толстой кишке, являясь ее основной пристеночной и просветной микрофлорой. Бифидобактерии присутствуют в кишечнике на протяжении всей жизни человека, у детей они составляют от 90 до 98% всех микроорганизмов кишечника в зависимости от возраста. Доминирующее положение в микробном пейзаже кишечника у здоровых новорожденных детей, находящихся на естественном вскармливании, бифидофлора начинает занимать к 5-20-му дню после рождения. Среди различных видов бифидобактерии у детей, находящихся на грудном вскармливании, преобладают Bifidobacterium bifidum. В норме количество бифидобактерии у грудных детей должно составлять 1010-1011 КОЕ/г фекалий, у детей старшего возраста и у взрослых - 109-1010 КОЕ/г.

Таблица 1
Качественный и количественный состав основной микрофлоры
толстого кишечника у здоровых людей (КОЕ/г фекалий)
Виды микроорганизмов
Возраст, годы


< 1
1-60
> 60

Бифидобактерии
1010 - 1011
109 - 1010
108 - 109

Лактобактерии
106 - 107
107 - 108
106 - 107

Бактероиды
107 - 108
109 - 1010
1010- 1011

Энтерококки
105 - 107
105 - 108
106 - 107

Фузобактерии
<106
108 - 109
108 - 109

Эубактерии
106 - 107
109 - 1010
109 - 1010

Пептострептококки
<105
109 - 1010
1010

Клостридии
<=103
<=105
<=106

E. coli типичные
107 - 108
107 - 108
107 - 108

E. coli лактозонегативные
<105
<105
<105

E. coli гемолитические
0
0
0

Другие условнопатогенные энтеробактерии < * >
<104
<104
<104

Стафилококк золотистый
0
0
0

Стафилококки (сапрофитный эпидермальный)
<=104
<=104
<=104

Дрожжеподобные грибы рода Candida
<=103
<=104
<=104

Неферментирующие
бактерии < ** >
<=103
<=104
<=104

<*> - представители родов Klebsiella, Enterobacter, Hafnia, Serratia, Proteus, Morganella, Providecia, Citrobacter и др.
< ** > - представители родов Pseudomonas, Acinetobacter и др.

Бифидобактерии являются также представителями вагинальной микрофлоры, где обнаруживаются в количестве 106 КОЕ/г вагинального содержимого.
Установлено, что бифидобактерии выполняют следующие функции:
- осуществляют путем ассоциации со слизистой оболочкой кишечника физиологическую защиту кишечного барьера от проникновения микробов и токсинов во внутреннюю среду организма;
- обладают высокой антагонистической активностью по отношению к патогенным и условно патогенным микроорганизмам за счет выработки органических жирных кислот;
- участвуют в утилизации пищевых субстратов и активизации пристеночного пищеварения;
- синтезируют аминокислоты и белки, витамин К, пантотеновую кислоту, витамины группы В: В1 - тиамин, В2 - рибофлавин, В3 - никотиновую кислоту, В6 - пиридоксин, фолиевую кислоту;
- способствуют усилению процессов всасывания через стенки кишечника ионов кальция, железа, витамина Д.
Другим представителем облигатной микрофлоры гастроинтестинального тракта являются лактобактерии, представляющие собой грамположительные палочки с выраженным полиморфизмом, располагающиеся цепочками или поодиночке, неспорообразующие.
Лактофлора заселяет организм новорожденного ребенка в раннем постнатальном периоде. Средой обитания лактобацилл являются различные отделы желудочно-кишечного тракта, начиная с полости рта и кончая толстой кишкой, где они поддерживают рН на уровне 5,5-5,6. Лактофлору удается обнаружить в молоке человека и животных. В желудке лактобациллы содержатся в количестве 102 - 103 КОЕ/мл желудочного сока, в тонкой кишке - до 103 - 104 КОЕ/мл кишечного сока, в толстой - 106 -108 КОЕ/г фекалий (в зависимости от возраста).
Лактобактерии в процессе жизнедеятельности вступают в сложное взаимодействие с другими микроорганизмами, в результате чего подавляются гнилостные и гноеродные условно патогенные микроорганизмы, в первую очередь протеи, а также возбудители острых кишечных инфекций. В процессе нормального метаболизма они способны образовывать молочную кислоту, перекись водорода, продуцировать лизоцим, другие вещества с антибиотической активностью: реутерин, плантарицин, лактоцидин, лактолин. В желудке и тонкой кишке лактобациллы в кооперации с организмом хозяина являются основным микробиологическим звеном формирования колонизационной резистентности.
Наряду с бифидо- и лактобактериями группу нормальных кислотообразователей, т.е. бактерий, вырабатывающих органические кислоты, составляют анаэробные пропионобактерии. Снижая рН окружающей среды, пропионобактерии проявляют антагонистические свойства в отношении патогенных и условно патогенных бактерий.
К представителям облигатной микрофлоры кишечника также относятся эшерихии (кишечные палочки). В кишечнике человека эшерихии появляются в первые дни после рождения в количестве 107 -108 КОЕ/г фекалий и сохраняются на протяжении жизни на этом уровне. Экологическая ниша данных микроорганизмовв здоровом организме - толстая кишка и дистальные отделы тонкой кишки. Выявлено, что эшерихии способствуют гидролизу лактозы, участвуют в продукции витаминов (К, группы В), вырабатывают колицины - антибиотикоподобные вещества, тормозящие рост энтеропатогенных кишечных палочек, стимулируют антителообразование.
Бактероиды являются анаэробными неспорообразующими микроорганизмами. Их уровень в толстом кишечнике колеблется в диапазоне 107 - 1011 КОЕ/г фекалий. Заселение кишечника бактероидами происходит постепенно. Они обычно не регистрируются в бактерийных картах фекалий у детей первого полугодия жизни, у детей в возрасте от 7 мес. до 1-2 лет содержание бактероидов не превышает 108 КОЕ/г. Бактероиды принимают участие в пищеварении, расщепляют желчные кислоты, участвуют в процессах липидного обмена.
Пептострептококки представляют собой неферментирующие грамположительные анаэробные стрептококки. В процессе жизнедеятельности они образуют водород, который в кишечнике превращается в перекись водорода, что способствует поддержанию рН 5,5 и ниже, а также участвуют в протеолизе молочных белков, ферментации углеводов. Не обладают гемолитическими свойствами. Экониша - толстый кишечник.
Энтерококки присутствуют в кишечнике в количествах 105 - 108 КОЕ/г фекалий и в норме не должны превышать общее количество кишечных палочек. Энтерококки осуществляют метаболизм бродильного типа, сбраживают разнообразные углеводы (лактозу) с образованием в основном молочной кислоты, но не газа. В некоторых случаях восстанавливают нитрат.

2.2. Факультативная микрофлора кишечника

Факультативная микрофлора представлена пептококками, стафилококками, стрептококками, бациллами, дрожжевыми и дрожжеподобными грибами.
Пептококки (анаэробные кокки) содержатся в количестве 105 - 106 КОЕ/г кишечного содержимого, метаболизируют пептон и аминокислоты с образованием жирных кислот, вырабатывают сероводород, уксусную, молочную, лимонную, изовалериановую и другие кислоты.
Стафилококки - негемолитические (эпидермальные, сапрофитирующие)- входят в группу сапрофитной микрофлоры, попадающей в организм из объектов окружающей среды. Обычно восстанавливают нитрат до нитрита. Количество их в норме не должно превышать 104 КОЕ/г фекалий.
Стрептококки выявляются в кишечнике здорового человека в количестве 104 - 105 КОЕ/г фекалий. Среди них выделяются такие непатогенные штаммы, как молочнокислый стрептококк, обладающий антагонистической активностью по отношению к болезнетворным микроорганизмам. Стрептококки образуют в основном лактат.
Бациллы в кишечнике могут быть представлены аэробными и анаэробными видами микроорганизмов. Bacillus subtilis, B. pumilis, B. cereus - аэробные спорообразующие бактерии; Clostridium perfringens, C. novyi, C. septicum, C. histolyticum, C. tetanus, C. difficile - анаэробные. Наибольший интерес представляют анаэробные спорообразующие бактерии C. difficile. В кишечнике здорового человека их количество обычно не превышает 103 КОЕ/г фекалий. Из углеводов или пептона они образуют смесь органических кислот и спиртов.
Дрожжи и некоторые дрожжеподобные грибы относят к сапрофитной микрофлоре. Содержание плесневых грибов в толстой кишке у здоровых людей не должно превышать 104 КОЕ/г фекалий. Дрожжеподобные грибы рода Candida, чаше всего C. albicans и C. steleatoidea, являются условно патогенными микроорганизмами. Они могут встречаться во всех полостных органах пищеварительной системы и вульвовагинальной области.
Условно патогенные энтеробактерии включают представителей семейства Enterobacteriacae (кишечных бактерий): клебсиеллы, протеи, цитробактеры, энтеробактеры, серрации и др.
Фузобактерии - грамотрицательные, неспорообразующие, полиморфные палочковидные бактерии, являющиеся представителями анаэробной микрофлоры толстой кишки.
Неферментирующие грамотрицательные палочки чаще всего выявляются как транзиторная микрофлора, т.к. бактерии данной группы относятся к свободно живущим и легко попадают в кишечник из окружающей среды.

