[Медкниги]Лекции по курсу биотехнология

Кафедра микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно санитарной экспертизы с основами технологии и стандартизации продуктов животноводства
УЛЬЯНОВСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ










ЛЕКЦИИ ПО КУРСУ: БИОТЕХНОЛОГИЯ
ДЛЯ СТУДЕНТОВ ФАКУЛЬТЕТОВ: ВЕТЕРИНАРНОЙ МЕДИЦИНЫ, БИОТЕХНОЛОГИИ






Подготовлен для печати:
профессором Васильевым Д.А.
профессором Золотухиным С.Н.
профессором Щербаковым А.А.
ассистентом Молофеевой Н.И.











УЛЬЯНОВСК 2005

УДК 619 : 616











Д.А. ВАСИЛЬЕВ, С.Н.ЗОЛОТУХИН, А.А.ЩЕРБАКОВ, Н.И. МОЛОФЕЕВА

УЧЕБНО – МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ ПО ПОДГОТОВКЕ К ЛАБОРАТОРНЫМ И СЕМИНАРСКИМ ЗАНЯТИЯМ ПО КУРСУ БИОТЕХНОЛОГИИ



Данное учебное пособие подготовлено: профессором Васильевым Д.А.
профессором Золотухиным С.Н.,профессором Щербаковым А.А., ассистентом Молофеевой Н.И.

Цель издания – восполнить существующий пробел в учебном процессе при изучении материала по лабораторному практикуму курса биотехнология. Некоторые разделы изложены более детально, а по некоторым дан описательный материал, что обусловлено лабораторными возможностями кафедры.
Рекомендовано к изданию кафедрой микробиологии, вирусологии, эпизоотологии ветеринарно – санитарной экспертизы для студентов факультета ветеринарной медицины. Рецензент - ст преподаватель, кбн, Афонин Э.А.









«Биотехнология знаменует собой еще одну революцию в науке, которая может изменить жизнь и будущее... людей так же радикально, как это сделала Промышленная революция два века назад и компьютерная революция в наши дни».
из отчета отдела по оценкам новых технологий США за 1987 г.


Лекция 1.
Введение. Знакомство с данным курсом. Природа и многообразие биотехнологических процессов.

В середине 1960-х гг. многие пророчили возникновение «новой биологии», развитие прикладных областей которой существенно изменило бы процедуры получения целого ряда химических и фармацевтических средств. Эта «революция» стала реальностью благодаря многочисленным открытиям последующего десятилетия в биохимии, в биологии клетки микробиологии, вирусологии и молекулярной биологии. Столь смелые надежды основывались в первую очередь на установлении структуры и функции определенных ферментов, их использовании в иммобилизованной форме прежде всего микробиологами и энзимологами в разнообразных производственных процессах, а также на том, что специалисты в области молекулярной генетики открыли способ модификации ДНК и перенесения ее из одних организмов в другие. Благодаря стремительному прогрессу вирусологии (в исследованиях бактериофагов), микробиологии (в углубленном изучении физиологии, генетики и молекулярной биологии кишечной палочки (Escherichia coli), а также в изучении плазмид), молекулярной генетики (в установлении генетического кода) и энзимологии (в открытии ферментов рестрикции) были накоплены знания и разработаны методы генной инженерии. Одновременно были по достоинству оценены и потенциальные возможности этих методов.
Термин «биотехнология» был придуман в 1917 г. венгерским инженером Карлом Эреки для описания процесса крупномасштабного выращивания свиней с использованием в качестве корма сахарной свеклы. По определению Эреки, биотехнология это «все виды работ, при которых из сырьевых материалов с помощью живых организмов производятся те или иные продукты». Однако это совершенно точное определение не получило широкого распространения. Долгое время термин «биотехнология» относился к двум очень разным дисциплинам. С одной стороны, его употребляли, говоря о промышленной ферментации, с другой применительно к той области, которая сейчас называется эргономикой. Такой двойственности пришел конец в 1961 г., когда шведский микробиолог Карл Гёрен Хеден порекомендовал изменить название научного журнала "Journal of Microbiological and Biochemical Engineering and Technology" («Журнал микробиологической и биохимической инженерии и технологии»), специализирующегося на публикации работ по прикладной микробиологии и промышленной ферментации, на "Biotechnology and Bioengineering" («Биотехнология и биоинженерия»). С этого момента биотехнология оказалась четко и необратимо связана с исследованиями в области «промышленного производства товаров и услуг при участии живых организмов, биологических систем и процессов» и встала на прочный фундамент микробиологии, биохимии и химической инженерии.
По классическому определению - биотехнология, это в сущности, не что иное, как использование культур клеток бактерий, дрожжей, животных или растений, метаболизм и биосинтетические возможности которых обеспечивают выработку специфических веществ. Согласно определению Европейской биотехнологической федерации, созданной в 1978 г., биотехнология на основе применения знаний и методов биохимии, молекулярной биологии, микробиологии, генетики и химической техники позволяет извлекать выгоду в технологических процессах из свойств микроорганизмов, макроорганизмов и клеточных культур. Она создает возможность получения с помощью легко доступных и возобновляемых ресурсов тех веществ и соединений, которые важны для жизни и благосостояния людей. Новейшее определение биотехнологии, предлагаемое академиком ВАСХНИЛ В.С. Шевелухи, это наука о генно-инженерных и клеточных методах и технологиях создания и использования генетически трансформированных биологических объектов для интенсификации производства или получения новых видов продуктов различного назначения.
В промышленном масштабе биотехнология представляет собой уже биоиндустрию. Последняя включает в себя, с одной стороны, отрасли, в которых биотехнологические методы могут с успехом заменить широко используемые в настоящее время традиционные методы, а с другой отрасли, в которых биотехнология играет ведущую роль. Среди первых в области химической промышленности синтез искусственных приправ, полимеров, сырья для текстильной промышленности, в области энергетики получение метанола, этанола, биогаза и водорода, в области биометаллургии извлечение некоторых металлов. Во второй группе отраслей биотехнология охватывает: производство продовольствия (широкомасштабное выращивание дрожжей, водорослей и бактерий для получения белков, аминокислот, витаминов, ферментов, продукты гибридомной технологии); увеличение продуктивности сельского хозяйства (клонирование и селекция сортов растений, исходя из тканевых и клеточных культур, производство биоинсектицидов); микробиологическую промышленность (разработка и производство вакцин, диагностических препаратов, синтез гормонов, интерферонов и антибиотиков); защиту окружающей среды и уменьшение ее загрязнения (очистка сточных вод, переработка хозяйственных отходов, изготовление компоста, а также производство соединений, поддающихся расщеплению микроорганизмами).
Эта эволюция биотехнологии неотделима от развития знаний об основополагающих механизмах жизнедеятельности. В 1953 г. Сэнгер установил полную структуру белка инсулина, а Уотсон и Крик доказали, что дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) построена из двух нитей. В 1963 г. Ниренберг расшифровал генетический код, который оказался универсальным как для бактерий, так и для высших организмов вплоть до человека. Тем самым генетическая информация и ее смысл, т. е. взаимосвязь между генетическим кодом и структурой белков, стали доступны для изучения. Важнейший этап был пройден в 60-х гг., когда появилась возможность автоматически определять структуру белков. Стали производиться приборы, установлены последовательности (первичные структуры) белков, которые составили «атлас белков», хранящийся в компьютерных системах. Вслед за изучением белков были достигнуты и в исследованиях нуклеиновых кислот. В 1976 г. Гилберт и Максам в Гарвардском университете разработали быстрый метод химического анализа ДНК; появилась реальная возможность определять последовательность нуклеотидов. В 19821985гг. стало возможно создать прибор для автоматического анализа нуклеиновых кислот. Анализ ДНК позволяет дедуцировать, основываясь на генетическом коде, аминокислотные последовательности белков, синтез которых находится под контролем соответствующих генов. Следующий важнейший этап это синтез биополимеров по установленной структуре. Первые коммерческие приборы, производящие автоматизированный синтез полипептидов, были разработаны на основе исследований Меррифилда в 1963 г. После определения структуры фенилаланиновой транспортной РНК (тРНК) Корана (первоначально в Висконсинском университете, а затем в Массачусетском технологическом институте в 19701972 гг.) произвел синтез ДНК (иначе говоря, гена), соответствующей этой тРНК. Впоследствии Корана и его сотр. синтезировали ген предшественника тирозиновой тРНК Escherichia coli. Итакура с сотр. в Национальном медицинском центре «Хоуп» (Дуарте, Калифорния) в 1977 г. с успехом синтезировали ген соматостатина, а в 1979 г. ген инсулина человека. Эти гены были введены в клетки бактерии Е. coli с использованием методов генной инженерии. Так впервые была продемонстрирована экспрессия гена человека в бактериальных клетках. Созданы автоматические «синтезаторы», позволяющие проводить более или менее автоматическое наращивание нуклеотидной цепи, связанной с носителем, а вся процедура в целом может контролироваться компьютером (т. е. программой, предусматривающей хранение, дозировку, перекачивание, впрыскивание в реакционную камеру, отмывку растворителей и реагентов, а также контроль запрограммированной последовательности операций). В 1980 г. Итакура создал первый синтезатор генов. Синтез фрагментов нуклеиновых кислот, который в 1981 г. проводили наращиванием нуклеотидов один к одному, был быстро усовершенствован за счет соединения заранее полученных более длинных последовательностей согласно заданной программе. Полный синтез ДНК, содержащей специфическую последовательность нуклеотидов, отличается от репликации ДНК in vivo или in vitro, катализируемой ДНК-полимеразой. Последняя нуждается в матрице, которая представляет собой двунитевую молекулу ДНК и содержит точно воспроизводящуюся информацию, но не служит источником новой информации. При химическом синтезе имеется возможность вносить изменения в последовательность нуклеотидов и изучать их влияние на биологическую функцию синтезированной таким способом молекулы ДНК (или РНК). Химический синтез дает возможность изучения регуляции синтеза нуклеиновых кислот, а также регуляции транскрипции РНК на матрице ДНК. В процессе транскрипции решающая роль принадлежит определенным нуклеотидным последовательностям, которые называются промоторами. Вводя различные нуклеотиды в последовательность при химическом ее синтезе, т е, фактически получая точковые мутации, можно проследить за изменениями функции такой последовательности в клетке. Именно таким способом в лаборатории Университет Луи Пастера в Страсбурге, в промоторном участке гена, кодирующего один из полипептидов белка куриного яйца, был заменен единичный нуклеотид. Эта мутация позволила установить роль специфической нуклеотидной последовательности в регуляции синтеза информационной РНК. Полученные в результате химического синтеза полинуклеотиды могут быть использованы для выделения с помощью гибридизации соответствующей информационной РНК, кодирующей структуру белка.
Стремительный прогресс биологии, особенно ярко проявившийся в бурном развитии биотехнологии, тесно связан с усовершенствованием аналитических методов (необходимисть в которых возникла в связи с развитием микробиологии и вирусологии), таких, как ультрацентрифугирование, введение в молекулы радиоактивных изотопов, электрофорез, аффинная хроматография (например, разделение сложных молекул с помощью соответствующих моноклональных антител), двумерное электрофокусирование (позволяющее анализировать до 50 000 белков в одной клетке) и методы микроанализа (например, определение первичной структуры белка, исходя всего из 10 нг, а также определение структуры других биологических макромолекул, таких, как полисахариды, связанные с белками в составе гликопротеинов).
Таким образом, если развитие биологических знаний и в самом деле можно считать детищем технического прогресса, то в настоящее время биологическая наука, обогащенная достижениями энзимологии, микробиологии, вирусологии, молекулярной биологии в силах создать систему взаимосвязанных отраслей биотехнологии, обладающих уникальным достоинством: они будут основаны на функционировании природных (а не искусственных) систем, метаболические механизмы которых будут подчинены интересам человечества.
В историческом смысле биотехнология возникла как прикладная микробиология тогда, когда дрожжи впервые были использованы для производства пива, а бактерии для производства кисломолочных продуктов. В пользу этого свидетельствует описание процесса приготовления пива, обнаруженное в 1981 г. при раскопках Вавилона на дощечке, которая датируется примерно 6-м тысячелетием до н. э. В 3-м тысячелетии до н. э. шумеры изготовляли до двух десятков видов пива. Совершенствование процессов сбраживания, увеличение их эффективности, а также изучение многочисленных биохимических реакций, присущих микроорганизмам, шли параллельно с выделением из клеток бактерий и грибов веществ, которые все в большей степени вытесняли синтетические продукты, и противовоспалительные препараты и противопаразитарные средства. Что касается более современных биотехнологических процессов, то они основаны на методах рекомбинантных ДНК, а также на использовании иммобилизованных ферментов, клеток или клеточных органелл. При их рассмотрении предпочтительнее пользоваться терминами «генетическая рекомбинация in vitro» или «использование рекомбинантных ДНК», а не «манипулирование генами» или «генная инженерия». Согласно определению Национальных институтов здоровья США, рекомбинантными ДНК называются молекулы ДНК, полученные вне живой клетки, в пробирке, путем соединения природных или синтетических фрагментов ДНК с молекулами, способными реплицироваться в клетке. Основу эксперимента составляет встраивание природной или чужеродной ДНК в вектор, который представляет собой бактериальную плазмиду или геном вируса; затем рекомбинантную молекулу ДНК вводят в клетку, где она реплицируется. Клетка, содержащая такую ДНК, размножается, образуя клон трансформированных клеток. Одна из целей биотехнологии заключается в том, чтобы получить клоны трансформированных клеток, способных к экспрессии чужеродной генетической информации и образованию специфических белков в больших количествах. Предпосылкой прогресса в этой области послужило открытие в 1972 г. Арбером (Базель) и Смитом и Натансом (Университет Джона Гопкинса) лауреатами Нобелевской премии 1978 г. ферментов рестрикции, которые расщепляют ДНК в специфических участках. Не менее важным оказалось открытие лигаз ферментов, способных «сшивать» фрагменты ДНК, и обратной транскриптазы, синтезирующей ДНК на матрице РНК. Для встраивания одного или нескольких генов в ДНК с последующим введением в клетки микроорганизма необходимы как рестрикционные эндонуклеазы, так и лигазы. Следует подчеркнуть, что генная инженерия чрезвычайно важна не только для биотехнологических разработок, но в не меньшей степени и для фундаментальных исследований, связанных с изучением структуры генов высших организмов, регуляции экспрессии генов, структуры белков, которую определяют по структуре кодирующей их ДНК, а также перетасовки генов в эволюции. Технология иммобилизованных ферментов получила свое развитие в конце 60-х гг и с успехом применялась не только в промышленном производстве полусинтетических пенициллинов, получении концентрата фруктозы из крахмала зерновых культур, но и при проведении биохимических анализов. Еще эффективнее оказываются иммобилизованные клетки или клеточные органеллы, поскольку они содержат все необходимые гены для синтеза сложных соединений.
Таким образом, развитие биотехнологии в огромной степени определяется исследованиями в области микробиологии, биохимии, энзимологии и генетики микроорганизмов, а также наличием коллекций культур микроорганизмов, надлежащим образом учтенных и постоянно изучаемых. Необходимо уделять внимание и таксономии микроорганизмов, так как биотехнологические разработки базируются на глубоком знании характеристик штаммов микробов. Более того, поскольку эти штаммы могут быть защищены патентами, они будут играть ключевую роль в развитии многих отраслей фундаментальных исследований, а также в прикладных исследованиях, в биотехнологии и промышленной микробиологии. История промышленной микробиологии, и ее современное состояние позволяют проследить тесную связь фундаментальных и прикладных исследований. Столетие назад исследования Пастера, направленные на решение сугубо практических задач, привели к становлению микробиологии, иммунологии и биохимии, а открытие в 1940-х гг. микробиологами-практиками антибиотиков обусловило создание методических приемов, сыгравших решающую роль в развитии молекулярной биологии, и одновременно дало толчок важнейшим изменениям в фармацевтической промышленности. Наконец, за последние 30 лет фундаментальные исследования в области генетики микроорганизмов позволили разработать целый ряд новых методов для промышленного применения. Такая взаимосвязь науки и технологии является решающим условием дальнейшего прогресса промышленной микробиологии. Вместе с тем, хотя биотехнологические процессы прежде всего связаны с микробиологией и энзимологией, не менее существенную роль играет и использование клеток животных, например для культивирования вирусов, при производстве вакцин, для получения интерферона, а также при синтезе моноклональных антител клетками гибридом. С начала 1950-х гг. вирус полиомиелита для производства вакцины выращивается в культурах клеток млекопитающих. С тех пор линии культур клеток человека стали незаменимыми для выделения и выращивания ряда других вирусов, при производстве высокоспецифичных белков (таких, как антитела и интерфероны), в исследованиях рака и в противовирусной химиотерапии. Суспензию отдельных клеток получают обработкой размельченной ткани эмбриона пищеварительным ферментом, трипсином. Если клеткам в такой суспензии дать осесть на плоскую поверхность в сосуде с культуральной средой, то клетки становятся плоскими и делятся, образуя монослой. Рост клеток и выход биомассы можно увеличить, добавив к суспензии носитель микроскопические гранулы из инертного синтетического полимера, на которых клетки закрепляются и пролиферируют. Суспензионные культуры клеток получают объемом до 10 000 л. Деление клеток млекопитающих происходит примерно раз в сутки, тогда как клетки дрожжей делятся каждые 1,52 ч, а бактериальные клетки каждые 20 60 мин. Большинство культур клеток млекопитающих, в том числе и клеток человека, удается сохранять неопределенно долгое время замороженными в специальной среде при -180° С.
Развитие биотехнологии коснулось и растений, хотя и позднее: для широкомасштабного производства клонов растений используются меристемы, а культуры растительных клеток применяют для синтеза различных веществ, как самых обычных (алкалоиды и другие вторичные метаболиты), так и экзотических (идиолиты). В 1937 г. Готере с успехом культивировал недифференцированную ткань моркови. Полученный при этом каллус, отделенный от родительского растения, удавалось фрагментировать и культивировать в новой культуральной среде, содержащей растительный гормон, ауксин. Такие культуры можно было поддерживать неопределенно долго. Некоторые линии, полученные Готере, поддерживаются в культуре до сих пор. В 1954 г. Мюир, Хильдебрандт и Рикер получили культуру из отдельных растительных клеток; этот метод затем усовершенствовал во Франции Лутс, а Бергманн для выращивания суспензионных культур растительных клеток воспользовался методами, разработанными для бактериальных культур. Еще в 1892 г. Клеркер выделил протопласты, однако лишь в 1960 г. Кокинг создал достаточно простой метод ферментативного получения протопластов в больших количествах. Слияние протопластов позволяет увеличивать число и разнообразие гибридов без применения полового размножения В 1957 г. Скоог и Миллер, обработав каллус растительными гормонами (ауксином и кинетином), добились образования корней и стеблей. Затем Морель показал, что другой растительный гормон гиббереллин индуцирует пролиферацию меристем и их дифференцировку с образованием в конечном счете целого растения. Этот процесс регенерации нашел важное применение в сельскохозяйственной практике на нем основано получение безвирусных растений, а также размножение новых культурных разновидностей или видов, которые обычно не размножаются вегетативно. Биологическое многообразие культур растительных клеток и тканей открывает интересные перспективы изучения новых полезных соединений. Освоение методов массового культивирования позволит синтезировать такие молекулы. Начиная с 1970 г. исследователи нередко наблюдали, что клетки, растущие в культуре, синтезируют вещества, которые не обнаруживаются в целом растении.
Так, клеточные культуры Catharanthus roscus синтезируют несколько десятков различных алкалоидов; из них идентифицированы лишь восемь, четыре не найдены в целом растении, а два оказались неизвестными дотоле веществами.
Решение таких проблем, как нехватка продуктов питания и дефицит белка, будет найдено с помощью биотехнологии за счет снижения стоимости производства аминокислот необходимого компонента корма домашних животных, благодаря разработке методов получения белка одноклеточных (кормового белка), переработкой парафинов или другого доступного сырья (целлюлозы, агропромышленных или сельскохозяйственных отходов, сточных вод), а также путем клонирования растений и отбора высокоэффективных разновидностей. В перспективе на основе методов рекомбинантных ДНК биотехнология позволит освоить синтез растительных белков и добиться искусственного фотосинтеза и фиксации азота.
Резюмируя выше изложенное обобщим понятия о сути биотехнологии и её задачах.
История становления биотехнологии может быть подразделена на пять основных этапов (периодов), которые вследствие их важности для развития биотехнологии иногда не совсем строго называют «эрами».
1. Допастеровская эра (до 1865 г.). В этот период биотехнологическими методами получали пиво, вино, сыр, хлеб, йогурт, кефир, разного рода ферментированную пищу.
2. Пастеровская эра (18651940 гг.). Стали известны микроорганизмы-продуценты, и это позволило создать производства этанола, бутанола, ацетона, глицерина, лимонной кислоты, многих вакцин, организовать процессы биологической очистки стоков аэробными микроорганизмами.
3. Эра антибиотиков (19401960 гг.). Были открыты пенициллин, стрептомицин и многие другие антибиотики, разработана технология культивирования клеток животных и получение вирусных вакцин, технология биотрансформации стероидных гормонов.
4. Постантибиотическая эра (19601975 гг.). Созданы технологии аминокислот, микробиологического белка на парафинах нефти, ферментов, используемых в стиральных порошках. Разработана технология иммобилизации ферментов (закрепления их на носителях) для получения глюкозо-фруктозных сиропов. К аэробной обработке стоков добавилась анаэробная обработка твердых отходов с получением биогаза. Открыт микробиологический способ получения полисахаридов (начиная от ксантана для увеличения вязкости раствора нефтяных скважин до жевательной резинки). В этот период стали серьезно говорить о газохоле и вообще о техническом спирте как топливе для автомобилей.
Созданы микробиологические технологии витаминов В3 и B12, а также микопротеина мицелиального микроскопического гриба, используемого как заменитель мяса. Ученые научились культивировать изолированные растительные клетки, что положило начало биотехнологическому производству многих ценных лекарственных веществ с использованием огромного потенциала лекарственных растений. К этому же периоду относится зарождение биометаллургии бактериального выщелачивания меди и цинка из руд.
5. Эра новой биотехнологии (после 1975г.). Характеризуется разработкой генной инженерии, которая позволяет целенаправленно изменять геном микроорганизмов, переносить в него свойства, заимствованные из геномов растений и животных. Это позволило создать микробиологическую технологию человеческого инсулина, интерферона, соматотропного и ростовых гормонов и многого другого. Создана гибридомная технология, позволяющая получать мо-ноклональные антитела, являющиеся основой для огромного разнообразия диагностических препаратов. Появились так называемые «трансгенные» растения и животные, в которых осуществлялось целенаправленное конструирование генома.
Как же понять термин биотехнология? Биотехнология это целенаправленное получение ценных продуктов, в процессе которого используется биохимическая деятельность микроорганизмов, изолированных клеток или их компонентов.
В этом определении скрыты некоторые «подводные камни», поэтому рассмотрим его более подробно на примерах. Наиболее часто биотехнологию путают с растениеводством или животноводством. Например, получение пшеницы из воды и удобрений на первый взгляд биотехнология. Однако здесь используется биохимическая деятельность не изолированных клеток, а целого растения, макроорганизма, относящегося к высшим, многоклеточным организмам. Это не биотехнология, а растениеводство. Точно так же получение лекарства из корня женьшеня не биотехнология. А вот когда из этого корня берут отдельные клетки, отделяя их с помощью ферментов от многоклеточной растительной ткани, и разводят эти отдельные, изолированные клетки на специальном питательном растворе, как дрожжи, получая биомассу изолированных клеток женьшеня, из которой путем настаивания можно получить столь же ценное лекарство, как из целого корня, это уже биотехнология.
Другой пример производство молока. Молоко получают от коровы, овцы или другого млекопитающего животного, т. е. это работа макроорганизма. Значит, это не биотехнология. А вот получение из молока кефира, йогурта или другого кисло-молочного продукта основано на биохимической деятельности молочно-кислых бактерий это вполне легитимная биотехнология. В производстве глюкозы из крахмала есть процесс гидролиза: раствор крахмала подкисляют, нагревают до определенной температуры и выдерживают некоторое время. В результате крахмал распадается на глюкозу, получается гидролизат грязноватый раствор глюкозы с примесями. Это химический, а не биотехнологический процесс. Есть другой процесс процесс ферментативного гидролиза крахмала. В этом случае к суспензии крахмала добавляют фермент, и под его действием также происходит расщепление крахмала до глюкозы, но в гораздо более мягких условиях и без образования нежелательных примесей, с меньшими потерями. Ферменты это выделенные из клетки белковые вещества, компоненты клетки. Следовательно, по определению, этот процесс биотехнология.
Во всех приведенных примерах в качестве основания для отнесения процесса к биотехнологии или к химической технологии мы рассматривали то, посредством каких воздействий осуществляется обработка продукта.
Иногда обращают внимание на другое: какое сырье обрабатывается химическое или биологическое. Например, очень часто производство мясных продуктов относят к биотехнологии, обосновывая это тем, что исходное сырье туши забитых животных, сырое мясо и так далее являются продуктами биологического происхождения. С этой точки зрения, например, приготовление котлет это биотехнология, хотя рабочий процесс заключается в измельчении мяса и затем в его тепловой обработке, т. е. нет биохимической деятельности микроорганизмов или клеток, а значит, это не биотехнология. А вот обработка мясного фарша определенными заквасками и последующий режим созревания, используемый при приготовлении дорогих сортов колбас, это, конечно, биотехнология.
На практике часто не делают столь строгих различий, и многие процессы переработки сырья биологического происхождения называют процессами биотехнологическими.
В дальнейшем мы увидим, что и строго биотехнологические производства, например микробиологическое получение спирта или антибиотиков, имеют в своем составе кроме биотехнологических также химико-технологические и физико-механические процессы.
Поскольку сырьем для каждого из этих процессов служит полупродукт биотехнологического происхождения, эти процессы вполне законно также называют биотехнологическими как часть многостадийной технологии производства.
Обратим внимание еще на одно важное слово в определении биотехнологии «целенаправленно». Действительно, с точки зрения человека микроорганизмы работают в природе не всегда целенаправленно. Например, многие болезни вызываются действием микроорганизмов, и наоборот, многие микроорганизмы, населяющие человеческое тело полезны. Вспомните, что после лечения антибиотиками, когда эти полезные микроорганизмы уничтожаются наряду с вредными, возникает такое заболевание, как дисбактериоз, которое приходится лечить введением в организм бактерий (например, бифидобактерий или молочно-кислых бактерий). Это не биотехнология, а медицина.
Биотехнология это организованная человеком деятельность микроорганизмов, направленная на получение определенного продукта.
Существует биогеохимическая деятельность бактерий, в результате чего происходит переработка растительности и деревьев в торф, уголь, нефть, выщелачивание металлов и многие другие глобальные процессы. Эти процессы нельзя называть биотехнологическимм, потому что они нецеленаправленные. Или, например, можно заметить, как после загрязнения почвы нефтью происходит естественное (не организованное человеком, т. е. не целенаправленное) биовосстановление через 510 лет под воздействием микроорганизмов почва самоочищается. А вот когда мы специально организовываем технологию очищения почвы, вводя в нее дополнительные микроорганизмы или усиливая питание естественных почвенных микроорганизмов, это уже биотехнология, биотехнология очистки почвы от загрязнений.
В настоящее время достижения биотехнологии перспективны в следующих отраслях:
в промышленности (пищевая, фармацевтическая, химическая, нефтегазовая) использование биосинтеза и биотрансформации новых веществ на основе сконструированных методами генной инженерии штаммов бактерий и дрожжей с заданными свойствами на основе микробиологического синтеза;
в экологии повышение эффективности экологизированной защиты растений, разработка экологически безопасных технологий очистки сточных вод, утилизация отходов агропромышленного комплекса, конструирование экосистем;
в энергетике применение новых источников биоэнергии, полученных на основе микробиологического синтеза и моделированных фотосинтетических процессов, биоконверсии биомассы в биогаз;
в сельском хозяйстве разработка в области растениеводства трансгенных агрокультур, биологических средств защиты растений, бактериальных удобрений, микробиологических методов рекультивации почв; в области животноводства создание эффективных кормовых препаратов из растительной, микробной биомассы и отходов сельского хозяйства, репродукция животных на основе эмбриогенетических методов;
в медицине разработка медицинских биопрепаратов, мо-ноклональных антител, диагностикумов, вакцин, развитие имму-нобиотехнологии в направлении повышения чувствительности и специфичности иммуноанализа заболеваний инфекционной и неинфекционной природы. Своеобразием и активностью ферментов определяются все жизненные функции организмов.


