биотехнология печать


Банки генетичних ресурсівЗа даними деяких дослідників, швидкість зникання видів рослин із Землі буде наростати і до 2040 року щорічно будуть втрачатися 20-75 видів рослин. Для збереження різноманіття рослинного світу у всьому світі створюють банки генетичних ресурсів і бази даних про них. Зараз функціонує їх понад 1300.
В Україні ця робота покладена на Національний центр генетичних ресурсів рослин, що знаходиться в Інституті рослинництва ім.. В.Я.Юр'єва. Останнім разом з Інститутом проблем кріобіології та кріомедицини НАН України розроблені умови кріоконсервації багатьох видів рослин.
Очищення протопластів.
Від решток клітин і тканин фільтруванням крізь сита 40-150 мкм. Ферменти – центрифугуванням та 3-4 разовою промивкою в промив очному або культуральному середовищі. Використовують метод флотації в концентрованих розчинах сахарози, манітолу, фіколу.
Вектори для переносу рекомб. Днк
Векторами, які відповідають цим вимогам, можуть бути: бактеріофаг λ або частини його геному, окремі онкогенні віруси тварин, бактеріальні плазміди та епісоми.
Фаг λ, як акцептор чужерідних фрагментів ДНК може мати один сайт-мішень, до якого прикріплюється чужерідна ДНК, називається інсерціоним вектором. А вектори, які мають пару сайтів, де можна вмонтувати фрагмент чужерідної ДНК називаються переміщуємими векторами або векторами заміщення.
Серед онковірусів тварин як вектор широко використовується онковірус мавпи SV40.
Перспективними для трансгенезису (перенесення генів у вигляді фрагментів молекул ДНК від однієї клітини до іншої в межах одного або різних видів, яке не пов‘язане з природною взаємодією генів (статевим процесом або його еквівалентом у бактерій) у рослини є вектори на основі плазмід: HYPERLINK "Глосарій.doc" \l "OLE_LINK1" \s "1,50273,50285,0,,Ті-ллазміди " Ті-ллазміди (Корончасті гали) Agrobacterium tumefaciens і HYPERLINK "Глосарій.doc" \l "_Hlk263158118" \s "1,50538,50550,0,,Ri-плазміди " Ri-плазміди (бородаті корені)- Agrobacterium rhirogenes.
Утворення корончатих галів на кореневій шийці відбувається в результаті проникнення бактерій A. tumefaciens через рани і трансформації генів, що відповідають за синтез бактеріальних білків, в геном рослин. Ті-плазміди (анг. tumor inducing – той, що спричиняє пухлини) є позахромосомною кільцевою молекулою ДНК з молекулярною масою близькою 1,2*108 (3-5% від розміру хромосоми агробактерії). Вони розмножуються в бактеріальній клітині автономно, тобто характеризуються незалежною реплікацією.
Повністю механізм перенесення тДНК в рослинну клітину не вивчений. Проте, відомо, що після поранення в рослинних клітинах утворюються фенольні та інші сполуки, які можуть активізувати гени vir – ділянки плазміди. Її активність спричиняє утворення одноланцюгових молекул тДНК (іноді дволанцюгових), які і переносяться в клітину рослин. Для здійснення процесу потрібна наявність правого повтору з 25п.н. Він забезпечує перенесення тДНК як в цис-, так і транс-положення відносно vir – ділянки.
Використання обеззброєних векторів дозволило: 1) переносити генетичну інформацію у рослини, не змінюючи їхнього росту та розвитку; 2) перевіряти експресію перенесених генів in vitro при функціонуванні повної програми життєздатності рослин. Ці фактори обумовили практичне використання генетичної інженерії – використання трансгенних рослин із заданими ознаками.
Цінним є використання бінарних (транс) векторів. Суть їх у можливості vir – ділянки в транс-положенні переносити в геном рослини послідовності ДНК, обмежені прямими повтореннями Т-ділянки. На підставі цього створені вектори, що мають дві плазміди в одній агробактерії. В одній плазміді видаляється Т-ділянка, але зберігається в інтактному стані vir–ділянка. В іншій плазміді між лівим та правим повторами знаходяться селективний ген та фрагмент ДНК (полілінкер) з численними сайтами транскрипції. Перевага бінарних векторів у можливості (завдяки селективному гену) добирати трансформанти і вбудовувати будь-який ген, який переноситься разом із селективним, що забезпечується полілінкером. Функціонування генів vir – ділянки однієї плазміди забезпечує перенесення в рослинні клітини послідовностей ДНК іншої плазміди, що обмежені повтореннями Т-ділянки.
ХіміотерапіЯ при оздоровленні рослин
В Інституті картоплярства РФ відпрацьований метод поєднання методу верхівкової меристеми з хіміотерапією. Він заснований на додавання в речовин – інгібіторів вірусів, зокрема, панкріотичної рибонуклеази. Її застосовують для обробки паростків перед виділенням меристеми або додаванням в живильне середовище з концентрацією 0,001-0,1%.
Обробіток паростків проводиться методом інфільтрації у вакуум-камері впродовж 20 хв. В живильне середовище РНК-азу додають дома способами. З використанням першого розчин рибонуклеази фільтрують через фільт Зейтца. Потім, в стерильних умовах, цей розчин додають до теплого живильного. Після ретельного перемішування суміш розливають у пробірки.
Згідно другого способу РНК-азу розчиняють у стерильній воді, а потім додають його до теплого проавтоклавованого живильного середовища. Щоб зменшити витрати РНК-ази, застосовується модифікація другого способу. Це досягається розміщенням рибонуклеази у верхній частині середовища. Для цього з об'єму середовища 1л 0,9 розливають у пробірки. У 100мл, які залишилися додають РНК-азу в необхідній концентрації. Потім в кожну пробірку додають охолоджений до 40 0 С залишок (100мл) живильного середовища з РНК-азою, з тим, щоб він знаходився у верхній частині пробірки (висота близько 0,5см.).
Застосування РНК-ази позитивно впливає на стимуляцію морфогенезу меристем і вихід регенератів. Приживлення меристем при використанні РНК-ази залежно від сорту зросло на 10-35%, а кількість отриманих регенератів на 30-40% і більше. Частка здорових рослин при використанні живильного середовища з рибонуклеазою в 1,2-2,0 разу більший ніж без неї.
Особливості сомоклональної мінливості
Кожен генотип взаємодіючи з різними умовами навколишнього середовища може по різному проявлятися у фенотипі.
Фенотип – це реалізація генотипу в певних умовах.
Сомаклональна мінливість виникає у процесі культивування клітин і тканин in vitro. Основою цього є генетична гетерогенність клітин, а також генетична і епігенетична мінливість викликана культивуванням in vitro.
Визначення генетичної мінливості in vitro, відбувається в тканинах клітин і його можна визначити використовуючи генетичний аналіз.
Прийняті певні позначення рослин in vitro. Ro-тільки висаджені, R1- і т. д. позначають покоління регенерантів від самозапилення, а покоління від схрещування R, F1.Виділяють такі механізми виникнення сомаклональної мінливості:
1. грубі кардіологічні зміни (зміни кількості і морфології хромосом),
2. критичні (не помітні за звичайного цитологічного аналізу) перебудови хромосом,
3. зміни в метилуванні певних послідовностей ДНК,
4. транспозиції рухливих генетичних елементів,
5. ампліфікація і редукція повторюваних послідовностей ДНК,
6. соматичний кросинговер та обмін сестринських хроматид,
7 криптичні елімінації вірусів.
Отримання безвірусного матеріалу картоплі
Отримання безвірусного насіннєвого матеріалу картоплі відбувається в декілька етапів.
1. Підготовка бульб для вичленення меристем .
2. Виділення меристем.
3. Вирощування виділених меристем.
4. Пересадка проростків.
5. Розчеренкування одержаних рослин та перший аналіз наявності вірусів.
6. Повторна дво-триразова перевірка ліній на зараженість вірусами.
7. Пересадка рослин з пробірок у теплицю.
8. Перевірка тепличних рослин на наявність вірусів.
9. Прискорене розмноження безвірусного матеріалу.
10. Випробування та розмноження тепличних меристемних клонів в польових умовах.
11.Збереження колекції оздоровлених сортів іп vitro .
Для виділення меристеми відбирають бульби без симптомів грибних, бактеріальних хвороб та механічних пошкоджень. Як правило, вони беруться від клонів, які в процесі вегетації не мали симптомів вірусних хвороб та мали негативну реакцію при використанні ІФА.
Переваги мутагенезу ін вітро
перед мутагенезом на рівні рослин:
1. значна економія експериментальних площ. Якщо в одній чашці Петрі діаметром 10см. можна розмістити 10 7- 108 клітин, то для на рівні рослин для цього потрібно 1 тис. га.
2. досить швидкий прояв мутантних ознак на рівні клітин,
3. можливість отримання нових типів мутацій, зокрема біохімічного характеру,
4. економія часу і витрат на одержання нової ознаки. Водночас, у деяких випадках мутантні клони можуть втратити регенеруючу здатність або мутація не може зберегтися при регенерації рослин..
Експериментальний мутагенез іп vitro значно розширює можливості по створенню цінного вихідного матеріалу. Цінність методу може бути ще вищою, коли він доповнений методами клітинної селекції. При in vitro мутагенами обробляються культивовані клітини. Додавання в середовище різних селективних агентів створює селективний тиск на культивовані клітини. Ті, що не здатні протистояти тиску селективних агентів гинуть, а ті, що залишилися мають генетичні зміни. Генетичне різноманіття при експериментальному мутагенезі in vitro значно вище ніж при спонтанному або індукованому in vivo. Відмінність культивування мутантів in vitro в отриманні варіантів на клітинному рівні та регенерації з них рослин, тобто експресія гена спостерігається уже поколінні Rо, тоді як з використанням традиційного методу в М2, М3 та наступних поколіннях
Поширення генетично модифікованих рослин
Вперше на комерційній основі стали вирощувати генетично модифіковані рослини в 1996 році в США на площі 1,7 млн. га. Впродовж дев'яти років (по 2004 р.) площа під ними зросла у 47 разів - до 81 млн. га. Причому, темпи зростання особливо збільшуються в останні роки. Наприклад, площі під ГМР лише за 2004 рік збільшилися на 20% порівняно з 2003 р.
У 2004 році до 10 мегакраїн , які вирощують біотехнологічні рослини на площі 50 000 га і більше добавилося ще чотири. Очолюють список США, з площею 47,6 млн. га. (59% від світових площ). Серед культур найбільші площі займає біотехнологічна соя – 48,4 млн. га або 60% світових площ під ГМР. Далі ідуть: кукурудза, бавовник, олійний ріпак, соя. В 2004 році в Китаї посіви ГМ бавовнику склали 3,7 млн. га або 66% від загальної площі посіву культури. В Аргентині ГМ соя займає 98% загальних площ під культурою, а кукурудза – 55%.
У світових масштабах за даними 2004 року площа посіву ГМ сої склала 56% від загальних площ зайнятих культурою, бавовника – 21%, ріпака – 19%, кукурудзи – 14%.
Найбільші площі відведені під ГМ культури стійкість проти гербіцидів (72%), стійких проти комах – 19%. Цінним є комбінування стійкості проти гербіцидів і комах в одній формі. Це стосується кукурудзи, бавовнику, площа яких складає 9% порівняно із загальними площами біотехнологічних рослин цих культур.
Ще до інтенсивного поширення ГМ рослин. З 1985 по 2003 роки дозвіл на польові випробування бітехнологічних рослин в США отримали 150 приватних та 75 державних закладів. Інвестиції бюджету США в дослідження, пов'язані з сільським господарством складають 3,540 млрд. дол. Цікаві факти стосовно наукового забезпечення в США виконання цих досліджень. Кількість випускників різних навчальних закладів в області біологічних наук в 1990 році було 45 тис., а в 2000 збільшилося на 62% і склало 73 тис.
Синтез генів поза організмом або в організмі
Власне до генної інженерії в повній мірі можна віднести лише перший напрямок досліджень – синтез генів поза організмом. Вперше дослідження з синтезу генів провів Г. Корана у 1967-1969 рр. Об‘єктом була відома послідовність нуклеотидіваланінової т РНК дріжджів. Робота виконана в декілька етапів: 1) одержання однонитчастих дезоксиолігонуклеотидів; 2) одержання двонитчастих фрагментів дезоксиолігонуклеотидів довжиною 8-12 п.п Синтезований ген мав довжину 77 нуклеотидів, але не характеризувався експресією, бо не мав регуляторних ділянок.
В подальшому Г. Корані продовжив дослідження в цьому напрямку, але першість у синтезі повноцінного гену належить Полу Бергу. Він одержав іп vitro першу рекомбінантну ДНК шляхом об‘єднання лінійних фрагментів ДНК з допомогою штучних “липких” кінців. Для синтезу використані: геном онкогенного вірусу мавпи (SV40), частина геному бактеріофага λ (лямбда) і гени лактозного оперону кишкової палички Esckerichia coli. Оскільки ген мав структурну регуляторну частини, він індукував в бактеріальній клітині тваринний гормон сомастатин. Саме дата отримання Бергом першої рекомбінантної ДНК (1972 р.) і вважається початком генної інженерії.