3. Роль нормальной микрофлоры в поддержании здоровья человека

Представители нормальной микрофлоры присутствуют в организме человека и животных в виде фиксированных к определенным рецепторам микроколоний, заключенных в биопленку. Биопленка, покрывающая слизистые оболочки человека и животных, помимо экзополисахаридов микробного происхождения состоит из микроколоний морфологически идентичных клеток, а также муцина, продуцируемого бокаловидными клетками. Число рецепторов на эпителиальных клетках, к которым адгезируются бактерии, ограниченно.
В последние годы интенсивно исследуются механизмы, ответственные за специфическую адгезию. Установлено, что элементами, ответственными за нее, являются поверхностные структуры бактерий, содержащие лектины, комплементарные соответствующим рецепторам, расположенным на мембранах эпителиальных клеток. Лектины представляют собой широко распространенные соединения белковой или гликопротеиновой природы, проявляющие специфическую и обратимую углеводсвязывающую активность. Будучи медиаторами адгезии, лектины могут быть локализованы в мембранах бактерий, на их поверхности, а также на специфических фимбриях, которые, проходя сквозь толщу экзополисахаридно-муцинового матрикса, фиксируют бактерии к соответствующим рецепторам эпителиальных клеток. Последние представляют собой гликосфинголипиды.
Бактерии могут адгезироваться и к рецепторам, локализованным в муциновом слое на других микроорганизмах (опосредованная адгезия). Своеобразие рецепторов детерминируется генетически у каждого индивидума, о чем свидетельствует наличие почти полностью идентичной анаэробной и аэробной микрофлоры у однояйцевых близнецов человека, чего не наблюдается у разнояйцевых близнецов.
Будучи заключенной в высокогидратированный экзополисахаридномуциновый матрикс (биопленку), нормальная микрофлора, как перчатка, покрывает кожу и слизистые оболочки, и более резистентна к воздействию неблагоприятных факторов физической, химической и биологической природы, а также их комбинаций по сравнению со свободно живущими бактериями. Функционально биопленка напоминает роль плаценты. Если плацента регулирует взаимоотношения плода и организма матери, то биопленка выполняет схожую роль, регулируя взаимоотношения между макроорганизмом и окружающей средой. Микроорганизмы, входящие в состав биопленки, осуществляют также многочисленные метаболические реакции, вовлекаясь в процессы синтеза и деградации как соединений, образуемых в организме хозяина, так и чужеродных субстанций. Кроме того, они участвуют в процессах распознавания, абсорбции и транслокации не только полезных, но и потенциально вредных агентов.
Научные достижения и клинические наблюдения в этом направлении убедительно свидетельствуют, что микробиоценозы хозяина действительно являются его интегральной частью, своеобразным экстракорпоральным органом, имеющим важное значение в физиологии человека и животных. Подобно тому, как эукариотические клетки органов и тканей высших организмов дифференцировались и выполняют определенные функции, так и симбиотические ассоциации анаэробных бактерий также специализировались, регулируя конкретные биохимические реакции и физиологические функции макроорганизма в естественных условиях его обитания.
Накопленные научные данные о значимости метаболической активности микробных популяций для гомеостаза позволили скандинавским исследователям предложить в 1985 г. два специальных термина, определяющих взаимоотношения хозяина и его микрофлоры: МAC – микроорганизм-ассоциированная характеристика и GAC – характеристика, не связанная с микроорганизмами. Термином МАС определяются те анатомические структуры, физиологические функции или биохимические реакции макроорганизма, которые связаны с жизнедеятельностью микрофлоры хозяина, GAC – те параметры, которые проявляются только в организме безмикробных животных. Не вызывает сомнения, что число обнаруживаемых MAC и GAC c каждым годом будет все более увеличиваться и может достигнуть сотен и даже тысяч. Чтобы лучше ориентироваться во взаимоотношениях хозяина и его микрофлоры, предлагается помимо MAC и GAC ввести дополнительный термин MAIF – микроорганизм-ассоциированная интегральная функция, параметр, являющийся конечным этапом каскадных реакций взаимодействия хозяина и его микрофлоры. Согласно этому определению MAIF является финальным событием последовательных или одновременно протекающих простых ферментных реакций, связанных с активностью различных аблигатных микроорганизмов или их комплексов. Например, колонизационная резистентность, согласно данному определению, является типичной MAIF. Она реализуется за счет таких MAC, как продуцирование конкретными микроорганизмами, присутствующими в соответствующем биотопе, разнообразных антибиотиков, органических кислот, блокаторов рецепторов и т.д. Число уже известных MAIF достаточно велико, что объясняется многообразием существующих функций микрофлоры. Выделим основные 4 группы положительных функций кишечной микрофлоры.
1. Ферментопродуцирующая функция
Бактериальные протеазы гидролизуют белки и пептиды, последние под действием бактероидов гидролизуются до аминокислот и пептидных остатков. Нормофлора осуществляет метаболизм азот- и углеродсодержащих соединений за счет микробных ферментов, например, метаболизм мочевины в кишечнике происходит за счет микробных уреаз. Микрофлора кишечника также участвует в деградации липидов и в их синтезе, принимает участие в рециркуляции желчных кислот и активно влияет на холестериновый и билирубиновый метаболизм. Бифидо- и лактобактерии, бактероиды, эубактерии способствуют всасыванию кальция, витамина Д, железа. Лактобактерии нейтрализуют действие фенольных ферментов, поддерживающих разрастания раковых клеток в кишечнике, препятствуя тем самым развитию рака молочной железы и толстого кишечника.
2. Защитная функция
Нормальная микрофлора кишечника в процессе эволюции приобрела исключительно важную роль в формировании колонизационной резистентности организма. Одним из главных механизмов защиты от колонизации условно-патогенными и патогенными бактериями является присутствие в организме достаточного количества собственной полезной микрофлоры, к которой, в первую очередь, относятся лакто- и бифидобактерии. Очень важным фактором защиты является то, что представители нормофлоры продуцируют бактериоцины, лизоцим и другие антибиотико-подобные вещества, обуславливающие антагонистическую активность этих бактерий. Представители нормофлоры в кишечнике конкурируют с патогенной флорой за аргинин, треонин, аспарагиновую кислоту, серин, за область обитания - экологические ниши.
В случае снижения колонизационной резистентности увеличивается число и расширяется спектр потенциально патогенных микроорганизмов, их транслокация через стенку кишечника или других полых органов, что может сопровождаться возникновением эндогенной инфекции или суперинфекции различной локализации. Так, на примере безмикробных и обычных животных продемонстрировано, что инфекционный процесс при сальмонеллезе реализуется у безмикробных животных при микробной нагрузке 10 – 100 микробных клеток. У обычных животных для клинического проявления сходной инфекции требуется инфицирующая доза, содержащая несколько десятков или даже сотен миллионов бактерий.
3. Синтетическая функция
Бифидобактерии синтезируют витамины группы В, в частности, никотиновую, фолиевую кислоты, тиамин, биотин, цианкобаламин, а так же аминокислоты и белки обеспечивающие их всасывание. Лактобактерии образуют молочную кислоту, продуцируют лизоцим, леколин, низин, ацидофилин и др. Кишечная палочка способствует синтезу иммуноглобулинов, что препятствует развитию инфекций, вырабатывает канцеролитические вещества. Продуцируя молочную кислоту бифидо- и лактобактерии создают в кишечнике кислую среду, подавляя гнилостную флору и способствуя всасыванию кальция, витамина Д и железа. Большое значение имеет продуцирование анаэробами летучих жирных кислот, которые принимают участие в рециркуляции и абсорбции ионов натрия, калия, хлора, воды, а также кальция, магния и цинка. Кишечная нормофлора способна разлагать белки до конечных продуктов распада (индол, фенол, скатол), утилизировать непереваренные пищевые субстраты, образуя органические кислоты, аминокислоты и другие соединения, которые нормализуют обмен веществ в организме.
Нормальная микрофлора, прежде всего кишечника, оказывает выраженное детоксицирующее действие как в отношении соединений, попадающих извне, так и образующихся в организме хозяина. Процесс детоксикации с участием нормальной микрофлоры идет по нескольким направлением: биотрансформация с образованием нетоксичных конечных продуктов, микробная трансформация, сопровождающаяся образованием метаболитов, подвергающихся быстрой деструкции в печени, изменение полярности соединений таким образом, что изменяется скорость их экскреции в окружающую среду или транслокации в кровяное русло.
Как “естественный биосорбент” нормальная микрофлора способна также аккумулировать значительное количество различных токсичных продуктов, включая металлы, фенолы, яды растительного, животного и микробного происхождения, другие ксенобиотики. Все процессы детоксикации с вовлечением нормальной микрофлоры идут преимущественно в условиях анаэробиоза за счет гидролитических и восстановительных реакций.
Микрофлора кишечника, в конечном счете, поддерживает водный, электролитный и кислотно-щелочной балансы в организме.
4. Иммунногенная функция
Нормальная микрофлора способствует пролиферации плазматических клеток. Бифидобактерии стимулируют синтез антител к овальбумину, а лактобактерии повышают активность фагоцитов и лимфоцитов. Повышение численности бифидо- и лактобактерии при их недостатке приводит к положительному эффекту в уменьшении воспалительных процессов слизистой кишечника и увеличении В-лимфоцитов в периферической крови. Иммуностимулирующий эффект под воздействием нормофлоры проявляется усилением фагоцитарной активности макрофагов, моноцитов, синтезом цитокинов, стимуляцией клеточных иммунных механизмов защиты.
Таким образом, можно выделить участие микрофлоры хозяина в регуляции газового состава, морфогенезе тканей, водно-солевом, энергетическом и другом обмене, обеспечении колонизационной резистентности, кишечно-печеночной рециркуляции органических и неорганических соединений, детоксикации эндо- и экзогенных субстанций и других анатомических и физиологических проявлениях.