ЛЕКЦИЯ 2.
СПОСОБЫ И ОСОБЕННОСТИ ТЕХНОЛОГИИ ПРОМЫШЛЕННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ
Для осуществления любого биотехнологического процесса необходимы:
^ культура микроорганизмов;
^ питательная среда;
^ аппаратура для выращивания и проведения вспомогательных операций;
^ средства контроля и управления.
Культивирование является основной стадией технологического процесса и во многом определяет количественные и качественные характеристики производства биопрепаратов. На стадии культивирования осуществляется накопление как самой биомассы, так и продуктов метаболизма (жизнедеятельности) микроорганизмов.
Иногда, например, при производстве бактериальных препаратов, целевым продуктом является сама биомасса, в других случаях продукты, синтезируемые клеткой - антибиотики, ферменты, аминокислоты и др. При этом синтезируемый продукт может накапливаться как внутри клеток, так и выделяться в культуральную жидкость.
В том случае, когда культура растет на поверхности жидкой или плотной питательной среды, потребляя содержащиеся в ней субстраты и выделяя в эту среду продукты метаболизма, такой способ культивирования называют поверхностным.
При твердофазном культивировании клетки растут на поверхности твердой (плотной) среды, содержащей достаточное количество влаги и питательных веществ (чаще всего основу такой среды составляют пшеничные отруби).
При жидкофазном (глубинном) культивировании, микроорганизмы распределяются по всему объекту жидкой питательной среды, а кислород поступает к клеткам в результате интенсивной операции перемешивания.
Последний способ наиболее широко применяется в настоящее время в производстве большинства препаратов по следующим причинам:
1. Позволяет получить большое количество бактериальной массы за короткое время. Так, при культивировании микроорганизмов группы кишечной палочки в условиях состояния покоя количество микробов не превышает 1-2 млрд см -3, а с применением принудительной аэрации урожайность, в зависимости от состава питательной среды, достигает 50 - 60 млрд см-3. Это объясняется тем, что при аэрации практически отсутствует начальная стационарная фаза, и бактерии сразу начинают интенсивно размножаться, переходя в логарифмическую фазу.
2. Процесс легко управляем. При глубинном выращивании имеются существенные различия в степени потребления углеродных и азотистых веществ. Они интенсивно потребляются при аэрации культураль-ной жидкости, поэтому, чтобы процесс роста и размножения не прекращался быстро, нужно в процессе культивирования дополнительно вводить углеродные и азотистые соединения, а при необходимости и другие стимуляторы роста микроорганизмов.
Добавление питательных веществ, особенно углеводных (глюкоза) и биологических стимуляторов усиливает интенсивность размножения, что и приводит к увеличению концентрации микроорганизмов в момент съема их биомассы. Данный способ также позволяет легко корректировать рН среды в процессе культивирования, что очень важно для достижения максимальной интенсивности размножения.
3. Максимальная технологичность. Так, поверхностный метод менее технологичен и в промышленных условиях применяется в исключительных случаях, когда нельзя воспользоваться глубинным методом.
Технологический процесс глубинного выращивания микроорганизмов в реакторах (ферментерах) так же как и при использовании плотных питательных сред, складывается из следующих этапов:
1. Отбор штаммов микроорганизмов и работа с ними.
2. Приготовление посевной микробной культуры.
3. Приготовление и стерилизация питательных сред.
4. Подготовка биореактора к посеву.
5. Выращивание микроорганизмов в реакторе и контроль над процессом культивирования.
Кроме того, он включает ряд вспомогательных операций:
> стерилизацию оборудования и коммуникаций;
> приготовление и стерилизацию пеногасителей, растворов и др. Остановимся на каждом из этапов культивирования.
1.1. ОТБОР ШТАММОВ МИКРООРГАНИЗМОВ И РАБОТА С НИМИ
Эталонные, или референтные, штаммы хранятся и поддерживаются на заданном уровне во ВГНКЙ ветеринарных препаратов. Эти штаммы, в свою очередь, являются производственными, поскольку на их основе готовятся вакцины. При этом инактивированные вакцины, как правило, готовятся из высоковирулентных штаммов, а живые вакцины - из аттенуированных (ослабленных), авирулентных штаммов.
Наряду с производственными и эталонными штаммами во ВГНКИ хранятся контрольные штаммы, которые используют для оценки качества вакцинных препаратов. Эти штаммы должны быть генетически однородными популяциями микроорганизмов со стабильными морфологическими, специфическими и биологическими свойствами. Основными требованиями к этим штаммам являются их высокие антигенные и иммуногенные свойства.
Антигенные свойства штаммов оцениваются по титру антител в сыворотке крови чувствительных животных через определенные сроки после введения им микроорганизмов.
Иммуногенньхе свойства штаммов определяются по устойчивости привитых животных к заражению возбудителем болезни определенной дозой контрольного (вирулентного) штамма и выражают 50%-ной дозой иммуногенности или по нарастанию титра антител в сыворотке крови. При этом 80% привитых животных должны быть невосприимчивы к инфекции, против которой их вакцинировали.
Безвредность (реактогенность) эталонного, производственного штамма проверяют по выраженности реакции у лабораторных и естественно-восприимчивых животных на 5-10-кратное увеличение прививочной дозы.
Производственные, эталонные штаммы, должны сохранять генетическую стабильных антигенных, иммуногенных и других присущих им биологических свойств на протяжении 10-20 последовательных пересевов как in vivo, так и in vitro.
1.2. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПОСЕВНОЙ МИКРОБНОЙ КУЛЬТУРЫ
Обычно производственное культивирование микроорганизмов при изготовлении вакцин осуществляют в больших объемах. Поэтому вначале из имеющегося эталонного штамма микроорганизма, находящегося, как правило, в лиофильно высушенном состоянии в ампуле, делают посевы в небольшие емкости, например во флаконы емкостью 100-200 см3, заполненные по 50-150 мл производственной средой. Затем из флаконов делают высевы в большие емкости - бутыли объемом 18-20 литров.
При хорошем накоплении микроорганизмов такую культуру вносят в реактор и называют посевной (матрацной, матровой, маточной). При этом нужно предварительно рассчитать необходимое количество посевной культуры для производственного культивирования микроорганизмов, исходя из посевной дозы, которая обычно составляет от 1 до 10 % по объему. Посевные микробные культуры также контролируются на сохранение ими типичных морфологических, культурально-биохимических, антигенных и иммуногенных свойств и отсутствие в них посторонней микрофлоры (ПМФ).

1.3. ПРИГОТОВЛЕНИЕ И СТЕРИЛИЗАЦИЯ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД
Одним из этапов получения биопрепаратов является культивирование микроорганизмов, которое невозможно без достаточного количества разнообразных стандартных, эффективных и недорогих питательных сред (ПС).
В этой связи представляется целесообразным рассмотреть основные принципы, лежащие в основе конструирования ПС, к которым относятся:
- удовлетворение питательных потребностей микроорганизмов;
- выбор сырьевых источников для конструирования ПС;
- дифференциация ПС по целевому назначению;
- оптимизация ПС;
- стандартизация ПС.
Удовлетворение питательных потребностей микроорганизмов
Основополагающим принципом конструирования ПС является полноценность, т.е. состав среды должен удовлетворять питательным потребностям культивируемых микроорганизмов.
В процессе роста микроорганизмы потребляют из окружающей их питательной среды целый ряд разнообразных химических веществ, составляющих основу энергетического и конструктивного обмена в клетках.
Поступление питательных веществ в цитоплазму может осуществляться через всю поверхность клетки и связано с их диффузией, а также с действием специальных транспортных систем. Причем необходимые для роста и жизнедеятельности клетки элементы должны находиться в определенной, легкоусваиваемой форме.
К основным компонентам, формирующим клеточное вещество, относятся: углерод, азот, кислород и водород. Содержание этих элементов в различных микроорганизмах практически постоянно.
Синтетические возможности микроорганизмов и способы получения ими энергии разнообразны, следовательно, и очень индивидуальны их потребности в источниках питания.
Отсюда ясно, что универсальных сред, одинаково пригодных для роста всех без исключения микроорганизмов и клеток не существует.
Разнообразие микроорганизмов проявляется, прежде всего, в отношении к источникам углерода и азота. Эти элементы представлены в средах различными веществами, и именно они определяют специфичность сред.
В зависимости от формы, в которой микроорганизмы используют необходимые им питательные вещества, их подразделяют на две большие группы:
1. Автотрофы микроорганизмы, которые могут синтезировать вещества своей протоплазмы из простых неорганических соединений. Например, они ассимилируют углерод из углекислоты воздуха, азот из аммиака.
2. Гетеротрофы - микроорганизмы, для которых источником углерода и азота служат органические вещества. Они усваивают органические углеродсодержащие соединения: углеводы, органические кислоты, спирты и углеводороды. Наиболее доступные из источников углеродного питания-углеводы, такие как глюкоза, сахароза или мальтоза.
В зависимости от типов используемых азотистых соединений микроорганизмы разделяют на две группы:
1. Протеолитические, расщепляющие высокомолекулярные белковые вещества и пептиды;
2. Дезаминирующие, требующие присутствия в среде готовых аминокислот, расщепление которых сопровождается выделением аммиака.
Очень часто микроорганизмы и клетки нуждаются во многих природных аминокислотах, которые являются универсальными компонентами питания. Они целиком включаются в структуру клетки.
Из всех незаменимых аминокислот ключевая роль принадлежит глутамину, а также аргинину, который имеет принципиальное значение для обезвреживания токсичных метаболитов незаменимых аминокислот и аммиака.
Неорганические соли, входящие в состав ПС, удовлетворяют потребности микроорганизмов в ионах К+, Mg2+, Мп2+ , Fe2+ или Fe3+, Р043-, S042-. Они же определяют необходимое осмотическое давление среды, величину рН и буферную емкость.
В ПС необходимо также наличие некоторых других ионов, в частности, Zn2+ Cu2+ , Co2+ ,Ca2+, СL- и др. Обычно они присутствуют в достаточном количестве в виде примесей в питательных основах, минеральных компонентах среды или содержатся в водопроводной воде, используемой для приготовления ПС.
Функция необходимых микроорганизмам и клеткам ионов металлов заключается в том, что они служат активаторами и кофакторами
многих ферментов, кроме того, участвуют в регуляции синтеза белка, являются компонентами белковых комплексов.
Считается также, что в ПС должны присутствовать факторы роста, различные по химической природе соединения, главным образом, органические вещества (витамины, аминокислоты, жирные кислоты, пу-риновые и пиримидиновые основания), добавление которых в очень незначительных количествах стимулирует рост и размножение микроорганизмов.
К факторам роста относят витамины группы В, гемин (фактор X), путресцин, олеиновую кислоту, козимазу (фактор Y) и ее ферменты, пуриновые основания (аденин, гуанин, ксантин, гипоксантин) и пиримидиновые (цитозин, тиамин, урацил), гормоны и др.
Функции факторов роста разнообразны. Они участвуют в процессах обмена веществ. Отсутствие или недостаток их в среде приводит к бактериостатическому эффекту.