В 1976 році продовжуючи свої дослідження Г. Корані вдалося синтезувати ген тирозинової тРНК кишкової палички. Він складався із структурної частини (126 нуклеотидів), регуляторної (промотора) – 52 нуклеотиди і термінатора – 21 нуклеотид. На відміну від попередніх досліджень цей штучно створений ген мав всі необхідні складові, а тому, коли був введений у бактеріальну клітину функціонував як природний.
До останнього часу хімічним способом створювати штучно великі гени не вдавалося. Запропонований інший метод з використанням ферментативного синтезу за допомогою механізму транскрипції. Він оснований на даних, отриманих вченими Г. Теміна і Д. Балтімора. Вони встановили, що під час репродукції генних РНК - вмісних вірусів, що спричиняють пухлини у тварин, спадкова інформація може передаватися ввід РНК до ДНК. Цей процес відбувається за участю спеціального ферменту – РНК залежна ДНК полімераза або зворотня транскриптаза (ревертаза).
Практично ферментативний синтез здійснюють так. In vitro з використанням зворотньої транскриптази на матричній РНК синтезуються комплементарна їй ДНК (одна нитка). Потім вона подвоюється і стає двонитчастою. Після цього мРНК руйнується рибонуклеазою. Оскільки синтезована ДНК не є такою, що міститься в ядрі, вона називається ДНК - копією (кДНК). Особливість її – відсутність інтрогенів, тобто за структурою вона не відрізняється від бактеріального гена.
Створений таким способом ген може функціонувати у бактеріальній клині. На ньому синтезується мРНК, за кодом якої утворюється білок. Створений під керівництвом В.М. Енгельгарда ген, який введений у фаг, обумовлював синтез галактозидази. Пізніше синтезовані гени, що керують утворенням гемоглобіну людини, кроля, голуба, гени мітохондрій печінки щура тощо. Цим способом також отриманий, клонований їм експресований у клітинах бактерій генів інтерферону людини для боротьби з вірусною інфекцією.
Синтезовані гени з використанням зворотньої транскрипції через відсутність регуляторної частини і промотора не можуть функціонувати в клітинах еукаріотів. Водночас, перенесені в мікробну клітину до них приєднується промотор, добутий з неї, що забезпечує експресію гена. Так були синтезовані гени, які контролюють синтез інсуліну, а в інших дослідах – нітрогормони.
Перспективність ферментативного синтезу генів у можливості транскрибування будь-яких генів з мРНК. Проте відсутність регуляторних генів обмежує і навіть унеможливлює практичне використання таких генів. У них відсутні також інтрониі.
Наступні етапи досліджень, вважаю, відносяться до генетичної інженерії. У 1969 році під керівництвом Дж. Беквіта здійснено вперше виділення гена. Ним був ген лактозного оперону кишкової палочки Escherichia coli. В дослідження залучали два бактеріофаги: λ і φ (фі)80, у яких орієнтація Lac-оперону протилежна відносно власних генів. У фага λ послідовність структурних генів така: a, y, z, o, p, i, а фага φ протилежна – i, p, o, z, y, a. Щоб звільнитися від генів фагів проводили гібридизацію важних ниток ДНК (багатих Г-Ц парами) обох фагів. В результаті комплементарність генів мала місця лише на ділянці lac-оперону. Однонитчасту ДНК, яка знаходилася по обидва боки гібридної ДНК, вирізали специфічною ДНК дезоксирибонуклеазою, виділеною з N.crassa. Таким чином був отриманий lac-оперон у чистому вигляді.
Сомоклональна мінливість
Процес культивування in vitro з використанням штучних живильних середовищ до складу яких входять фізіологічно активні речовини збільшують частоту мутацій. Крім цього сам експлант, який ми вводимо в культуру на рівні клітин неоднорідний. Ці два фактори спричиняють мінливість матеріалу який ми вирощуємо.
Рослини –регенеранти які отримані і характеризуються генетичною мінливість називаються сомаклональними варіантами або сомаклонами.
В практичних цілях використовуючи сомаклональну мінливість можна отримати:
- селекційно цінні форми; -можно дослідити мутабільну активність окремих ознак;- можно оцінити загальну стабільність генотипу.
Сомаклональність виникає внаслідок:
- спадковості (ядерна, поза ядерна, акаріотична мінливість)
-мінливості ( спадкова, не спадкова)
Спадкову мінливість поділяють на комбінаційну, мутаційну, онтогенетична.
Виходячи з природи генетичного матеріалу відрізняють три рівні його організації: генний, хромосомний, геном ний.
Генний рівень організації базується на чіткому контролі ознак окремими генами. Вся мінливість зокрема комбінативна на цьому рівні підпорядкована Менделівським законам які діють бездоганно.
На хромосомному рівні генетичний матеріал розташований у хромосомах і зрозуміло, що мінливість на хромосомному рівні має меншу частоту. Ще меншою мірою проявляється геномна мінливість.
Поза хромосомна мінливість через порівняно невелику кількість генів у мітохондріях, пластидах характеризується меншою мінливістю. Крім цього вона може передатися потомству лише по материнській лінії.
Запліднення in vitro.
Для усунення невідповідності схрещуваних рослин за репродуктивними органами використовують запліднення in vitro. Для цього самозапильні культури каструють за декілька днів до розпускання пуп'янків з наступною ізоляцією їх. За день до розкриття пуп'янків їх зрізають і для стерилізації кілька секунд витримують в 70% етиловому спирті, а також після цього 10 хв. в хлорній воді. Після цього вилучають цілу маточку або зав'язь, які розрізають, щоб оголити насіннєві зачатки. Іноді вирізають шматочки плаценти з насіннєвими зачатками.
Ізольовані таким чином складові квітки переносять на живильне середовище. Через 2-3 доби туди ж переносять простерилізований пилок, що досягається витримуванням його біля 30 хв. під ультрафіолетовим промінням, або виділенням його в стерильних боксах з нерозкритих пуп'янків, які попередньо стерилізують. Пилок проростає на агаризованому середовищі і пилкові трубки через мікропіле насіннєвого зачатка потрапляють у зародковий мішок. Розвиток заплідненого насіннєвого зачатка не закінчується формуванням насіння, а переходить в утворення рослини.
Однією із складностей подальшого залучення віддалених гібридів в селекційну практику є їхня стерильність. Звичайно це зумовлено порушеннями мейозу у амфігаплоїдів, отже відсутністю повноцінних гамет. Подолати цей бар'єр можна з використанням методу поліплоїдії. В природі іноді подвоєння хромосом у віддалених гібридів відбувається спонтанно. Прикладом можуть бути редиско-капустяні гібриди Г.Карпеченка. Експериментально поліплоїдія досягається застосуванням індукторів цього процесу. Ними є речовини, які порушують функції веретена, внаслідок чого розходження хромосом не відбувається. Для подолання такої форми стерильності використовуються штучні живильні середовища. В їхній склад можна вводити ті ж індуктори поліплоїдії. А іноді в умовах in vitro відбувається спонтанна поліплоїдизація.
Використання біотехнологічних процесів у державах Стародавнього Світу.
Більше 6000р. тому шумери, вже володіли мистецтвом пивоваріння. З цією метою ячмінь або полбу (форма пшениці) зволожували і пророщували. В результаті отримували солод. Потім випікали “пивні хлібини”, дрібнили їх і заливали водою. Потім з допомогою сита відділяли тверді частини, а розчин розливали в глиняні ємності, які запробковували. Через деякий час в рідині утворювалися бульбашки газу (вона забродила, як говориться зараз). Греки це називали по-іншому, але процес відбувався як і зараз. Таким чином в рідині утворювався спирт. Це і було пиво.
Досвід шумерів перейняли вавілоняни і мабуть пішли в удосконалення технології виготовлення пива значно далі, бо у них уже було відомо більше 20 сортів пива. Цей напій користувався великою популярністю і, мабуть, був високоякісним, особливо після указу вавилонського царя Хаммурані. Він наказав висікти на камінні наказ – якщо пивовари, розбавлятимуть пиво водою, вони будуть покарані – питимуть розбавлене пиво до тих пір, поки не сп‘яніють, або будуть утоплені в своїх бочках.
Єгипетська технологія виготовлення пива відрізнялась тим, що в солод добавляли відстій вдало звареного пива.
Слід зазначити, що хоча в далекому минулому і використовувалася біотехнологія в сучасному розумінні, але природа процесів, які відбувалися, не була відома. Не можна було побачити об‘єкти досліджень – величина клітини пивних дріжджів складає біля сотої долі міліметра, а тому неозброєним оком її не видно. Так би продовжувалося невідомо скільки, якби не геній Антоніо ван Левенгука (голландського крамничного). А все почалося з того, що Левенгук навчився у оптика мистецтву шліфування лінз. З їх допомогою він змайстрував саморобний мікроскоп. Одного разу розглядаючи каплю води з бочки, куди стікала вода з даху, він прийшов в жах, побачивши маленьких істот, які швидко плавали. Про це Левенгук написав в Лондонське Королівське товариство. Так звіт взнав про наявність мікроорганізмів. Вивчаючи наліт із зубів Левенгук побачив ще менших “звірят”, які були різні за формою, швидкістю пересування. Це були бактерії. За внесок в науку Антоніо ван Левенгук одноголосно був обраний членом Лондонського Королівського товариства. Завдяки вмілим рукам, питливості і терпінню він зробив більше, ніж багато вчених. Його відвідали королева Англії, король Пруссії Фрідріх І, Петро І.
Випічка хліба, що також є біотехнологічним процесом, стала відомою, ймовірно, пізніше. До цього вживали прісний хліб, а 6000 років тому народ став виготовляти пористий хліб із заквашеної кашиці з муки. Таке тісто мало численні бульбашки газу, в результаті чого ставало рихлим. При випіканні клітини дріжджів гинули, випаровувався і спирт, а пустоти залишалися.
З давніх давен відомі технології біотехнологічної переробки молока. Було підмічено також, що сир смачніший, якщо до молока добавити сичуг-матеріал, який знаходиться в шлунках молочних телят. Він здатний швидко коагулювати молочний білок. Це вже роблять плісняві гриби, які на відміну від дріжджів є багатоклітинними організмами. Їх навіть видно на поверхні продуктів, але не грибницю, а лише спороношення.
Ще один давній біотехнологічний процес квашення капусти. Кожен знає як в домашніх умовах відбувається цей процес. Він закінчується бродінням капусти. Без повітря свіжа капуста перетворюється у квашену. Аналогічно відбувається заготівля силосу
Вихідний матеріал для виділення протопластів.
Ізолюють з культивованих клітин або тканин. Найчастіше – тканини листків і клітинні суспензії. Перед виділенням поверхню листків стерилізують, епідерміс знизу натирають карборундом або видаляють, або для поліпшення надходження ферментів густо надрізають. Дія ферментів посилюється вакуумною обробкою та перемішуванням розчину на качалці.
Успіх виділення, життєздатність і стабільність протопластів пов'язана з умовами вирощування вихідного матеріалу. Крім цього: генотип рослини, вік листків, інтенсивність освітлення, вологість, вологість повітря при вирощуванні, додавання СаСі2 в субстрат та ін.
Кількість протопластів і їх стабільність під час ізолювання залежать від: засобу стерилізації, типу ферменту, його концентрації, вакуумної інфільтрації, об'єм розчину, перемішування під час ізолювання, температура, осмотичний тиск і т.п.
8
Вихідний матеріал.
Вихідним матеріалом для мутагенезу і селекції мутантів in vitro можуть бути калюсні та суспензійні культури, ізольовані протопласти та інші об'єкти. Перші роботи з експериментального мутагенезу з використанням клітинних технологій виконані на казусних та суспензійних культурах. Використовують, як правило, свіжовиділену або пасажну культуру, яка має високу регенеративну здатність.. Таким чином, вперше виділені лінії тютюну, стійкі проти бром дезоксиурацилу, стрептоміцину. Водночас, при роботі з калюсную культурою відмічені істотні недоліки, які зводяться до повільного росту тканин, нерівноцінний для всіх клітин ефект мутагенів (особливо при хімічному мутагенезі), а також токсичних речовин, які використовуються як селективні агенти. Ідентифікація окремих стійких клітин може маскуватися не мутантними або ріст їх може гальмуватися мертвими клітинами. Разом із стійкими можливе виживання чутливих, які знаходяться в контакті з мутантними. Для пасажних клітин характерна генетична нестабільність і втрату регенераційної здатності. Складним є отримання рецесивних мутацій навіть при використанні гаплоїдів. Крім цього, незважаючи на недоліки використання для мутагенезу казусних культур для багатьох видів культивування одиничних клітин ще не відпрацьовано.
Окремі переваги для мутагенезу і селекції нових варіант має суспензійна культура, яку, головним чином, отримують з казусної тканини, ресуспендуючи їх на протязі декількох пасажів у рідкому середовищі.