4. Дисбактериоз: причины возникновения, стадии развития, способы лечения

Экологическая система, неразрывными компонентами которой являются макроорганизм, его микрофлора и окружающая среда, характеризуется единством и способностью к саморегуляции. В результате различных неблагоприятных воздействий и патологических состояний могут происходить качественные и количественные изменения в составе нормальной микрофлоры кишечника.
Развитие микроэкологических нарушений в пищеварительном тракте приводит к отягощению течения заболевания, ухудшает его прогноз и исход. А. Дюбуа еще в 1966 году высказал положение о том, что «многие характеристики взрослого организма, кажущиеся наследственными, в действительности определяются состоянием микробиоценоза, сформировавшегося на самых ранних этапах жизни ребенка и существенно влияющего на его морфологический и физиологический статус».
Биологическое равновесие нормофлоры легко нарушается различными факторами экзогенной и эндогенной природы:
- стрессы;
- несбалансированное питание по основным макро- и микронутриентам (несоответствующие потребностям организма: режим питания, набор продуктов, низкое качество продуктов);
- кишечные инфекции;
- лечение антибактериальными препаратами;
- длительная гормонотерапия, лечение нестероидными противовоспалительными препаратами;
- проведение химио- и лучевой терапии у онкологических больных;
- иммунодефицитные состояния.
Нарушения качественные или количественные нормальной микрофлоры относят к дисбактериозам, которые в зарубежной литературе обозначаются как микроэкологические нарушения. В России в Отраслевом Стандарте «Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника» (ОСТ 91500.11.0004-2003, утвержден Приказом МЗ РФ № 231 от 09.06.2003) сохранен термин «дисбактериоз». Согласно положению стандарта дисбактериоз кишечника - это клинико-лабораторный синдром, возникающий при целом ряде заболеваний и клинических ситуаций, который характеризуется изменением качественного и/или количественного состава нормофлоры определенного биотопа, а также транслокацией различных ее представителей в несвойственные биотопы, а также метаболическими и иммунными нарушениями, сопровождающимися у части пациентов клиническими симптомами.
Степени тяжести дисбактериоза:
I степень (Д1) - отклонение от нормы (количественные, видовые, качественные) касаются облигатной или факультативной микрофлоры и носят достаточно стойкий характер;
II степень (Д2) - устойчивые изменения обнаруживаются в факультативном и облигатной микрофлоре;
III степень (Д3) наступившие сдвиги в микрофлоре кала сопровождаются бактериальным заселением вышележащих отделов пищеварительного тракта; при этом снижается иммунологическая реактивность организма, появляются ответные реакции на микрофлору.
IV степень (Д4) - имеются осложнения, обусловленные дисбактериозом: микрофлора выявляется в других органах и биологических средах, которые в норме не имеют микробов (кровь, моча и др.), появляются дополнительные очаги инфекционного процесса.
Все перечисленные стадии дисбактериоза наблюдаются, в основном, при медикаментозных дисбактериозах. При дисбактериозах другого происхождения отмечаются, как правило, две первые стадии. В настоящее время в связи с тем, что первая степень дисбактериоза может быть обнаружена только случайно, все большее употребление приобретает деление дисбактериоза на 3 степени (табл. 2). Этот подход с практической точки зрения более оправдан.
По возбудителю (этиологический принцип - преобладание определенного возбудителя) среди дисбактериозов чаще встречаются: протейный, клебсиеллезный, стафилококковый, кандидозный, синегнойный и пр.).

Методы лечения дисбактериоза
Из воздействий, дающих наиболее эффективный и длительный результат по восстановлению нормальной микрофлоры, следует отметить рациональное питание. Это связано с тем что, изменяя спектр пищевых продуктов, можно целенаправленно создавать в желудочно-кишечном тракте условия максимально благоприятные для восстановления собственной микрофлоры. Но одновременно, это и самый трудный путь, ведь фактически каждому, кто идет по этому пути лечения дисбактериоза, приходится кардинально изменять пищевые привычки.
Гидроколонотерапия и субаквальные промывания кишечника. Следует отметить, что, несмотря на получение быстрого результата в плане удаления патогенной микрофлоры, стимуляции двигательной активности кишечника и снижения уровня интоксикации, отдаленные результаты лечения не столь эффективны.




Таблица 2
Клинико-микробиологическая классификация дисбактериоза

Степень дисбак-
териоза
Симптомы
Микробиологические
признаки

I
Сниженный аппетит
Нарушение прибавки веса у детей
Вздутие
Запоры
Неравномерная окраска каловых масс
Снижение количества бифидобактерий, лактобактерий или обеих на 1-2 порядка; снижение кишечных палочек < 1млн КОЕ/мл, или их увеличение более 100 млн КОЕ/мл, или появление измененных форм.

II
Желудочные проявления (гастрит): боль, связанная с приемом пищи; диспепсия (отрыжка, тошнота, изжога, рвота); снижение аппетита; нарушения моторики кишечника; боль в подложечной области; вздутие; запоры.
Кишечные проявления (энтерит): понос; вздутие; боль в животе; ощущение переполненности кишечника; язык обложен налетом.
Характерны:
периодическое появление аллергических реакций типа крапивницы; анемия; гиповитаминоз; гипокальциемия.
При наличии одного вида условно-патогенных микроорганизмов в количестве не выше 100 тыс КОЕ/мл или при наличии ассоциаций условно-патогенных микроорганизмов в количестве 1-10 тыс. КОЕ/мл. Для этой степени характерно большое количество кишечной палочки (E.coli 1ас(-)) > 10тыс КОЕ/мл и/или кишечной палочки с измененными свойствами ферментов.


III
Транзиторная бактериемия
Кратковременное повышение температуры тела:
озноб; головная боль преимущественно во второй половине суток; синдром желудочно-кишечной диспепсии; появление бактерий в моче, желчи; при тяжелом течении возможно развитие очагов: инфекции во внутренних органах

При наличии условно-патогенной микрофлоры одного вида или ассоциации разных видов в большом количестве.


Фаготерапия. Применение бактериофагов - препаратов, содержащих вирусы, избирательно уничтожающих определенные микроорганизмы. Своеобразная "волшебная пуля" не дала ожидаемого результата. К причинам можно отнести: слишком узкая специфичность, быстрое появление фагорезистентных штаммов патогенных бактерий, а также возможность сенсибилизации организма чужеродными белками. Кроме того, фаги плохо сорбируются в коллоидной среде, так что трудно представить их возможность бактерицидности в толстом кишечнике, где бактерии окутаны слизью и перемешаны с фекальными массами. Проблемой является доставка фагов к «месту назначения». В частности, практикуемое введение препаратов при помощи клизмы не обеспечивает поступления фагов в проксимальные отделы толстого кишечника, где может быть локализован основной дисбиотический процесс, то же касается и введения фагов в виде ректальных свечей.
Антибиотикотерапия дисбактериоза. Преимущественно назначают антибиотики широкого спектра действия, так как большинство представителей условно-патогенной флоры относятся к грамотрицательным бактериям. Назначают антибиотики короткими курсами из-за их способности при длительном приеме усугублять дисбактериоз, преимущественно за счет развития грибковой микрофлоры (кандидоз слизистых оболочек). Препараты этой группы в минимальной степени воздействуют на нормальную микрофлору кишечника, в связи с этим курс лечения может быть более длительным - до 10-14 дней. Одновременно с антибиотиками целесообразно назначать поливитамины, для уменьшения их неблагоприятного действия на нормальную микрофлору кишечника. После антибактериальной терапии, когда предположительно подавлен рост наиболее агрессивных представителей измененной микробной флоры в кишечнике, назначаются бактериальные препараты.
Эубиотики. Применением эубиотиков, несмотря на наличие большого их количества, и разных форм употребления, проблема эффективного устранения дисбактериоза не решена до сих пор. Это связано с тем, что микроорганизмы, содержащиеся в эубиотиках, после прекращения их употребления быстро удаляются из организма. А при сохранении негативного воздействия на организм это быстро приводит к рецидиву дисбактериоза, что особенно часто наблюдается при вторичных дисбактериозах. Однако, в настоящее время, именно применение препаратов эубиотиков является наиболее распространенным и, пожалуй, эффективным методом профилактики и лечения дисбиотических состояний.

5. Производство препаратов нормофлоры

5.1. Требования к микроорганизмам, используемым для создания препаратов пробиотиков

Для микроорганизмов, используемых при производстве пробиотиков, установлены определенные правила:
- они должны быть фено- и генотипически классифицируемыми;
- они не должны обладать патогенностъю;
- они должны быть изолированы из организма тех видов животных и человека, для которых они и будут предназначены;
- они должны обладать полезным воздействием на организм хозяина, подтвержденным лабораторными исследованиями и клиническими наблюдениями;
- при длительном использовании они не должны вызывать побочные эффекты;
- они должны обладать колонизационным потенциалом, то есть сохраняться в пищеварительном тракте до достижения максимального положительного действия (быть устойчивыми к низким значениям рН, желчным кислотам, антимикробным субстанциям, продуцируемым индигенной микрофлорой, хорошо адгезироваться к эпителию соответствующих слизистых оболочек);
- они должны обладать стабильными характеристиками как в клиническом, так и в технологическом плане;
- они должны обладать высокой скоростью роста и размножения в условиях, близким таковым в кишечном тракте, а при их культивировании in vitro для накопления биомассы следует создавать условия, максимально приближающие таковым микроокружения просвета кишечника.
Только доказавшие свою клиническую эффективность в плацебо-контролируемых исследованиях штаммы могут быть использованы для производства пробиотиков (табл. 3).
Принципы рационального конструирования микробных биопрепаратов, были сформулированы российскими исследователями еще в 1986-1990 годах. По мнению отечественных авторов при создании пробиотиков для лечебно-профилактического применения следует использовать единые приемы селекции производственных штаммов по критерию антагонистической активности в условиях культивирования смешанных популяций, близких к естественным экологическим. При отборе производственных штаммов преимущество следует отдавать умеренным кислотообразователям в расчете на продукцию отобранными штаммами истинных антибиотикосхожих субстанций. При этом необходимо обязательно учитывать генетические особенности этих штаммов, включая наличие у них внехромосомных факторов наследственности, а также их адгезивную способность на субстрате естественных биотопов.
Конструирование поликомпонентных пробиотиков следует проводить с учетом природного синергизма видов, путем оценки накопления биомассы отдельными культурами при совместном их выращивании. При разработке фармакопейных лекарственных форм микробных препаратов требуется учитывать принципы биофармации и потенцирующего, протективного или ингибирующего действия вспомогательных веществ. Для улучшения технологических и функциональных характеристик отобранных для производства пробиотиков и продуктов функционального питания стартерных культур молочнокислых бактерий, а также для конструирования новых штаммов с заданными свойствами используются различные приемы селекции, генетики и генетической инженерии этих микроорганизмов.