Выбор сырьевых источников для конструирования питательных сред
Другим наиболее важным принципом конструирования ПС является выбор сырьевых источников.
Качество ПС во многом определяется полноценностью состава питательных субстратов и исходного сырья, используемого для их приготовления. Большое разнообразие видов сырьевых источников ставит сложную задачу выбора наиболее перспективных, пригодных для конструирования ПС требуемого качества. Определяющую роль в данном вопросе играют, прежде всего, биохимические показатели состава сырья, от которых зависит выбор способа и режимов его переработки с целью наиболее полного и эффективного использования содержащихся в нем питательных веществ.
Для получения ПС с особо ценными свойствами применяют прежде всего традиционные источники белка животного происхождения, а именно мясо крупного рогатого скота (КРС), казеин, рыбу и продукты ее переработки. Наиболее полно разработаны и широко применяются ПС на основе мяса КРС.
Учитывая дефицит кильки каспийской, широко применяемой в недалеком прошлом, для получения рыбных питательных основ стала использоваться более дешевая и доступная непищевая продукция рыбной промышленности - сухой криль, отходы переработки мяса криля, филетированный минтай и его перезрелую икру. Наибольшее же распространение получила рыбная кормовая мука (РКМ), удовлетворяющая требованиям биологической ценности, доступности и относительной стандартности.
Довольно широкое распространение получили ПС на основе казеина, который содержит все компоненты, имеющиеся в молоке: жир, лактозу, витамины, ферменты и соли. Однако необходимо отметить, что в связи с удорожанием продуктов переработки молока, а также повышением спроса на казеин на мировом рынке, применение его носит несколько ограниченный характер.
Из непищевых источников белка животного происхождения в качестве сырья для конструирования полноценных ПС необходимо выделить кровь убойных животных, которая богата биологически активными веществами и микроэлементами и, кроме того, содержит продукты клеточного и тканевого обмена. Гидролизаты крови сельскохозяйственных животных используются в качестве заменителей пептона в дифференциально-диагностических питательных средах.
К другим видам белоксодержащего сырья животного происхождения, которые могут быть использованы для конструирования ПС, относятся: плацента и селезенка КРС, сухой белковый концентрат - продукт переработки мясных отходов, спилковая обрезь, получаемая при обработке кожи, эмбрионы домашних птиц - отход вакцинного производства, кровезаменители с истекшим сроком годности, творожная сыворотка, мягкие ткани моллюсков и ластоногих.
Перспективно использование тушек пушных зверей из зверо-хозяйств, крови КРС, получаемой на мясокомбинате, обезжиренного молока и молочной сыворотки (отходы маслозаводов).
В целом же ПС, приготовленные из сырья животного происхождения, имеют высокое содержание основных питательных компонентов, являются полноценными и сбалансированными по аминокислотному составу и достаточно хорошо изучены.
Из продуктов растительного происхождения в качестве белкового субстрата для ПС возможно использование кукурузы, сои, гороха, картофеля, люпина и др. Однако, растительное сельскохозяйственное сырье содержит белок, несбалансированный состав которого зависит от условий выращивания культур, а также липиды в больших количествах, чем продукты животного происхождения.
Обширную группу составляют ПС, изготавливаемые из белкового сырья микробного происхождения (дрожжи, бактерии и т.д.). Аминокислотный состав микроорганизмов, служащих субстратом для приготовления ПС, хорошо изучен, а биомасса используемых микроорганизмов является полноценной по составу питательных веществ и характеризуется повышенным содержанием лизина и треонина.
Разработан целый ряд ПС комбинированного состава из белковых субстратов различного происхождения. К ним относятся дрожжевая казеиновая питательная среда, дрожжевая мясная и т.д.
Основой большинства известных ПС являются гидролизаты казеина, мяса КРС и рыбы (до 80%). Удельный же вес непищевого сырья в технологии конструирования ПС составляет всего 15% и в дальнейшем требует увеличения.
Используемое для получения питательной основы (ПС) непищевое сырье должно удовлетворять определенным требованиям, а именно быть:
^ полноценным (количественный и качественный состав сырья должен, в основном, удовлетворять питательным потребностям микроорганизмов и клеток, для которых разрабатываются ПС);
^ доступным (иметь достаточно обширную сырьевую базу);
^ технологичным (затраты на внедрение в производство должны осуществляться с использованием имеющегося оборудования или существующей технологии);
^ экономичным (затраты на внедрение технологии при переходе на новое сырье и его переработку не должны превосходить нормы затрат для получения целевого продукта);
^ стандартным (иметь длительные сроки хранения без изменения физико-химических свойств и питательной ценности).
Дифференциация питательных сред по целевому назначению
Прежде чем приступить к разработке ПС, необходимо решить вопрос о предназначении будущей среды. Следовательно, дифференциация ПС по целевому назначению также является одним из основных принципов их конструирования.
В соответствии с этим принципом среды подразделяют:
на микробиологические (предназначенные для культивирования бактерий,
дрожжей, грибов);
среды для культур клеток, часть из которых относят также к вирусологическим средам.
По физическому состоянию ПС классифицируются на:
> жидкие
> жидкие концентрированные
> полужидкие
> твердые (плотные)
> сухие.
Жидкие среды лучше обогащать кислородом, в них легче изучить влияние на культуру различных факторов, определить бактериальную массу, образование веществ и побочных продуктов. Жидкие среды используют для проведения более точных исследований, их составом проще варьировать.
Полужидкие среды получают путем добавления к жидким концентрирующих примесей, например 0,5% агара, и используют, в частности, для культивирования анаэробных микроорганизмов или при диагностике вирусов в чувствительных тканевых культурах.
Для культивирования клеток широко применяются жидкие концентрированные среды, выпускаемые фирмами в виде 10-, 50- и 100-кратных концентратов.
К плотным ПС обычно относят агаризованные среды, но в качестве уплотняющих веществ могут использоваться желатина, силикагель, карбоксилметилцеллюлоза и другие. К ним можно отнести свернутую сыворотку, свернутый яичный белок, картофель, ломтики моркови, зерна, пшено, рис и отруби.
Плотные ПС, в отличие от жидких, более удобны в транспортировке. На них легче проводить микроскопическое изучение культур, легче выявить заражение посторонней микрофлорой и выделить чистую культуру из отдельных колоний. Кроме того, для хранения микроорганизмов, как правило, применяются именно плотные ПС. Однако, поскольку плотные среды получают, главным образом, включением в их состав агара, то вместе с ним могут быть внесены в качестве примесей различные катионы, питательные вещества и ростовые факторы в количестве, достаточном для проявления роста некоторых нежелательных культур.
Очень удобны в работе и перспективны в использовании сухие ПС. Они стандартны, хорошо хранятся и транспортируются, быстро растворяются в воде при комнатной температуре. Их широко используют для получения диагностических ПС. Дифференциация ПС проводится также по сложности. По этому признаку среда подразделяются на:
< простые, или обычные (пептонная вода, мясо-пептонный бульон, мясо-пептонный агар, питательная желатина и др.); их иногда называют универсальными;
< сложные, политропные, или специальные (кровяной агар, асци-тический агар и бульон, мясо-пептонный сахарный бульон, сывороточный агар и бульон, свернутая сыворотка, кровяной бульон).
По происхождению и природе составных элементов среды подразделяются на:
> естественные (натуральные, комплексные);
> полусинтетические;
> синтетические.
Натуральные ПС - это природные, комплексные органические среды неизвестного или неопределенного состава, которые включают ' продукты животного или растительного происхождения.
К ним относятся пептоны, кровь, отвары и экстракты, полученные из природных субстратов (мясо, рыба, навоз, почва, крупы), овощные или фруктовые соки, сусло, молоко, ткани и сыворотка животных, картофель, соевые бобы и др.
На натуральных средах хорошо развиваются многие микроорганизмы, т.к. в них имеются, как правило, все компоненты, необходимые для их роста и развития. Но они имеют сложный непостоянный химический состав, т.е. нестандартны, что является их очевидным недостатком. И поэтому мало пригодны для изучения физиологии обмена веществ микроорганизмов, т.к. не позволяют учесть потребление ряда компонентов среды и образование продуктов обмена по ходу развития.
Полусинтетические среды, кроме органических и неорганических веществ известного состава, содержат в незначительных количествах продукты природного происхождения. Эти ПС также отличаются нестандартностью (хотя и более стандартны, чем натуральные). Примером могут быть: картофельная среда с глюкозой, состав которой зависит от сорта и возраста картофеля; дрожжевая среда; мясо-пептонный бульон и др.
Синтетические ПС готовят из точно определённых количеств органических и неорганических химических соединений известного состава и воды. Преимущество синтетических сред постоянный состав и воспроизводимость. Однако, как правило, в них требуется вносить различные добавки, в частности факторы роста.
Следует отметить, что среды, содержащие агар, нельзя рассматривать как синтетические из-за сложности и недостаточной определённости состава агара.
Возможность менять состав среды в нужном направлении делает синтетические среды весьма пригодными для систематического изучения физиологии микроорганизмов путем широкого синтеза питательных веществ из определённых составных частей.
Отдельные штаммы одного и того же вида бактерий по-разному относятся к различным химическим соединениям, и в связи с этим он получил практическое приложение в вопросах дифференциации отдельных штаммов внутри групп.
По набору питательных веществ выделяют:
минимальные среды, которые содержат лишь источники питания, достаточные для роста;
богатые среды, в состав которых входят многие дополнительные вещества.
В зависимости от назначения ПС различают:
дифференциально-диагностические
элективные
селективные
ингибиторные
среды для поддержания культуры
накопительные (насыщения, обогащения)
консервирующие
контрольные.
Дифференциально-диагностические - это сложные среды, на которых микроорганизмы разных видов растут по-разному, в зависимости от биохимических свойств культуры. Они предназначены для идентификации видовой принадлежности микроорганизмов, широко используются в клинической бактериологии и проведении генетических исследований.
Селективные, ингибиторные и элективные ПС предназначены для выращивания строго определенного вида микроорганизма. Эти среды служат для выделения бактерий из смешанных популяций и дифференцирования их от сходных видов. В их состав добавляют различные вещества, подавляющие рост одних видов и не влияющие на рост других.
Например, для выделения грамотрицательных бактерий рода Brucella из зараженной почвы или навоза применяют питательный агар с добавлением некоторых антибиотиков и кристаллвиолета, которые подавляют большинство патогенных грибов и бактерий, но не влияют на рост бруцелл. В больших концентрациях хлорид натрия подавляет рост многих бактерий, но хорошо переносится стафилококками.
Для достижения избирательности употребляют также азид, цитрат, теллурит, лаурилсульфат и селенит натрия, йод и фенилэтанол. Для этих же целей используют натуральную желчь, очищенные желчные соли и их заменители.
Среду можно сделать селективной за счет величины рН. Примерами является среда Сабуро для культивирования дрожжей с низким рН, а также среды с рН от 8 до 9 для выделения холерного вибриона. В последнее время в качестве веществ, придающих средам селективный характер, применяют антимикробные агенты, такие как антибиотики и другие химиотерапевтические вещества.
Элективные ПС нашли широкое применение при выделении возбудителей кишечных инфекций. При добавлении малахитовой или бриллиантовой зелени, солей желчных кислот (в частности, таурохолево-кислого натрия), значительного количества хлорида натрия или лимоннокислых солей подавляется рост кишечной палочки, но рост патогенных бактерий кишечной группы не ухудшается. Некоторые элективные среды готовят с добавлением антибиотиков.
Среды для поддержания культуры составляют так, чтобы в них не было селективных веществ, способных вызывать изменчивость культур.
Накопительные ПС (обогащения, насыщения) это среды, на которых определенные виды культур или группы культур растут быстрее и интенсивнее сопутствующих. При культивировании на этих средах обычно не применяются ингибиторные вещества, а, наоборот, создают благоприятные условия для определенного присутствующего в смеси вида. Основой сред накопления являются желчь и ее соли, тетратионат натрия, различные красители, селенитовые соли, антибиотики и др.
Консервирующие среды служат для первичного посева и транспортировки исследуемого материала.
Выделяют также контрольные ПС, которые применяют для контроля стерильности и общей бактериальной обсемененности антибиотиков.
По масштабам использования ПС подразделяются на:
> производственные (технологические);
> среды для научных исследований с ограниченным по объему применением.
Производственные ПС должны быть доступными, экономичными, удобными в приготовлении и использовании для крупномасштабного культивирования. Среды для научных исследований, как правило, бывают синтетическими и богатыми по набору питательных веществ.
Прописи применяемых в настоящее время ПС очень многообразны. Особенно вариабельны по составу, как наиболее многокомпонентные системы, прописи для клеточных культур, которые могут включать более шестидесяти компонентов.
Оптимизация многокомпонентного состава питательной среды
Несмотря на наличие большого количества работ, посвященных вопросам питания микроорганизмов, не всегда с достоверной точностью удается определить количественные и качественные характеристики необходимых для развития и метаболизма клеток питательных веществ. Поэтому при конструировании новых ПС необходимо проведение широких исследований по выбору ПС и оптимизации качественных и количественных компонентов среды с целью получения наиболее желаемого результата при ее использовании.
Культивирование микроорганизмов неразрывно связано с целесообразностью выявления оптимальных условий ведения процесса. При этом приходится иметь дело с задачами определения оптимальных параметров процесса в зависимости от выбранного критерия оптимизации. Их решение связано с необходимостью максимизации продуктивности процесса по бактериальной массе и минимизации затрат.
Процессы культивирования микроорганизмов можно оптимизировать методами, которые разделяются на две группы.
К первой группе относятся методы оптимизации по экспериментальным данным. Они не требуют привлечения сложных математических расчетов, но связаны со значительными затратами времени, возникающими из-за необходимости проведения большого количества экспериментальных исследований.
Ко второй группе относятся методы с применением математических моделей.
В свою очередь последние подразделяются на две отличающиеся по сложности исполнения и точности описания реального процесса подгруппы.
К первой следует отнести методы, основанные на построении математической зависимости (уравнения регрессии) протекания ограниченных процессов с использованием традиционного метода планирования эксперимента Бокса-Уилсона. Он позволяет строить поисковые модели, когда исследователь, не располагая сведениями о механизме соблюдаемого явления, имеет лишь информацию о реакции системы на возмущение.
Ко второй подгруппе относятся методы, основанные на построении моделей, базисом которых являются законы, описывающие протекание фундаментальных процессов микробиологии (например, процесс размножения и отмирания микроорганизмов). В этом случае принимается за основу положение, что комплекс всех изменений, происходящих в культуральной жидкости (изменение содержания компонентов ПС, образование и расходование промежуточных продуктов биосинтеза, выделение метаболитов и катаболитов, трансформация органических соединений) - это следствие процессов самовоспроизведения, а также результат реакций, связанных с адаптацией и саморегуляцией микробной популяции.
Оптимизация процессов микробиологического синтеза, основанная на использовании методов второй подгруппы, является наиболее глубокой и точной, хотя и более трудоемка и длинна, т.к. требует основательного изучения законов протекания элементарного акта на лабораторном уровне с целью последующего создания математической модели в форме кинетических уравнений. На основе этой модели идет дальнейшая балансировка состава ПС, а также поиск оптимума основных режимов ведения процесса.
Задача оптимизации управляемого периодического процесса культивирования по максимизации бактериальной массы или целевого продукта в общем виде выглядит следующим образом: определяется наиболее рациональный состав исходной ПС, а затем профили изменения основных технологических параметров, обеспечивающих значение выбранного критерия эффективности при заданных ограничениях.
Важнейшим элементом оптимизации технологического процесса является выбор критерия эффективности. В качестве критериев используют такие показатели, как концентрация живых микробных клеток, съем целевого продукта с единицы объема среды и т.д. Обычно оптимизация процесса культивирования начинается с выбора ПС, обеспечивающей питательные потребности популяции микробов или синтез максимального количества продуктов метаболизма. Количество компонентов, входящих в ПС для выращивания микроорганизмов, может превышать десяток элементов. Биологической роли каждого элемента, влияющего в целом ряде случаев в микродозах на активность метаболических превращений в клетке, посвящено большое число исследований.
Сложность выбора определяется еще и тем, что на рост микроорганизмов влияет также взаимное соотношение компонентов.
Большое количество и взаимосвязь составляющих ПС ингредиентов обуславливает выбор методов экспериментального исследования. Обычно используемые методы однофакторного планирования в этих условиях малоэффективны. Использование же математических методов многофакторного планирования экспериментов позволяет установить необходимые концентрации компонентов питания с учетом их совместного влияния на скорость роста, качество биомассы и количество целевого продукта.
Обычную схему оптимизации ПС можно представить следующими этапами (схема.1).
Сбор предварительных данных о ПО и составе ПС



Выбор критерия оптимизации




Постановка эксперимента по матрице планирования




Получение обобщающей зависимости (модели)





Проверка адекватности модели и значимости коэффициентов




Оптимизация модели





Экспериментальная проверка расчетных концентраций компонентов среды





Получение прописи оптимальной ПС



Схема. 1. Схема оптимизации ПС.

Высоко объективным является и метод балансировки состава ПС, в основу которого заложено использование уравнения ассимиляции микробной популяции, где учитываются такие показатели:
> концентрация потребляемого субстрата;
> время потребления;
> концентрация биомассы;
> коэффициент метаболизма;
> константы скорости образования и отмирания микроорганизмов;
> концентрация субстрата в начальный момент культивирования.
Обычно при периодическом процессе культивирования большинство важных параметров, в том числе и концентрация питательных веществ в культуральной жидкости, изменяется в течение времени. Вместе с тем, профили их изменения не всегда близки к оптимальным. Поэтому при подборе ПС для периодического культивирования возникает противоречие между необходимостью внесения в нее достаточно большого количества субстратов и ингибирующим влиянием высоких концентраций одного или нескольких элементов питания на рост микробной клетки и(или) биосинтез целевого продукта. Снижение концентрации таких субстратов в исходной ПС с последующим их добавлением в ферментер, по определенной программе, позволяет исключить ингибирование процесса в начальной фазе роста и в то же время не допустить его лимитирования в последующий период размножения микробов.
Стандартизация питательных сред
Кроме оптимизированного состава, питательные среды, используемые в микробиологической практике для выполнения различных экспериментальных работ, а также для выпуска стабильных по своим свойствам биопрепаратов, должны быть стандартны.
Под стандартностью ПС принято понимать постоянство их состава по биохимическим показателям: аминокислотному, минеральному, жирнокислотному, углеводному составам, а также содержанию витаминов, углеводородов, антибиотиков и др. компонентов.
Многогранность и сложность проблемы стандартизации обуславливают необходимость использования комплексного подхода к решению данных задач, который предусматривает не только разработку требований к качеству сырья, материалов, полуфабрикатов, унификацию технологии оснастки оборудования, но также и разработку совокупности мероприятий, методов и средств, направленных на установление, обеспечение и поддержание необходимого уровня качества препарата на всех стадиях его изготовления и применения.
Большое значение для получения более стандартных ПС имеют разработки на использование в их производстве сухих питательных основ, готовых сухих ПС промышленного изготовления и сухих витаминсодержащих добавок.
Примером может служить технология изготовления сухого ферментативного гидролизата казеина неглубокой степени расщепления, который широко используется при конструировании многих ПС, а также сухой экстракт кормовых дрожжей.
Работы, направленные на повышение стандартности ПС, могут приводить к их удорожанию, но это считается оправданным, т.к. применение разнокачественных сред может приводить к срыву еще более дорогостоящего эксперимента, к появлению брака и к получению несопоставимых результатов.
Создание и развитие системы оценки стандартности состава и свойств ПС, оценка воспроизводимости технологии их приготовления являются как одними из основных принципов конструирования ПС, так и передовыми задачами развития микробиологии на современном этапе.
1.4. ПОДГОТОВКА БИОРЕАКТОРА К ПОСЕВУ
Современные биореакторы изготавливаются из нержавеющей стали и представляют собой довольно сложный аппарат, в который осуществляют закачку соответствующей для культивируемого микроба питательной cреды.
Реактор имеет рубашку для нагревания паром и охлаждения водой с соответствующей запорной фурнитурой. Внутри реактора имеется турбинная механическая или электромагнитная мешалка со скоростью 150-200 об/мин и трубка для подачи воздуха. На крышке реактора имеются отверстия для подающей и отводящей трубок, смотровое окно, окно для освещения и отверстие для вставления четырёх сифонов, служащих для внесения посевного материала, взятия проб, внесения пеногасителя, глюкозы и других питательных веществ, а при необходимости и факторов роста. Современные реакторы оснащены различными измерительными приборами.
Регулирование температуры осуществляется автоматически. Регистрация её, а также измерения рН осуществляется с помощью электронного потенциометра.
При первичной установке реакторов в цехах и при их последующей эксплуатации важной инженерно-технической проблемой является технологическая обвязка биореакторов трубопроводами. К комплексу наиболее важных проблем технологической обвязки относятся:
1. Стерилизация внутренней полости реактора текучим паром.
2. Подача стерильного воздуха во внутреннюю полость реактора при культивировании, либо при удалении готового продукта из неё на последующую обработку.
Решение этих проблем позволяет получать более стабильные результаты по стерильности и накоплению микробной массы при реакторном способе культивирования микроорганизмов.
1.5. ВЫРАЩИВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ В РЕАКТОРЕ И КОНТРОЛЬ ЗА ПРОЦЕССОМ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ
Рассмотрим примеры особенностей культивирования некоторых микроорганизмов с применением:
1. Активной аэрации микробных культур.
2. В покоящемся состоянии без применения механических мешалок (без аэрации).
3. В состоянии анаэробиоза.
Промышленное культивирование микроорганизмов с применением активной аэрации
Процесс осуществляют в реакторах объёмом от 0,01 до 100 м3, как правило, в асептических условиях. Пустой аппарат тщательно моют, проверяют герметичность стерильность и стерилизуют острым паром. Одновременно стерилизуют все коммуникации. Затем в реактор подают простерилизованную в УНСи охлажденную до 25-35°С питательную среду, вносят посевной материал в количестве 5-10% объёма питательной среды (0,2-0,4 млрд. живых микробных клеток в 1 мл по оптической концентрации), включают систему аэрации и перемешивающее устройство. Так, например, для листерий и сальмонелл скорость вращения механической мешалки составляет 150-180 об/мин, а культура микробов аэрируется подогретым до 37°С очищенным, стерильным воздухом с коэффициентом подачи 1,5 л воздуха на 1 л среды в одну минуту. Коэффициент заполнения реактора обычно 0,5-0,8.
Превышение этой величины может привести к значительному уносу пены с отходящим воздухом и нарушению асептических условий.
Температуру культивирования поддерживают путём подачи охлаждающей воды в рубашку и другие теплообменные устройства аппарата.
Оптимальная температура для разных микроорганизмов различна, обычно от 25 до 37°С.
Для регулирования рН культуральной жидкости в ходе культивирования добавляют соответствующие титрующие агенты (щёлочи, кислоты, раствор аммиака и др.). Продолжительность выращивания микроорганизмов в культиваторе 18-24 ч, спорообразующих - 40-48 ч и 200-250 ч - для актиномицетов и микроскопических грибов.
Процесс культивирования контролируют по показателям приборов - изменение температуры, рН, расход воздуха, частота вращения мешалки, а также путём периодического отбора проб (через 1-12 ч в зависимости от длительности процесса).
В отобранных пробах определяют содержание углеводов, общего и аммонийного азота, фосфора, биомассы, целевого продукта метаболизма, морфологию микробных клеток, наличие посторонней микрофлоры.
Технология культивирования микроорганизмов в покоящемся состоянии без аэрации
Некоторые микроорганизмы относятся к группе микроаэрофильных (возбудители бруцеллёза, лептоспироза, кампилобактериоза и др.), которые не требуют принудительной аэрации питательной среды, в которой они выращиваются.
Применяют баллонный и реакторный способы культивирования.
Баллонный способ, в частности для культивирования лептоспир, заключается в том, что микробные культуры лептоспир каждого серологического варианта выращиваются в 16-литровых стеклянных баллонах с 10-12 л сывороточной или альбуминно-сывороточной (производственной) средами при температуре 27-28°С в течение 5-7 суток.
При реакторном способе культивирование проводят в ферментерах, которые могут быть объединены в единую технологическую цепочку. Так, на Ставропольской биофабрике при культивировании лептоспир было смонтировано 54 реактора объёмом от 250 до 5000 л.

Технология промышленного культивирования анаэробных микроорганизмов
К анаэробным микроорганизмам относятся такие, которые способны жить и размножаться при отсутствии атмосферного кислорода.
В силу биологических особенностей анаэробов методы культивирования их в промышленности имеют свои особенности.
1. При культивировании анаэробных микроорганизмов нужно в реакторах создать условия полного вытеснения из питательной среды свободного кислорода. Это достигается путём заполнения анаэро(бо)статов газовой смесью водорода и двуокиси углерода, а остаточный кислород может быть удалён путём каталитического связывания с воздухом.
Анаэробные условия могут быть достигнуты также добавлением в среду восстанавливающих агентов, таких как цистина и сульфида натрия, аскорбиновой кислоты.
2. Степень анаэробиоза определяется окислительно-восстановительным потенциалом (Eh). Для этих целей в среду вводят окислительно-восстановительные индикаторы, чаще всего используют резазурин (диазорезоурин)-10-4 ч л -1, меняющий цвет от сине-розового до бесцветного. Бесцветное состояние достигается при Eh около 100 мВ и указывает на наличие анаэробных условий.
3. При культивировании анаэробов необходимо постоянно корректировать рН среды, поддерживая её в пределах 7,2-7,8. В процессе роста анаэробов рН среды очень быстро снижается в кислую сторону, что приводит к ингибированию их роста.