Значне поширення отримав метод посіву суспензії клітин а агаризовані селективні середовища. Таким чином відібрані лінії та рослини, стійкі проти антибіотиків, аналогам нуклеїнових кислот. Але, як і при використанні казусних культур, так і суспензійних залишаються невирішеними проблеми, пов'язані з багатоклітинністю культур.
Більш успішним є використання для клітинної селекції спонтанних і індукованих мутантів ізольованих протопластів. Особливо успішні дослідження в цьому напрямку проведені з модельними об'єктами: тютюн, дурман. Основні вимоги при цьому швидкий ріст в культурі in vitro, збереження регенераційної здатності, невелика кількість хромосом, наявність високоефективної методики виділення і культивування протопластів, наявність генетичної карти, наявність гаплоїдів тощо.
Відпрацьований склад живильного середовища для культивування протопластів, ефективність висіву яких складає 70-90%. Низькі щільності висіву протопластів зводять до мінімуму ефект перехресного живлення, коли мутантна клітина підтримує життєдіяльність клітин дикого типу. Це виключає також одержання химерних тканин і рослин. Дослідження в цьому напрямку з тютюном проведені Сидоровим В.А. Ним також отримані мутанти з протопластів картоплі. Високо гетерозисний стан багатьох сортів не сприяє успішному мутагенезу. Використання культури in vitro дало змогу після відпрацювання ефективної технології культивування протопластів, зокрема, отриманими з гаплоїдних форм, мати успіхи в мутагенезі культури. З меншим успіхом використовують для мутагенезу пилок і насіння або зародків.
Гаметоклональна мінливість.
Гаметоклональна мінливість обумовлена змінами у рослин-регенерантів, джерелом експлантів яких є генеративні органи рослин: пиляки, пилок, незапліднені зачатки зародка, зародки. Для рослин-регенерантів, одержаних з гаплоїдних клітин, характерним є: домінантні і рецесивні мутації виявляються вже на рівні рослин-регенерантів R0, оскільки кожен ген має лише одну алель, рекуомбінантні процеси, що виявляються у гаметоклональних форм, є результатом не мітотичного, а мейотичного кросинговеру, в результаті поліплоїдизації гаплоїдних форм виникають зміни, що є результатом негаметоклонального варіювання, наявність летальних та напівлегальних мутацій обумовлює гибель гаплоїдних клітин, що знижує спроможність гаплоїдних калюсів до регенерації порівняно з диплоїдними
Гаплоїди
– це рослини, в клітинах яких половинний (як у гаметах) набір хромосом, а не соматичний.
Гаплоїди використовуються для отримання гомозиготних ліній, при кількісному генетичному аналізі, для подолання несхрещуваності.
Залежно від рівня плоїдності вихідних рослин гаплоїди поділяють на: моноплоїди (моно гаплоїди) – гаплоїди, що походять від особин із диплоїдним числом хромосом і полі гаплоїди – гаплоїди, що походять від поліплоїдних особин.
У середині 70-х відкрито явище елімінації хромосом однієї з батьківських форм на ячмені на основі схрещування Hordeum vulgare x H.bulbosum, що прискорило одержання гомозиготних рекомбінантних ліній ячменю. Проведений пошук нових гаплопродюсерів.
Явище елімінації хромосом одного з батьків є одним з механізмів міжвидової несумісності. При схрещуванні ячменів запліднення відбувається нормально, проте на ранніх стадіях розвитку зародка хромосоми H.bulbosum елімінуються. Незрілі зародки виділяють на 10-12 добу після запліднення і переносять на живильні середовища, іп vіvо такі зародки гинуть. Обробка запилених колосків гібереловою кислотою низької концентрації (25-100мг/л) кілька діб підвищує вихід гаплоїдниї рослин. Подібно гаплоїди м'якої пшениці, схрещуючи її з кукурудзою, сорго, ячменем. Гаплоїди тютюну при схрещуванні з дикими видами.
Генна, генетична інженерія, Трактування понять
.
Наука як не одна із сфер діяльності людини не допускає косності. А тому трактування окремих фактів уточнюється з використанням нових методів, підходів. Особливо це відноситься до нових напрямків досліджень. Виходячи з цього відсутнє однозначне визначення поняття генна інженерія. Окремі дослідники взагалі вважають терміни генна і генетична інженерія синонімами. Зокрема вони визначають їх як напрямки досліджень в генетиці, в процесі яких відпрацьовуються засоби, що дозволяють згідно наміченого плану перебудовувати геном організму, змінюючи в ньому генетичну інформацію.
Молоцький, Васильківський, Князюк, виділяючи окремо генну інженерію, вважають що це розділ генетичної інженерії, де на молекулярно-біологічному рівні здійснюється генетичне конструювання, в результаті чого отримують рекомбінантні молекули.
Мабуть, найбільш повне визначення генної інженерії наведено в роботі Муровцева та ін. – це комплекс засобів і методів, які забезпечують направлену зміну спадкових властивостей організму шляхом переносу або впливу на гени, які визначають ту або іншу генетичну ознаку.
Давайте ми зробимо своє визначення генної інженерії, можливо дещо спрощене, але більш зрозуміле. Це напрям досліджень з маніпулюванням генами, що дозволяє отримати нові спадкові фактори.
На відміну від генної інженерії, генетична – це зміна спадкових властивостей організмів, які обумовлені оперуванням з геномом.
.Гібридні зародки як джерело гаплоїдів.
Гаплоїди – це рослини, в клітинах.
Гаплоїди – це рослини, в клітинах яких половинний (як у гаметах) набір хромосом, а не соматичний.
Гаплоїди використовуються для отримання гомозиготних ліній, при кількісному генетичному аналізі, для подолання несхрещуваності.
Залежно від рівня плоїдності вихідних рослин гаплоїди поділяють на: моноплоїди (моно гаплоїди) – гаплоїди, що походять від особин із диплоїдним числом хромосом і полі гаплоїди – гаплоїди, що походять від поліплоїдних особин.
У середині 70-х відкрито явище елімінації хромосом однієї з батьківських форм на ячмені на основі схрещування Hordeum vulgare x H.bulbosum, що прискорило одержання гомозиготних рекомбінантних ліній ячменю. Проведений пошук нових гаплопродюсерів.
Явище елімінації хромосом одного з батьків є одним з механізмів міжвидової несумісності. При схрещуванні ячменів запліднення відбувається нормально, проте на ранніх стадіях розвитку зародка хромосоми H.bulbosum елімінуються. Незрілі зародки виділяють на 10-12 добу після запліднення і переносять на живильні середовища, іп vіvо такі зародки гинуть. Обробка запилених колосків гібереловою кислотою низької концентрації (25-100мг/л) кілька діб підвищує вихід гаплоїдниї рослин. Подібно гаплоїди м'якої пшениці, схрещуючи її з кукурудзою, сорго, ячменем. Гаплоїди тютюну при схрещуванні з дикими видами.
При віддаленій гібридизації гаплоїди через стимуляцію клітини до партеногенетичного розвитку. У картоплі при запиленні культурним видом, Проте, у цьому випадку гаплоїдні зародки розвиваються повільно, часто гинуть, а тому їх вичленюють і переносять на штучні середовища.
Загальні уявлення про кріозбереження.
збереження генетичного різноманіття рослин є надзвичайно актуальною проблемою
Найефективнішим способом збереження рослинних ресурсів є використання для цього насіння. Проте, цього можна досягти не завжди з таких причин:
1. не всі рослини можуть розмножуватися насінням,
2. деяке насіння зберігає життєздатність проти невеликого проміжку часу,
3. потомки багатьох видів гетерозиготні, а тому не можуть підтримувати вихідний генотип, насіння окремих видів швидко знижує якість внаслідок зараженості патогенами, чутливості до високих температур, вологості.
Ще складніше підтримувати вегетативно розмножуванні культури. По-перше, це дуже трудомістка справа. Для виконання таких робіт необхідні значні кошти. Підтримання на високому рівні ознак у вегетативно розмножуваних рослин складне через значне ураження їх патогенами та біологічним старінням рослин. Наприклад, з причини поширення і шкідливості вірусних хвороб з колекції картоплі випадають оригінальні зразки, які характеризуються зниженою стійкістю проти цих хвороб.
Для збереження генетичних ресурсів використовують культуру in vitro. З цією метою здійснюють періодичне перенесення пробіркових рослин на свіже живильне середовище, вирощують їх при відносно низьких температурах (4-10 С), використовують мінімальне за складом живильне середовище, використання прошарку олії, часткове дегідратування тканин, вирощування рослин при низькому атмосферному тискові. Але всі перераховані методи зберігання рослин придатні лише для тимчасового зберігання генетичних ресурсів.
Ефективним способом збереження генофонду рослин є консервація насіння або частин рослин в умовах заморожування. Для насіння достатньою є температура 18-20 С та вологість 3-7%. При цьому збереження життєздатності триває 50-100 років. Проте, навіть при цих температурах в мембранах відбувається перекидне окислення ліпідів, а -60 С у мембранах проходять динамічні процеси, а при -130 С процеси перекристалізації.
Найкращим способом збереження насіння є довготривале витримування його в парах рідкого азоту (-160 С) або в рідкому азоті (-196 С). Це перш за все стосується "мікробіотиків" – видів, насіння яких швидко втрачає схожість під час зберігання в звичайних умовах, а також вегетативно розмножуваних культурі меристем in vitro. Перспективним вважається збереження генофонду рослин з використанням кріоконсервації пилку, який в подальшому використовується при схрещуванні.
Перспективність кріозберігання базується на виключення втрат запасних поживних речовин при тривалому зберіганні, неможливість накопичення токсинів, розпадання та інактивації ферментативних комплексів, самоокислення ліпідів, деградацію функціональних та генетичних систем та інших процесів старіння клітин.
Умови кріозбереження відпрацьовані для такого рослинного матеріалу: верхівкових і пазушних меристем, культивованих клітин, клітинних агрегатів та соматичних ембріоїдів, ізольованих протопластів, інших органів рослин, наприклад, зародки, ендосперм, генеративні бруньки, пиляки, пилок, насіння.
Залежно від мети дослідження, матеріалу використовуються різні методи кріозбереження. Позитивні результати одержані при експериментах з тютюном, морквою, картоплею, рисом, цукровою тростиною, горохом, арахісом.
Ізоляція протопластів
проходить в два етапи:
1. руйнується пектин серединних пластинок, внаслідок чого утворюються окремі клітини. Пектин азу.
2. Обробляються ферментами целюлозами для руйнування мікрофібрил целюлози клітинної стінки, тобто клітина без клітинної оболонки. Ферменти з мікроорганізмів – плісневих грибів (чорної і сірої, які на рештках хліба).
Потрібно: концентрації, час дії, склад ферментів та речовини – осмотики для викликання плазмолізу (високі концентрації цукрів – до 23%, маніту і сорбіту). Ці ос мотики зневоднюють клітину та відокремлюють її протопласт від клітинної оболонки. Він збирається всередині, що захищає його від ушкодження в разі руйнування оболонки. При цьому клітина може мати розділений протопласт: протопласт з ядром і цитопласт . Відмивають від ферментів і на живильне з манітом чи сорбітом для підтримання високого осмотичного тиску, бо тонка цитоплазматична ліпідно-білкова мембрана може розірватися.
Відновлення клітинних оболонок відбувається відразу, але тривалий час клітини нагадують типові калюсні, ніж вихідного експлант . До утворення клітинної оболонки протопласти здатні об'єднуватися (зливатися), формувати одну клітину навіть віддалених видів; поглинати з навколишнього середовища не лише низькомолекулярні речовини, але й макромолекули. Останнє пов'язане з особливим видом транспорту, спрямованого всередину клітини – піноцитозом. Практичне значення має можливість введення в ізольовані протопласти вірусних часток, молекул ДНК, бактеріальних клітин і хлоропластів. Змінюється генетична властивість клітини, незвичайні за властивостями рослини. Практично цінним злиття двох протопластів – одного з ядром, а іншого лише з цитоплазмою – цибриди .
Культура клітин як клонова популяція.
Вперше поняття популяція ввів В.Йогансен. Але він розглядав популяції на рівні співіснування особин одного виду, що знаходяться в певному просторі, які генетично дещо відрізняються між собою. В даний час значення терміну популяція дещо уточнене. Це сукупність організмів одного виду рослин, тварин, мікроорганізмів, які впродовж численних поколінь знаходяться на певній території та ізольовані від інших подібних сукупностей того ж виду. Популяція також відноситься до сукупності клітин, які вирощуються in vitro.
Виділення окремих особин в популяцію, генофонд її обумовлюється рекомбінаціями генетичного матеріалу під статевого процесу. В популяції культивованих клітин такого обміну немає, але відмінність є, а тому останні відносять до неменделівських популяцій. Особливість неменделівських популяцій – некомбінантна спадкова мінливість. А тому, виникнення, зміна, збереження успадкованого поліморфізму у них залежить від двох чинників: мінливості і добору. В клітинних популяціях спадкова мінливість не вичерпується мутаційною мінливістю. В процесі еволюції в багатоклітинних організмів виробився ще один тип спадкової мінливості – епігенетична. Це дозволяє пояснити генетичні аспекти таких процесів: пристосування клітинних популяцій до умов середовища, їх старіння і відмирання, перетворення нормальних соматичних клітин на злоякісні тощо.