Таблица 3
Виды и штаммы микроорганизмов, входящих в состав пробиотиков

Род
Вид
Штамм

Lactobacillus
L. acidophilus
100аш; NK1; K3Ш24; Ер317/402


L. rhamnosus
L. ramnosus GG


L. plantarum
299 v; 8RA-3


L. reuteri
 


L. fermentum
KLD; 90-TC-4


L. lactis
 


L. casei
L. Shirota


L. bulgaricum
 

Bifidobacterium
B. longum
B. infantis; BB536; B379M


B. bifidum
 791; ЛВА-3


B. breve
 79119; 79-88


B. adolescentis
 7513; MC-42; Г013


B. animalis
B. lactis Bb 12


B. infantis
Г 73-15; 79-43

Streptococcus
S. thermophylus
 


S. cremoris,



S. lactis


Enterococcus
E. faecium
Enterococcus SF68


E. faecalis


Saccharomyces
S. boulardi
 

Bacillu
B. subtilis


Eschеrichia
E. coli




Необходимым условием массового производства препаратов эубиотиков является сохранение их стабильности в течение длительного времени. Бактерийные препараты, содержащие живые микроорганизмы, относятся к наименее стойким, их активность снижается за счет гибели клеток. Микроорганизмы, имея низкий уровень биологической организации, сохраняют жизнеспособность практически при полной потере воды, при этом в них обратимо замедляются или прекращаются обменные процессы. Для увеличения сроков жизнеспособности бактерий показана сублимационная сушка, проходящая в условиях низкой температуры и глубокого вакуума (незначительной концентрации кислорода).
По причине гигроскопичности укупорку сухих биопрепаратов проводят под вакуумом или в токе инертного газа.
К факторам, оказывающим влияние на выживаемость микроорганизмов в препаратах сухих эубиотиков при хранении, следует отнести:
регламентированное содержание остаточной влаги;
наличие защитных сред;
хранение сухих препаратов в атмосфере, не содержащей кислород.
В целях защиты эубиотиков от кислой среды желудка на таблетиро-ванные и капсулированные формы наносят ацидорезистентные покрытия или проводят иммобилизацию бактерий на сорбенте.
Производство должно быть организовано в соотвествии с ГОСТ Р 52249-2004 «Правила производства и контроля качества лекарственных средств».

5.2. Общая схема технологического процесса производства пробиотиков

1. Подготовка производственных помещений, оборудования, посуды, персонала, вентиляционной системы в соответствии с требованиями инструкций, регламентирующих условия работы со стерильными лекарственными средствами.
2. Подготовка и стерилизация сред (концентрированной, производственной и защитной среды высушивания) включает:
- качественный подбор необходимых для данной культуры веществ;
- оценку влияния отдельных компонентов на выход целевого продукта;
- нахождение оптимального соотношения составляющих и удешевление сред.
3. Выращивание маточных (до 6 пассажей) и производственных культур. Вначале выращивают маточную культуру из специального штамма при температуре 37 °С, используя различные питательные среды. Производственную культуру выращивают методом глубинного культивирования в реакторах, установленных в боксах. Реакторы оснащены магнитной мешалкой и паровой рубашкой.
4. Розлив жидкого полуфабриката во флаконы. Розлив микробной суспензии в ампулы и флаконы проводят на аппаратах розлива и запайки ампул. Заполненные ампулы и флаконы поступают на сублимацию.
5. Сублимационная сушка. Ампулы помещают в морозильные камеры под углом 75°. Содержимое ампул замораживают при температуре -40 °С, выдерживают при этой температуре 18-24 ч, подвергая сублимации.
6. Укупорка. Ампулы с сухой микробной массой запаивают (флаконы укупоривают) с газовой защитой.
7. Маркировка, упаковка. Ампулы маркируют и упаковывают в пачки по 10 штук.
8. Контроль качества готовой лекарственной формы.

5.3. Частная технология препаратов нормофлоры

Лактобактерин. Для производства лактобактерина применяют штамм лактобактерий Lactobacillus plantarum, который относится к роду Lactobacillococcus. Лактобактерий представляют собой грамположительные палочки длиной 0,7-3,0 мкм. Растут в атмосфере СО2, N2, О2.
Лактобактерин сухой (Lactobacterium siccuum) получают по общей схеме для бактерийных препаратов.
1. Приготовление и стерилизация питательных сред:
1.1. Приготовление гидролизованного молока (к прокипяченному обезжиренному молоку с рН 7,7±0,1 добавляют панкреатин и хлороформ, выдерживают при 40±2 °С 72 ч, затем фильтруют, разводят вдвое водой для инъекций, разливают в бутыли и стерилизуют).
1.2. Приготовление дрожжевого аутолизата (хлебопекарные дрожжи разводят в бутылях водой для инъекций и стерилизуют).
1.3. Приготовление среды МРС (к гидролизованному молоку добавляют дрожжевой аутолизат и навески следующих веществ: марганца и магния сернокислого, аммония лимоннокислого, глюкозы и др.).
1.4. Приготовление гидролизата казеина (в реакторе готовят раствор казеина, устанавливают необходимое значение рН, добавляют хлороформ, выдерживают пять суток при 45 °С, затем фильтруют в бутыли и стерилизуют).
1.5. Приготовление казеиново-дрожжевой среды.
1.6. Приготовление защитных сред высушивания (желатин, сахароза, молоко, натрий лимоннокислый и вода).
2. Получение маточной культуры
Готовят 6 пассажей в пробирках, чашках Петри, флаконах и бутылях - в течение 9 суток.
3. Выращивание производственной культуры
Выращивание осуществляют в реакторах с жидкой питательной средой в течение 8-12 ч при 37 °С (в 1 мл микробной суспензии производственного штамма должно быть не менее 6 млрд. живых микробных клеток), затем к полученной микробной суспензии добавляют защитные среды высушивания - сахарозно-желатозную или обрат молока.
4. Розлив лактобактерина в ампулы
Доза бактериального препарата зависит от концентрации живых микробных клеток в производственной культуре.
5. Лиофильная (сублимационная) сушка:
5.1. Замораживание ампул с лактобактерином, расположенных наклонно под углом 75°, в течение 18-24 ч в холодильной камере до минус 40 °С.
5.2. Лиофилизация (сублимирование) - сушка в условиях глубокого вакуума, длительность сублимации 68-70 ч.
6. Запайка ампул
Запайка осуществляется в режиме газовой защиты - в атмосфере азота.
7. Контроль качества:
7.1. Описание: кристальная или пористая масса желтовато-белого цвета, кисломолочного запаха и вкуса. Определяют органолептически.
7.2. Подлинность определяется наличием характерных морфологических, культуральных и биохимических свойств в производственных штаммах лактобацилл.
7.3. Показатель рН растворенного препарата должен составлять 5,5±0,5.
7.4. Остаточная влажность лактобактерина в ампулах или флаконах не должна превышать 3,5%, в таблетках 5%.
7.5. Растворимость. Сухой препарат должен растворяться в воде, очищенной и добавленной из расчета 1 мл на 1 дозу, в течение 5 мин образовывать гомогенную взвесь, желтовато-бежевого цвета. Определяют визуально.
7.6 Бактериальная контаминация проверяется бактериоскопически и бактериологически.
Бактериоскопически - путем просмотра мазков, приготовленных из взвеси растворенного препарата и окрашенных по Грамму. В мазках должны быть клетки, характерные для лактобацилл (грамположительные).
Бактериологически - путем посева на питательные среды и инкубации в течение 2-х суток не должно содержаться колоний. Если обнаружен рост хотя бы в одной пробирке или чашке, производится повторный посев удвоенного количества образцов. В случаях повторного роста серию препарата бракуют. Препарат сухой не должен быть контаминирован посторонней микрофлорой. Препарат в таблетках не должен содержать патогенных и условно-патогенных микроорганизмов (допускается наличие микробов сапрофитов в количестве не более 300 на 1 таблетку).
7.7. Специфическая безвредность. Препарат должен быть безвредным для белых мышей при введении его внутрь в количестве одной дозы. Наблюдение за мышами осуществляется в течение 5 суток. В случае гибели за этот срок хотя бы одной мыши контроль повторяют на удвоенном количестве животных. Если мыши не погибнут, препарат считают выдержавшим испытание, в противном случае данную серию препарата бракуют.
7.8. Специфическая активность. Определяется активность по количеству жизнеспособных клеток лактобацилл в 1 дозе препарата, а также активности кислотообразования.
7.8.1. Определение количества живых лактобацилл в 1 дозе. Для определения количества живых лактобацилл в одной дозе препарата от каждой серии испытывают не менее 3-х образцов. Содержимое флакона после разведений высевают по 0,1 мл микробной суспензии на 4 чашки Петри. После 44 ч инкубации при температуре 37 °С производят подсчет выросших колоний и вычисляют содержание живых бактерий в 1 дозе препарата.
7.8.2. Определение активности кислотообразования проводят тит-риметрическим методом при выращивании бифидобактерий в модифицированной печеночной среде. Каждую пробу титруют раствором натрия гидроксида в концентрации 0,1 моль/л в присутствии индикатора фенолфталеина до появления слабо-розового окрашивания. В одной дозе препарата (1 таблетка) при выпуске должно содержаться не менее 2·109 живых лактобацилл. Показатель активности кислотообразования лактобактерина, выраженный в градусах Тернера (ТО), должен быть не менее 200.
7.9. Определение компонентов стабилизирующей среды высушивания и других веществ, входящих в состав препарата.
8. Маркировка и упаковка
При производстве таблеток лактобактерина микробную суспензию сушат в кассетах. Сухую микробную массу (СММ) протирают через металлическое сито в бутыли с азотом. Таблеточную массу готовят в шаровой мельнице с добавлением к СММ вспомогательных веществ (лактозы, аэросила, кальция стеарата). В таблеточной массе определяют количество живых лактобактерий и рассчитывают массу таблетки. Таблетирование ведут методом прямого прессования в асептических условиях при строгом соблюдении влажности воздуха (не более 50% при 18 °С). Таблетки передают на фасовку во флаконы. Препарат должен находиться в вакууме, атмосфере азота или стерильного воздуха. С целью защиты бактерийных препаратов от агрессивной кислой среды желудка создаются таблетки с ацидорезистентным покрытием, капсулированные формы, иммобилизованные на сорбенте бактерии. Предприняты попытки создания микрокапсулированных форм пробиотиков.
Продолжительность процесса производства лактобактерина в ампулах и таблетках составляет соответственно 42 и 66 суток. Хранят препарат в сухом, темном месте при 5±3 °С. Срок годности равен 12 месяцам, если в одной дозе при выпуске содержится 4 млрд. и более живых лактобацилл; 6 месяцов - при содержании от 2 до 3,9 млрд. К концу срока годности в бактериальном препарате должно содержаться 1 млрд. живых лактобацилл.