1.6. ПЕРИОДИЧЕСКИЕ И ХЕМОСТАТНЫЕ СИСТЕМЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ
При глубинном выращивании микроорганизмов их культуры могут находиться в периодических, или "закрытых", и хемостатных (непрерывных) - "открытых" системах.
Закрытой называют такую систему (культуру), когда хотя бы один из компонентов питательной среды или она вся не может ни поступать в систему, ни покидать её. В такой системе скорость роста микроорганизмов должна после ускорения стремиться к нулю из-за недостатка субстрата или из-за гибели микробных клеток вследствие накопления продуктов метаболизма. Следовательно, периодические культуры микроорганизмов находятся в неустойчивом состоянии.
Открытая (хемостатная) система - это система, когда все питательные компоненты могут поступать в реактор, в котором выращивается тот или иной микроорганизм, и удаляться из реактора в виде продуктов синтеза микроорганизмов (антибиотики, витамины, ферменты и т.д.) или биомасса самих микроорганизмов. При этом скорость поступления питательной среды в реактор и удаление из него продуктов синтеза или биомассы можно регулировать в нужной нам среде размножения микроорганизмов.
Периодическое культивирование микроорганизмов
В периодическом состоянии динамика роста и размножения микроорганизмов в жидкой питательной среде обладает рядом особенностей, общих для бактерий, актиномицетов, микроскопических грибов, микоплазм и других про- и эукариот. При индивидуальном развитии им свойственна высокая скорость размножения. Развитие происходит в виде последовательных фаз, характер и продолжительность которых зависят от физиологического состояния клеток, определяемого в свою очередь условиями разнообразных факторов среды, в которой развиваются популяция того или иного организма.
Другими словами, фазы роста микроорганизма отражают количественные и качественные изменения в их биомассе и окружающей среде.
В простой гомогенной периодической культуре микроорганизмов выделяют от 4 до 8, и даже до 16 фаз.
1. Исходная фаза (лаг-фаза или индукционный период) является фазой задержки роста, когда размножения микробных клеток не происходит. Эта фаза характеризуется отсутствием роста клеток. В этот период посевная культура приспосабливается к изменившимся внешним условиям и вырабатывает ферменты, необходимые для роста на данной питательной среде. В лаг-фазе в клетках культуры происходят значительные качественные изменения: возрастет количество нуклеиновых кислот, в первую очередь РНК, активизируются одни ферменты и синтезируются другие.
Продолжительность лаг-фазы зависит от следующих факторов:
- от состава питательной среды - если питательная среда по составу мало отличается от среды, на которой росла посевная культура, лаг-фаза может практически отсутствовать;
- от качества посевного материала ~ количества в нем жизнеспособных клеток, их возраста, способа хранения;
- от посевной дозы.
2. Период положительного ускорения роста. Длительность этого периода для большинства микроорганизмов составляет 2 часа, и она зависит от температуры, состава питательной среды, качества посевного материала. Многие авторы эти две фазы рассматривают вместе. Число клеток остаётся постоянным из-за отсутствия в этот период клеточного деления. Общее состояние микробных клеток характеризуется как состояние приспособления к питательной среде. В этот период усиливается синтез веществ, клеток, они увеличиваются в размере, в них образуется большое количество индуцибельных ферментов.
3. Фаза логарифмического (лог-фаза) или экспоненциального (показательного) роста. Она характеризуется постоянной и максимальной скоростью роста клеток. Рост микробов в эту фазу происходит в геометрической прогрессии.
Продолжительность этой фазы зависит:
- от запаса питательных веществ в среде;
- от условий аэрации;
- от перемешивания и др. факторов.
Для описания процессов роста микроорганизмов используют такие характеристики, как общая и удельная скорости роста биомассы (или числа клеток). Другой важной характеристикой роста культуры является время генерации, за которое биомасса культуры удваивается. Время генерации из разных культур микроорганизмов сильно различается. Наиболее быстрорастущие бактерии при благоприятных условиях генерации имеют период генерации - 20-25 мин.
Продолжительность генерации в лог-фазе у разных микроорганизмов не одинакова. Так, для сальмонелл она равна 20-30 мин., для стрептококков и стафилококков - 25-35 мин., для эшерихий - 15-17 мин.
На продолжительность генераций влияют температура, рН среды, состав среды и т. д.
Если на единицу объема растущей периодической культуры приходится а0 клеток - это число клеток, которое внесли в питательную среду с маточной культурой в момент to, то после п делений за время t число клеток будет Ао х 2n = Аt
Логарифмируя это выражение получим: lg Аt == lg Ао + п lg 2.
Количество клеток в момент to и t определяют подсчетом в камере Горяева с помощью автоматических счетчиков, используемых для подсчета форменных элементов крови типа Целлоскоп или Каултера, или спектро-фотометрически (турдиметрически или нефелометрически). Однако с помощью этих методов определяются как живые, так и мертвые клетки.
В некоторых случаях проводят подсчет только живых клеток. Для этого производят высев клеток на плотные питательные среды с последующим подсчетом числа колоний, образуемых жизнеспособными клетками.
Из приведенного уравнения можно рассчитать количество делений клеток и константу скорости деления (V) число клеточных делений в 1 час.

п == lgAt-lgAo,
lg2
V=п lgAt-lgAo
t lg2 (t,-to)
Рассмотрим конкретный пример. В питательную среду внесли 1000 (103) клеток. Через 10 часов культивирования в среде выявили 109 (1 миллиард) микробных клеток.
Константа скорости деления (число клеточных делений в час) равна:
Ig109 – lgl03 9-3 6
V- = = = 2.
0,3010x10 0,3010x10 3,010
Число клеточных делений равно:
IglO 9 - lglO3 9-3 6
п - == = = 20.
0,3010 0,3 0,3
Время, необходимое для одного клеточного деления (tn),или время генерации:
t 10
tn = = == 0,5 часа .
п 20

Эти данные используют при выборе производственных штаммов и для их объективной оценки. Рост периодической культуры можно проследить не только по числу клеток, но и по урожаю клеток. Под урожаем понимают разность между полученной и исходной массами бактерий. Массу выражают в граммах сухого вещества. Это имеет производственное значение, т.к. рост микробной клетки сопровождается не только делением клеток, но и увеличением размеров и массы одной конкретной особи между двумя делениями.
Обозначим первоначальную массу клеток Ао, а Аt - масса клеток через время t. Тогда урожай бактериальной массы А = аt -a0.
Еще одним важным производственным показателем характеристики штаммов бактерий является скорость экспоненциального роста. Для ее расчета используют показатель плотности бактериальной суспензии. Это связано с тем, что константа скорости роста и константа скорости деления клеток не равноценны, т.к. число и масса клеток не идентичные понятия и во время роста периодической культуры соотношение между этими двумя показателями изменяется.
Обозначим константу скорости роста - ц, начальную плотность суспензии бактерий через Хо (г/см3), а конечную Xt (г/см3), при этом начальное время to, а конечное время t1. Тогда константу скорости роста вычисляют по формуле:
lgX t-lgXo lgX t-lgXo
M = = .
Lg e(t1-t0) 0,43429 t
t- время культивирования, час; lg e == 0,43429.
Время удвоения клеточной массы td можно рассчитать по формуле:
td = ln 2 = 0,693
M M
ln - натуральные логарифмы при основании e, е = 2,71828.
С экономической точки зрения важным показателем процесса культивирования является показатель, называемый экономическим коэффициентом. Если обозначить его через букву Y, его можно рассчитать по формуле:

А
Y= __
S
где S - количество потребленного субстрата (г); А - сухая бакмасса (г).

Высокая скорость развития микроорганизмов сохраняется на всей экспоненциальной стадии. Однако эта зависимость наблюдается в течение ограниченного времени. По мере роста культуры в среде постепенно потребляются питательные вещества, накапливаются продукты обмена, затрудняется транспорт питательных веществ (в первую очередь кислорода) и метаболитов вследствие увеличения плотности популяции.
4. Фаза отрицательного ускорения. В эту фазу скорость размножения замедляется, а время генерации увеличивается. Наступление этой фазы обусловлено истощением питательной среды и накоплением в культуральной жидкости токсических веществ, которые начинают ингибировать развитие культуры. Кроме того, в эту фазу происходит наивысшее накопление микробной массы в единице объёма.
5. Стационарная фаза роста, или максимума, на протяжении которой численность микробной популяции не уменьшается. В эту фазу скорость размножения и отмирания клеток одинаковая. Концентрация живых клеток в эту фазу достигает максимума, и она называется М-концентрацией. В этой фазе сама биомасса микроорганизмов и продукты их биосинтеза обладают наибольшей биотехнологической ценностью.
6. Фаза отмирания микробной популяции. Любая микробная популяция, растущая в сосуде с несменяемой средой, вступает после фазы стационарного роста в стадию отмирания. По скорости отмирания вначале устанавливают фазу ускоренного отмирания (VI), затем фазу постоянной скорости отмирания (VII) и фазу замедленной скорости отмирания (VIII). Причинами отмирания микробной популяции являются истощение среды и накопление в ней большого количества токсических продуктов метаболизма. В период стадии отмирания общее количество биомассы уменьшается, что чаще всего происходит за счет аутолиза.
Продолжительность стадии отмирания у различных микроорганизмов не одинакова: у пневмококка она составляет 2-3 суток, у эшери-хий несколько месяцев. В этот период в культуре находят значительное уменьшение клеток. У них уменьшается биохимическая и антигенная активность.
Учитывая это для изготовления ряда биопрепаратов отбирают культуры микроорганизмов чаще всего в фазе отрицательного ускорения роста, или в начале стационарной фазы роста, когда концентрация живых микробных клеток приближается или равна М-концентрации.

Хемостатная культура, или метод непрерывного культивирования микроорганизмов
Хемостатная, или непрерывная, культура представляет собой прочную культуру тех или иных микроорганизмов. В таком случае возможность продления жизни микробной популяции поддерживается с помощью непрерывной подачи свежей среды и постоянного отбора микробной биомассы или образовавшихся продуктов метаболизма, т.е. можно культуру микроорганизма как бы зафиксировать в одной, например стационарной, фазе роста и получать нужные продукты обмена или биомассу во времени столько, сколько требуется. Таким образом, максимальная производительность в хемостатной культуре всегда выше, чем максимальная производительность в периодической культуре.
Нужно сказать, что до 50-х годов для культивирования микроорганизмов с целью их всестороннего изучения служила простая периодическая культура. Только с переходом к методу хемостатного культивирования обнаружился недостаток периодической культуры, которая не даёт полного представления обо всех изменениях, происходящих в клетке, и о влиянии внешних факторов на протекающие в ней процессы.
Развитие хемостатного культивирования открыло возможность управлять процессом, контролируя рост и поведение микроорганизмов, а при необходимости вмешиваться в этот процесс, изменяя скорость роста до задаваемых пределов путём воздействия на такую культуру внешними факторами. В настоящее время интерес к непрерывному культивированию растёт как в нашей стране, так и за рубежом. Однако, несмотря на преимущества хемостатных культур, в биологической промышленности при производстве вакцин они не получили ещё достаточного применения по следующим причинам:
1. Технические трудности, в первую очередь связанные с созданием асептических условий.
2. Не во всех случаях непрерывный процесс предпочтительнее периодического, поскольку при низкой удельной скорости роста биомассы периодический процесс по эффективности не уступает непрерывному и более выгоден, т. к. его проще осуществить.
3. Интенсивный биосинтез многих продуктов метаболизма происходит при медленном росте биомассы, поэтому в периодических процессах концентрация целевого продукта в культуральной жидкости обычно выше, чем в непрерывных, что существенно повышает эффективность стадий выделения и очистки продукта. Всё это свидетельствует о том, что периодические процессы в будущем будут применяться.
2. ОСОБЕННОСТИ БИОТЕХНОЛОГИИ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ВИРУСОВ
Вирусы являются облигатными внутриклеточными микроорганизмами, поэтому на искусственных питательных средах они не растут. Для культивирования вирусов используют 3 живые системы:
1. Восприимчивые животные.
2. Куриные эмбрионы.
3. Культуры клеток.
При лабораторном культивировании вирусов используют культуры клеток, растущие на поверхности стенок тех или других емкостей (матрасах).
В крупномасштабном производстве используют метод выращивания суспензионных клеточных культур. Этот метод впервые описал в 1953 г. Оуенс. Он показал способность клеток размножаться в жидкой среде в свободном суспендированном состоянии. Клетки перевиваемых линий могут длительно культивироваться во взвешенном состоянии. В таких условиях клетки размножаются, не прикрепляясь к стенкам культурального сосуда, благодаря постоянному перемешиванию среды. Перемешивание суспензионных культур проводят лопастными и магнитными мешалками, а также круговыми качалками.
В настоящее время указанная клеточная система широко используется в вирусологических исследованиях для накопления больших количеств вируссодержащего материала при изготовлении вакцин, т.к. при оптимальном режиме выращивания клетки в суспензиях быстро размножаются и дают более высокий «урожай», чем в стационарных культурах.
Суспензионные культуры готовят из однослойных клеточных культур. Клетки снимают со стекла с помощью растворов Версена и трипсина. Осадок клеток после центрифугирования ресуспендируют в свежей ростовой питательной среде. Приготовленную суспензию помещают в культуральные сосуды, реакторы, ферментеры и выращивают при постоянном и интенсивном перемешивании. Это делается для того, чтобы поддерживать клетки во взвешенном состоянии, препятствовать их осаждению и прикреплению к стенкам сосуда и в то же время не вызывать их механического повреждения. Способ суспензионного выращивания клеток в биологической промышленности стал применяться сравнительно недавно.
Даже за короткий срок получены впечатляющие результаты. Большие успехи достигнуты при получении суспензионных постоянных культур клеток ВНК-21 для выращивания вируса ящура, вируса бешенства клеток почки поросят JBRS-2 для размножения вируса ящура, вируса везикулярной болезни свиней и др.
Выращивание клеточных культур осуществляют в специальных реакторах емкостью 1000 и более литров при температуре 36-37° С, рН 7,4 и непрерывном перемешивании суспензии клеток при 300-350 об/мин.
Несмотря на достижения по выращиванию суспензионных клеточных культур, на многих предприятиях биологической промышленности чаще используются методы получения клеточных линий в состоянии покоя или роллерным (динамичным) способом.


ЛЕКЦИЯ 3.
Концентрирование и высушивание биопрепаратов
В культуральной жидкости после окончания процесса ферментации содержатся микроорганизмы, продукты их жизнедеятельности, остатки питательной среды, пеногаситель, растворимые и нерастворимые вещества. Целевым продуктом биосинтеза могут быть непосредственно сами микроорганизмы, либо их метаболиты, растворенные в культуральной жидкости или находящиеся внутри клеток микроорганизмов.
Почти во всех случаях для получения целевого продукта необходимо отделить взвешенную фазу - массу микроорганизмов от культуральной жидкости.
Культуральные жидкости обычно являются сложными смесями и содержат большое число компонентов, многие из которых обладают близкими физико-химическими свойствами.
Наряду с растворенными минеральными солями, углеводами, белками и другими органическими веществами культуральные жидкости содержат в значительном количестве полидисперсные коллоидные частицы и взвеси. Следовательно, они являются не только многокомпонентными растворами, но и суспензиями. Дисперсная фаза этих суспензий состоит из мицелия или клеток микроорганизмов, а также из твердых частиц, содержащихся во многих питательных средах - муки, хлопьев из кукурузного экстракта и т.п. Содержание микроорганизмов в культуральной жидкости, как правило, очень низкое. В 1 л содержится обычно 5-10 г сухой биомассы. Отделение такого количества взвешенной фазы-трудная технологическая задача, которую приходится решать путем концентрирования биомассы различными способами (флотирование, сепарирование, упаривание).
В производственных условиях приходится затрачивать значительное количество энергии на обработку больших объемов труднофильт-руемых суспензий.
Способы отделения клеточной биомассы микроорганизмов от культуральной жидкости можно разделить на:
- механические (отстаивание, фильтрование, центрифугирование)
- теплотехнические (сушка).
В зависимости от конечной цели выбирают различные сочетания этих способов. При выборе схемы концентрирования и извлечения биомассы проводят предварительную экономическую оценку выбранного способа с учетом товарной формы биопрепаратов, концентрации микроорганизмов в культуральной жидкости и др.
Большинство целевых продуктов микробиологического синтеза нестабильны и подвержены влиянию различных факторов. Белки, например, исключительно чувствительны к нагреванию, изменению рН среды, к многим физическим и химическим воздействиям.
Очень часто выделить целевой продукт с помощью одного метода практически невозможно. Поэтому применяют комбинацию нескольких методов.

1.МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ И КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ ПРОДУКТОВ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО СИНТЕЗА

При выборе метода выделения и концентрирования того или иного продукта микробиологического синтеза необходимо учитывать следующие факторы:
1. Физико-химические свойства культуральной жидкости.
2. Свойства выделяемого продукта (термолабильность, стойкость к различным химическим агентам и др.).
3. Требования к конечной форме продукта (степень чистоты и степень концентрирования).
4. Технологические и технико-экономические показатели (выход продукта, производительность оборудования, необходимость дальнейшей обработки и др.).
Все методы выделения продуктов микробиологического синтеза из культуральной жидкости делят на две группы:
1. Экстракция, ионный обмен, адсорбция, кристаллизация - если целевой продукт в растворе.
2. Осаждение, фильтрование, центрифугирование, сепарирование -если целевой продукт в виде твердой фазы.
Часто невозможно выделить целевой продукт с помощью одного метода, тогда применяют комбинацию нескольких методов и в процессе выделения переводят продукт из растворимой формы в нерастворимую (или наоборот). Как правило, при выделении растворенных веществ культуральную жидкость приходится подвергать предварительной обработке и очистке с помощью осаждения, фильтрования, центрифугирования, сепарирования и мембранных методов (электродиализ, ультра- и микрофильтрация).

1.1. ОСАЖДЕНИЕ
Осаждение (седиментация) - это процесс расслоения дисперсных систем под действием силы тяжести и отделение дисперсной фазы в виде осадка.
Простейший случай седиментации - отстаивание применяют в следующих случаях:
1. При диаметре частиц более 3 мкм, когда броуновское движение не оказывает существенного влияния на процесс отстаивания.
2. При выделении стабильных продуктов, когда фактор времени не имеет решающего значения.
3. При более низких, чем при других методах, затратах.
4. В особых случаях, когда необходимо разделить частицы на фракции по размеру или плотности на основании их различных скоростей осаждения.
5. Если необходимо предварительно разделить суспензию на две фракции - осадок и надосадочную жидкость, которые в дальнейшем можно обрабатывать на различном оборудовании.
Скорость осаждения биомассы из культуральной жидкости невелика и составляет порядка 10-6 – 10-7 м/с.
Для ускорения процесса осаждения применяют:
1. Коагулянты - вещества, переводящие взвешенные частицы в агрегатно-неустойчивое состояние.
2. Флокулянты - вещества, способствующие разрушению коллоидных структур и образованию крупных хлопьев.
В качестве коагулянтов применяют обычно желатин, рыбный клей, казеин, в качестве флокулятов - метилцеллюлозу, пектин, альгинат натрия и др.

1.2. ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ
Центрифугирование - это разделение неоднородных систем под воздействием поля центробежных сил.
Для центрифугирования применяют центрифуги различных конструкций.
Центрифуги, имеющие высокий фактор разделения и оснащенные тарельчатым барабаном называют сепараторами. В микробиологической промышленности сепараторы являются одним из самых распространенных типов центрифуг. Сепараторы позволяют сконцентрировать осадок до влажности 60-90%.
В последние годы появились специальные герметичные сепараторы, позволяющие вести процесс сепарирования в автоматизированном режиме, оптимально подобранном для специфических условий конкретных культуральных жидкостей.
Области применения центрифугирования:
1. Выделение биомассы из культуральной жидкости (дрожжи, бактерии, грибы).
2. Отделение различных целевых продуктов микробиологического синтеза (антибиотики, ферменты, витамины и др.), переведенных предварительно в твердую фазу.
3. Разделение эмульсий, образующихся при экстракции.
Недостатки центрифугирования:
1. Сложность конструкции, высокая энергоемкость и стоимость.
2. Сложность эксплуатации (ненадежность, вибрация, шум, необходимость периодической разборки и мойки).
3. Воздействие на клетку центробежной силы, нагрев, трудность герметизации и обеспечения асептических условий ведения процесса.
Главные достоинства центрифугирования и сепарирования - высокая производительность и высокая степень концентрирования - позволяют успешно конкурировать с другими способами выделения и концентрирования как в промышленных, так и в лабораторных условиях.

1.3. ФИЛЬТРОВАНИЕ
Фильтрование - это разделение твердой и жидкой фаз суспензии при пропускании ее через пористую перегородку.
Конечная цель фильтрования - получение твердой или жидкой фазы (когда одна из них является отходом), а также одновременное получение твердой и жидкой фаз.
Фильтрование - гидродинамический процесс, скорость которого прямо пропорциональна разности давлений, создаваемой по обеим сторонам фильтровальной перегородки и обратно пропорциональна сопротивлению, испытываемому жидкостью при ее движении через поры перегородки и слой образовавшегося осадка.
На процесс фильтрования влияет ряд факторов, которые можно разделить на две группы:
1. Макрофакторы - разность давлений, толщина слоя осадка, вязкость жидкой фазы и др. Эти факторы заведомо известны и контролируются с помощью приборов.
2. Микрофакторы - размер и форма частиц осадка и пор фильтровальной перегородки, толщина двойного электрического слоя на поверхности частиц и др. Эти факторы менее изучены и их характеризуют лишь косвенными методами. Именно микрофакторы оказывают решающее влияние на процесс фильтрования и затрудняют его масштабирование.
При фильтровании культуральной жидкости образуются большей частью студенистые хлопьевидные или мелкозернистые осадки, обладающие большим сопротивлением. Средняя скорость фильтрации при этом составляет всего 50 л/м2 в час.
Для увеличения скорости фильтрования обычно используют два приема:
1. Предварительная обработка суспензий.
2. Применение вспомогательных фильтровальных материалов. Предварительная обработка культуральной жидкости позволяет более полно перевести целевой продукт в жидкую или твердую фазу, обеспечить лучшее разделение фаз и получить продукт, годный для дальнейшей очистки и выделения. В результате предварительной обработки происходит коагуляция взвешенных частиц.
Наиболее распространены следующие способы предварительной обработки:
1. Кислотная коагуляция (применяется для выделения антибиотиков, стойких к низким рН).
2. Обработка электролитами.
3. Тепловая коагуляция (возможна в тех случаях, когда продукт стоек к нагреванию до 70-80°С).
4. Образование наполнителей при добавлении химических агентов. В качестве вспомогательных фильтровальных материалов используются фильтровальные порошки, которые вносят в фильтруемую жидкость как наполнители или предварительно наносят на рабочую поверхность фильтра в виде грунтового слоя.