Аналізуючи генетичні процесі в клітинних популяціях необхідно враховувати мутаційну мінливість і добір та епігенетичну мінливість і добір, але й процеси взаємодії різних форм мінливості.
Взаємозв'язок між клітинами в популяції крім усього іншого базується на їхньому виділенні в середовище продуктів метаболіту та обмін цими продуктами. Підтвердженням цього є отримання клонів від окремих клітин і протопластів з використанням ефекту кондиціювання середовища. Цей ефект пояснюється гіпотезою кооперативної дії генів у клітинній популяції: кожна клітина знаходиться під впливом не лише власного геному , але й геному сусідніх клітин; дія геномів усіх клітин популяції взаємно узгоджується.
Ця гіпотеза дозволяє пояснити генетичну гетерогенність культивованих клітин, зокрема їхня міксоплоїдність пояснюється таким чином: клітини з різним числом хромосом відрізняються за характером метаболізму і між ними існують симбіотичні взаємовідносини – вони обмінюються продуктами метаболізму. Але існує і антагоністична взаємодія між клітинами з різним набором хромосом, основу якого складає взаємне пригнічення продуктами метаболізму.
Методи кріозбереження.
Цей процес безпечний для матеріалу з невеликою кількістю води: пилок, насіння, які можна безпосередньо занурювати в рідкий азот, а тотім розморожувати в звичайних умовах. Інший матеріал, що має високу обводненість клітин, тканин, органів рослин, процес зберігання в умовах ультра низьких температур є стресовим фактором, а тому потребує спеціальної підготовки. Вона закінчується рекультивуванням із забезпеченням інтенсивного поділу клітин.
Глибоке охолодження рідким азотом, зберігання та розмороження є стресовим фактором для клітин. При цьому важливе значення мають: процес утворення кристаликів льоду та зневоднення клітин, застосування ефективних кріопротекторів і відповідна система заморожування та розморожування.
Основні методи кріозбереження ідентичні для різних видів рослин. Відмінність зводиться до модифікації окремих етапів виконання досліджень, а саме:асептичне ізолювання і культивування рослинних тканин, адаптація до низьких температур, попереднє культивування матеріалу на відповідному живильному середовищі, до складу якого на певному етапі входять кріопротектори, додавання кріопротекторів до зразків на підготовчій стадії заморожування, контрольне охолодження і замороження проб, зберігання в рідкому азоті, швидке розморожування рослинних тканин, відмивання кріопротекторів, повторне культивування відновлених тканин та індукція їх регенерації.
Заморожування бруньок і меристем.
Значну перспективність для кріозбереження має меристема . Це обумовлено використанням генетично стабільного матеріалу. Меристема порівняно легко витримує заморожування, тому що складається з дрібних клітин з невеликими вакуолями.
Для їх заморожування використовують, як правило, занурення в рідкий азот або поступово охолоджуючи. Обидва способи мають переваги і недоліки, а тому не є універсальними. При швидкому заморожуванні життєздатність клітин зберігається через відсутність у міжклітинниках льоду, який руйнує клітини. Цей метод успішно використовується для верхівкових меристем картоплі і гвоздики. В процесі повільного заморожування в клітинах через гідратацію зовнішній тиск стає нижчим , ніж у середині переохолодженої клітини.
Детально процеси, що відбуваються з меристемами при замороженні вивчені на гороху і полуниці. Встановлено, що коли швидкість охолодження складає 0,6-0,8 С за хвилину, у цих культур зберігається висока життєздатність (95%), і після 8-26 – тижневої експозиції вона залишається на рівні 73%. Найкращі результати отримані при повільному охолодженні до -40 С. Оптимальним режимом швидкого розморожування є витримування матеріалу на водяній бані за температури 37-40 С, коли зберігається максимальна життєздатність зразків, заморожених повільним охолодженням. При повільному розморожуванні існує можливість рекристалізації дрібних несферичних часток льоду, що спричиняє пошкодження клітинних органел.
Заморожування культур клітин і тканин.
Основні підходи до кріозбереження культури клітин і тканин ті ж, що і для меристеми. Використовується швидкоростуча культура клітин і тканин. У них попередньо встановлюють загальний фізіологічний стан: метаболічні резерви, водний уміст, співвідношення цитоплазма-вакуоля, осмотичний стан клітин, проникність мембран та ступінь щільності і життєздатність суспензії.
Зразки клітинних культур уміщують у спеціальні ампули з пробками, які загвинчуються, ємністю 2 мл. Робота виконується в стерильних умовах. Причому, ампула заповнюється на половину. Умови кріозбереження виключають можливість позаклітинного заморожування (дегідратація цитоплазми). Існують такі способи дегідратації: 1. повільне охолодження з однаковою швидкістю, 2. повільне охолодження з різною швидкістю і поступове заморожування під впливом низьких температур – одно- або багаторазово з наступним зануренням в рідкий азот. Швидке замороження використовують для культури зародків.
З рідкого азоту ампули переносять у водяну баню з температурою близько 40 С. Розморожування здійснюється впродовж 1-2 хв. за умови, що пробірки погойдуються. Для дотримання умов стерильності вода для водяної бані стерильна. Її також використовують для протирання ампул перед їх відкриванням. Кращими для відновлення росту та розвитку розморожених клітинних культур є стандартні рідкі або напіврідкі живильні середовища.
Заморожування протопластів.
Особливість цитопластів – відсутність клітинної стінки та міжклітинного цитоплазматичного зв'язку вимагають підготовчої стадії перед заморожуванням. Запобігання плазмолізного стресу протопластів досягається використанням 5% дим етилсульфоксиду і 10% глюкози.
. Можливі ризики від вивільнення та використання трансгенних рослин.
Постільки проблема ГМ рослин дуже широка, то вона включає ряд ризиків, які стосуються: збереження біорізноманіття, сталого розвитку, глобалізації, і навіть етичні проблеми.
Аналіз екологічних ризиків включає принципи усвідомлення та принцип упередження.
Під біобезпекою стосовно генетично модифікованих організмів розуміють стан захищеності, який досягається використанням системи заходів, направлених на запобігання або пониження до безпечного рівня шкідливих впливів ГМО на здоров'я людей та навколишнє середовище.
Екологічні ризики можуть бути пов'язані з тим: чи не окупують трансгенні рослини природні екосистеми та агроландшафти, чи не витіснять ГМ рослини інші види, чи можливе перенесення генів трансгенних рослин до інших видів, чи не впливають ГМ рослини на інші компоненти системи (комахи, мікрофлору тощо), чи не приведе тривале вирощування трансформованих рослин до підвищення стійкості проти пестицидів, інсектицидів диких видів та самих патогенів, чи не вплинуть ГМ рослини на біорізноманіття та на сортову чистоту. Питань, як бачите, багато, а тому зупинимося лише на деяких.
Ще в 1999 році Лосі повідомляв про менший рівень виживання личинок метелика монарха в лабораторних умовах, коли їх кормили листками молочаю, оброблених пилком Вt-кукурудзи . Дані науковців Карнельського університету свідчать про загибель гусениць метелика-монарха в природних умовах, коли вони вживали пилок Bt-кукурудзи.
В кількох лабораторіях світу дослідили вплив трансгенних рослин на життєвий цикл запилювачів: бджіл, джмелів. Встановлено вплив на їх онтогенез інгібіторів протеїназ Bt.
Досліджено взаємодію грунтової мікрофлори та кореневої системи транс генних рослин. Встановлено, що Bt токсин, як і інший транс генний білок Т4 лізоцим не лише можуть бути присутніми в кореневих ексудатах, але й зберігати свою біологічну активність після попадання в грунт. Причому, Bt токсин зберігає активність проти личинки тютюнової гусениці в нестирилізованому грунті впродовж 234 днів. Причому він не дуже деградує навіть в зимовий період.
Ще до цього. Встановлено, що фіто маса Bt-кукурудзи значно знижує загальну метаболітичну активність грунту, а звідси негативний вплив на супресивність грунту відносно збудника кореневої гнилі.
Важливим є питання горизонтального перенесення генів від генетично модифікованих рослин до їх близьких родичів та диких видів. Горизонтальний переніс генів – це передача генів між одночасно існуючими організмами, а не ввід батьків – потомству, яке називається вертикальним. Адже інтрогресія (перенесення) генів від транс генних рослин до їхніх спів родичів може викликати появу у останніх ознак, притаманних генетично модифікованим.
Польовими експериментами, виконаними в Інституті цукрових буряків встановлена передача транс гену стійкості проти гербіциду Баста диким видам.
Ще один приклад, який знайшов відголосок в усьому світі. Американська компанія Монсанта звинуватила канадського фермера Персмі Шмайсера у незаконному вирощуванні транс генної сої. В продукції з його поля виявлений специфічний ген. Виявляється причина в тому, що на сусідньому полі вирощували транс генну сою, а недалеко знаходився завод з її переробки, що і обумовило перенесення трас гену на поле фермера.
Встановлено, що транс генна соя має декілька "зайвих" фрагментів ДНК, походження і функції яких не встановлені. Дозвіл на використання їх при реєстрації не одержано. Але головне в тому, що передбачити поводження цих генів в агроценозі неможливо. Тобто, із введенням у виробництво ГМ рослин відбувається генетичне забруднення, що в кінцевому результаті негативно відіб'ється на загальному екологічному стані.
Дослідженнями Бергельсона доведений негативний вплив транс генної гірчиці на її насіннєві властивості, які погіршилися у 20 разів. Це стало через порушення транс геном послідовності і активності генів, що відповідають за запилення і фертильність.
У зв'язку з появою, значним поширенням ГМ рослин гостро постала проблема збереження генетичних ресурсів культурних рослин, їх біологічного різноманіття. По-перше, може статися так, що на певний період стануть непотрібними види, сорти, у яких стійкість проти певних зовнішніх факторів нижча, ніж у транс генних рослин. А тому, вони потребують додаткових зусиль для їхнього збереження. По-друге, олігогенна, як правило, стійкість ГМ форм спричинить посилення формотворчого процесу у патогенів, що негативно відіб'ється на загальному генетичному потенціалі сільськогосподарських культур, який в цьому відношенні значно знизиться
Риск, пов'язаний з вирощуванням ГМ рослин є серйозним, бо він не завжди зпрогнозований і дуже часто незворотній. В цілому, це проявляється в: 1) виникнення резистентності до гербіцидів у бур'янів і пестицидів у комах; 2) зниження біорізноманіття в тому числі вимирання традиційних сортів, форм тощо; 3) можливість ГМ сортів стати шкідливими для подібних до них; 4) довільне перенесення генів транс генних рослин, в тому числі в агроекосистему (в США 50-80% зразків звичайної сої, кукурудзи засмічені трансгенами). Стосовно шкідливості продуктів з ГМ рослин для людини кількість фактів обмежена. По-перше, для цього необхідні тривалі дослідження. А по-друге, проведення їх вимагає формування груп добровольців, що як ви розумієте зробити важко. Водночас, відомо, що при вживанні триптофана в ГМ продуктах у США померло 37 чоловік, а 1500 стали інвалідами. Встановлено, що модифікована соя викликає у багатьох людей сильну алергію, причиною якої є метіонін або білок, що його містить. Відносно людей у багатьох країнах вживаються запобіжні заходи при використанні ГМ продуктів. В країнах Європейської спільноти на продуктах з ГМ рослин обов'язково повинна бути етикетка про це. Крім цього, такі продукти забороняється використовувати для харчування дітей, а також продавати в дитячих закладах.
Мутагени та їх застосування на клітинних культурах.
Основним моментом є вплив різних доз великого арсеналу мутагенів на виживання клітин, які культивуються поза організмом. Поряд з хімічними мутагенами широко використовуються іонізуючі (рентгенівське, гамма- проміння ) та ультрафіолетове проміння.
Серед хімічних мутагенів найчастіше використовується етилметансульфанат (ЕМС). На цій основі отримано 25 фенотипічних варіантів. Водночас, у інших випадках ефективність цього мутагену була незначною.
Інший мутаген, який заслуговує на увагу Н-етил-Н-нітрозосечовина (НЕС). Особливість даної речовини у нестабільності, а тому вона швидко розкладається в середовищі, що не вимагає додаткової промивки матеріалу. Ефективність даного мутагену виявлена на суспензійній культурі тютюну. В результаті цього частота хлорат стійких форм збільшилася у 20 разів, а стрептоміцин стійких форм у 30 разів.
Широкий спектр мутацій отримують при іонізуючому випромінені. При рентгенівському опроміненні клітин дурману вдалося виділити пігментдефектні лінії. Використання гамма опромінення дозволило отримати лінії, стійкі проти гербіциду.