5.4. Основные пути создание препаратов эубиотиков нового поколения

По аналогии с антибиотиками нами предлагается условно выделять «поколения» биотических препаратов. Так, к «первому поколению» можно отнести лекарственные средства на основе лиофилизированной монокультуры микроорганизма-представителя нормальной микрофлоры кишечника («Лактобактерин», «Бифидумбактерин»).
Ко «второму поколению» принадлежат эубиотики на основе комплекса живых микроорганизмов, их структурных компонентов, метаболитов в различных сочетаниях и соединений, стимулирующих рост представителей нормальной микрофлоры. При конструировании комплексных пробиотиков основываются на том, что каждый индивидуум, употребляя поликомпонентный пробиотический препарат, создает благоприятные условия для отбора из него представителей тех видов бифидо- и лактобацилл, которые в его кишечнике находятся в дефиците.
Более современными («третье поколение») являются лекарственные средства на основе жидких препаратов эубиотиков и микроорганизмов иммобилизованных на специально подобранном сорбенте («Бифидумбактерин форте»). Так, показано, что лечебный эффект на фоне терапии жидкими бифидобактеринами развивался через 1-2 месяца, тогда как применение сухих бифидобактеринов приводило к улучшению клинической и лабораторной симптоматики только через 3-6 месяцев. Антагонистические свойства пробиотических микроорганизмов, присутствующих в жидкой форме более выражены, чем у тех же штаммов, находящихся в лиофилизированном состоянии; это может быть связано с присутствием в жидких формах пробиотиков более высоких концентраций уксусной, молочной кислот, перекиси водорода, а возможно и других антагонистических и иных регуляторных субстанций-метаболитов. Кроме того, жидкие биопрепараты, содержат большее количество микробных тел (1011-1015 в 1 мл объёма по сравнению 108 в сухих препаратах), не содержат посторонней микрофлоры, и, жизнеспособность микроорганизмов жидких препаратов оказалась значительно более высокой.
В настоящее время идет активная разработка и внедрение препаратов эубиотиков на основе генно–инженерных штаммов микроорганизмов, их структурных компонентов и метаболитов с заданными характеристиками («четвертое поколение»). Так, для профилактики развития дисбактериоза в процессе терапии антибактериальными препаратами получен антибиотикорезистентный штамм бифидобактерии Bolongum D4a200, проявивший высокую эффективность при восстановлении микрофлоры кишечника уже в процессе антибиотикотерапии.
Весьма перспективно создание с помощью генной инженерии рекомбинантных пробиотиков, характеризующихся одновременно антибактериальными и антивирусными свойствами. Известен штамм Bacillus subtilis 2335/105 продуцирующий интерферон в количестве 104-105 МЕ на 1 мл культуральной жидкости, что позволяет совмещать в одном лекарственном средстве и бактериальную и противовирусную активность.
Недавно были разработаны генномодифицированные пробиотики на основе Lactococcus lactis, в геном которых искусственно введены структурные гены эукариотических клеток, детерминирующие продукцию функциональных цитокинов (IL-10) и других регуляторных протеинов (TFF- фактор). В экспериментах на животных и в клинических наблюдениях показана высокая эффективность подобного пробиотика в лечении болезни Крона и язвенного колита.

6. Классификация препаратов нормофлоры

Препараты, используемые для профилактики и лечения дисбактериоза (эубиотики) можно подразделить на 3 группы: пробиотики, пребиотики и симбиотики.
Пробиотики – биологические препараты, содержащие живые штаммы нормальной микрофлоры кишечника человека.
Пребиотиками принято считать пищевые добавки, селективно-стимулирующие рост и размножение так называемых дружественных человеку бактерий. Это низкомолекулярные углеводы (фруктозо-олигосахариды, инулин, лактулоза и др.), которые не должны подвергаться гидролизу пищеварительными ферментами.
Симбиотики комплексные препараты, содержащие пробиотик и пребиотик.
Основные препараты-пробиотики, зарегистрированые в Российской Федерации указанные в табл. 4.

6.1. Бифидосодержащие препараты

Действующим началом бифидосодержащих препаратов являются живые бифидобактерии, которые обладают антагонистической активностью против широкого спектра патогенных и условно-патогенных бактерий, за счет продукции кислот, ферментов, микроцинов. Эти препараты нормализуют деятельность желудочно-кишечного тракта, улучшают обменные процессы, повышают неспецифическую резистентность организма. Основное назначение бифидосодержащих препаратов – обеспечение быстрой нормализации микрофлоры кишечного и урогенитального трактов.
Бифидумбактерин. Препарат выпускают в сухом виде в нескольких лекарственных формах: во флаконах, в ампулах, в таблетках, в порошке, капсулах, в свечах. Для изготовления лекарственных форм используют микробную массу живых бифидобактерий, лиофильно высушенную в защитной среде.
Бифидумбактерин в порошке – лиофильно высушенная биомасса живых бактерий, очищенная от среды выращивания. Одна доза препарата во флаконах, ампулах, содержит 107 , в порошке, капсуле - 108 живых микробных клеток (м.к.). В каждой из указанных фасовок содержится по 5 доз, в таблетке и свече – по 1 дозе.
Препарат целесообразно применять при острых и хронических заболеваниях желудочно-кишечного тракта, при раннем переводе детей грудного возраста на искусственное вскармливание, в комплексном лечении детей (в том числе новорожденных), больных пневмонией, сепсисом и другими гнойно-инфекционными заболеваниями, для профилактики или купирования рас стройств функции кишечника и предотвращения язвенно-некротического энтероколита, лечения и профилактики дисбактериозов, а также местно с целью профилактики мастита. Препарат также назначают для лечения и профилактики заболеваний женской половой сферы, сопровождающихся дисбактериозом.
Таблица 4
Препараты-пробиотики

 Группы препаратов
Моно-компонентные
Поли-компонентные
Комбинированные и сорбированные

 
Бифидо-содержащие
Бифидумбактерин в порошке (B. bifidum).
Бифидумбактерин сухой (B. bifidum).
 
Бификол сухой (B. bifidum и E. coli M-17).
Линекс (B. infantis, L. acidophilus, E. faecium).
Бифиформ (В. longum и E. faecium).
Бифилиз сухой (B. bifidum и лизоцим).
Бифидумбактерин форте (B. bifidum, адсорбированные на активированном угле, доза 5х107).
Пробифор (B. bifidum, адсорбированные на активированном угле, доза 5x108).

 
Лакто-содержащие
Лактобактерин сухой (L. plantarum 8RA-3)
Биобактон сухой (L. acidophilus 12б).
Гастрофарм (L. bulgaricus LB-51).
Ацилакт сухой (L. acidophilus - 3 разных штамма).
 
Аципол (L. acidophilus и полисахарид кефирных грибков)

Коли-содержащие
Колибактерин сухой (E. coli М-17),
Бификол сухой (B. bifidum и E. coli M-17)
Биофлор (E. coli М-17, выращенная на среде с экстрактами из сои, овощей и прополиса)

Из других видов бактерий или микробных метаболитов
 
Споробактерин
(Bacillus subtilis).
Бактиспорин
(B. subtilis).
Бактисубтил (B. sereus)
А-бактерин (Aerococcus viridans)
Энтерол (S. boulardii).
Биоспорин (B. subtilis и B. licheniformis)
Хилак-форте содержит продукты метаболизма L. acidophilus и L. helveticus, E. coli, Enterococcus faecalis, молочную, фосфорную кислоты и др.