1.4. ЭКСТРАКЦИЯ
Экстракция процесс разделения смеси твердых и жидких веществ с помощью избирательных (селективных) растворителей (экст-рагентов).
Физическая сущность экстракции состоит в переходе извлекаемого компонента их одной фазы (жидкой или твердой) в фазу жидкого экст-рагента при их взаимном соприкосновении. Экстрагируемые компоненты переходят из исходного раствора в растворитель вследствие разности концентраций, поэтому данный процесс относится к числу диффузионных.
Процесс экстракции проводится обычно в двухфазных системах:
«твердое тело-жидкость» или «жидкость-жидкость».
Область применения экстракции: выделение и очистка антибиотиков, витаминов и аминокислот.
Преимущества метода:
1. Низкие затраты.
2. Высокая скорость экстракционных процессов.
Недостаток метода: использование вредных, взрывоопасных органических растворителей.

1.5. ИОНООБМЕН
Ионообмен представляет собой сорбционный процесс.
Адсорбция - это процесс поглощения одного или нескольких компонентов целевого продукта из газовой смеси или раствора твердым веществом – адсорбентом.
Процессы адсорбции (как и другие процессы массопередачи) избирательны и обычно обратимы. Благодаря этому становится возможным выделение поглощенных веществ из адсорбента, т.е. проведение процесса десорбции,
Первые сорбционные методы выделения и очистки биологически активных веществ и антибиотиков были основаны на применении молекулярных сорбентов (активированные угли, окись алюминия и др.). Молекулярные сорбенты которые одинаково хорошо сорбируют выделяемое вещество и ряд примесей.
В настоящее время разработаны ионообменные сорбенты (иониты), которые характеризуются различной избирательностью и высокой специфичностью.
Иониты - это органические и неорганические вещества, практически нерастворимые в воде и обычных растворителях, которые содержат активные (ионогенные) группы с подвижными ионами, способные обменивать эти ионы на ионы электролитов при контакте с их растворами.
Наиболее перспективны синтетические ионообменные смолы (КУ-2, КБ-4, КБ-ЧП-2, КМД, АВ-17, ЭДЭ-10 и др.).
В зависимости от наличия ионогенных групп иониты можно разделить на 2 основных класса:
1. Ионообменные сорбенты, содержащие кислотные группы - катиониты (нерастворимые кислоты).
2. Ионообменные сорбенты, содержащие основные группы - анио-ниты (нерастворимые основания).
Иониты нашли широкое применение в технологии производства антибиотиков на этапе их сорбции из культуральной жидкости.

1.6. КРИСТАЛЛИЗАЦИЯ
Кристаллизация - это выделение твердой фазы в виде кристаллов, главным образом, из растворов и расплавов.
Кристаллизация антибиотиков и других биологически активных веществ основана на резком уменьшении их растворимости в результате изменения температуры раствора (обычно понижения, но иногда, например, в случае эритромицина - повышения) или перевода их в другую плохо растворимую химическую форму. Последнее достигается изменением рН раствора или добавлением соответствующего реагента, часто с одновременным снижением температуры.
Кристаллизация является не только способом получения антибиотиков в твердом виде, но и очень эффективным средством очистки от сопутствующих примесей, что является существенным преимуществом по сравнению с некоторыми другими методами разделения.
Метод кристаллизации нашел применение в технологии получения антибиотиков (тетрациклина, эритромицина и др.), витаминов, полисахаридов.

1.7. УПАРИВАНИЕ
Упаривание - это процесс концентрирования жидких растворов путем частичного удаления растворителя испарением при нагревании жидкости. В ряде случаев упаренный раствор подвергают последующей кристаллизации.
Концентрированные растворы и твердые вещества, получаемые в результате упаривания, легче и дешевле перерабатывать, хранить и транспортировать.
Обычно упаривание в производстве антибиотиков осуществляют при температуре 60-70°С под вакуумом, поэтому данный метод недопустим при переработке термолабильных биологически активных веществ.

2. МЕМБРАННЫЕ МЕТОДЫ РАЗДЕЛЕНИЯ
К мембранным методам разделения относятся:
1. Диализ и электродиализ.
2. Обратный осмос.
3. Микрофильтрация.
4. Ультрафильтрация.
В основе этих методов лежит явление осмоса - диффузии растворенных веществ через полупроницаемую перегородку, представляющую собой мембрану с большим количеством (до 10 10 -10 11 на 1 м2) мелких отверстий - пор, диаметр которых не превышает 0,5 мкм.
Под мембраной обычно принято понимать высокопористую или беспористую плоскую или трубчатую перегородку, оформленную из полимерных или неорганических материалов и способную эффективно разделять частицы различных видов (ионы, молекулы, макромолекулы и коллоидные частицы), находящиеся в смеси или растворе. Использование мембран позволяет создавать экономически высокоэффективные и малоотходные технологии.
Среди мембранных процессов особенно интенсивно развиваются баромембранные. Если обратный осмос изучен достаточно полно, то существенно в меньшей мере это касается микрофильтрации и тем более ультрафильтрации, несмотря на ее очевидную перспективность. Границы баромембранных методов разделения четко не определены, что, по видимому, принципиально невозможно, поскольку микро- и ультрафильтрация и обратный осмос в широких пределах перекрываются как в отношении их физико-химического описания, так и решаемых задач. Следовательно, приведенная классификация барометрических методов разделения в значительной мере условна. Тем не менее, каждый из указанных методов имеет свои характерные особенности, на основании которых предложено несколько их классификаций.
Микрофильтрация, в основном, является гидродинамическим процессом, близким к обычной фильтрации. Специфическая особенность микрофильтрации - использование мембран с диаметром пор от 0,1 до 10 мкм для отделения мелких частиц твердой фазы, в том числе микроорганизмов, в этом случае ее называют стерилизующей фильтрацией. Поэтому в отличие от процесса фильтрации при микрофильтрации явления диффузии (особенно при небольших размерах пор от 0,1 до 0,5 мкм) также играют определенную роль.
В основе ультрафильтрации лежит использование мембран с диаметром пор от 0,001 до 0,1 мкм. Ультрафильтрация применяется для разделения клеток и молекул.
Мембранные методы разделения, применительно к биологическим суспензиям, обладают рядом преимуществ.
1. Концентрирование и очистка осуществляются без изменения агрегатного состояния и фазовых превращений.
2. Перерабатываемый продукт не подвергается тепловым и химическим воздействиям.
3. Механическое и аэродинамическое воздействие на биологический материал незначительно.
4. Легко обеспечиваются герметичность и асептические условия.
5. Аппаратурное оформление компактно по конструкции, отсутствуют движущиеся детали.
6. Процесс не обладает высокой энергоемкостью, в большинстве случаев энергия затрачивается только на перекачивание растворов.
Механизм переноса атомов, молекул или ионов различных веществ через полупроницаемые мембраны может быть объяснен одной из следующих теорий.
Теория просеивания предполагает, что в полупроницаемой мембране существуют поры, размеры которых достаточны для того, чтобы пропускать растворитель, но слишком малы для того, чтобы пропускать молекулы или ионы растворенных веществ.
Теория молекулярной диффузии основана на неодинаковой растворимости и на различии коэффициента диффузии разделяемых компонентов в полимерных мембранах. Теория капиллярно-фильтрационной проницаемости основана на различии физико-химических свойств граничного слоя жидкости на поверхности мембраны и раствора в объеме.
Из предложенных теорий, получила распространение капиллярно-фильтрационная модель.
Основным рабочим органом мембранных аппаратов являются полупроницаемые мембраны. Мембраны должны обладать высокой разделительной способностью или селективностью, высокой удельной производительностью или проницаемостью, постоянством своих характеристик в процессе эксплуатации, химической стойкостью в разделяющей среде, механической прочностью, невысокой стоимостью. Селективность и проницаемость - это наиболее важные технологические характеристики мембран и аппарата в целом.
Селективность мембраны зависит от размера и формы молекул растворенного вещества. Следует иметь в виду, что практически во всех случаях существуют молекулы, задерживаемые мембраной лишь частично. Мембраны изготавливают из различных материалов: полимерных пленок, стекла, керамики, металлической фольги и т.п. Широкое распространение получили мембраны из полимерных пленок.
Полупроницаемые мембраны бывают пористые и непористые. Через непористые мембраны процесс осуществляется за счет молекулярной диффузии. Такие мембраны называются диффузионными и применяются для разделения компонентов с близкими свойствами. Пористые мембраны изготавливаются в основном из полимерных материалов и могут быть анизотропными и изотропными.
Пористые мембраны получают обычно путем удаления растворителей или вымыванием предварительно введенных добавок из растворов полимеров при их формировании. Полученные таким образом мембраны имеют тонкий 0,25-0,5 мкм поверхностный слой на микропористой подложке толщиной 100-250 мкм. Процесс мембранного разделения осуществляется в поверхностном активном слое, а подложка обеспечивает механическую прочность мембраны.
Широкое распространение получили ядерные мембраны, или нуклеопоры. Эти мембраны образуются облучением тонких полимерных пленок, заряженными альфа-частицами с последующим травлением пор химическими реагентами.
К основным достоинствам ядерных мембран относятся:
- правильная круглая форма пор;
- возможность получить мембраны с заранее заданными размерами и числом пор;
- одинаковый размер пор;
- химическая стойкость.
Ядерные мембраны изготавливают на основе покарбонатных пленок с диаметром пор от 0,1 до 8 мкм.
Наряду с полимерными известны мембраны с жесткой структурой:
металлические, из пористого стекла, керамики.
Металлические мембраны изготавливают выщелачиванием или возгонкой одного из компонентов сплава фольги. При этом получают высокопористые мембраны с порами одинакового размера - в пределах 5- 0,1 мкм.
Другой способ получения металлических мембран - спекание металлического порошка при высоких температурах методом порошковой металлургии.
Недостатки мембранных методов разделения:
1. Некоторые материалы, из которых изготавливаются мембраны, быстро изнашиваются.
2. Возникают определенные трудности при обработке растворов, содержащих твердую фазу.
Тем не менее, следует отметить перспективность применения мембранных методов разделения в технологии микробиологического синтеза.

ОСНОВНЫЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ СЕЛЕКТИВНОГО РАЗДЕЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ РАСТВОРОВ И СУСПЕНЗИЙ НА ПОРИСТЫХ МЕМБРАНАХ
К основным мембранным методам разделения жидких систем относятся обратный осмос, ультра- и микрофильтрация. Эти методы характеризуются такими общими чертами, как использование полупроницаемых, т.е. по-разному пропускающих разные компоненты растворов и суспензий, мембран, применение в качестве движущей силы процесса избыточного давления, способы борьбы с концентрационной поляризацией.
Деление указанных методов является в значительной степени условным и базируется, как правило, на размерах фильтруемых объектов и размерах пор соответствующих полупроницаемых мембран.
Более отчетливо следует разграничить методы ультра- и микрофильтрации по фазовым состояниям разделяемых систем (соответственно, растворы и суспензии), а методов ультрафильтрации и обратного осмоса по механизму проницаемости (вязкое течение и активированная диффузия).
Можно приблизительно определить, что обратноосмотические мембраны могут задерживать частицы размером более 1-10-4 мкм, т.е. гидратированные неорганические ионы, а ультрафильтрация наиболее эффективна для частиц размером более 1-10-3 мкм, т.е. ультрафильтра-ционные мембраны могут задерживать органические молекулы и ионы. Соответственно, микрофильтрация позволяет эффективно задерживать частицы от 5-10-2 до 10 мкм, те которые не осаждаются из растворов в поле гравитационных сил.
Тем не менее, четко определить границы применения различных мембранных методов не представляется возможным как из-за общности физических явлений, лежащих в основе данных методов, так и ввиду широкого спектра свойств и природы разделяемых баромембранными процессами веществ.

ФИЗИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ МИКРОФИЛЬТРАЦИИ
Разделение растворов и суспензий методом микрофильтрации основано на различии и эффективных гидродинамических размерах разделяемых молекул и частиц. Процесс разделения описывается в рамках различных теорий и механизмов полупроницаемости, учитывающих влияние физико-химических, гидродинамических и межмолекулярных факторов на прохождение частиц через мембраны.
Как правило, анализ и расчет процессов ультра- и микрофильтрации проводится с единых позиций. Такой подход правомерен, если учесть, что протекание этих процессов обычно сопровождается образованием слоя осадка на мембране, оказывающего основное сопротивление массопереносу. Образование этого осадка и его свойства могут быть описаны едиными зависимостями.
Поверхностные явления на границе мембрана-раствор, свойства раствора и растворенного вещества (для микрофильтрации - свойства диспергированных частиц) оказывают существенное влияние на процесс ультра- и микрофильтрации.
Объект применения микрофильтрации - как правило, коллоидные (дисперсные) системы, имеющие дисперсную среду («растворитель») и дисперсную фазу (частицы, взвешенные в растворителе). В разделении этих фаз часто и состоит задача проведения микрофильтрации жидкостей.
Важнейшую роль во всех процессах разделения мембранных играют адгезионные и электростатические взаимодействия частиц с поверхностью мембраны.
Биологические клеточные объекты представляют собой типичные лиофильные системы. Для них, в отличие от лиофобных систем, характерно сильное межмолекулярное взаимодействие вещества дисперсной фазы с дисперсной средой. Такое взаимодействие приводит к образованию сольватных гидратных (в случае, если дисперсионной средой является вода) оболочек из молекул дисперсионной среды вокруг частиц дисперсной фазы. Кроме этого, клетки микроорганизмов обладают зарядом (электрокинетический потенциал ЭКП), величина которого различна у разных микроорганизмов. Для одного и того же вида микроорганизмов величина заряда меняется в зависимости от условий среды и процессов, происходящих в самой клетке. Наличие у клеток заряда позволяет рассматривать биологические суспензии как растворы электролитов.


КОНЦЕНТРАЦИОННАЯ ПОЛЯРИЗАЦИЯ
При разделении растворов и суспензий с помощью полупроницаемых мембран, через мембрану преимущественно проходит растворитель. При этом концентрация растворенного вещества в пограничном слое у поверхности мембраны увеличивается. Повышение концентрации происходит до тех пор, пока под действием возникающего градиента концентраций растворенного вещества между поверхностью мембраны и объемом раствора не установится динамическое равновесие.
Явление образования у поверхности мембраны пограничного слоя, в котором концентрация растворенного вещества больше, чем в основном объеме раствора, получило название концентрационной поляризации. Влияние концентрационной поляризации на фильтрацию всегда отрицательно по следующим причинам:
- Снижается эффективное давление вследствие увеличения осмотического давления раствора, определяемого концентрацией именно в пограничном слое. Это приводит к снижению, как скорости процесса, так и селективности, сокращается срок службы мембран, который в значительной степени зависит от концентрации растворенного вещества.
- Концентрационная поляризация связана с образованием пограничного слоя, отделяющего поверхность мембраны от раствора в объеме. Толщина этого слоя в общем случае определяется гидродинамическими условиями в установке - интенсивностью перемешивания и скоростью движения потока. Профиль концентрации этого слоя зависит от режима движения раствора.
Различают два режима концентрационной поляризации:
- предгелевый, когда концентрация у поверхности мембраны Cw ниже концентрации гелеобразования Cg;
- режим гелевой поляризации, когда Cw==Cg, и на мембране образуется слой геля.
Образование геля на поверхности мембраны приводит к резкому падению проницаемости и росту задерживающей способности микрофильтрационных мембран. Однако существует предположение, что снижение проницаемости при концентрационной поляризации мембраны достигается не полной блокировкой ее пор слоем геля, а их модификацией гелем таким образом, что эффективные размеры всех пор уменьшаются на некоторую постоянную величину R. Образуется так называемая динамическая гелевая мембрана. При этом в уменьшенных порах мембраны реализуется классический капиллярно-фильтрационный механизм разделения.
Считается также, что для возникновения концентрационной поляризации размеры фильтруемых частиц должны обеспечивать «критическое» отношение размеров частицы и поры, характеризующее переход из предгелевого в гелевый режим концентрационной поляризации вследствие увеличения коэффициента задержания.
Для уменьшения вредного влияния концентрационной поляризации на процесс микрофильтрации используют различные способы: повышают температуру (вследствие чего снижается вязкость и увеличивается концентрация гелеобразования), применяют электрическое поле, употребляют высокие скорости тангенциального потока и пульсационные режимы фильтрации.

ВЛИЯНИЕ ВНЕШНИХ ФАКТОРОВ НА ХАРАКТЕРИСТИКИ РАЗДЕЛЕНИЯ
Выбор рабочего давления зависит от вида процесса, природы и концентрации разделяемого раствора, типа используемой мембраны, конструкции аппарата, гидравлического сопротивления и т. д. Для микрофильтрации рабочее давление составляет 0,03-0,1 МПа, и для каждого раствора определяется экспериментальным путем.
Увеличение рабочего давления приводит к увеличению скорости фильтрации до некоторых пределов, обусловленных тем, что увеличение давления приводит и к увеличению и уплотнению слоя геля на поверхности мембраны.
В результате воздействия высокого давления на мембраны могут наблюдаться значительные остаточные деформации: при снятии давления структура мембраны не возвращается в исходное состояние. Усадка структуры мембраны снижает проницательность и повышает селективность.
Анализ данных о влиянии температуры на селективность и проницаемость мембран при микрофильтрации показывает, что повышение температуры приводит к увеличению и проницаемости, и селективности. Это объясняется тем, что уменьшается вязкость пермеата, а также значительно снижается влияние концентрационной поляризации мембран.
При увеличении концентрации растворенных веществ в разделяемом растворе ухудшаются рабочие характеристики мембран - удельная производительность и селективность. При концентрировании повышается осмотическое давление раствора, а следовательно снижается эффективная движущая сила процесса разделения.


ЛЕКЦИЯ 4. ВАКЦИНЫ.

Вакцинация способствует формированию у реципиента иммунитета к патогенным микроорганизмам и тем самым защищает его от инфекции. В ответ на пероральное или парентеральное введение вакцины в организме хозяина вырабатываются антитела к патогенному микроорганизму, которые при последующей инфекции приводят к его инактивации (нейтрализации или гибели), блокируют его пролиферацию и не позволяют развиться заболеванию.
Эффект вакцинации открыл более 200 лет назад в 1796 г. врач Эдвард Дженнер. Он доказал экспериментально, что человек, перенесший коровью оспу, не очень тяжелую болезнь крупного рогатого скота, становится невосприимчивым к оспе натуральной. Натуральная оспа - высококонтагиозное заболевание с высокой смертностью: даже если больной не погибает, у него нередко возникают различные уродства, психические расстройства и слепота. Дженнер публично провел прививку коровьей оспы 8-летнему мальчику Джеймсу Фиппсу, использовав для этого экссудат из пустулы больной коровьей оспой, а затем через определенное время дважды инфицировал ребенка гноем из пустулы больного натуральной оспой. Все проявления заболевания ограничились покраснением в месте прививки, исчезнувшим через несколько дней.
Ранее такие инфекционные болезни, как туберкулез, оспа, холера, брюшной тиф, бубонная чума и полиомиелит, были настоящим бичом для человечества. С появлением вакцин, антибиотиков и внедрением мер профилактики эти эпиидемические болезни удалось взять под контроль. Однако защитные меры со временем становились неэффективными, и возникали новые вспышки заболеваний. В 1991 г. эпидемия холеры поразила Перу; в течение трех следующих лет было выявлено примерно 1 млн. заболевших, несколько тысяч из них умерли. К сожалению, против многих болезней человека и животных вакцин не существует. Сегодня во всем мире более 2 млрд. людей страдают заболеваниями, которые можно было бы предотвратить с помощью вакцинации. Вакцины могут оказаться полезными и для профилактики постоянно появляющихся «новых» болезней (например, СПИДа).
Как правило, современные вакцины создают на основе убитых (инактивированных) патогенных микроорганизмов либо живых, но невирулентных (аттенуированных) штаммов. Для этого штамм дикого типа выращивают в культуре, очищают, а затем инактивируют или модифицируют таким образом, чтобы он вызывал иммунный ответ, достаточно эффективный в отношении вирулентного штамма. Несмотря на значительные успехи в создании вакцин против таких заболеваний, как краснуха, дифтерия, коклюш, столбняк, оспа и полиомиелит, производство современных вакцин сталкивается с целым рядом ограничений:
Не все патогенные микроорганизмы удается культивировать, поэтому для многих заболеваний вакцины не созданы.
Для получения вирусов животных и человека необходима дорогостоящая культура животных клеток.
Титр вирусов животных и человека в культуре и скорость их размножения часто бывают очень низкими, что удорожает производство вакцин.
Необходимо строго соблюдать меры предосторожности, чтобы не допустить инфицирования персонала.
При нарушении производственного процесса в некоторые партии вакцины могут попасть живые или недостаточно ослабленные вирулентные микроорганизмы, что может привести к неумышленному распространению инфекции.
Аттенуированные штаммы могут ревертировать к исходному штамму, поэтому необходимо постоянно контролировать вирулентность.
Некоторые заболевания (например, СПИД) нельзя предупреждать с помощью традиционных вакцин.
Большинство современных вакцин имеют ограниченный срок годности и сохраняют активность только при пониженной температуре, что затрудняет их использование в развивающихся странах.
В последнее десятилетие, с развитием технологии рекомбинантных ДНК, появилась возможность создать новое поколение вакцин, не обладающих недостатками традиционных вакцин. Для их разработки применяют методы генной инженерии.
Патогенный микроорганизм модифицируют, делетируя гены, ответственные за вирулентность. Способность вызывать иммунный ответ при этом сохраняется. Такой микроорганизм можно безбоязненно использовать в качестве живой вакцины, поскольку выращивание в чистой культуре исключает возможность спонтанного восстановления целого гена.
Создают живые непатогенные системы переноса отдельных антигенных детерминант неродственного патогенного организма. Такая система переноса способствует развитию выраженного иммунного ответа на патогенный микроорганизм.
Если патогенные микроорганизмы не растут в культуре, можно изолировать, клонировать и экспрессировать в альтернативном хозяине (например, в Е. coli или линии клеток млекопитающих) гены тех белков, которые содержат основные антигенные детерминанты, и использовать эти белки как «субъединичные» вакцины (см. следующий раздел).
Некоторые патогенные микроорганизмы действуют опосредованно, вызывая развитие аутоиммунной реакции на инфицированные клетки организма-хозяина. Для таких заболеваний можно создать систему специфического уничтожения клеток-мишеней, сконструировав ген, кодирующий химерный белок, одна часть которого будет связываться с инфицированной клеткой, а другая - уничтожать ее. Эта система не является истинной вакциной, хотя она и действует только на инфицированные клетки, устраняя саму причину развития аутоиммунной реакции.
К вакцинам для животных предъявляются менее жесткие требования, поэтому первыми вакцинами, полученными с помощью технологии рекомбинантных ДНК, были вакцины против ящура, бешенства, дизентерии и диареи поросят. Создаются и другие вакцины для животных, а в скором времени появятся и рекомбинантные вакцины, предназначенные для человека .