Особливістю чужерідних генів, введених в рослину
з використанням Ті-плазмідних векторів, в тому, що зазвичай, вони не експресуються. Це підтверджено численними експериментами за участю бактеріальних генів контролю стійкості проти антибіотиків, генів тварин або неспоріднених рослинних генів, введених в геном тютюну. Слід зазначити, що Ті-плазміди трансформувалися зі своїми промоторними послідовностями. Для експресії перенесених генів потрібний спеціальний промотор з тДНК. Ним виявився ген Ті-плазміди, що кодує нокалінсинтетазу (NOS-ген). У нього ідентифіковано ділянку з промотором. Останній функціонує в клітині і легко з‘єднується з кодуючою послідовністю чужерідного гена. Перевага цього промотора у реалізації його у калюсах, більшості органів рослин. Успадкування цих генів відбувається згідно законів Менделя.
Як вектори використовуються плазміди іншої ґрунтової бактерії Agrobacterium rhirogents – Pi-плазміди. Вони спричиняють хворобу “бородатий корінь”, симптоми якої у швидкому розмноженні коренів у пораненій тканині при інфікуванні бактеріями. Як і у попередньої бактерії корінці швидко ростуть у культурі за відсутності бактерій, тобто у них відбулася трансформація генів Rі-плазміди. На відміну від корончатих галів трансформовані клітини корінців “бородатого кореня” відносно легко регенерують здорові рослини, хоча у їхніх листках, коренях є опініни. Крім цього, тДНК таких рослин передається потомству статевим шляхом.
Наприклад, інфікований бактерією корінь моркви утворює численні кореневі волокна. При перенесенні їх на тверде агаризоване середовище утворюється калюс. Наступний посад його на рідке середовище дозволяє отримати виброїди, з яких регенерують рослини.
Перевага використання Rі-плазмід у можливості отримання здорових трансгенних рослин, а також у культивуванні в більшій мірі органів, ніж тканин, що має значення у збереженні вихідного рівня плоїдності.
Передумови практичного розвитку біотехнології, позитивні та негатив ні сторони використання її
Homo sapiens – людина розумна. Науковців завжди цікавило питання: коли ж людина прийняла теперішній внутрішній та зовнішній облік? Дещо вдалося вияснити завдяки швидкому розвитку генетики і біотехнології.
Ще в 1960 році Дж. Ліллі зробив припущення, що за інтелектом дельфін не поступається людині, а може і випереджає її. Проте, дельфін не здатний творчо мислити, змінювати дійсність. Не могла цього і людина, що жила близько 50 тис. років тому. У 2003 році Річард Клайн з Стенфордського університету в Каліфорнії висунув теорію, що людина стала тим, ким вона є завдяки мутації гену творчості. Пізніше дійсно був виділений ген FOXP-2, який відповідає за мову. Правда, ген творчості ще не відкрито. Але археологи підтвердили, що лише близько 50 тис. років тому в побуті людини з'явилися елементи творчості, різноманіття.
Вершина, до якої піднялася людина і перспективи подальшого її вдосконалення яскраво демонструє розвиток біотехнології. І коли вчені стверджують про домінуючий розвиток до 2040 року біологічних наук, то не останнє місце при цьому відводиться біотехнології. В попередніх лекціях ми з вами говорили про спочатку інтуїтивне, а потім і свідоме використання людиною в процесі життєдіяльності бітехнологічних процесів з безпосереднім використанням мікроорганіізмів, досягнення в генній, генетичній інженерії, гаплоїдії, мутагенезу, культурі протопластів і соматичній гібридизації, культури клітин in vitro тощо.
Поєднання методів термотерапії і верхівкової меристеми.
При оздоровленні сортів картоплі від вірусів широко застосовується поєднання методу виділення меристеми з термотерапією. Вперше останній запроваджено в Англії в 1956р. Кассаніс Б. вказав на можливість звільнення бульб картоплі від вірусу скручування листків. Пізніше виявлена ефективність методу при оздоровленні бульб, уражених вірусом "відьмині мітли" та за даними деяких авторів від інших вірусів. Водночас, окремі дослідники ставлять під сумнів можливість звільнення картоплі, з використанням цього методу, від мозаїчниї вірусів та віро їда веретоновидності бульб.
Важливою є температура, при якій витримуються бульби для одержання паростків. В дослідах, проведених в Інституті картоплярства РФ, встановлено, що при збільшенні паростків до 1,5-2,0 см. (температура 16-24 0 С) у їхньому соку різко зменшується кількість позитивних реакцій на віруси Х В соку паростків довжиною 30-40 см, що виросли при температурі 28-30 0 С вірус Х втратив свою активність.
Позитивні результати отримані при витримуванні бульб в умовах понижених температур (4-50 С ). У сорту Рання роза при вирощуванні паростків з температурою 28-30 0 С одна з десяти отриманих рослин була вільна від вірусів Х, Y. В інших умовах (4-5 0 С) з 21 отриманої рослини лише одна не мала згаданих вірусів.
В цілому вважається, що максимальна затримка в поширенні вірусів у меристемі відбувається при 35-37 0 С і експозиції 3-4 тижні, залежно від біологічних особливостей сортів та вірусів. Ефективним виявилося також прогрівання частинок бульб при температурі 400 С 2-3 години на добу і витримуванням їх впродовж останнього часу при 18-20 0 С протягом 56 днів, хоча, в цілому, вважається, більш доцільним використання для отримання паростків цілих бульб. Ця робота проводиться в спеціальній термокамері, яка складається з двох боксів із стелажами. Вхід у другий бокс здійснюється через перший. Температуру підтримують автоматично, а вологість повітря на рівні 75% розміщення кювет з насиченим розчином кухонної солі. Бульби для термотерапії розміщуються у другому боксі в кюветах, наповнених піском. Останній зволожують двічі на день та один раз в десять днів підживлюють розчином Кнопа з мікроелементами за прописом Мурасіге-Скуга () 5мл маточного розчину при 1х1000 на 1л розчину Кнопа. Це дозволяє уникнути фізіологічне почорніння та відмирання проростка і продовжити строки багаторазового зйому паростків до 4-6 місяців, незалежно від сорту.
У першому боксі підтримується температура 28-30 0 С. В ньому можна розміщувати бульби, які не пройшли періоду спокою. Їх розкладають також у кюветах з піском. Таким чином скорочується проходження періоду спокою у бульб перед закладанням їх на термотерапію. Це дозволяє розпочинати дослідження по оздоровленню сортів у серпні і мати паростки у вересні-жовтні. Крім цього, перший бокс є буфером для дотримання температурного режиму у другому. Окремі сорти особливо негативно реагують на термообробку бульб. Їх бульби погано проростають, дають поодинокі ростки. Для них рекомендовано проводити цю роботу в два етапи. На першому бульби витримують впродовж одного-двох тижнів при температурі 28-3- 0 С, а на другому біля чотирьох тижнів при 37-380 С.
Встановлено, що під впливом термообробки відбуваються зміни у клітинних структурах. Відхилення у розвитку рослин мали місце при витримуванні бульб для виділення меристеми впродовж 6 неділь при 37± 0,5 0 С. При цьому стебла були викривлені, листки недорозвинуті, більшість нижніх листків мало хлоротичне забарвлення і швидко опадало. Отримані дані свідчать про цитологічні зміни, які відбуваються при цьому.
Поняття про спадковість і мінливість.
Спадковість – це властивість клітин, організмів матеріально та функціонально забезпечувати повторюваність в поколіннях. Водночас, для реалізації спадковості необхідні певні умови. В цьому відношенні говорять про норму реакції генотипу на вирощування в певних умовах. Наприклад, особини з різним генотипом можуть мати однаковий фенотиповий прояв ознак (з урахуванням домінування) і навпаки, з однаковим генотипом мати різне фенотипові вираження (при модифікаційній мінливості).
Відрізняють такі типи спадковості: 1. ядерна, при якій зв'язок між поколіннями контролюється генами, локалізованими в хромосомах. Залежно від типу поділу клітин ця спадковість може бути мейотично-кон'югативною, що спостерігається при статевому розмноженні, і відбувається згідно законів Менделя та мітотична – властива діленню клітин при вегетативному розмноженні.
2. поза ядерна, при якій успадкування здійснюється за рахунок спадковості окремих цитоплазменних структур (пластид, мітохондрій, плазмід ). Звичайно, таке успадкування відбувається за материнськими формами. І лише, коли перенесення пластид, мітохондрій чи плазмід здійснюється через пилкові трубки, ці ознаки успадковуються через запилювачів. 3. безядерна або акаріотична – притаманна вірусам і бактеріям.
Мінливість – це здатність організмів змінювати свої ознаки та властивості. Мінливість є спадкова і не спадкова (модифікаційна). Під спадковою розуміють здатність до змін самого генетичного матеріалу, а піід не спадковою – здатність організмів реагувати на умови зовнішнього середовища і змінюватися в межах норми реакції, заданої генотипом. Змінені форми називаються варіантами.
Спадкова мінливість поділяється на комбінаційну та мутаційну.
Комбінаційна- є наслідком пере комбінації генів і хромосом із різними алелями. При цьому появляються потомство з новим комплексом ознак, які проявляються в результаті комбінації спадкових одиниць батьківських форм.
Мутаційна мінливість – це поява нових варіантів дискретних одиниць генетичного матеріалу, перш за все нових алелей.
Виділяють також онтогенетичну мінливість, яка є наслідком реалізації норми реакції організмів впродовж індивідуального розвитку (онтогенез). Якщо відштовхнутися від суті процесу, то онтогенетичну мінливість слід віднести до не спадкової мінливості. Водночас, якщо впродовж онтогенезу зміни стосуються генетичного матеріалу, то в цьому випадку її слід класифікувати як спадкову.
Виходячи з природи генетичного матеріалу виділяють три рівні його організації: генний, хромосомний та геномний. Елементарною функціональною одиницею спадкового матеріалу , що визначає розвиток окремої ознаки є ген (спадковий задаток за Менделем). Передачею генів в ряду поколінь і досягається матеріальна спадкоємність – успадкування потомством батьківських ознак.
Хромосомний рівень організації генетичного матеріалу являє собою хромосоми, де розташовані гени.
Тести для визначення життєздатності клітин.
Найбільш простим іі надійним тестом визначення життєздатності культури меристеми є здатність регенерувати нормальні рослини. Поява калюсу свідчить про невдалу методику кріозбереження через появу у калюсних клітин сомаклональних варіантів.
Для визначення життєздатності клітинних культур використовують такі тести:
фарбування флюоресциндіацетатом. При цьому лише живі клітини мають забарвлення і флюорисциюють в ультрафіолетовому світлі. Як показник використовують відсоток життєздатних клітин тобто виживання 2.2,3,5-трифенілтетразоліумхлоридний (ТТХ)
метод, коли виживання клітин визначається за ступенем редукції ТТХ. Цим методом визначається активність мітохондрій, у яких ТТХ перетворюється у форма зон, що має червону субстанцію, нерозчинну у воді, але розчинну у етанолі. Результати життєздатності визначаються спектрофотометрично.
Згадані методи потрібно використовувати обережно, тому що латентне пошкодження може проявлятися пізніше. У зв'язку з цим, для оцінки життєздатності матеріалу використовують різні методи і проводять це не один раз. Розширений аналіз повинен включати такі характеристики: мітотичний індекс, щільність клітин, об'єм клітин в осаді, сира і суха маси, відсутність виходу електролітів.
Виживання клітин після обробітку мутагенами.
Кількісну оцінку виживання клітин проводять на основі репродукційного потенціалу окремих клітин (здатність їх утворювати колонії). Проте, ще можна зробити лише при використанні ізольованих протопластів мезофілу листка. При використанні суспензійних культур або калюсних зробити облік клітин, які вижили неможливо. У останньому випадку використовують показник – приріст маси..
При роботі із протопластами або дрібнодисперсними суспензіями виживання клітин визначають, порівнюючи з кон6тролем (без мутагенів). Виживання клітин або ефективність висіву визначають як процент виживши клітин до загальної кількості висіяних. Ефективність висіву клітин у модельних об'єктах визначають як відносне виживання і як контроль беруть 100%.
На виживання клітин важливу роль відіграє стадія, на якій проводиться обробіток мутагенами (доцільно проводити до їх першого ділення).
На відміну від генетично активних фізичних факторів, хімічні мутагени мають більш токсичну дію на клітини. В окремих випадках процент летальності при використанні хімічних мутагенів може сягати 100. Через це використовують невисокі дози хімічних мутагенів.
Виживання клітин при обробці мутагенами залежить від плоїдності їх. Більш висока чутливість до мутагенів виявлена у гаплоїдних протопластів, порівняно з диплоїдними.
Відмінності між біотехнологією і традиційною селекцією
. В цілому, як в процесі селекції, так і при створенні біотехнологічних рослин відбувається зміна геному. Водночас, в процесі виведення сортів методами традиційної селекції відбувається оперуванням всім геномом з наступним добором форм з комплексом бажаних ознак. Біотехнологія дозволяє оперувати окремими генами. З цієї позиції її можна розглядати як високотехнологічну версію традиційної селекції. Але з іншої сторони, сорт повинен мати не лише трансформовані гени, а всі, що забезпечують комплекс господарсько-цінних ознак. Біотехнологи цього не заперечують. Вони навіть в назві своїх форм зберігають назву сорту. Наприклад, в картоплі додається лише два слова "новий лист". Тобто, біотехнологи не мають змоги, та мабуть і потреби, конструювати новий геном, а внести конкретні зміни до нього, мабуть, доцільно.