Бифидумбактерин форте (БФ). Представляет собой высушенную микробную массу живых бифидобактерий, иммобилизованных на сорбенте (косточковый активированный уголь). Одна доза содержит не менее 5х107 КОЕ бифидобактерий. Механизм терапевтического действия БФ отличается от других бифидосодержащих препаратов. Искусственно созданные на частичках активированного косточкового угля микроколонии бифидобактерий находятся в ином физико-химическом состоянии, что обеспечивает более интенсивное их взаимодействие с пристеночным слоем слизистой кишечника и заселение кишечника бифидобактериями, что существенно повышает их антагонистическую активность.
Объединение бифидобактерий в микроколонии обеспечивает также их высокую выживаемость при прохождении через кислую среду желудка, позволяет добиться высоких локальных концентраций на поверхности слизистой кишечника. Быстрое заселение кишечника бифидобактериями способствует нормализации количественного и качественного состава микрофлоры. Препарат выпускают в порошке по 5 доз. Высокие лечебные свойства БФ обусловлены заселением кишечника бифидобактериями, которые в иммобилизованном состоянии обеспечивают плотную локальную колонизацию слизистых оболочек и, тем самым, быстрее восстанавливают нормофлору и стимулируют репаративный процесс в слизистой оболочке кишечника.
БФ применяется с целью нормализации микробиоценоза желудочно-кишечного тракта, повышения неспецифической резистентности организма, стимуляции функциональной деятельности пищеварительной системы, для профилактики госпитальных инфекций в родильных домах и больницах. Препарат назначается детям и взрослым при лечении острых кишечных инфекций (ОКИ): шигеллез, сальмонеллез, стафилококковый энтероколит, ротавирусная инфекция, а также ОКИ не установленной этиологии и пищевых токсикоинфекций. БФ широко используется при лечении заболеваний пищеварительного тракта, сопровождающихся развитием дисбактериоза (язвенная болезнь желудка и 12-перстной кишки, панкреатит, холецистит, хронические заболевания печени и желчевыводящих путей), при аллергических заболеваниях, пневмониях, острых и хронических бронхитах, сопровождающихся дисбактериозами. Препарат назначают при воспалительных заболеваниях урогенитального тракта, больным хирургического профиля с заболеваниями кишечника, печени, поджелудочной железы в период предоперационной подготовки и после операций с целью коррекции микробиоценоза кишечника.
Учитывая нарушения микрофлоры кишечника, БФ широко назначается при применении антибактериальных препаратов, в том числе антибиотиков, гормонов, нестероидных противовоспалительных препаратов.
Пробифор. В состав порошка в пакете входят: лиофильно высушенная микробная масса живых бактерий антагонистически активного штамма B. bifidum 1, иммобилизованных на частицах косточкового активированного измельченного угля – (не менее 5х108 КОЕ) и лактоза (не более 0,89 г/пакет). Высокие концентрации бифидобактерий в желудочно-кишечном тракте не оказывают местно раздражающего, токсического и аллергического воздействия. Пробифор назначается детям с одного года и взрослым при лечении острых кишечных инфекций установленной и неустановленной этиологии, протекающих по типу энтерита, гастроэнтерита, колита, энтероколита, гастроэнтероколита; хронических гастродуоденита, панкреатита; проктосигмоидита и язвенного колита; постгастрорезекционных расстройств; состояний после холецистэктомий; цирроза печени; дивертикулеза кишечника различной локализации; синдрома раздраженного кишечника и др.
Бифилиз. Препарат содержит лиофилизированную микробную массу B. bifidum (108 КОЕ) и 10 мг лизоцима. Во флаконе – 5 доз. Лечебное действие препарата обусловлено наличием в его основе живых бифидобактерий и лизоцима в качестве естественного фактора защиты желудочно-кишечного тракта. Оптимальное сочетание бифидобактерий и лизоцима усиливает лечебное действие каждого компонента в препарате и позволяет ограничить применение антибиотиков для лечения кишечных инфекций и селективной элиминации патогенов.
Бифилиз назначают детям с первых дней жизни и взрослым при дисбактериозах, ОКИ и хронических заболеваниях различной этиологии. Особенно препарат показан ослабленным, недоношенным детям с отягощенным преморбидным фоном, при наличии смешанной патологии (инфекционно-воспалительные заболевания, угроза сепсиса, гипотрофия, анемия), при вторичных иммунодефицитных состояниях, в том числе после терапии цитостатиками, при гнойно-септических заболеваниях на фоне применения антибиотиков широкого спектра. Бифилиз назначают новорожденным для профилактики инфекционных и деструктивных осложнений, в том числе язвенно-некротического колита, а также при раннем искусственном или смешанном вскармливании.
Бифиформ. Препарат представляет собой высушенную микробную массу живых Bifidobacterium longum и Enterococcus faecium, расфасованную в капсулы. В капсуле содержится не менее 107 КОЕ каждого штамма. Препарат предназначен для нормализации микрофлоры кишечника, а также для предупреждения и лечения желудочно-кишечных расстройств у детей старше 2 лет и взрослых.

6.2. Лактосодержащие препараты

Действующим началом лактосодержащих препаратов являются живые лактобациллы, обладающие антагонистическим действием против широкого спектра патогенных и условнопатогенных бактерий за счет продукции кислот, перекиси водорода, лизоцима и антибиотических веществ. Лактосодержащие биопрепараты целесообразно назначать детям и взрослым при лечении ОКИ, хронических заболеваний желудочно-кишечного тракта с выраженными дисбиотическими явлениями, особенно в случае дефицита лактофлоры или при необходимости использования этих препаратов в комбинированной терапии с антибиотиками.
Лактобактерин. Препарат выпускают в сухом виде во флаконах, ампулах, в таблетках, свечах. Для изготовления всех форм используют микробную массу живых лактобацилл Lactobacillus plantarum, лиофильно высушенную в защитной среде. Одна доза препарата содержит не менее 109 КОЕ лактобацилл, препарат во флаконах содержит 5 доз, в ампулах - 3-5 доз, в таблетках и свечах - 1 дозу. Лактобактерин сухой и в таблетках предназначен для лечения детей (таблетки назначают детям с 3 летнего возраста) и взрослых, страдающих хроническими колитами различной этиологии.
Препарат применяют в комплексном лечении больных неспецифическим язвенным колитом, соматическими заболеваниями, осложненными дисбактериозами. Для больных, перенесших острые кишечные инфекции, при наличии дисфункций кишечника или выделении патогенной (условнопатогенной) микрофлоры, лактобактерин назначается для быстрого восстановления рН в кишечнике. Лактобактерин в свечах можно назначать женщинам с явлениями вагиноза в случае отсутствия грибков рода Candida.
Ацилакт. Препарат представляет собой микробную массу живых Lactobacillus acidophilus (штаммы 100АШ, NK1, К3III24), лиофильно высушенных в защитной среде. Одна доза содержит не менее 107 КОЕ лактобацилл. Ацилакт во флаконах содержит 5 доз, в таблетке и в свече - по 1 дозе. Лечебное действие препарата определяется присутствием живых ацидофильных лактобацилл, обладающих антагонистической активностью против широкого спектра патогенных и условнопатогенных бактерий за счет продукции кислот и антибиотических веществ.
Препарат оказывает корригирующее действие при нарушениях нормальной микрофлоры ротовой полости, кишечного и урогенитального трактов. Во флаконах препарат назначают детям с первого дня жизни и взрослым, в таблетках – детям с 3 летнего возраста. Ацилакт сухой и в таблетках рекомендуют детям и взрослым при ОКИ установленной и неустановленной этиологии, показан при ротавирусной инфекции. В тяжелых случаях возможно его совмещение с химио- и антибиотикотерапией из-за высокой резистентности к ним используемых штаммов. Ацилакт назначают при затяжных и хронических колитах и энтероколитах инфекционной и неинфекционной этиологии, сопровождающихся дисбактериозом, при среднетяжелой и легкой формах неспецифического колита у взрослых.
Аципол. Препарат представляет собой биомассу, состоящую из смеси живых антагонистически активных штаммов Lactobacillus acidophilus и полисахарида кефирных грибков. Препарат выпускают во флаконах или в таблетках, он имеет специфический кисломолочный запах и вкус. В одной таблетке содержится не менее 107 живых ацидофильных бактерий и 0,8 мг полисахарида кефирных грибков.
По механизму действия аципол является многофакторным лечебным средством: обладает антагонистической активностью в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов за счет синтеза органических кислот и антибиотических веществ, принимает участие в пищеварении и обмене веществ, оказывает корригирующее действие на микрофлору кишечника, обладает иммуномодулирующим действием за счет полисахарида кефирных грибков.
Аципол сухой применяют для профилактики и лечения детей с первых дней жизни и взрослых, в таблетках – с 3-летнего возраста. Препарат назначают для коррекции дисбиотических изменений в кишечнике, при ОКИ установленной и неустановленной этиологии (шигеллез, сальмонеллез, ротавирусная инфекция и др.). Аципол эффективен в комплексной терапии при заболеваниях, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, а также при длительных кишечных расстройствах различной этиологии, в том числе после проводимой антибактериальной терапии.
Биобактон. Препарат представляет собой сухую, однородную аморфную микробную массу живых бактерий L. acidophilus штамм 12б, лиофилизированных в защитной среде. В одной дозе биобактона содержится не менее 2,5х108 живых бактерий. Биобактон предназначен для применения у взрослых и детей, начиная с первых дней жизни. Препарат назначается при дисбактериозах кишечника различного генеза, ОКИ вирусно-бактериальной природы, а также при хронических заболеваниях ЖКТ, протекающих с явлениями дисбактериоза кишечника. При необходимости может применяться на фоне антибиотикотерапи, так как обладает устойчивостью к ряду антибиотиков.
Линекс – изготовлен на основе Bifidobacterium infantis var. liberorum, Lactobacillus acidophilus и Enterococcus faecium, лиофильно высушенных и расфасованных в капсулы. В одной капсуле содержится не менее 1,2х107 живых микробных клеток каждого штамма. Молочнокислые бактерии продуцируют молочную кислоту, в меньшей степени уксусную и пропионовую кислоты. Создаваемая кислая среда является неблагоприятной для развития патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Линекс применяется при острых кишечных инфекциях вирусной и бактериальной природы, хронических заболеваниях желудочно-кишечного тракта, протекающих с явлениями дисбактериоза кишечника.
Гастрофарм. Активным компонентом препарата являются высушенные жизнеспособные лактобактерии (штамм L. bulgaricus LB-51) и биологически активные субстанции. Препарат предназначен для лечения острых и хронических гастритов, при повышенной кислотности желудочного сока, язвенной болезни желудка и 12-перстной кишки у детей с 3 летнего возраста и взрослых. Выпускается в таблетках.