Субъединичные вакцины
Как правило, вакцины содержат неповрежденные патогенные микроорганизмы, но при этом неживые или аттенуированные. Антитела, вырабатываемые в ответ на их введение, связываются с поверхностными белками патогенного организма и запускают иммунный ответ. В связи с этим возникает вопрос: должна ли вакцина содержать целые клетки или лишь какие-то специфические поверхностные компоненты? Что касается вирусов, то, как было показано, для выработки в организме-хозяине антител в ответ на вирусную инфекцию достаточно очищенных поверхностных белков вируса (белков капсида или внешней оболочки). Вакцины, содержащие лишь отдельные компоненты патогенного микроорганизма, называют «субъединичными»; для их разработки с успехом используется технология рекомбинантных ДНК.
Субъединичные вакцины имеют свои достоинства и недостатки. Достоинства состоят в том, что препарат, содержащий очищенный иммуногенный белок, стабилен и безопасен, его химические свойства известны, в нем отсутствуют дополнительные белки и нуклеиновые кислоты, которые могли бы вызывать нежелательные побочные эффекты в организме-хозяине. Недостатки заключаются в том, что очистка специфического белка стоит дорого, а конформация выделенного белка может отличаться от той, которую он имеет in situ (т. е. в составе вирусного капсида или оболочки), что может приводить к изменению его антигенных свойств. Решение о производстве субъединичной вакцины принимается с учетом всех имеющих отношение к делу биологических и экономических факторов.

Противогерпетические вакцины
Вирус простого герпеса (HSV, herpes simplex virus) вызывает инфекционные заболевания генерализованного или местного характера (тяжелые поражения глаз, энцефалит, урогенитальные инфекции и т. д.). Кроме того, он является онкогенным, поэтому вакцинация убитым или аттенуированным вирусом сопряжена с определенным риском развития рака. Для защиты от HSV-инфекции можно использовать неонкогенную субъединичную вакцину.
Для создания любой субъединичной вакцины прежде всего нужно идентифицировать те компоненты патогенного микроорганизма, которые индуцируют выработку антител. В случае HSV типа I (HSV-1) таким компонентом является гликопротеин D оболочки (gD). В ответ на введение этого гликопротеина мышам у них вырабатываются антитела, нейтрализующие интактный HSV. Ген gD HSV-1 был изолирован, клонирован в одном из экспрессируюших векторов в клетках млекопитающих и введен в яйцеклетки китайского хомячка (СНО), в которых в отличие от Е. coli происходит гликолизирование чужеродных белков. Полноразмерный ген gD кодирует белок, в норме связывающийся с мембраной клетки млекопитающего. Такой белок труднее очистить, чем растворимый, поэтому ген gD модифицировали, удалив ту его часть, которая кодирует С-концевой трансмембранный домен. Затем модифицированным геном трансформировали СНО-клетки, которые гликозилировали белковый продукт и секретировали его во внешнюю среду, поскольку он не мог встраиваться в клеточную мембрану. Лабораторные испытания показали, что антитела, вырабатываемые в ответ на введение модифицированного белка gD, эффективны в отношении как HSV-1, так и HSV-2.
Противоящурные вакцины
Вирус ящура (FMDV, foot-and-mouth disease virus) в высшей степени вирулентен и вызывает массовую гибель крупного рогатого скота и свиней. Для защиты от FMDV-инфекции используют вакцину, содержащую вирус, инактивированный формалином. В мире ежегодно производится примерно 1 млрд. доз этой вакцины.
Основной антигенной детерминантой, индуцирующей образование антител, является вирусный капсидный белок 1 (VP1, viral protein 1). Это более слабый антиген, чем интактные вирусные частицы, но все же он индуцирует образование антител и обеспечивает защиту животных от инфекции. Поэтому были предприняты попытки клонировать VPl-ген.
Геном FMDV представляет собой одноцепочечную РНК. Поэтому сначала синтезировали полноразмерную двухцепочечную кДНК длиной примерно 8000 п. н. Затем ее расщепили с помощью рестрицируюших эндонуклеаз и клонировали полученные фрагменты в экспрессирующем E.coli-векторе. Продукт кодирующей последовательности VPl-гена идентифицировали иммунологическими методами как часть слитого (химерного) белка, синтез которого контролируется системой pL-промоторcl-penpeccop. Белок состоит из 396 аминокислотных остатков, содержит часть молекулы репликазы бактериофага MS2 и полноразмерный VP1-белок FMDV, благодаря чему он и индуцирует выработку нейтрализующих FMDV антител.
Получить разрешение на применение вакцины, содержащей химерный белок, очень трудно, поэтому, вероятно, придется субклонировать VP1-последовательность в другом экспрессирующем векторе. Так или иначе, субъединичная вакцина против ящура скоро будет готова для проведения доклинических испытаний.

Противотуберкулезные вакцины
Туберкулез - системное инфекционное заболевание, широко распространенное во всем мире. Его возбудителем является бактерия Mycobacterium tuberculosis. Она инфицирует разные ткани и органы (чаще всего легкие) и приводит к гибели клеток. У пациентов наблюдаются лихорадка, потеря веса, а в отсутствие лечения заболевание заканчивается смертью. По оценкам, этим патогенным микроорганизмом инфицировано около 2 млрд. людей, а туберкулез ежегодно уносит примерно 3 млн. жизней. Последние 50 лет для лечения туберкулеза использовали антибиотики, но уже появилось множество устойчивых к ним штаммов М. tuberculosis, так что заболевание, казавшееся побежденным, вновь стало серьезной проблемой.
В настоящее время в ряде стран в качестве противотуберкулезной вакцины используют один из штаммов Mycobacterium bovis, бациллу КальметаГерена (BCG, bacillus Calmette-Guerin). Однако эффективность такого подхода вызывает сомнения по двум причинам: 1) живые BCG-клетки могут вызвать серьезное заболевание у лиц со сниженным иммунным статусом (например, у больных СПИДом); 2) лица, которым ввели BCG-вакцину, дают положительный ответ на обычную процедуру выявления вызывающих туберкулез бактерий, что не позволяет отличить их от больных туберкулезом. В связи с этим в некоторых странах, в том числе и в США, BCG-вакцина к использованию не разрешена. В попытках создания более безопасной и эффективной субъединичной противотуберкулезной вакцины были изучены иммуннопротективные свойства очищенных внеклеточных белков М. tuberculosis. Из жидкой бактериальной культуры выделили и очистили шесть основных из 100 секретируемых белков, и каждый из них по отдельности, а затем различные их комбинации использовали для иммунизации морских свинок. Животным вводили в виде аэрозоля примерно 200 живых клеток М. tuberculosis, что является для них весьма высокой дозой. Через 9-10 нед животных умерщвляли и исследовали их легкие и селезенку на предмет присутствия этой патогенной бактерии. При введении некоторых комбинаций очищенных белков потеря веса, поражение легких и селезенки и уровень смертности были такими же, как и при иммунизации живой BCG-вакциной. Теперь нужно провести сравнение эффективности белков М. tuberculosis, полученных с помощью технологии рекомбинантных ДНК, с эффективностью секреторных белков и разработать безопасную и эффективную вакцину для профилактики туберкулеза у человека.

Пептидные вакцины
Далее возникает следующий вопрос: может ли небольшой участок белковой молекулы (домен) служить эффективной субъединичной вакциной и индуцировать выработку антител? Интуитивно кажется, что те домены, которые доступны для антитела (т. е. те, которые находятся на поверхности вируса), обладают иммуногенными свойствами, а внутренние домены несущественны, если только они не влияют на конформацию иммуногенного домена. Если это предположение верно, то короткие пептиды. имитирующие эпитопы (антигенные детерминанты), можно использовать для создания вакцин.
Имея все это в виду, синтезировали химическими методами домены VP1 FMDV и проверили возможность создания на их основе пептидных вакцин. Каждый из пептидов, соответствующих аминокислотным остаткам 141160, 151160 и 200213 С-концевого участка VP1 и аминокислотным остаткам 924, 1732 и 2541 N-концевого участка, сшили по отдельности с инертным белком-переносчиком (гемоцианином моллюска фиссурелии), чтобы предотвратить их разрушение, и ввели морским свинкам. Синтез антител в количестве, достаточном для защиты животного от последующих FMDV-инфекций наблюдался только при введении пептида 141-160. Введение же целого VP1 или пептидов 9-24, 17-32 и 25-41 индуцировало синтез антител в меньших количествах.
Более длинный пептид, состоящий из аминокислотных остатков 141158 и 200213, которые были соединены двумя пролиновыми остатками, индуцировал эффективный синтез антител у морских свинок даже в том случае, когда он не был сшит с белком-носителем. Эта «двухпептидная» молекула оказалась эффективнее любого изолированного пептида и блокировала пролиферацию FMDV у крупного рогатого скота и морских свинок.
Эти результаты являются весьма многообещающими, однако количество (доза) пептидного материала, необходимого для индукции иммунного ответа, примерно в 1000 раз выше, чем в случае убитой FMDV-вакцины. Чтобы решить эту проблему, фрагмент ДНК, кодирующий пептид из аминокислотных остатков 142-160 VP1 FMDV, сшили с геном, кодирующим коровый белок гепатита В (HBcAg). При экспрессии этого химерного гена в Е. coli или культуре животных клеток его продукты белковые молекулы - в процессе самосборки образовывали стабильные «27нм-частицы», на поверхности которых находился пептид из VP1 FMDV. Эти частицы обладали высокой иммуногенностью. Таким образом, HBcAg можно использовать в качестве эффективной молекулы-носителя синтетических пептидов. Сравнение иммуногенности различных пептидных FMDV-вакцин, содержащих домен 142-160 VP1-белка, проведенное на морских свинках, показало, что иммуногенность химерного белка, состоящего из HBcAg и указанного домена, в 10 раз ниже, чем у инактивированных FMDV-частиц, в 35 раз выше, чем у химерного белка, содержащего (-галактозидазу Е. coli и домен 137-162 из VP1 FMDV, и в 500 раз выше, чем у свободного синтетического пептида, состоящего из аминокислотных остатков 142-160. Поскольку синтетический пептид, сшитый с HBcAg, образует 27нм-частицы, сходные с вирусом гепатита В, и они обладают почти такой же иммуногенностью, как и интактный вирус, на основе которого получен синтетический пептид, этот подход может стать основным способом доставки пептидных вакцин к месту их действия.
И все же существует несколько ограничений на использование коротких пептидов в качестве вакцин.
Эпитоп, использующийся для создания эффективной пептидной вакцины, должен представлять собой короткий, но непрерывный участок белковой молекулы, а это бывает не всегда.
Конформация пептида должна быть такой же, как у эпитопа в интактной вирусной частице.
Изолированный эпитоп может не обладать достаточной иммуногенностью. В будущем синтетические пептидные вакцины могут стать высокоспецифичной, относительно недорогой, безопасной и эффективной альтернативой традиционным вакцинам, хотя для этого необходимо провести еще немало исследований.

Генная иммунизация
Новый подход, позволяющий индуцировать у организма иммунный ответ без введения антигена, основан на включении в клетки животного-мишени гена, кодирующего белок-антиген. В первых экспериментах такого рода Е. coli-плазмиду, содержащую клонированный ген белка-антигена, транскрипция которого находилась под контролем промотора вируса животных, конъюгировали с микрочастицами золота и бомбардировали ими клетки уха мыши. Впоследствии выяснилось, что клонированную кДНК можно вводить в клетки и с помощью внутримышечной инъекции раствора с большим количеством плазмиды, несущей соответствующую ДНК. Для этого необходимо в 103-104 раз больше ДНК, чем при бомбардировке микрочастицами. В одном из экспериментов более чем в 75% случаев ген включался в клетки мыши, и синтезированный белок-антиген индуцировал синтез антител. Этот подход позволяет избежать очистки антигена, что требует много времени и средств, или использования для создания вакцины технологии рекомбинантных ДНК. Кроме того, получаемые с его помощью белки с большей вероятностью подвергаются правильной посттрансляционной модификации, чем белки, синтезируемые организмами-хозяевами. Этот метод, получивший название генной иммунизации, можно использовать для вакцинации домашних животных.
Перспективы генной иммунизации были тщательно изучены. В одной из серий экспериментов мышам в квадрицепсы обеих задних конечностей вводили раствор с Е. соli-плазмидой, несущей кДНК нуклеопротеина вируса гриппа А, транскрипция которой находилась под контролем промотора вируса саркомы Рауса или цитомегаловируса. Хотя уровень экспрессии гена нуклеопротеина был настолько низок, что не поддавался регистрации, через 2 нед после иммунизации в крови мышей обнаруживались антитела к нему. Выживаемость иммунизированных мышей оказалась значительно выше, чем мышей из контрольной группы. Более того, они были нечувствительны и к другому штамму вируса гриппа. Такая перекрестная защита не вырабатывается при введении традиционных противогриппозных вакцин, полученных на основе поверхностных антигенов вируса, и поэтому каждая вакцина специфична лишь к одному штамму вируса. Более того, традиционные вакцины сохраняют свою эффективность только до тех пор, пока остаются неизмененными поверхностные антигены. К сожалению, для генов поверхностных антигенов характерна высокая частота мутаций, что приводит к появлению существенно различающихся штаммов вируса. Коровые же белки, такие как нуклепротеин, относительно стабильны и активируют иммунную систему по другому механизму, чем поверхностные антигены.
ДНК-иммунизация позволяет не только избежать очистки белковых антигенов, но и индуцировать иммунный ответ, направленный именно на кодируемый плазмидой белок, а не на саму плазмиду. Поэтому один и тот же вектор можно использовать для доставки разных белков или для многократного введения одного и того же гена.
Судьба введенной в клетку ДНК точно неизвестна. В принципе она может интегрировать в геном хозяина с весьма серьезными последствиями, если при этом затрагивается какой-то важный ген или происходит злокачественная трансформация клетки. Однако такое развитие событий считается крайне маловероятным. Скорее всего такая ДНК какое-то время просуществует в клетке в виде нереплицируюшегося внехромосомного элемента, а затем разрушится. Генную иммунизацию пока используют для выработки иммунитета к некоторым патогенным микроорганизмам (вирусу гриппа А, вирусу иммунодефицита человека типа I, вирусу бычьего герпеса, вирусу бешенства, Plasmodium sp., вызывающему малярию, вирусу гепатита В) у животных, но не у человека.
Для облегчения доставки ДНК в клетки животных при проведении генной иммунизации был создан модифицированный штамм Shigella flexneri. Эта бактерия проникает в эпителиальные клетки животных путем фагоцитоза, и присутствующая в ней плазмидная ДНК попадает в цитоплазму клетки-хозяина, где и происходят транскрипция и трансляция переносимого ею гена, находящегося под контролем эукариотического промотора. Shigella это патогенный микроорганизм, и как таковой он не может использоваться для доставки ДНК. Ее непатогенный штамм можно получить, введя делецию в ген asd, кодирующий фермент аспартат-(-полу-альдегиддегидрогеназу, который участвует в синтезе компонента клеточной стенки диаминопимелиновой кислоты. Штаммы с мутацией в asd-гене растут только в присутствии диаминопимелиновой кислоты и их можно использовать для доставки плазмидной ДНК в эпителиальные клетки животных, поскольку они в них не пролиферируют.
Эксперименты, в которых в качестве вектора для доставки ДНК в клетки использовались Shigella, были проведены на морских свинках, и хотя они оказались успешными, судить о безопасности данной системы можно будет лишь после проведения клинических испытаний. Огромным преимуществом этого подхода является возможность перорального введения вакцин.

Аттенуированные вакцины
В некоторых случаях в качестве живых вакцин можно использовать генетически модифицированные (рекомбинантные) микроорганизмы (бактерии или вирусы). Такие вакцины содержат либо непатогенные микроорганизмы, синтезирующие антигенные детерминанты определенного патогенного агента, либо штаммы патогенных микроорганизмов, у которых модифицированы или делетированы гены вирулентности. В этих случаях основные антигенные детерминанты являются составными компонентами бактерериальных или вирусных частиц и имеют такую же конформацию, какую они принимают в болезнетворном микроорганизме. Изолированным антиген часто утрачивает исходную конформацию и вызывает лишь слабый иммунный ответ.
Иммунизация с помощью пептида, синтезированного исходя из данных о нуклеотидной последовательности РНК вируса ящура
Начиная с первой вакцины, созданной Дженнером более 200 лет назад, большинство человеческих противовирусных вакцин содержали убитые или аттенуированные патогенные вирусы или сходные с ними непатогенные штаммы. Этот подход достаточно эффективен и предотвращает распространение ряда вирусных инфекций, однако его применение ограничено по ряду причин: не все вирусы могут расти в культуре, что не позволяет создавать вакцины против них; производство традиционных вакцин дорогостояшая и потенциально опасная процедура; не все вирусные заболевания можно предотвратить с помощью традиционных вакцин. С развитием молекулярной биотехнологии во многих лабораториях были предприняты попытки создания более безопасных и эффективных и в то же время менее дорогих вакцин, не имеющих ограничений в применении. Введение вакцины индуцирует выработку антител к антигенным детерминантам, в норме присутствующим на поверхности вирусной частицы, поэтому разумно было предположить, что аналогичный иммунный ответ могут вызвать короткие синтетические пептиды с такой же аминокислотной последовательностью, как у вирусной антигенной детерминанты. Конечно, такой подход применим лишь в том случае, когда антигенная область представляет собой короткий, но непрерывный домен.
Биттл и др. выделили и охарактеризовали РНК вируса яшура и определили аминокислотную последовательность основного вирусного белка VP1. Проведя соответствующие эксперименты, они пришли к выводу, что его антигенные детерминанты находятся на N- или С-конце белковой молекулы. Определив их аминокислотные последовательности, они синтезировали серию пептидов, которые сшили с белками-переносчиками и ввели кроликам. В ответ на иммунизацию С-концевыми пептидами VPI у кроликов и морских свинок вырабатывались антитела, защищающие их от инфекции интактным вирусом яшура. Эта работа показала, что для индукции синтеза антител, нейтрализующих интактные вирусные частицы, достаточно одного (или нескольких) домена (доменов) специфического вирусного белка, и, следовательно, можно создавать вакцины нового типа, не содержащие патогенных вирусов.

Противохолерные вакцины
Живые вакцины, как правило, гораздо более эффективны, чем неживые или субъединичные. Основное требование, предъявляемое к ним, отсутствие в инокуляционном материале вирулентных микроорганизмов. Это требование учитывалось и при создании живой противохолерной вакцины. Холера быстро развивающаяся кишечная инфекция, характеризующаяся лихорадкой, диареей, болью в животе, дегидратацией; передается через питьевую воду, загрязненную фекалиями. В развивающихся странах, где системы очистки воды и удаления сточных вод недостаточно развиты, угроза холеры вполне реальна. Возбудителем холеры является Vibrio cholerae. Бактерия размножается в тонком кишечнике и выделяет в большом количестве энтеротоксин, который и ответствен за патогенный эффект. Энтеротоксин - это гексамерный белок: он состоит из одной субъединицы А, которая обладает ADP-рибозилирующей активностью и стимулирует аденилатциклазу, и пяти субъединиц В, которые специфически связываются с клеточным рецептором слизистой кишечника. Субъединица А имеет два функциональных домена: А1, обладающий токсической активностью, и А2, отвечающий за ее связывание с субъединицами В. В настоящее время используется противохолерная вакцина, содержащая убитые фенолом холерные вибрионы; она обеспечивает только частичную защиту от инфекции и лишь в течение 36 мес. Поэтому были предприняты попытки создать другие типы противохолерной вакцины.
Как показали проведенные ранее исследования, субъединичная вакцина, содержащая инактивированный холерный энтеротоксин, не приводит к выработке полноценного иммунитета.
Поскольку V. cholerae колонизирует слизистую кишечника, разумно было предположить, что наиболее эффективной будет пероральная противохолерная вакцина. Имея это в виду, создали штамм V. cholerae, из генома которого была делетирована часть кодирующей А1-пептид нуклеотидной последовательности. Этот штамм не синтезирует энтеротоксин, а потому не является патогенным и подходит для создания живой вакцины.
Эксперимент состоял в следующем. В ген А1-пептида V. cholerae был встроен ген устойчивости к тетрациклину. При этом прерывалась рамка считывания для А1-пептида, но штамм становился устойчивым к тетрациклину. Его нельзя было использовать в качестве вакцины и потому, что со временем происходила спонтанная утрата тетрациклинового гена, и синтез энтеротоксина восстанавливался. Чтобы обойти эту проблему, создали штамм с дефектной нуклеотидной последовательностью, кодирующей А1-пептид, которая не могла восстанавливаться. Для этого использовали следующий подход.
1. Плазмиду, которая содержала сегмент ДНК, кодирующий Aj-пептид, обработали рестрицирующими эндонуклеазами ClaI и XbaI, каждая из которых расщепляла только кодирующую А1-пептид последовательность вставки.
2. Чтобы замкнуть плазмиду в кольцо, к ClaI-сайту пришили XbaI-линкер и обработали плазмиду рестриктазой XbaI.
3. С помощью ДНК-лигазы фага Т4 соединили XbaI-сайты плазмиды. В результате из середины кодирующей А1-пептид последовательности оказался удаленным сегмент длиной 550 п. н., соответствующий аминокислотным остаткам 183-194.
4. С помощью конъюгации перенесли эту плазмиду в штамм V. cholerae, несущий ген устойчивости к тетрациклину в локусе, кодирующем A 1-пептид.
5. В результате рекомбинации между оставшейся в составе плазмиды частью последовательности, кодирующей А1-пептид, и геном А-пептида, прерванным Теtг-геном, кодирующая А1 -пептид последовательность в хромосоме была замещена гомологичным плазмидным сегментом с делецией.
6. Внехромосомная плазмида не могла долго существовать в холерном вибрионе и через несколько поколений была утрачена.
7. Отобрали клетки с интегрированной дефектной А1-кодирующей последовательностью, используя их чувствительность к тетрациклину.
Полученный таким способом стабильный штамм с делегированной кодирующей А1-пептид последовательностью не синтезировал активный энтеротоксин и при этом сохранял нее остальные биохимические свойства патогенной формы V. cholerae. Проводимые в настоящее время клинические испытания эффективности этой формы как противохолерной вакцины пока не дали однозначного результата. Вакцина обеспечивает почти 90%-ную защиту от холеры, но у некоторых испытуемых наблюдаются побочные эффекты. Возможно, понадобится изменить другой хромосомный локус этого штамма, чтобы можно было использовать его как вакцину.