Культура гаплоїдних клітин
1..Гібридні зародки як джерело гаплоїдів. Гаплоїди – це рослини, в клітинах
Гаплоїди – це рослини, в клітинах яких половинний (як у гаметах) набір хромосом, а не соматичний.
Гаплоїди використовуються для отримання гомозиготних ліній, при кількісному генетичному аналізі, для подолання несхрещуваності.
Залежно від рівня плоїдності вихідних рослин гаплоїди поділяють на: моноплоїди (моно гаплоїди) – гаплоїди, що походять від особин із диплоїдним числом хромосом і полі гаплоїди – гаплоїди, що походять від поліплоїдних особин.
У середині 70-х відкрито явище елімінації хромосом однієї з батьківських форм на ячмені на основі схрещування Hordeum vulgare x H.bulbosum, що прискорило одержання гомозиготних рекомбінантних ліній ячменю. Проведений пошук нових гаплопродюсерів.
Явище елімінації хромосом одного з батьків є одним з механізмів міжвидової несумісності. При схрещуванні ячменів запліднення відбувається нормально, проте на ранніх стадіях розвитку зародка хромосоми H.bulbosum елімінуються. Незрілі зародки виділяють на 10-12 добу після запліднення і переносять на живильні середовища, іп vіvо такі зародки гинуть. Обробка запилених колосків гібереловою кислотою низької концентрації (25-100мг/л) кілька діб підвищує вихід гаплоїдниї рослин. Подібно гаплоїди м'якої пшениці, схрещуючи її з кукурудзою, сорго, ячменем. Гаплоїди тютюну при схрещуванні з дикими видами.
При віддаленій гібридизації гаплоїди через стимуляцію клітини до партеногенетичного розвитку. У картоплі при запиленні культурним видом, Проте, у цьому випадку гаплоїдні зародки розвиваються повільно, часто гинуть, а тому їх вичленюють і переносять на штучні середовища.
2. Регенерація та особливості гаплоїдних рослин.
У беладони, дурману індійського, тютюну, перцю, деяких злаків гаплоїди формуються безпосередньо з пилку шляхом прямого ембріогенезу соматичного . У інших – в результаті проміжного етапу калюсоутворення. При цьому калус переноситься на середовище для диференціації адвентивних бруньок або соматичних зародків. Залежно від виду рослин ці середовища можуть бути: без фітогормонів, з низьким умістом ауксинів , з високим умістом цитокінінів . Позитивний ефект може бути при використанні гідролізату казеїну. В процесі регенерації гаплоїдних рослин часто спостерігаються аномалії розвитку сформованих соматичних зародків. Це відбувається внаслідок використання високих концентрацій сахарози, регуляторів росту . Подальший розвиток їх відбувається досить складно, а тому використовують перенесення на середовище із меншою концентрацією цукрози, регуляторів росту або з повною відсутністю фітогормонів.Цитологічний аналіз регенерантів з пиляків, незапліднених рослинних зачатків і зав'язей свідчить про їхню неоднорідність за рівнем плоїдності. Зустрічаються: диплоїди , поліпоїди, міксоплоїди , анеуплоїди . У багатьох видів гаплоїди спонтанно поліплохдизуються, формують химери . У рослин, одержаних з пилкових зерен поліпоїди виникають в результаті злиття ядер або ендоредуплікації. Зміни в процесі онтогенезу обумовлені порушеннями мітозу. У окремих видів під час одержання андрогенних гаплоїдних рослин виникають альбіноси. Різними методами можна зменшити їх частоту. Для пшениці: збільшення концентрації цукрози до 10%, додавання розчинного крохмалю та яблучної кислоти.

Культура ізольованих тканин як метод оздоровлення від вірусних хвороб.
Кожна із сільськогосподарських культур в значній мірі потерпає від хвороб та шкідників, які не дозволяють реалізувати генетичний потенціал сорту. Серед збудників хвороб найбільш стабільний прояв мають віруси. З іншої сторони, методи звільнення організмів від вірусів, як правило забезпечують звільнення від бактерій і грибів.
Відпрацьовано декілька методів звільнення рослин від вірусної інфекції. Одним з них є метод культури ізольованої тканини. В дослідження залучали хворі рослини тютюну, про що свідчили не лише симптоми на рослинах, але й позитивна серологічна реакція на вірус F. Кусочки листків таких рослин розміщували на штучне живильне середовище Мурасіге і Скуга з 2,4-дихлорфеноксиоцтової кислоти (2мл/л). Інкубація відбувалася в термостаті при відсутності світла (температура 27 0 С, відносна вологість повітря біля 55%). Отриману в результаті росту на живильному середовищі калюсну тканину пасажували чотири разу. Проростки, які при цьому утворювалися укореняли на середовищі Хеллера. Після утворення у них коріння рослини висаджували в грунт. В результаті утворилися повноцінні рослини, які не лише добре вегетували, але й давали насіннєве потомство.
Аналіз одержаних рослин на присутність вірусу F проводили з використанням індикаторного методу в чотириразовому повторенні. Встановлено, що калус , який спочатку утворився мав вірус, але в кількості значно меншій, ніж вихідний матеріал (позитивна реакція виявлена лише при використанні індикаторного методу і лише на S. miniatum).
Калюс першого і наступних пасажів не мав вірусу. Таким чином, з використанням методу культури тканин вдалося отримати рослини вільні від вірусу F навіть при використанні інфікованого матеріалу.
Для багатьох культур встановлена доцільність використання не будь-яких тканин вірусних рослин, а апікальної (верхівкової) меристеми. Особливо підвищується ефективність одержання безвірусного матеріалу при використанні додаткових методів. Класичним прикладом в цьому відношенні може бути картопля
Культура ізольованих зародків та насіння, яке тривалий час не сходить.
Для подолання міжвидової несхрещуваності використовують біотехнологічні методи, а саме: запилення та запліднення in vitro, культуру незрілих зародків in vitro, культуру насіннєвих зачатків.
Метод культивування незрілих зародків in vitro використовується коли мають місце порушення в розвитку ендосперму, що в свою чергу призводить до загибелі зародка. Для успішного виконання таких робіт необхідне спеціальне живильне середовище, яке б давало змогу нормального розвитку зародка. Особливо суттєвим це є при культивуванні молодих зародків. У цьому випадку необхідними складовими штучного поживного середовища крім мікро- і макро солей є: вітаміни, амінокислоти, фітогормони, а також складні комплексні добавки (екстракт дріжджів, гідролізат казеїну, кокосове молоко тощо). Оптимальний осмотичний тиск середовища регулюється манітолом або іншими добавками.
Незрілі зародки культивують на поверхні напівтвердого середовища, в рідкому середовищі, в атмосфері азоту. Це ще раз підтверджує, що умови живлення, комплекс зовнішніх чинників різний залежно від етапу розвитку зародка. Особливо це стосується етапу поділу щойно заплідненої яйцеклітини (наприклад, на стадії 4 клітин).
При вирощуванні з використанням штучного поживного середовища ізольованих зародків більш пізніх фаз їх розвитку застосовується менша кількість компонентів. Культивування зародків із дозрілого насіння передбачає прискорене отримання рослин, отримання гібридів з насіння, яке у звичайних умовах не проростає. Для подолання стану спокою насіння використовують стратифікацію (дію відносно низькими температурами) або скарифікацію (пошкодження твердої шкірки, яка не дозволяє насінню прорости).
Дія механізмів спокою насіння залежить від численних факторів, основними з яких є: освітлення, температура, наявність ендогенних інгібіторів. Є види рослин, насіння яких в природних умовах не проростає. Прикладом може бути дика форма культурного банана – Musa balbisiana.
Для культивування зрілих зародків використовують прості середовища без фізіологічно активних речовин, які можуть викликати появу відхилень в рості і розвитку зародків, включаючи калюсоутворення з 1% цукрозою. З цією метою доцільно насіння попередньо намочити, що полегшить виділення зародків. При необхідності цю роботу можна проводити і з сухим насінням. Обов'язковою умовою є з зовнішня стерилізація насіння. Іноді для цього використовують навіть обпалювання в полум'ї спиртівки. Після цього в стерильних умовах виділяють зародки і висаджують на штучне живильне середовище.
Здебільшого бар'єри несумісності між ендоспермом і зародком виникають на середніх і пізніх стадіях ембріогенезу, що спричиняє загибель останнього. Спеціально підібраний склад поживного середовища може за своїм складом повністю замінити ендосперм і надати зародку всі речовини, які необхідні для його розвитку.
Культивування ізольованих зародків започаткував Ханніг в 1904 р. Зараз цей метод використовується більше ніж у 70 видів рослин, наприклад: льон, кокосова пальма, горох і особливо при одержанні віддалених гібридів ячменю і жити, кукурудзи і сорго, в дослідженнях з тритикале тощо.
Широко використовується ембріокультура в селекції плодових Зокрема це стосується ранньостиглих сортів, у яких не завжди є умови для нормального розвитку зародка через раннє дозрівання плодів.
Використовується метод вирощування дозрілих ізольованих зародків на штучному середовищі для одержання рослин із старого насіння, яке майже втратило свою життєздатність. При віддаленій гібридизації може формуватися насіння, яке має не повністю здатні до осту проростки, які гинуть на ранніх стадіях. Іноді, наприклад, спостерігається утворення сім'ядолей, але без первинного корінця. Вирощування такого матеріалу на простих за складом середовищах живильних дає змогу розвиватися рослинам на перших стадіях навіть при відсутності корінців. Пізніше вони утворюються з підсім'ядольного коліна або калюсу.
Культура клітин. Особливість формування і функціювання.
. Загальні положення. Ізоляція клітин від організму вищих рослин і перенесення їх для подальшого росту на штучне живильне середовище означає відділення їх від цілісного організму, де вони виконували певні функції. Крім цього, характер живлення клітин також значно відрізняється від того, що відбувається в організмі, де в повному циклі метаболізму задіяні різні тканини і відбувається він часто поетапно, залежно від експресії певних генів в певних органах . Ці два фактори є стресовими для клітин, а тому, обумовлюють кардинальні зміни в метаболізмі клітин, їх функції, відхилення на генному і навіть геномному рівні, напрямку та інтенсивності добору клітин і в кінцевому результаті до відмінностей в структурі клітинних популяцій. Результатом цих всіх процесів є значна гетерогенність клітин і великі перебудови геному. Спектр і глибина перебудов може перевищувати мінливість потомства від міжвидових схрещувань.
В результаті введення клітин iіп vitro утворюється нова біологічна система, особливість якої в тому, що клітини, які виконували певні функції в організмі, самі стають незалежними організмами та утворення з них особливої клонової популяції, аналоги якої відсутні в природі, хоча розвиток відбувається у відповідності із загальними законами розвитку вищих рослин.
2. Культура клітин як клонова популяція. Вперше поняття популяція ввів В.Йогансен. Але він розглядав популяції на рівні співіснування особин одного виду, що знаходяться в певному просторі, які генетично дещо відрізняються між собою. В даний час значення терміну популяція дещо уточнене. Це сукупність організмів одного виду рослин, тварин, мікроорганізмів, які впродовж численних поколінь знаходяться на певній території та ізольовані від інших подібних сукупностей того ж виду. Популяція також відноситься до сукупності клітин, які вирощуються in vitro.
Виділення окремих особин в популяцію, генофонд її обумовлюється рекомбінаціями генетичного матеріалу під статевого процесу. В популяції культивованих клітин такого обміну немає, але відмінність є, а тому останні відносять до неменделівських популяцій. Особливість неменделівських популяцій – некомбінантна спадкова мінливість. А тому, виникнення, зміна, збереження успадкованого поліморфізму у них залежить від двох чинників: мінливості і добору. В клітинних популяціях спадкова мінливість не вичерпується мутаційною мінливістю. В процесі еволюції в багатоклітинних організмів виробився ще один тип спадкової мінливості – епігенетична. Це дозволяє пояснити генетичні аспекти таких процесів: пристосування клітинних популяцій до умов середовища, їх старіння і відмирання, перетворення нормальних соматичних клітин на злоякісні тощо.
Аналізуючи генетичні процесі в клітинних популяціях необхідно враховувати мутаційну мінливість і добір та епігенетичну мінливість і добір, але й процеси взаємодії різних форм мінливості.
Взаємозв'язок між клітинами в популяції крім усього іншого базується на їхньому виділенні в середовище продуктів метаболіту та обмін цими продуктами. Підтвердженням цього є отримання клонів від окремих клітин і протопластів з використанням ефекту кондиціювання середовища. Цей ефект пояснюється гіпотезою кооперативної дії генів у клітинній популяції: кожна клітина знаходиться під впливом не лише власного геному , але й геному сусідніх клітин; дія геномів усіх клітин популяції взаємно узгоджується.
Ця гіпотеза дозволяє пояснити генетичну гетерогенність культивованих клітин, зокрема їхня міксоплоїдність пояснюється таким чином: клітини з різним числом хромосом відрізняються за характером метаболізму і між ними існують симбіотичні взаємовідносини – вони обмінюються продуктами метаболізму. Але існує і антагоністична взаємодія між клітинами з різним набором хромосом, основу якого складає взаємне пригнічення продуктами метаболізму.