6.3. Колисодержащие препараты

К данной группе препаратов относится колибактерин, бификол и биофлор.
Колибактерин. В одной дозе препарата содержится не менее 109 живых клеток E. coli М-17, лиофилизированных в среде культивирования. Лечебное действие обусловлено антагонистической активностью кишечной палочки в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, включая шигеллы, сальмонеллы, протей и др. Препарат применяется для лечения затяжной и хронической дизентерии, долечивания реконвалесцентов после острых кишечных инфекций, хронических колитов и энтероколитов различной этиологии, дисбактериоза кишечника.
Бификол. Представляет собой лиофильно высушенную в среде культивирования микробную массу живых бифидобактерий (B. bifidum 1) и эшерихий (E. coli М-17). Препарат выпускают во флаконах или ампулах (5 доз). Одна доза содержит не менее 100 млн. живых бактерий каждого штамма. По механизму действия является многофакторным лечебным средством, обладает антагонистической активностью в отношении широкого спектра патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, включая шигеллы, сальмонеллы, протей, оказывает корригирующее воздействие на биоценоз, стимулирует местные репаративные процессы в кишечнике; способствует улучшению пищеварения и обмена веществ, а также стимулирует естественные факторы защиты.
Бификол применяется для лечения больных с хроническими колитами разной этиологии, реконвалесцентов острых кишечных инфекций при наличии дисфункций кишечника, протекающих на фоне дисбактериоза. Препарат применяют для лечения больных детей с 6-месячного возраста и взрослых.
Биофлор. Комплексный препарат жидкий, содержит биологически активный экстракт из сои, овощей и прополиса, сквашенный по специальной технологии бактериями E. coli М-17. Механизм действия биофлора заключается в подавлении жизнедеятельности болезнетворных микроорганизмов, конкурентном вытеснении условно-патогенных бактерий, нормализации иммунологических процессов, улучшении всасывания соединений железа, кальция, фосфора и др. Биофлор показан при лечении ОКИ и хронических заболеваний ЖКТ, а также при выраженных проявлениях дисбактериоза кишечника и при онкологических заболеваниях, проведении лучевой и химиотерапии. Курс лечения при ОКИ 5-7 дней, при хронических заболеваниях – более длительно (до 1-2 месяцев). Средние суточные дозы: детям 1 ст. л. 3 раза в день, взрослым – 2 ст. л. 3 раза в день.

6.4. Препараты из апатогенных представителей других таксономических групп или микробных метаболитов

К данной группе относятся препараты из апатогенных представителей родов Bacillus, Aerococcus и Saccharomyces. Лечебное действие споровых препаратов обусловлено их выраженными антагонистическими свойствами против широкого спектра патогенных и условно-патогенных бактерий, в том числе протеев, стафилококков и грибов рода Candida. Эти препараты содержат комплекс ферментов, стимулирующих пищеварение, и способствуют лучшему усвоению пищи, содержат протеолитические и фибринолитические ферменты, чем способствуют очищению воспалительных очагов от некротических тканей.
Препарат А-бактерин создан на основе штамма Aerococcus viridans, антагонистическая активность которого связана с синтезом перекиси водорода и бактериальной мурамидазы. Пептидогликан и тейхоевые кислоты, входящие в состав клеточной стенки аэрококков, обладают иммуномодулирующим действием.
Споробактерин сухой - микробная масса живых бактерий Bacillus subtilis. Применяется для лечения хирургических инфекций мягких тканей, остеомиелита, дисбактериозов. Выпускается в виде лиофилизированной массы в ампулах.
Энтерол 250 (Enterol-250) применяется в качестве активного компонента, содержит лиофилизированные дрожжи Sacchoromyces boulardii, механизм действия которых принципиально отличается от механизма действия других бактериальных препаратов. Sacchoromyces boulardii, обладают генетически обусловленной устойчивостью к антибиотикам и поэтому при проведении антибактериальной терапии сохраняют свою активность. Они не колонизируют пищеварительный тракт, клетки дрожжей элиминируются с калом в течение нескольких дней после завершения курса терапии. Таким образом, S. boulardii действуют как «временная» кишечная микрофлора, способная сохранять или восстановливать равновесие экосистемы кишечника.
Дрожжевые грибки S. boulardii активны в отношении Clostridium difficile и рекомендованы для лечения различных дисфункций желудочно-кишечного тракта и особенно антибиотико-индуцированных диарей.
Хилак-форте. Препарат содержит концентрат продуктов метаболизма бактерий тонкой и толстой кишки, в том числе метаболиты Lactobacillus acidophilus, L. helveticus, E. coli, Enterococcus faecalis, молочную и фосфорную кислоты, аминокислоты и другие вещества, способствующие нормализации рН, восстановлению водно-электролитного баланса, состава нормофлоры и поддержанию физиологической функции слизистой оболочки кишечника.

6.5. Пребиотики

Разработчики и производители препаратов пребиотиков указывают на ряд трудностей лечения дисбактериоза с помощью пробиотических лекарственных средств:
1. Кишечная нормофлора в составе пробиотиков обладает плохой проходимостью через верхние разделы желудочно-кишечного тракта и не достигает толстого кишечника в количестве достаточном для достижения терапевтического эффекта.
2. Незначительное количество нормофлоры, которое достигает толстого кишечника, плохо приживается в конкурентной среде патогенных микроорганизмов и не достигает своей экологической ниши на эпителиальном слое.
3. Видовой состав внедряемой с помощью пробиотиков микрофлоры не воспроизводит все видовое многообразие нормофлоры, подавленной при дисбактериозе.
В связи с этим, предлагается следующая стратегия лечения дисбактериоза: «Не заселять искусственно толстый кишечник человека нормофлорой, а стимулировать пребиотиками развитие собственной нормофлоры». В эту группу входят препараты, относящиеся к различным фармакотерапевтическим группам, но обладающие общим свойством – активизировать рост нормальной микрофлоры кишечника.
Основные известные в настоящее время препараты-пребиотики и симбиотики приведены ниже (табл.5).
Таблица 5
Пребиотики и синбиотики

Пребиотики
Симбиотики

Лактулоза
(нормазе, дюфалак, лактусан)
Биовестин-лакто (B. bifidum, B. adolescentis, L. plantarum и бифидогенные факторы)

ПАМБА
(пара-амино-метил-бензойная кислота)
Мальтодофилюс (B. bifidum, L. acidiphilus, L. bulgaricus и мальтодекстрин)

Лизоцим


Патотенат кальция
 

Фрукто-олигосахариды
Бифидобак (комплекс лакто- и бифидобактерий и комплекс фруктоолигосахаридов из топинамбура)


Лактулоза – полусинтетический дисахарид, состоящий из галактозы и фруктозы, который не расщепляется в кишечнике, поскольку у человека отсутствует лактулаза – фермент, необходимый для расщепления лактулозы и в неизменном виде достигает поперечно-ободочной кишки. Препарат способствует размножению лактобактерий, которые гидролизует лактулозу с образованием основных метаболитов: низкомолекулярных жирных кислот (молочной, уксусной, масляной и пропионовой), водорода, диоксида углерода. Результатом этого является сдвиг рН содержимого толстого кишечника в кислую сторону и усиление перистальтики. Кроме того, лактулоза, расщепляясь в кишечнике, высвобождает ионы водорода, связывает свободный аммиак, уменьшает образование токсических азотсодержащих веществ в проксимальном отделе толстого кишечника и их адсорбцию, увеличивает диффузию аммиака из крови в кишечник и, соответственно, его выведение из организма. Оказывает слабительное действие, ускоряя тем самым выведение токсинов.
Кальция пантотенат – участвует в процессах ацетилирования и окисления в клетках, углеводном и жировом обменах, синтезе ацетилхолина, стимулирует образование кортикостероидов в коре надпочечников. Утилизируется бифидобактериями и способствует увеличению их биомассы.
ПАМБА – пара-амино-метил-бензойная кислота (аналог амбен), ингибирующая действие протеолитических ферментов условно-патогенных бактерий и грибов, стимулирующая рост и размножение бифидо- и лактофлоры.
Лизоцим – способствует нормализации нарушенной микрофлоры. Наиболее активен в отношении грамположительных патогенных и условнопатогенных бактерий. Лизоцим обладает бифидогенным, иммуномодулирующим, противовоспалительным действием, стимулирует метаболические и репаративные процессы и эритропоэз, улучшает пищеварение, повышает противоинфекционную и антитоксическую резистентность организма, оказывает антибактериальное действие и проявляет синергизм со многими антибиотиками.
Фрукто-олигосахариды (ФОС) – это короткоцепочечные полисахариды, улучшающие рост сапрофитной микрофлоры. Они не всасываются в кишечнике человека, но перевариваются микрофлорой, в результате чего увеличивается количество лакто- и бифидобактерий и уменьшаются колонии патогенных микроорганизмов. Кроме того, ФОС улучшают синтез жирных кислот с короткой цепочкой (бутираты), улучшают функцию печени, снижают уровень холестерина в плазме, повышают элиминацию токсических соединений. Рекомендуемая доза для очищенных ФОС – 2000-3000 мг в сутки. Естественными пищевыми источниками ФОС являются репчатый лук, чеснок и спаржа. Однако, в рационе человека среднее количество ФОС, потребляемое с этими источниками составляет около 800 мг.
Кроме описанных выше лекарственных средств, различными компаниями выпускаются многочисленные биологически активные добавки (БАД) к пище. БАДы, содержащие пробиотические бактерии, целесообразно отнести к препаратам-синбиотикам.