Противосальмонеллезные вакцины
Другой способ получения непатогенных штаммов, пригодных для создания на их основе живых вакцин, состоит в удалении из генома патогенных бактерий хромосомных областей, отвечающих за независимые жизненноважные функции. При этом лучше делегировать по крайней мере две такие области, поскольку вероятность их одновременного восстановления очень мала. Предполагается, что штамм с двойной делецией будет обладать ограниченной пролиферативной способностью и сниженной патогенностью, но обеспечит выработку иммунного ответа.
Разные штаммы Salmonella вызывают острые кишечные инфекции, постнатальную инфекцию, брюшной тиф, пищевую токсикоинфекцию. Для профилактики всех этих заболеваний совершенно необходимо иметь эффективную вакцину. Чтобы получить аттенуированные штаммы Salmonella, вносили делении в гены arо, кодирующие ферменты биосинтеза ароматических соединений, и в гены риr, кодирующие ферменты метаболизма пуринов. Такие штаммы двойной делецией вызывают легкую форму инфекции и обладают в 106 раз меньшей вирулентностью. На их основе уже созданы эффективные пероральные вакцины для мышей, овец, крупного рогатого скота, цыплят, а совсем недавно и для человека.

Противолейшманиозные вакцины
Простейшие паразиты Leishmania тоже могут вызывать у человека развитие иммунного ответа, однако создание эффективных вакцин против них представляет собой нелегкую задачу. С этой целью можно использовать аттенуированные линии Leishmania, но они часто ревертируют и становятся вирулентными, а кроме того, могут длительное время бессимптомно перси-стировать в организме человека резервуаре инфекции и передаваться другим людям. Чтобы решить эти проблемы, попытались создать аттенуированную неревертирующую линию Leishmania с помощью делеции одного из важных для метаболизма генов (например, гена дигидрофолатредуктазытимидилатсинтазы). У одного из таких паразитов, Leishmania major Е10-5АЗ, два гена дигидрофолатредуктазытимидилатсинтазы были заменены генами устойчивости к антибиотикам G-418 и гигромицину. В отличие от паразитов дикого типа, при выращивании L. major E10-5A3 в обычной культуре или в культуре макрофагов в среду необходимо добавлять тимидин. В организме мышей BALB/c паразиты оставались жизнеспособными в течение нескольких дней, что достаточно для создания стойкого иммунитета у животных, но недостаточно для развития заболевания. Ни персистирующая инфекция, ни заболевание не возникали даже у наиболее чувствительных видов мышей, так что данная линия вполне подходит для создания вакцины. Проведя дополнительные эксперименты на животных, можно будет проверить ее эффективность при иммунизации человека.

«Векторные» вакцины
Противовирусные вакцины.
В качестве эффективной живой противооспенной вакцины широко используют вирус коровьей оспы (ВКО), относящийся к роду поксвирусов. Геном этого вируса полностью секвенирован; он представляет собой двухцепочечную ДНК длиной 187т.п.н., кодирующую примерно 200 разных белков. ДНК ВКО реплицируется в цитоплазме инфицированных клеток, а не в ядре, благодаря наличию у вируса генов ДНК-полимеразы, РНК-полимеразы и ферментов, осуществляющих кэпирование, метилирование и полиаденилирование мРНК. Поэтому, если в геном ВКО встроить чужеродный ген, так чтобы он находился под контролем ВКО-промотора, то он будет экспрессироваться независимо от регуляторных и ферментных систем хозяина.
ВКО имеет широкий спектр хозяев (позвоночных и беспозвоночных), остается жизнеспособным в течение многих лет после лиофилизации (испарения воды с помощью замораживания) и не обладает онкогенными свойствами, а потому может использоваться для создания так называемых векторных вакцин. С их помощью осуществляется доставка и экспрессия в организме-хозяине клонированных генов, кодирующих антигенные белки, которые индуцируют выработку протективных антител. Геном ВКО имеет большие размеры и не содержит уникальных сайтов рестрикции, что не позволяет встраивать в него дополнительные нуклеотидные последовательности. Однако нужные гены можно вводить в геном ВКО с помощью гомологичной рекомбинации in vivo следующим образом.
1. Сегмент ДНК, кодирующий специфичный антиген (например, HBcAg), встраивают в плазмидный вектор непосредственно после клонированного ВКО-промотора, включенного в какой-либо несущественный ген ВКО, например ген тимидинкиназы.
2. Этой плазмидой трансформируют культуру дефектных по тимидинкиназе животных клеток, обычно фибробластов куриного эмбриона, предварительно инфицированных ВКО дикого типа, который синтезирует функциональную тимидинкиназу.
3.В результате рекомбинации между нуклеотидными последовательностями, фланкирующими промотор и ген протективного антигена, и гомологичными последовательностями вирусного генома происходит встраивание клонированного гена в вирусную ДНК. Частота таких рекомбинаций невысока, однако популяцию клеток, содержащих рекомбинантный ВКО, можно обогатить, используя селективную среду с бромдезоксиуридином. Этот токсичный аналог тимидина в отсутствие тимидинкиназы не включается в синтезируемую ДНК и не оказывает токсического действия. Дефектные по тимидинкиназе клетки-хозяева, которые содержат обычный ВКО, в присутствии бромдезоксиуридина погибают, а клетки, несущие рекомбинантный ВКО с разрывом в гене тимидинкиназы, становятся устойчивыми к его токсическому действию.
4. Проводят окончательный отбор с помощью ДНК-зонда, гибридизующегося с геном антигенного белка.
Поскольку дефектные по тимидинкиназе ВКО спонтанно возникают с относительно высокой частотой (примерно 1 на 103104 вирусных частиц), нередко проводят котрансфекцию клеток каким-либо селективным маркером и нужным геном. Это облегчает разграничение спонтанных мутантов и мутантов, полученных с помощью гомологичной рекомбинации. В качестве селективного маркера обычно используют ген пео, кодирующий фермент неомицин-фосфотрансферазу II и обеспечивающий устойчивость к аналогу канамицина G-418. Этот ген, в отличие от других селективных маркеров, остается стабильным при встраивании в геном ВКО.
Разработана специальная система, позволяющая избежать прерывания рамки считывания генов ВКО при встраивании чужеродного гена. При этом отпадает необходимость в использовании селективных маркеров, поскольку каждый образующий бляшку рекомбинантный вирус будет содержать и экспрессировать ген-мишень. ДНК ВКО дикого типа несет ген vp37, отвечающий за образование бляшек при росте вируса в монослойной культуре животных клеток. Если заменить этот ген маркерным геном Е. coli, то образуется мутантный ВКО, который не формирует бляшки при выращивании его в течение 23 сут в культуре животных клеток. Ген-мишень вводят в этот мутантный вирус с помощью гомологичной рекомбинации его ДНК с вектором, несущим ген vp37 и ген-мишень. Мутантный ВКО, получивший ген vp37, приобретает способность к образованию бляшек, при этом в его геном встраивается ген-мишень, а маркерный ген утрачивается. Мутантный вирус с делегированным геном vp37не может ревертировать к дикому типу, поэтому каждая вирусная частица, образующая бляшку, содержит желаемую конструкцию. Этот метод прост, применим для переноса и экспрессии любого гена-мишени, не требует каких-либо дополнительных маркерных генов и не прерывает рамку считывания генов ВКО.
В геном ВКО уже удалось встроить и экспрессировать в культуре животных клеток несколько генов антигенных белков: G-белка вируса бешенства, поверхностного антигена гепатита В, поверхностных белков вируса Синдбис, NP- и НА-белков вируса гриппа, N- и G-белков вируса везикулярного стоматита, гликопротеинов вируса простого герпеса. Некоторые из полученных на основе ВКО рекомбинантных векторов можно использовать для создания эффективных вакцин. Так, рекомбинантный ВКО, экспрессирующий ген гликопротеина D вируса простого герпеса типа 1, предотвращает герпесные инфекции у мышей, а рекомбинантный ВКО, экспрессирующий ген поверхностного антигена вируса бешенства, индуцирует выработку протективных антител у лис, основных переносчиков вируса бешенства в Европе.
Векторные ВКО-вакцины позволяют провести иммунизацию сразу от нескольких заболеваний. Для этого можно использовать рекомбинантный ВКО, который несет несколько генов, кодирующих разные антигены.
В зависимости от используемого ВКО-промотора чужеродный белок может синтезироваться в ранней или поздней фазе инфекционного цикла, при этом его количество определяется силой промотора. Обычно для достижения высокого уровня экспрессии используют «поздние» ВКО-промоторы: pll (промотор гена, отвечающего за синтез белка мол. массой 11 кДа) или рСАЕ (промотор гена интегрального белка вируса коровьей оспы типа А). При встраивании в одну ДНК ВКО нескольких чужеродных генов каждый из них помещают под контроль отдельного ВКО-промотора, чтобы предотвратить гомологичную рекомбинацию между различными участками вирусной ДНК, которая может привести к утрате встроенных генов.
Живая рекомбинантная вирусная вакцина имеет ряд преимуществ перед неживыми вирусными и субъединичными вакцинами: 1) презентация аутентичного антигена практически не отличается от таковой при обычной инфекции; 2) вирус может реплицироваться в клетке-хозяине и увеличивать количество антигена, который активирует продукцию антител В-клетками (гуморальный иммунитет) и стимулирует выработку Т-клеток (клеточный иммунитет); 3) встраивание генов антигенных белков в один и большее число сайтов генома ВКО еще больше уменьшает его вирулентность.
Недостаток живой рекомбинантной вирусной вакцины состоит в том, что при вакцинации лиц со сниженным иммунным статусом (например, больных СПИДом) у них может развиться тяжелая вирусная инфекция. Чтобы решить эту проблему, можно встроить в вирусный вектор ген, кодирующий человеческий интерлейкин-2, который стимулирует Т-клеточный ответ и ограничивает пролиферацию вируса.
Нежелательные побочные эффекты пролиферации ВКО можно предупредить инактивацией вируса после вакцинации. Для этого был создан чувствительный к интерферону вирус (ВКО дикого типа относительно устойчив к его действию), пролиферацию которого можно регулировать в случае возникших при вакцинации осложнений.
Механизм устойчивости ВКО к интерферону оставался неустановленным, пока не была обнаружена открытая рамка считывания K3L, кодирующая белок мол. массой 10,5 кДа. Этот белок содержит аминокислотную последовательность, гомологичную N-концевой части эукариотического фактора инициации elF-2( мол. массой 36,1 кДа. N-концевые области обоих белков содержат 87 практически идентичных аминокислотных остатков, причем в положении 51 в обоих случаях находится серии, который в elF-2( фосфорилируется активируемой интерфероном Р1-киназой, что приводит к ингибированию синтеза белка в обработанных интерфероном клетках. КЗЬ-белок действует как конкурентный ингибитор фосфорилирования elF-2альфа, обеспечивая устойчивость ВКО к интерферону, и если из генома ВКО удалить ген K3L или его часть, то вирус станет чувствительным к интерферону. С помощью ПЦР-мутагенеза гена K3L, находящегося в составе плазмиды, и последующей гомологичной рекомбинации между ДНК ВКО и плазмидой с целью замены К3L-последовательности дикого типа модифицированным вариантом был сконструирован мутантный ВКО K3L- . Этот штамм оказался в 1015 раз более чувствительным к интерферону, чем штамм дикого типа. Эта работа является важным этапом на пути создания более безопасных ВКО-векторов. Последовательности, сходные с K3L, могут содержать и другие устойчивые к интерферону вирусы, что позволит с помощью делеций создавать их штаммы, чувствительные к интерферону.
Большинство работ по созданию живых вирусных вакцин проводились на ВКО, однако в качестве кандидатов на роль векторов для вакцинации рассматриваются и другие вирусы: аденовирус, полиовирус и вирус ветряной оспы. Вектор на основе живого аттенуированного полиовируса (его исследования только начинаются) привлекателен тем, что позволяет проводить пероральную вакцинацию. Такие «слизистые» вакцины (вакцины, компоненты которых связываются с рецепторами, расположенными в легких или желудочно-кишечном тракте) пригодны для профилактики самых разных заболеваний: холеры, брюшного тифа, гриппа, пневмонии, мононуклеоза, бешенства, СПИДа, болезни Лайма. Но до любых клинических испытаний любого на первый взгляд безобидного вируса как системы доставки и экспрессии соответствующего гена необходимо убедиться в том, что он действительно безопасен. Например, повсеместно используемый ВКО вызывает у людей осложнения с частотой примерно 3,0-10-6. Поэтому из генома рекомбинантного вируса, который предполагается использовать для вакцинации человека, желательно удалить последовательности, ответственные за вирулентность.

Новые противобактериальные вакцины
Для лечения заболеваний, вызываемых бактериями, широко используются антибиотики, и лишь совсем недавно начались работы по созданию новых противобактериальных вакцин. Стимулом к этому стали весьма веские причины.
Не все бактериальные инфекции поддаются лечению антибиотиками.
Широкое использование антибиотиков в последние 40 лет привело к появлению большого числа устойчивых к ним бактериальных штаммов.
Во многих тропических странах отсутствуют условия для хранения антибиотиков.
Часто больные прекращают лечение раньше, чем это предписано врачом, или принимают антибиотики в недостаточной дозе.
Имея в виду, что создаваемая противобактериальная вакцина должна быть достаточно эффективной, важно выбрать правильную стратегию. Если патогенная бактерия плохо растет в культуре и сложно получить ее аттенуированный штамм, необходимо использовать альтернативные способы. Например, Rickettsia rickettsii, грамотрицательная облигатная внутриклеточная бактерия, вызывающая пятнистую лихорадку Скалистых гор, не растет в культуре. Чтобы обойти эту трудность, создали субъединичную вакцину, содержащую основной поверхностный антиген R. rickeltsii, белок мол. массой 155 кДа. Она эффективно защищала мышей от этой патогенной бактерии.

Бактерии как системы доставки антигенов
Антигены, находящиеся на наружной поверхности бактериальной клетки, обладают более высокой иммуногенностью, чем локализованные в цитоплазме. Поэтому один из подходов, используемых при создании вакцин, состоит в размещении протективного антигена патогенной бактерии на поверхности живой непатогенной бактерии. Многие бактерии имеют жгутики, состоящие из белка флагеллина; под микроскопом они выглядят как нити, отходящие от бактериальной клетки. Если сделать так, что жгутики непатогенного микроорганизма будут нести специфический эпитоп патогенного микроорганизма, то можно будет индуцировать выработку протективных антител.
Именно такой подход использовали при создании противохолерной вакцины. Синтетический олигонуклеотид, кодирующий эпитоп субъединицы В холерного токсина, встроили в гипервариабельный участок гена флагеллина Salmonella и полученную конструкцию ввели в дефектный по флагеллину штамм Salmonella. При этом было известно, что эпитоп, включающий 5064 аминокислотные остатки субъединицы В холерного токсина, индуцирует выработку антител к интактному холерному токсину. Химерный флагеллин нормально функционировал, а эпитоп холерного токсина размещался на поверхности жгутиков. Иммунизация мышей с помощью интраперитонеальной инъекции примерно 5-106 живых или убитых формалином бактерий с модифицированным флагеллином индуцировала выработку большого количества антител как к пептиду (5064 аминокислотным остаткам), так и к молекуле интактного холерного токсина. Аналогичным образом можно встраивать два и даже три разных эпитопа в один флагеллиновый ген Salmonella и создать поливалентную противобактериальную вакцину.
С помощью перорального введения аттенуированных штаммов Salmonella можно осуществлять доставку в организм хозяина многих бактериальных, вирусных и паразитарных антигенов. Большую роль при этом играет выбор промотора, контролирующего транскрипцию чужеродного гена. Если используется слишком сильный промотор, может возникнуть метаболическая «перегрузка», сдерживающая пролиферацию бактерий. В отличие от ферментера, организм животного-хозяина не является замкнутой системой и экспрессию чужеродного гена нельзя регулировать изменением температуры или добавлением специфических метаболитов. Регуляторную роль может играть только промотор, реагирующий на те или иные сигналы. Например, работу промотора nirB E. coli можно регулировать, изменяя содержание нитритов и кислорода в среде, а наиболее активен он в анаэробных условиях. В одном из экспериментов промотор nirB использовали для контроля экспрессии гена нетоксичного иммуногенного С-фрагмента столбнячного токсина в аттенуированном штамме Salmonella. В развивающихся странах инфекция Clostridium tetani уносит более 1 млн. жизней в год. Если генетически модифицированный штамм Salmonella выращивать в аэробных условиях, то С-фрагмент столбнячного токсина синтезироваться не будет. При пероральном же введении этой бактерии тестируемым мышам С-фрагмент синтезируется, и у животных вырабатываются антитела к нему. Таким образом, штамм Salmonella, в который встроен С-фрагмент столбнячного токсина, находящийся под контролем промотора nirB, можно использовать как живую пероральную противостолбнячную вакцину. Чтобы выяснить, насколько эффективен этот подход при вакцинации человека, необходимо провести дополнительные исследования.

Заключение
Традиционные вакцины содержат инактивированные или аттенуированные патогенные микроорганизмы (бактерии или вирусы). Эти вакцины имеют ряд недостатков: не все патогенные микроорганизмы можно вырастить в необходимых для производства вакцины количествах; работа с большим количеством патогенных микроорганизмов требует соблюдения строжайших мер предосторожности; аттенуированные штаммы нередко ревертируют и становятся вирулентными; инактивация часто бывает неполной; срок годности вакцины зависит от условий ее хранения.
Технология рекомбинантных ДНК позволяет создавать надежные вакцины, используя при этом разные подходы. Делетируя гены, ответственные за вирулентность, получают живые вакцины, содержащие непатогенные, иммунологи-чески активные штаммы, которые не могут ревертировать и становиться патогенными. Клонированные гены, кодирующие основные антигенные детерминанты патогенного организма, встраивают в геном непатогенного носителя (обычно вируса) и получают безопасную, не содержащую болезнетворных микроорганизмов вакцину. Наконец, гены или их сегменты, кодирующие основные антигенные детерминанты патогенных микроорганизмов, встраивают в экспрессирующие векторы, получают нужный продукт в большом количестве и используют его как вакцину. Последний подход позволяет производить субъединичные и пептидные вакцины (если используются полноразмерные гены в первом случае и фрагменты генов, кодирующих домены основных антигенных детерминант во втором). Пептидные вакцины получают и с помощью химического синтеза пептидов.


ЛЕКЦИЯ 5.
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ СИСТЕМ

С развитием технологии рекомбинантных ДНК появилась возможность более эффективно использовать многие полезные свойства микроорганизмов. Рассмотрим некоторые примеры практического применения микробиологических систем, модифицированных методами генной инженерии.
С помощью современных генетических методов биологи научились превращать бактерии в своеобразные «биологические фабрики» по производству белковых препаратов (например, рестрицирующих эндонуклеаз), различных химических соединений, аминокислот, антибиотиков и т. д. Клонируя в бактериальных клетках специфические гены, они создают новые пути биосинтеза для получения уникальных метаболитов, применяют клонированные гены болезнетворных микроорганизмов в качестве зондов для диагностики заболеваний человека и домашних животных, используют изолированные гены для получения безопасных и эффективных вакцин.
Методами генной инженерии можно усиливать природную способность определенных видов бактерий к осуществлению специфических биологических процессов. Например, уже получены штаммы бактерий, которые более эффективно разрушают токсичные отходы, загрязняющие окружающую среду, способствуют ускорению роста сельскохозяйственных культур, эффективно расщепляют целлюлозу до низкомолекулярных углеродных соединений, уничтожают вредных насекомых. Часто думают, что выращивание больших количеств микроорганизмов представляет собой рутинную процедуру. Однако для успешного производства рекомбинантных белков в промышленных масштабах необходимо контролировать множество параметров, от которых зависит рост синтезирующих их микроорганизмов и чистота получаемых продуктов.