Методи культивування протопластів:
метод мікрокапель. Коли кількість протеїнів незначна та при тестуванні живильних середовищ. Об’єм капель не > 50мкл. Для підтримання вологості в середині чашки Петрі кілька капель стерильної води;
суспензії протопластів. Суспензують у тонкому прошарку товщиною 1 мм рідкого живильного середовища в колбах або чашках Петрі з хитанням або без нього;
метод Клейтингу. Протопласти суспензовані у рідкому живильному середовищі змішують з таким же об’ємом культурального середовища (перед цим на водяній бані при 450С). Для аерації суміш тонким шаром дно чашки. Середовище напіврідке (0,4% агару) або на поверхні культурального середовища (0,8% агару). Використовують фільтрувальний папір, який на агаризованому середовищі;
культивування на “живильному прошарку”. Неподільні, але з активним метаболізмом клітини опромінені рентгеном або гамма-променями і занурені в середовище можуть підтримувати ріст протопластів за щільності 5-50 протопластів на 1мм. Застосовується при клонуванні сомат. гібридів. Як живильну культуру часто хлорофілдефектні клітини;
культивування мобілізованих протопластів. Протопласти вкриті оболонками з альгінату Са спроможні зберігати тургорний тиск в умовах осмотичного потенціалу культурального середовища. Встановлено, що зниження осмот. тиску культурального середовища підвищує життєздатність протопластів окремих видів.
Недоліки методу: частина протопластів пошкоджується і гине, часто зливаються не два , а більше протопластів, які нежиттєздатні, протопласти, які не злилися залишаються у злиплому стані.
На початку 80-х розроблений метод електрозлиття з використанням електричного поля (в суспензію вміщують два електроди). Змінний струм спричинює діелектрофорез – протопласти шикуються в ряд, приєднуючись своїми полярними поверхнями один до одного. Такі ланцюжки стабільні лише при наявності електричного поля. Додатковий одиничний сильний імпульс (600В/см, 10-20 мкс) спричиняє утворення пор у стиснутих протопластів і вони перетікають один в одного. Змінний згасаючий струм утримує протопласти доки відбувається змішування цитоплазми. Після припинення дії струму злиті протопласти приймають сферичну форму. При цьому не потрібні спеціальні умови, а злиття високоефективне.
Проте для електричного злиття потрібно дороге устаткування, а тому на практиці для злиття протопластів використовують модифікації хімічного методу.
На результативності злиття протопластів діє багато чинників, зокрема особливості ультраструктури клітин. Меристемні і калюсні протопласти зливаються легко, а вакулізовані, з розвиненими хлоропластами – гірше. Значний вплив має також вид рослин і навіть відносяться вони до одно- або двудольних (перші легше).
Методика і техніка мікроклонального розмноження рослин.
Зупинимося на загальних положеннях методики і техніки мікроклонального розмноження рослин. Перш за все тканини, які використовуватимуться для культивування повинні бути асептично ізольованими і розміщені у сприятливих умовах для органогенезу . Останньому сприяють склад живильного середовища, концентрація фітогормонів , оптимальні умови освітлення, температури, вологості.
На всіх етапах клонального розмноження рослин необхідно дотримуватися строгої стерильності. І навіть при цьому через різні причини частина матеріалу буває інфікованою, тобто підлягає бракуванню, а це значить, що роботи, виконані до цього етапу є безрезультатними. Основні роботи виконуються в таких кімнатах: для миття посуду, стерилізації середовища, посуду, матеріалів, приготування живильних середовищ, стерильної кімнати для виділення і пересадок тканин, культуральної кімнати та лабораторного приміщення.
Основні підготовчі роботи виконуються в кімнаті для миття посуду. Для цього необхідні глибокі раковини з кислотостійкого матеріалу, гаряча і холодна вода, стелажі для просушування посуди, шафи для її зберігання. Тут же встановлюють апарати для дистиляції води, а при потребі і бідистилятори.
Для приготування середовищ необхідно мати велику кількість різних ваг, pH – метр. В цьому приміщені повинно бути достатньо шаф, полок для зберігання хімічних реактивів посуди. Потрібен також холодильник для зберігання фітогормонів, концентрованих розчинів поживних речовин, електричні плитки, водяні бані, магнітні мішалки.
В кімнаті для стерилізації встановлюються автоклави, сушильні шафи. В наступному особлива стерильність дотримується в кімнаті, де підготовлюють матеріал для садіння і відбувається контакт його і живильного середовища. Асептичність може бути досягнута лише при виконанні комплексу робіт. По-перше, це стосується самої кімнати, яка стерилізується бактерицидними лампами впродовж ночі, але з розрахунку початку роботи в ній не раніше ніж через 2-3 години після виключення ламп. Впродовж години при тиску 2 атм. автоклавується також одежа, яка одівається поверху звичайної. Стерилізація додаткового матеріалу: вата, марля, фільтрувальний та інший папір, інструменти стерилізують в автоклаві 1 год. При тиску 2 атм. З цією метою можна також використовувати сушильні шафи. Для виділення меристеми тощо використовуються бінокулярні мікроскопи. Столи повинні мати легко миючу поверхню. Кожен день в цій кімнаті проводиться вологе прибирання.
Культиваційна кімната повинна бути обладнана відповідними стелажами з лампами, звичайно, денного світла, які виділяють менше тепла ніж накалювання.
Враховуючи, що посуд, інші матеріали використовують багато разів вони можуть бути джерелами інфекції. А тому, посуд тощо спочатку ретельно звільняється від решток попереднього використання, замочується на 4-6 год. В хром піку (розчин двохромовокислого калію в концентрованій сірчаній кислоті). Після цього посуд декілька разів промивають теплою водопровідною водою і ополіскують дистильованою. Новий посуд рекомендується простерилізувати з дистильованою водою впродовж 20-30 хв. при 1,5-2 атм. Вимитий посуд стерилізують в сушильній шафі при температурі 170-180 градусів впродовж 1-2 год.
У великій мірі успіх клонального мікророзмноження залежить від складу живильного середовища. Мінеральні солі ділять на макро і мікро. До перших відносять - N, P, K, Ca, Mg, а останніх - B, Mn, Zn, Cu, Co.Крім цього до складу середовищ входять амінокислоти, вітаміни, регулятори росту, добавки. У зв'язку з гетеротрофним харчуванням культивованих тканих, необхідна присутність вуглеводів.
Стосовно мінеральних компонентів склад середовища регулюється їхньою кількістю, концентрацією, співвідношенням. Азот обумовлює морфогенетичні можливості тканин. Значну роль відіграє форма азоту нітратна або амонійна.
З амінокислот найчастіше використовується гліцин або гідролізат казеїна. Для регуляції ростових процесів в середовища добавляють регулятори росту : ауксини, цитокініни, гібереліни.
Мікроклональне розмноження рослин.
Вирішення проблеми швидкого розмноження нових сортів стало можливим з використанням біотехнології, зокрема мікроклонального розмноження рослин. Цей напрямок дослідження вважається досить повно вивчений і широко використаний у виробництві. Навіть введений спеціальний термін біотехнологія в насінництві. Проте, і останнім часом при розмноженні рослин з використанням біотехнологічних методів запропоновано ряд нових підходів.
Клітини в складі тканин виконують певні вузько спеціалізовані функції, а тому реалізація їхньої тотипотентності не відбувається. Вона подавляється факторами і умовами, які мають місце у материнської рослини. Водночас, при виділенні однієї або групи рослинних клітин у них здатність регенерувати у цілі рослини проявляється.
мікроклональне розмноження – це безстатеве вегетативне розмноження, при якому зберігається генетична однорідність садивного матеріалу.
Цінність методу у можливості розмноження видів рослин, які важко піддаються цьому, поширенні видів, що знаходяться в поодиноких екземплярах, при розмноженні стерильних генотипів, збереженні оптимального поєднання спадкових факторів і, безумовно, при використанні для задоволення практичних потреб у швидкому розмноженні сортів, цінних форм, видів тощо.
Іншим цінним напрямком використання біотехнології в насінництві є можливість звільнення, матеріалу який вирощується від різних хвороб, особливо вірусних.
З використанням методу вдається перервати спокій рослин і проводити розмноження впродовж цілого року, що, безумовно, надзвичайно позитивно відбивається на коефіцієнті розмноження.
Залежно від клітин, тканин, які використовуються для мікроклонального розмноження можна отримати різний матеріал. Наприклад, клітини, тканини, які активно діляться обумовлюють утворення калюсу з наступною диференціацією в процесі ембріогенезу (формуються ембріоїди ). Якщо для мікроклонального розмноження використовуються недиференційовані клітини, тканини, то відбувається процес дедиференціації .
Враховуючи біологічні особливості видів рослин для кожного з них відпрацьовуються конкретні методики розмноження для досягання оптимальних умов їх вирощування. Крім цього, важливу роль відіграють особливості експланта і проходження основних процесів, які обумовлюють отримання регенеранта і садивного матеріалу.
Наукоємні підходи застосування біотехнології.
На думку численних вчених перша половина ХХІ століття характеризуватиметься переважаючим розвитком біотехнологічних наук. Серед них далеко не останнє місце займатиме біотехнологія. В першій частині лекції зупиняюсь коротко на відносно нових наукових підходах застосування біотехнології.
Про _Генна інженерія вперше згадали в 700-х роках минулого століття, коли вдалося in vitro створити першу рекомбінантну ДНК. З допомогою штучних "Липучі" кінці вдалося об’єднати частини ДНК трьох біологічних об’єктів: онковірусу мавпи SV40, частину геному Бактеріофага λ (лямбда) і гену лактозного оперону кишкової палочки. Особливо цінним є те, що бактеріальна клітина набула здатності виробляти тваринний гормон соматостатин.
Основними етапами генної інженерії є: виділення з клітин генів або синтез їх в штучних умовах; копіювання і розмноження цих генів.; одержання рекомбінантних молекул ДНК, виділених із чужорідних організмів; перенесення їх у клітину або організм.
Іншим важливим напрямком біотехнології є Клітинна інженерія . При цьому рівень, на якому виконуються дослідження вищий – клітинний, а не генний. Тут можна виділити два основні напрямки досліджень: соматична (парасексуальна) гібридизація і клітинна селекція . При соматичній гібридизації відрізняють такі етапи: відокремлення клітин від тканини; руйнування їх оболонки; злиття протопластів; утворення спільної оболонки. Основу клітинної селекції складає клітинна різноякісність тканин. Розбиваючи тканини на окремі клітини і вирощуючи їх на селективних середовищах вдається виділити такі, які мають відмінні ознаки від вихідної форми. Потім з таких клітин формують організми.
Ще на вищому рівні виконуються роботи з клонування рослин. Використовуючи як вихідний матеріал тканини з особливою характеристикою (наприклад, безвірусну меристему) можна не лише механічно розмножувати сорт, гібрид, але і отримати матеріал з додатковою характеристикою.
Крім глобальних напрямків біотехнологія в сьогоденні вирішує багато практичних питань.
Одержання протопластів.
Існує два способи руйнування клітинної оболонки – механічний і ферментативний. При механічному обмежений вихід протопластів, а також невеликою кількістю видів, де можна це застосувати. Ферментативний метод в 1960 р. на корінцях томатів. Методика вдосконалювалася, зокрема промислове виробництво ферментів. Найчастіше вживані ферменти драйселаза базидіоміцетів (збагачена целюлозою і пектиназою), пектиназа Rhisopus та ін. До їх складу входять небажані речовини: нуклеази, ліпази, пероксидази, протеолітичні ферменти, феноли. Тому, комерційні ферменти очищають сефадексом або біогелем. Але якщо потрібно одержати значну кількість протопластів, то неочищені.
Спочатку двофазне виділення протопластів з фільтрацією іі центрифугуванням, а пізніше – однофазне – сумішшю целюлози і пектинази. Для злакових пектиназа, целюлоза, драйселаза, розим.
Ферментні суміші готують на осмотичних стабілізаторах: метаболічно активні (глюкоза, сахароза, сорбітол) та інертні (манітол). Перші засвоюються протопластом під час росту і тим самим редукція осмотичного тиску в середовищі.
Для стабілізації мембран протопластів використовують мін. Сорлі, особливо Са2 . Декстран-сульфат калію і поліаміни додають для нейтралізації шкідливої дії деяких токсичних речовин, напр. рибонуклеаз при ізолюванні, а сироватку бичачого альбуміну – для зменшення руйнування органел. К-ть ферменту 0,025-5% залежно від типу ферментів, джерела протопластів, температури, рН середовища (оптимальна 5,5-6,0). Температура 20-30 С, але для злакових ефективна зниженими (14) в поєднанні з короткочасною інкубацією 30 С Час необхідний для ізолювання 0,5-24 год і залежить від вихідного матеріалу, суміші ферментів, рН, температури.
Основні напрями досліджень з генної і генетичної інженерії.