7. Применение эубиотиков в клинической практике

Учитывая многообразие функций лактобактерий и бифидобактерий, применение эубиотиков должно значительно улучшать общее здоровье людей. Однако, поскольку эубиотики оказывают специфические эффекты, в настоящее время рассматриваются несколько основных показаний для назначения эубиотиков: дисбактериозы различной этиологии и, в том числе, возникшие после проведения антибактериальной терапии, вагинальная грибковая инфекция, инфекция мочевого тракта, профилактика атеросклероза и новообразований кишечника.
Нормализация микрофлоры кишечника
Эубиотики играют важную роль в профилактике и лечении заболеваний, особенно кишечных и вагинальных инфекций. Механизм антагонистической активности микроорганизмов входящих в состав эубиотических препаратов подробно рассмотрен выше.
Коррекция постантибактериальных осложнений
Эубиотики широко применяются для профилактики и лечения постантибиотиковой диареи, кандидоза или инфекции мочеполовых путей.
Лактобактерии могут корректировать рост грамотрицательных микроорганизмов, которые часто обнаруживаются после назначения антибиотиков широкого спектра действия. Например, смесь лактобактерий и бифидобактерий препятствуют снижению кишечной микрофлоры, вызванное ампициллином и нормализует кишечную экосистему.
Снижение полезной микрофлоры или суперинфекция антибиотикоустойчивой флоры может быть предотвращено назначением продуктов, содержащих лактобактерии. Необходимая доза - 15-20 млн. микроорганизмов. Рекомендуется также применение антибиотикорезистентного штамма бифидобактерии Bolongum D4a200.
Кандидозная инфекция
Эубиотики могут задерживать рост Candida albicans - основного фактора вагинальных инфекций. Лактобактерии являются одним из нормальных составляющих вагинальной флоры, где играют определённую роль в обеспечении рН среды в результате ферментативного расщепления гликогена с образованием молочной кислоты.
Инфекции мочевыводящих путей
Одной из проблем антибиотикотерапии инфекций мочевыводящего тракта является разрушение нормальной микрофлоры, защищающей мочевыводящий тракт от инфекций. Для восстановления нормальной микрофлоры необходимо применять суппозитории лактобактерии вагинально.
Профилактика атеросклероза
Имеются данные, что ряд представителей нормальной микрофлоры способны разрушать холестерин, используя его как источник энергии. Некоторые штаммы лактобацилл влияют на уровень холестерина сыворотки крови, например, штамм GG Lactobacillus casei. При клиническом изучении этого штамма, проведённом у 35 добровольцев в течение 2 недель получавших кисло-молочный продукт, ферментированный этим штаммом, установлено значительное снижение уровня холестерина в плазме крови.

Профилактика новообразований
Многочисленными исследованиями было показано, что употребление кисло-молочных продуктов снижает риск возникновения рака толстого кишечника.
Lactobacillus bulgarocus - основные лактобактерии, которые используются для приготовления кефира, в некоторых исследованиях продемонстрировали выраженную профилактическую противоопухолевую активность. В клинических исследованиях было показано, что употребление лактобактерина и бифидумбактерина приводит к снижению активности бактериальных ферментов, связанных с формированием канцерогенных соединений кишечника. Препараты-эубиотики рекомендуется назначать больным со злокачественными новообразованиями кишечника в качестве дополнительных средств при химио- или лучевой терапии.
Однако следует провести границу между областью применения лекарственных препаратов и биологически активных добавок к пище, содержащих эубиотики. Лекарственные препараты применяются для лечения дисбактериоза различной этиологии, кандидоза, инфекций мочеполовой системы. БАДы к пище следует применять с целью повышения резистентности организма, укрепления иммунной системы, профилактики развития дисбактериоза, атеросклероза, осложнений, возникающих при химиотерапии. Применение БАД к пище, содержащих нормальную микрофлору в качестве монотерапии дисбактериоза не допустимо.
Заключение

Назначать пробиотические препараты целесообразно в соответствии с принципом микроэкологической адекватности с учетом микробиологических нарушений, фазы и стадии дисбактериоза кишечника. Одни препараты у взрослых целесообразно использовать с профилактической целью, другие назначаются для лечения. Важным является характер основного заболевания, при котором развивается дисбактериоз кишечника. Так, при вирусных заболеваниях более целесообразно использовать лактосодержащие препараты, при бактериальных – бифидо- и лактосодержащие. Споровые пробиотики рекомендуются для лечения дисбактериозов, протекающих с доминированием протеев и грибов рода Candida.
Лечение, как правило, комплексное с назначением специфических бактериофагов, витаминов, сорбентов, десенсибилизирующих средств, в ряде случаев кишечных антисептиков и антибактериальных препаратов, с последующим назначением пробиотиков.
В заключение следует отметить, что опыт дифференцированного применения пробиотических препаратов неоспоримо свидетельствует о том, что их использование наиболее физиологично. Более того, использование данных бактериальных препаратов показало их явное клинико-микробиологическое преимущество перед антибиотиками, усугубляющих дисбиотические явления кишечника.
Наряду с этим, возможности использования эубиотиков не ограничиваются лечением дисбиотических состояний и среди научно-практических направлений, связанных с микробной экологией, перспективными для разработки и реализации являются:
- разработка экспрессных молекулярных методов исследования состава и активности микробиоценозов человека и животных;
- поиски новых пребиотических функциональных субстанций;
- исследование и детализация молекулярных, биохимических и иных механизмов эффективности пробиотиков, пребиотиков и симбиотиков в профилактике, лечении и увеличении сроков ремиссии при различных заболеваниях, ассоциированных с дисбалансом микробной экологии пищеварительного тракта;
-углубленная оценка безопасности пробиотических препаратов и продуктов питания, используемых человеком;
- исследования возможности использования представителей нормальной микрофлоры в качестве носителей при конструировании различного рода бактериальных и вирусных вакцин;
- создание современных биотехнологических предприятий по производству пребиотиков, симбиотиков, стартерных заквасок прямого внесения, антибиотиков, иммуномодуляторов, витаминов, биогенно активных пептидов, биосенсоров и т.д. на основе представителей нормальной анаэробной микрофлоры человека и животных.
Не вызывает сомнения, что научно-обоснованное использование пробиотиков, пребиотиков, синбиотиков и продуктов функционального питания на их основе является важным приемом сохранения и восстановления здоровья человека
Следует надеяться, что и в ХХI веке микроэкологические подходы сохранят достойное место среди современных технологий профилактической и восстановительной медицины.
СПИСОК РЕКОМЕНДУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Биохимические и молекулярные аспекты симбиоза человека и его микрофлоры / В.Н. Бабин [и др.] // Рос. хим. журн. - 1994, Т. 38, № 6. – С. 66-78.
Бондаренко В.М. Дисбактериозы кишечника у взрослых / В.М. Бондаренко, Н.М. Грачева, Т.В. Мацулевич. - М. : KMK Scientific Press , 2003. - 220 с.
Бондаренко В.М. Дисбиозы и препараты с пробиотической функцией / В.М. Бондаренко, А.А. Воробьёв // Журн. микробиол. – 2004. - № 1. – С. 84-92.
Бондаренко В.М. Препараты пробиотики, пребиотики и синбиотики в терапии и профилактике кишечных дисбактериозов / В.М. Бондаренко, Н.М. Грачева // Фарматека. – 2003. - № 7. - С. 56-63.
Влияние пара (амино-метил) бензойной кислоты на микрофлору кишечника у детей с острыми кишечными инфекциями / Л.Н. Мазанкова [и др.] // Педиатрия. – 1993. - № 2. – С. 65-67.
Дисбактериозы кишечника / В.М. Коршунов, В.В. Володин, Б.А. Ефимов // Детская больница. - 2000. - № 1. - С. 66-74.
Дисбактериозы кишечника, причины возникновения, диагностика, применение бактерийных биологических препаратов / Н.М. Грачева [и др.] - М., 1999. - 44 с.
Доронин А.Ф. Функциональное питание / А.Ф. Доронин, Б.А. Шендеров. - М. : Грант, 2002. - 296 с.
Изучение динамики накопления интерферона-
·2 человека in vitro, продуцируемого генетически модифицированным микроорганизмом Bacillus subtilis / Е.А. Ставский [и др.] // Молекулярная медицина. 2007. №2. С. 25 28.
Лактулоза и микроэкология толстой кишки // В.И. Максимов, В.Е. Родоман, В.М. Бондаренко // Журн.микробиол. - 1998, № 5. – С. 101-107.
Маевская М.В. Применение лактулозы в клинической практике: механизмы действия и показания / М.В. Маевская // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 2000. - Т. 10, № 5. - С. 21-25.
Нетребенко О.К. Пробиотики и пребиотики в питании детей грудного возраста / О.К. Нетребенко // Педиатрия. 2007. Т. 86, № 1. С. 8087.
Основы фармацевтической биотехнологии / Т.П. Прищеп [и др.] Ростов н/Д. : Феникс; Томск : Издательство НТЛ, 2006. 256 с.
Отраслевой Стандарт «Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника» (ОСТ 91500.11.0004-2003, утвержден Приказом Министерства здравоохранения РФ № 231 от 09.06.2003).
Хавкин А.И. Микрофлора пищеварительного тракта / А.И. Хавкин. M. : Фонд социальной педиатрии, 2006. 415 с.
Характеристика биологических препаратов и пищевых добавок для функционального питания и коррекции микрофлоры кишечника / В.М. Коршунов, Б.А. Ефимов, А.П. Пикина // Журн. микробиол. – 2000. - № 3. – С. 86-91.
Frossard C.P. Oral administration of an IL-10-secreting Lactococcus lactis strain prevents food-induced IgE sensitization / C.P. Frossard, L. Steidler, P.A. Eigenmann // J. Allergy Clin. Immunol. - 2007. – V. 119, № 4. – P. 952-959.









13PAGE 15


13PAGE 143015




Заголовок 1 Заголовок 2 Заголовок 315

Приложенные файлы

  • doc 8841887
    Размер файла: 322 kB Загрузок: 0

Добавить комментарий