Основні напрямки дослідження з генної та генетичної інженерії зводяться до:
1) синтезу генів поза організмом;
2) виділення з клітин окремих генів або спадкових структур;
3) направлену перебудову виділених структур;
4) копіювання і розмноження виділених (синтезованих) генів або генетичних структур;
5) з‘єднання різних геномів в одній клітині.
Сюди ж можна віднести метод пересаджування ядра соматичних клітин в енуклейованій яйцеклітини
Особливості сомаклональної мінливості
Кожен генотип взаємодіючи з різними умовами навколишнього середовища може по різному проявлятися у фенотипі.
Фенотип – це реалізація генотипу в певних умовах.
Сомаклональна мінливість виникає у процесі культивування клітин і тканин in vitro. Основою цього є генетична гетерогенність клітин, а також генетична і епігенетична мінливість викликана культивуванням in vitro.
Визначення генетичної мінливості in vitro, відбувається в тканинах клітин і його можна визначити використовуючи генетичний аналіз.
Прийняті певні позначення рослин in vitro. Ro-тільки висаджені, R1- і т. д. позначають покоління регенерантів від самозапилення, а покоління від схрещування R, F1.Виділяють такі механізми виникнення сомаклональної мінливості: 1. грубі кардіологічні зміни (зміни кількості і морфології хромосом),
2. критичні (не помітні за звичайного цитологічного аналізу) перебудови хромосом,
3. зміни в метилуванні певних послідовностей ДНК, 4. транспозиції рухливих генетичних елементів,
5. ампліфікація і редукція повторюваних послідовностей ДНК,
6. соматичний кросинговер та обмін сестринських хроматид,
7 криптичні елімінації вірусів.
Причини біотехнологічного буму в останнє десятиріччя
Будь-якій сфері діяльності людини, поступальному розвитку цього процесу є причини. Які ж причини обумовили бум біотехнології, який почався лише трохи більше десятиліття тому. Homo sapiens –людина розумна. Здатність до творчості обумовили те, що людини може ставити перед собою задачі і вирішувати їх. Вони є глобальні, які зачіпають можливість існування людини на землі і менш значимі.
До глобальних відносяться різні катаклізми. Це і епідемії хвороб, війни, голод, через втрату значної частки сільгосппродукції, тощо. Останнім часом, завдяки науково-технічному прогресу ці страхіття не завдають такої великої, як раніше, шкоди, що у великій мірі обумовило значне зростання населення Землі. Щорічно воно збільшується на 70 млн. чол. А тому, стала проблема нагодувати людей. З кожним роком це зробити стає все важче. Адже, щоб забезпечити продуктами харчування лише щорічний приріст населення потрібно 2 млн. тон білку. Для його виробництва необхідно додатково збільшити площі, наприклад, під соєю на 40 млн. га. А земельні ресурси не безмежні. За прогнозами до 2050 року населення Землі збільшиться на третину (до 9 млрд. чол. Проти нинішніх 6 млрд.) і його потрібно нагодувати.
За даними заст. міністра с.-г. США Дж. Пенна уже сьогодні голодує близько 800млн чол. з 6 млрд., що живуть на Землі. Це складає більше 13%. Кожна третя дитина недоїдає і кожні 5 секунд одна вмирає з голоду.
Вчені завжди, і особливо в епоху науково-технічного прогресу шукають шляхи вирішення проблеми забезпечення населення Землі продуктами харчування. Перш за все це можна зробити підвищенням урожайності сільськогосподарських культур та продуктивності тваринництва. Зроблено багато в цьому, зокрема селекціонерами, але вирішити проблему не вдалося. Біотехнологія не залишалася осторонь цих питань. В попередніх лекціях (згадайте) ми говорили про використання в Англії з 1985 року мікробного білка для харчування людей. В Німеччині в період Першої світової війни та знову з 60-х років як добавку до ковбас, сиру використовують білок мікробіологічного виробництва. В останнє десятиліття внесок біотехнології в забезпечення людей продуктами харчування базується на використанні трансгенних рослин.
Причини значного поширення трансгенних рослин.
В чому ж причина такого буму біотехнологічних рослин у сільськогосподарському виробництві.
По-перше, ГМ рослини через появу нових якостей більш урожайні. Це питання ми з вами розглядали на лабораторно-практичних заняттях. Адже, наприклад, ми ніяк не можемо обробляти пестицидами кожну рослину картоплі при появі личинок колорадського жука або проводити з інтервалом в декілька днів міжрядний обробіток для знищення бур'янів. Тобто, в обох та інших випадках затримки з проведенням операцій знижують урожайність.
Мабуть, чи не найголовніша проблема, яку потрібно вирішувати на Землі це забезпечення людей продуктами харчування. Про це ми уже сьогодні говорили. ГМ рослини є тим фактором, який сприяє підвищенню врожайності сільськогосподарських культур.
По-друге, вища економічна ефективність при вирощуванні біотехнологічних рослин. Для уточнення: за рекомендаціями ФАО – організація ООН з сільського господарства та продовольства замість терміну "генетично модифіковані рослини" краще вживати – "біотехнологічні рослини", хоча в науковій та популярній літературі використовують обидва. Ми з вами також це питання розбирали на лабораторно-практичних заняттях. Тобто, у цьому випадку стають непотрібними окремі або навіть декілька технологічних процесів при вирощуванні ГМ рослин.
Посів ГМ сої дозволило скоротити витрати на гербіциди в розмірі 28,7 млн. фунтів стерлінгів, що обумовило зменшення вартості продукції на 1,1 млрд. доларів в рік. Відсутність потреби використання пестицидів на полях ГМ бавовника обумовило скорочення витрат при вирощуванні культури на 1,9 млрд. фунтів стерлінгів, кукурудзи – 16 млрд. фунтів стерлінгів та зростання збору зерна на 1 587 600 тон.
Декілька слів про економіку взагалі. Ринкова вартість біотехнологічних культур складається із вартості насіння та ліцензійних відрахувань за технології. Загальна вартість світового ринку ГМ культур в 2004 році склала 4,7 млрд. дол. Для порівняння: світовий ринок засобів захисту становить 32,5 млрд. дол., а ринок насіння – 30. Загальна ж вартість усієї біотехнологічної продукції (включаючи продукти харчування, корми для тварин тощо) у 2003 році оцінено в 44 млрд. дол.
Особливо слід відмітити, що у 2004 році ГМР вирощували 8 млн. 250 тис. фермерів у 17 країнах світу, 75% з яких займаються вирощування цих рослин у країнах, що розвиваються. Тобто, крім усього іншого, економічна відсталість не є перешкодою для використання ГМ рослин і навіть навпаки.
Спектр мінливості у рослин-регенерантів.
Рослини-регенеранти із фенотиповими та генотиповими змінами індукують ся in vitro з використанням калюсних, суспензійних культур, а також ізольованих протопластів. Це обумовлено змінами рівня плоїдності (поліплоїдія), кількості хромосом (анеуплоїдія), структурних змін хромосом (делеції, дуплікації, транслокації), а також зміни як ядерних генів, так і мітохондріальних та пластидних.
Мінливість in vitro може бути обумовлена генетичною гетерогенністю тканин вихідного експлантат, а також індукованою, вирощуванням в умовах штучного живильного середовища або яке наслідок дії обох факторів.
Модельним об'єктом для з'ясування причин сомаклонального варіювання може бути соматичний ембріогенез із протопластів. У деяких видів рослин процес утворення соматичних ембріоїдів безпосередньо з протопластів, минаючи стадію калюсогенезу, можливий. Порівняння рослин-регенерантів, отриманих в результаті прямого соматичного ембріогенезу та органогенезу із калюсних тканин дозволило встановити можливі причини сомаклональної мінливості.
Серед видів рослин із простими (неполіплоїдними) геномами гетерогенні клітинні популяції мають здатність до органогенезу і регенерації повноцінних переважно диплоїдних клітин, без видимих хромосомних аберацій. І навпаки, у рослин з поліплоїдним набором хромосом в культурі in vitro часто регенерують анеуплоїдні, химерні, міксоплоїдні форми, частка яких зростає по мірі культивування в штучних умовах.
Генетичний аналіз сома клонів
Результати генетичних аналізів багатьох сільськогосподарських культур свідчать, що більшість сомаклональних варіантів обумовлена стабільними генетичними змінами, що виникли внаслідок мутацій. Для вивчення природи сомаклональної варіабельності використовують модельні об'єкти з певними маркерними ознаками. У пшениці ним може бути гліадин – компонент білка зернівки, який може визначатися електрофорезом. Наявність молекулярних маркерів дозволяє уникнути невірної інтерпретації результатів мінливості, що може бути наслідком генетичної неоднорідності вихідного матеріалу, перезапиленням та інших помилок, не пов'язаних з культивуванням in vitro.
Генетичний аналіз свідчить, що більшість сомаклональних змін є мутаціями. Успадкування їх дозволило встановити такі узагальнення: 1. серед сома клонів виявлені зміни морфологічних, біохімічних характеристик і ознак, які контролюються як моно-, так і полігенами, 2. у окремих сома клонів можливі зміни за рядом ознак і в потомстві вони групуються незалежно, 3. серед регенерантів виявляються як гетеро-, так і гомозиготні мутанти, 4. сома клони можуть мати гени, які знаходяться в різних алель них станах і різних локусах, 5. мутації зачіпають ознаки, генні локуси яких локалізовані в усіх гомологічних хромосомах, 6. сомаклональні варіанти можуть бути рецесивними, домінантними або кодомінантними.
Найбільш повний генетичний аналіз сомаклональної мінливості проведений у томатів, що дозволило зробити такі висновки: 1. у результаті культивування in vitro у рослин-регенерантів спостерігаються зміни кількості окремих хромосом і рівня плоїдності, 2. виявлений ряд ядерних мутацій з домінантним, рецесивним і напівдомінантним типами успадкування, 3. частота окремих мутацій висока (одна мутація на 20-25 регенерантів), 4. окремі мутації виявлені вперше саме в культурі in vitro, 5. співвідношення за розщепленням серед потомства 3:1 в R1 дозволяє припустити, що мутанти мають клонове походження і мутації відбуваються до моменту регенерування бруньки, 6. однією з причин сомаклональної мінливості може бути мітотична рекомбінація хромосом, 7. зміни можуть стосуватися не лише ядерного, але й пластидного геному (мутації в хлДНК).
Отже сомаклональна мінливість – це унікальне явище, що може проявлятися лише у рослин-регенерантів, одержаних в культурі in vitro. Частота варіантів залежить від генотипу рослини-донора, експлантат, умов, тривалості культивування, типу морфогенезу. Сомаклональна мінливість є важливим фактором створення вихідного матеріалу. Водночас, існують деякі обмеження використання сомаклональної мінливості пов'язані з низькою частотою очікуваних змін, небажаними синергічними ефектами (зменшення висоти рослин спричиняє зниження урожайності), появою сома клонів із значними абераціями хромосом, нестабільність та не спадковість багатьох змін.
Трактування поняття "біотехнологія".
Біотехнологія – складне слово. Перша частина його „біо” – з грецького означає життя, живий організм. Друге – „техно” не що інше, як техніка. Але у словнику Даля на російську (українську) перекладається як заводське і ремісниче мистецтво, знання, уміння, а також способи робіт і прикладання їх до справи, вправність. Третє – „логос” – вчений. Дуже поширене у нас і інше слово – технологія, тобто процес, послідовність виконання операцій, пов’язаних із залученням техніки. Це дослівно. А тепер, що вкладають в це поняття виробничники, науковці.
У словнику, який нещодавно вийшов, Тлачко (батько і донька) дають таке трактування поняттю „біотехнологія” – це: 1) комплекс природних або штучно створених засобів для створення біологічних систем чи використання в промислових наукових цілях; 2) сукупність промислових методів, які використовують для виробництва живі організми і біологічні процеси. Двояке значення: для створення біологічних систем і для виробництва.
Мабуть правильніше ці трактування поміняти місцями, бо зародження біотехнології на початку (свідомо чи не свідомо) відбувалося з використанням живих організмів для виробництва певної продукції.
Четвертим етапом генетичної інженерії
з одержання трансгенних форм є копіювання і розмноження генетичних структур. Для одержання потрібної кількості фрагмента ДНК його потрібно вбудувати у вектор і розмножити. Вектор – це молекула ДНК або РНК, що складається із векторної частини (носія) і клонованого чужерідного гена. Він повинен відповідати певним вимогам, а саме:
1) мати невеликий розмір, щоб у його ДНК можна було включити бажані гени чужерідної ДНК;
2) декілька унікальних сайтів рестрипції, для вбудовування чужорідної ДНК;
3) автономно реплікуватися для стабільного перебування в клітині-господарі чужерідної ДНК;
4) бути здатним для ампліфікації з утворенням великої кількості копій; 5) мати маркери, за якими легко виявляють трансформовані клітини, а введення чужерідного гена не повинно порушувати спадкових функцій вектора;
7) гарантувати роботу чужерідної ДНК, яка включена в ДНК вектора;
8) мати здатність передавати виділений ген в клітини відповідного організму.

Приложенные файлы

  • docx 8842173
    Размер файла: 119 kB Загрузок: 0

Добавить комментарий