Молекулярная диагностика
Успехи современной медицины и сельского хозяйства часто зависят от того, удается ли обнаруживать специфические вирусы, бактерии, грибы, паразитические микроорганизмы, белки и низкомолекулярные соединения в организме человека или животных, в растениях, воде или почве. Например, профилактику и лечение любого инфекционного заболевания значительно облегчает ранняя и точная идентификация вызвавшего его патогенного микроорганизма. Для проведения многих диагностических процедур необходимо сначала вырастить культуру потенциально патогенного микроорганизма и лишь затем проанализировать спектр его физиологических свойств. Хотя подобные тесты весьма эффективны и обладают достаточно высокой специфичностью, они часто занимают много времени и являются дорогостоящими. Это относится к идентификации и бактерий, и паразитических микроорганизмов (табл.1). Кроме того, весьма ограничена возможность выявления тех патогенных микроорганизмов, которые плохо растут в культуре либо вообще не поддаются культивированию. В качестве примера можно привести облигатных внутриклеточных паразитов Chlamydia trachomatis, которые вызывают хламидиоз, болезнь, передающуюся половым путем и распространенную в Северной Америке и Европе. Хламидиоз трудно диагностировать, поскольку для этого необходима перевиваемая культура клеток. При этом часто получают ложноотрицательные результаты (т. е. ошибочно диагностируют отсутствие микроорганизма), в результате чего не проводится адекватное лечение. Безусловно, если для выявления микроорганизма необходимо выращивать его в культуре, то рутинной может стать идентификация лишь нескольких из всех известных патогенных микроорганизмов. Чтобы устранить это принципиальное ограничение, были разработаны методы молекулярной диагностики, в основе которых лежат иммунологические подходы или методы обнаружения специфической ДНК.
Таашца 1. Сравнение некоторых методов диагностики инфекционных заболеваний, вызванных паразитическими микроорганизмами

Метод
Преимущества
Недостатки

Mикроскопическое исследование

Простота
Прямое выявление паразитических
микроорганизмов
Возможность разграничения
микроорганизмов по морфологическим признакам
Трудоемкость, длительность
Низкая чувствительность
Невозможность азграничения сходных микроорганизмов
Необходимость высокой квалификации для интерпретации результатов

Культивирование in vitro u иммунизация мышей

Обнаружение только жизнеспособных паразитических микроорганизмов
Возможность определения вирулентности и инфекционности
Длительность анализа, высокая стоимость.
Разные породы животных дают разные ответы Потеря.жизнеспособности в организме животного
Использование животных

Определение антител в сыворотке

Простота, непродолжительность анализа
Возможность автоматизации
Возможность тестирования большого числа образцов

Не всегда специфичен
Невозможность разграничения острой и латентной форм инфекции


Гибридизация и ПЦР

Быстрота, высокие чувствительность и
специфичность
Прямое обнаружение паразитических
микроорганизмов
Возможность разграничения разных видов
Независимость результатов от предыдущих инфекций
Не требуют жизнеспособности
паразитов
Возможность автоматизации

Высокая стоимость анализов, многоэтапность
Невозможность различить живые и мертвые
микроорганизмы
Возможность получения ложноположительных
и ложноотрицательных результатов



Любой метод выявления патогенных микроорганизмов должен быть достаточно простым и обладать высокой специфичностью и чувствительностью. Специфичный диагностический тест должен давать положительный ответ только на микроорганизм- или молекулу-мишень, чувствительный обнаруживать очень малые количества такой мишени даже на фоне других микроорганизмов или молекул, загрязняющих образец. Простота метода подразумевает, что он является достаточно продуктивным, эффективным и недорогим для рутинного применения.

Методы иммунодиагностики
Многие иммунологические системы детекции обладают высокой чувствительностью и специфичностью, являясь в то же время достаточно простыми. Они широко используются для тестирования лекарственных препаратов, оценки мониторинга различных онкологических заболеваний, определения специфических метаболитов, идентификации и контроля патогенных микроорганизмов, но имеют и свои ограничения. Если молекулой-мишенью является белок. то необходимо обеспечить экспрессию детермипирующих его генов и создать условия, в которых не происходит маскирование или блокирование сайта связывания с антителом. Традиционные процедуры диагностики возбудителей инфекции опираются либо на набор характеристик патогенного микроорганизма, либо, что предпочтительнее, на одну уникальную, легко различимую его особенность. Клинические микробиологи пытаются найти тот минимальный набор биологических характеристик, при помощи которого можно будет гарантирование обнаруживать и идентифицировать патогенные микроорганизмы. Например, некоторые возбудители вырабатывают специфические биохимические соединения, которые и необходимо обнаружить в биологическом образце. Часто подобную маркерную молекулу можно выявить непосредственно, проведя высокоспецифичный биохимический анализ. Но такой подход неизбежно приведет к увеличению числа индивидуализированных систем детекции патогенных микроорганизмов. Более предпочтительным был бы универсальный метод, позволяющий выявлять любую маркерную молекулу независимо от ее химической природы. Именно таким является метод, основанный на идентификации комплексов антигенантитело.

Ферментный иммуносорбентный анализ
Существует целый ряд подходов, позволяющих определить, произошло ли связывние антитела с антигеном-мишенью. Один из них - это ферментный иммуносорбентный анализ (ELISA), который часто используют для диагностики. Процедура включает следующие этапы.
1. Образец, в котором хотят обнаружить специфическую молекулу или микроорганизм, фиксируют на твердой подложке, например на пластиковой микротитровальной плашке обычно имеющей 96 лунок.
2. К фиксированному образцу добавляют антитело, специфичное к маркерной молекуле (первое антитело), затем промывают лунку, чтобы удалить несвязавшиеся молекулы первого антитела .
3. Добавляют второе антитело, которое специфически связывается с первым антителом и не взаимодействует с маркерной молекулой. К этому антителу присоединен фермент (например, щелочная фосфатаза, пероксидаза или уреаза), катализирующий превращение неокрашенного субстрата в окрашенный продукт. Промывают лунку, чтобы удалить несвязавшиеся молекулы конъюгата второе антителофермент.
4. Добавляют неокрашенный субстрат .
5. Проводят качественное или количественное определение окрашенного продукта.
Если первое антитело не связывается с мишенью образца, то оно удаляется при первом промывании. Поскольку при этом конъюгату второе антителофермент не с чем связываться, он удаляется при втором промывании, и образец остается неокрашенным. Если связывание с мишенью происходит, то второе антитело присоединяется к первому, и конъюгированный фермент катализирует образование легко регистрируемого окрашенного продукта.
Основной принцип ELISA специфическое связывание первого антитела с мишенью. Если молекула-мишень представляет собой белок, то его очищенный препарат обычно используют для получения антител, при помощи которых затем и выявляют данную мишень. Антитела, которые образуются в сыворотке (антисыворотке) крови иммунизированного животного (обычно кролика), связываются с разными антигенными детерминантами (эпитопами) молекулы-мишени. Такую смесь антител называют поликлональным препаратом. Использование поликлональных антител имеет два недостатка, существенных для некоторых методов диагностики: 1) содержание отдельных антител в поликлональном препарате может варьировать от одной партии к другой; 2) поликлональные антитела нельзя применять, если необходимо различить две сходные мишени, т. е. когда патогенная (мишень) и непатогенная (не-мишень) формы различаются единственной детерминантой. Однако эти проблемы вполне разрешимы, поскольку сейчас научились получать препараты антител, выработанных к одной антигенной детерминанте, т. е. препараты моноклональных антител.

Моноклональные антитела
У млекопитающих в ходе эволюции выработался сложный набор клеточных систем, защищающих организм от токсичных веществ и инфекционных агентов. Составной частью защитной реакции является индуцированная выработка клетками лимфатической системы специфических белков (антител), которые соединяются с чужеродными веществами (антигенами) и при помощи других белков иммунной системы, включая системы комплемента, нейтрализуют их эффект. В ответ на иммунологический стимул каждая антителопродуцирующая клетка синтезирует и выделяет единственный вид антител, которые с высоким сродством распознают отдельный участок (эпитоп, антигенную детерминанту) молекулы антигена. Поскольку в молекуле антигена обычно присутствует несколько разных эпитопов, антитела против каждого из них вырабатываются отдельными клетками иммунной системы. Такие антитела, каждое из которых взаимодействует с данным антигеном, называют поликлональными.
Уже в начале нынешнего века, когда о поли клональности антител ничего не знали, было ясно, что их специфичность можно использован для подавления инфекций. Позже антитела стали применять в качестве диагностического инструмента для выявления токсичных соединений в клинических образцах. К сожалению, эффективность препаратов поликлональных антител варьирует от одной партии к другой, поскольку в одних случаях при проведении иммунизации антителопродуцирующие клетки сильнее стимулируются одними детерминантами данного антигена, а в других иммунная система активнее отвечает на другие эпитопы тоге же антигена. Это может влиять на способность разных препаратов нейтрализовать антигены, поскольку отдельные эпитопы обладают разной эффективностью (стимулирующей способностью). Следовательно, в данной партии поликлональных антител может содержаться мало молекул, направленных против основного эпитопа, и в результате она будет менее эффективной, чем предыдущая.
Следовательно, для практического применения антител в качестве диагностического инструмента или компонентов терапевтических средств необходимо было создать такую линию клеток, которая росла бы в культуре и продуцировала антитела одного типа, обладающие высоким сродством к специфическому антигену-мишени, моноклональные антитела. Подобная клеточная линия могла бы стать неиссякающим источником идентичных молекул антител. К сожалению, В-лимфоциты (В-клетки), синтезирующие антитела, не могут воспроизводиться в культуре. Решение данной проблемы виделось в создании гибридной клетки. Получив генетическую составляющую от В-клетки, она могла бы вырабатывать антитела, а приобретя способность к делению от клетки совместимого типа - расти в культуре. Было известно, что В-лимфоциты иногда перерождаются и становятся раковыми (миеломными) клетками, приобретая способность к росту в культуре и сохраняя в то же время многие свойства В-клеток. Так клетки миеломы, в первую очередь те, которые не вырабатывают антител, стали кандидатами на слияние с антителопродуцирующими В-клетками. В середине 70-х гг. эти идеи стали реальностью.
Первый шаг в процессе получения гибридной клеточной линии, продуцирующей антитела одного типа, состоит во введении мышам антигена. После ряда иммунизации, проведенных в течение нескольких недель, проверяют, произошло ли развитие у животных иммунного ответа. Если ответ развился, то животных умерщвляют, извлекают селезенку, промывают ее, измельчают и несильно встряхивают для высвобождения единичных клеток, среди которых находятся и антителопродуцирующие В-клетки. Взвесь клеток селезенки смешивают со взвесью миеломных клеток, дефектных по гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазе (HGPRT-). Комбинированную взвесь в течение нескольких минут инкубируют в 35%-ном полиэтиленгликоле, а затем переносят в среду, содержащую гипоксангин, аминоптерин и тимидин (среда ГАТ).
Обработка полиэтиленгликолем облегчает слияние клеток, тем не менее слияние происходит редко и является в достаточной степени случайным событием. В смеси присутствуют клетки миеломы, селезенки, а также слившиеся клетки миеломыселезенки, миеломымиеломы, селезенкиселезенки. Однако в среде ГАТ растут только гибридные клетки миеломыселезенки, все остальные типы клеток не могут в ней пролиферировать. Клетки селезенки и слившиеся клетки селезенкиселезенки вообще не растут в культуре, а миеломные клетки HGPRT- и слившиеся клетки миеломымиеломы не могут использовать гипоксантин в качестве предшественника в процессе биосинтеза пуриновых оснований гуанина и аденина, без которых невозможен синтез нуклеиновых кислот. Но у них есть другой естественный путь синтеза пуринов - при участии дигидрофолатредуктазы, поэтому в состав среды и входит аминоптерин, ингибирующий активность этого фермента. Таким образом, миеломные клетки HGPRT- и слившиеся клетки миеломы-миеломы не могут синтезировать пурины в среде ГАТ и погибают.
Слившиеся клетки селезенкимиеломы растут в среде ГАТ, поскольку: 1) клетки селезенки поставляют функциональную HGPRT, которая может утилизировать экзогенный гипоксантин среды несмотря на блокирование синтеза пуринов с участием дигидрофолатредуктазы аминоптерином; 2) клетки миеломы способны активно делиться. Тимидин необходим для устранения блокирования в синтезе пиримидинов, обусловленного ингибированием дигидрофолатредуктазы. На 1014-е сутки после слияния клеток в среде ГАТ остаются и растут только слившиеся клетки селезенкимиеломы. Их затем вносят в лунки пластиковых микротитровальных плашек и выращивают на полной культуральной среде без ГАТ.
Теперь необходимо идентифицировать гибридные клетки, вырабатывающие антитела к иммунизирующему антигену. Для этого обычно проводят скрининг культуральных сред, содержащих секретируемые антитела. Среду из тех лунок, в которых есть растущие клетки, отбирают и переносят в лунки другой микротитровальной плашки, предварительно покрытые слоем молекул антигена-мишени. Если в культуральной среде находится антитело (первое антитело), распознающее один из эпитопов данного антигена, то оно свяжется с антигеном и останется в лунках после их промывания. Затем в лунки добавляют второе антитело, специфичное к мышиным антителам. Оно будет присоединяться к любому первому антителу, связанному с антигеном.
К используемому в иммунном анализе второму антителу предварительно присоединяют фермент, который превращает неокрашенный субстрат в окрашенное соединение. Изменение цвета содержимого одной из лунок говорит о том, что исходная культуральная среда содержала антитело, специфичное к данному антигену. Если же такое антитело в среде отсутствовало, то второму антителу не с чем будет связываться и оно смоется при втором промывании. Субстрат в таких лунках останется неокрашенным.
Лунки исходной микротитровальной плашки, среда из которых дает положительный иммунный ответ (изменение цвета), могут содержать смесь слившихся клеток. Чтобы получить линии, происходящие от одной клетки (клоны) клеточную суспензию из таких лунок разводят культуральной средой и высевают в другие лунки. После культивирования полученных клонов среды вновь тестируют, определяя, какая из клеточных линий (гибридом) продуцирует моноклональные антитела, распознающие антиген-мишень. В том случае, когда получают более одной специфичной гибридомы, проводят дальнейшие исследования, позволяющие определить, направлены ли антитела, вырабатываемые разными клонами, против одной и той же антигенной детерминанты. Каждый клон, продуцирующий моноклональное антитело, можно поддерживать в культуре практически бесконечно. Кроме того, образцы можно заморозить в жидком азоте и использовать их в дальнейшем как источник клеток.
Применение моноклональных антител позволяет существенно повысить специфичность метода ELISA, поскольку они связываются с одним, строго определенным антигенным сайтом. К настоящему времени получен целый ряд моноклональных антител, которые можно использовать для обнаружения различных соединений и патогенных микроорганизмов. Альтернативой получению моноклональных антител из культуры гибридомных клеток может быть отбор и производство моноклональных антител и их частей (Fv-фрагментов), направленных против антигена-мишени, с помощью Е. coli .

Системы ДНК-диагностики
Информация о всем многообразии свойств организма заключена в его генетическом материале. Так, патогенность бактерий определяется наличием у них специфического гена или набора генов, а наследственное генетическое заболевание возникает в результате повреждения определенного гена. Сегмент ДНК, детерминирующий данный биологический признак, имеет строго определенную нуклеотидную последовательность и может служить диагностическим маркером.
В основе многих быстрых и надежных диагностических методов лежит гибридизация нуклеиновых кислот спаривание двух комплементарных сегментов разных молекул ДНК. Процедура в общих чертах состоит в следующем.
1. Фиксация одноцепочечной ДНК-мишени на мембранном фильтре.
2. Нанесение меченой одноцепочечной ДНК-зонда, которая при определенных условиях (температуре и ионной силе) спаривается с ДНК-мишенью.
3. Промывание фильтра для удаления избытка несвязавшейся меченой ДНК-зонда.
4. Детекция гибридных молекул зонд/мишень.
В диагностических тестах, основанных на гибридизации нуклеиновых кислот, ключевыми являются три компонента: ДНК-зонд, ДНК-мишень и метод детекции гибридизационного сигнала. Система детекции должна быть в высшей степени специфичной и высокочувствительной.

Гибридизационные зонды
Чтобы обеспечить адекватность диагностического теста, гибридизационные ДНК- и РНК-зонды должны быть высокоспецифичными. Другими словами, необходимо, чтобы зонд гибридизовался только с искомой нуклеотидной последовательностью. Если есть вероятность получения ложноположительного (наличие гибридизационного сигнала в отсутствие последовательности-мишени) или ложноотрицательного (отсутствие сигнала при наличии последовательности-мишени) результата, то целесообразность применения теста значительно снижается. Специфичность зондов может проявляться на разных уровнях: они могут «различать» два и более вида, отдельные штаммы в пределах одного вида или разные гены. В зависимости от ситуации зонды могут быть представлены молекулами ДНК или РНК; они могут быть длинными (более 100 нуклеотидов) или короткими (менее 50 нуклеотидов), представлять собой продукт химического синтеза, клонированные интактные гены или их фрагменты.
Зонды получают разными способами. Один из них состоит в следующем. ДНК патогенного микроорганизма расщепляют с помощью рестрицирующей эндонуклеазы и клонируют в плазмидном векторе. Затем проводят скрининг рекомбинантных плазмид с использованием геномной ДНК как патогенного, так и непатогенного штаммов. Те плазмиды, которые содержат последовательности, гибридизуюшиеся только с ДНК патогенного штамма, составляют основу видоспецифичных зондов. После этого проводят ряд дополнительных гибридизаций с ДНК, выделенными из различных организмов, чтобы удостовериться, что потенциальные зонды не дают с ними перекрестной гибридизации. Для определения чувствительности метода каждый из зондов проверяют также на модельных образцах, в том числе и на смешанных культурах.
Весьма желательно, чтобы ДНК-диагностику можно было проводить на исходном материале, без дополнительного его культивирования или выделения нуклеиновых кислот, особенно в тех случаях, когда тестируются клинические образцы. Исследователи с успехом проводят гибридизацию с ДНК-мишенями, присутствующими в образцах кала, мочи, крови, смывах из зева и в тканях без предварительной их очистки. Если концентрация последовательности-мишени в исследуемом образце слишком мала, ее можно амплифицировать с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Диагностика малярии
В качестве примера использования ДНК-зондов для диагностики заболеваний можно привести процедуру обнаружения Plasmodium falciparum. Этот паразит вызывает малярию, заболевание, угрожающее примерно трети всего населения Земли. Он инфицирует эритроциты и разрушай их, что приводит к развитию лихорадки, а в тяжелых случаях к поражению мозга, почек и других органов. Чтобы выявить источники инфекции, оценить эффективность мер по их ликвидации и обеспечить раннюю диагностику и лечение, необходимы достаточно чувствительные, простые и недорогие методы. В настоящее время малярию диагностируют с помощью микроскопического исследования мазков крови - эффективного, но трудоемкого и занимающем много времени процесса. Иммунологические методы обнаружения Plasmodium, такие как ELISA, достаточно быстрые и их легко автоматизировать, но с их помощью нельзя отличить, текущую инфекцию от прошедшей, поскольку при этом определяется только наличие антел к Plasmodium в крови больных.
Для избирательной ДНК-диагностики текущей инфекции, т. е. для выявления ДНК возбудителя, в качестве основы используются высокоповторяющиеся последовательности ДНК P. falciparum. Сначала с помощью ДНК-зонд, проводится скрининг библиотеки геномной ДНК паразита. Затем отбираются клоны, дающие наиболее интенсивный гибридизационный сигнал, поскольку именно они предположительно содержат высокоповторяющиеся последовательности. ДНК каждого из отобранных клонов проверяют на способность к гибридизации с ДНК видов Plasmodium, не вызывающих малярию. В качестве специфического зонда выбирается последовательность, гибридизующаяся с ДНК P. falciparum, но не с ДНК P.vivax, P. cynomolgi или с ДНК человека. С его помощью можно обнаруживать всего 10 пг очищенной ДНК P. falciparum или 1 нг той же ДНК в крови больного. Получены и охарактеризованы более 100 различных ДНК-зондов, позволяющих обнаруживать патогенные штаммы различных бактерий, вирусов и паразитических простейших. Так, имеются зонды для диагностики бактериальных инфекций человека, вызываемых Legionella рпеиmophila (респираторные заболевания), Salmonella typhi (пищевые отравления), Campylobacter hyoinrestinalis (гастриты), а также для выявления энтеротоксичного штамма Escherichia coll (гастроэнтериты). Однако это лишь «верхушка айсберга»; в принципе с помощью гибридизации можно выявлять практически любые патогенные микроорганизмы.

Выявление аллелей бетта-глобинового гена методом гибридизации с синтетическими олигонуклеотидами

С разработкой в начале 80-х гг. быстрых, эффективных и недорогих методов химического синтеза олигонуклеотидов появилась возможность использовать радиоактивно меченные олигонуклеотидные зонды для выявления различий между нуклеотидными последовательностями, в частности для обнаружения мутаций у человека. К тому времени было изолировано относительно небольшое число генов, главным образом в виде комплементарных ДНК (кДНК), поэтому подбор зонда, гомологичного конкретному гену, представлял собой непростую задачу. Но даже если соответствующие кДНК были получены, невозможно было различить нормальный и мутантный гены человека, отличающиеся друг от друга лишь одной парой оснований, проводя гибридизацию с протяженным (более 100 п. н.) зондом. В 1983 г. Коннер и др. синтезировали специфичные олигонуклеотиды, способные распознавать нормальную и мутантную ДНК, при этом можно было установить, гомозиготен или гетерозиготен данный индивидуум по исследуемому гену. Для диагностики серповидноклеточной анемии они использовали два олигонуклеотида длиной по 19 п. н.: один был комплементарен нормальному аллелю (-глобинового гена ((А), а другой мутантному ((s). ДНК здорового человека ((А(А) гибридизовалась только с (А-зондом, ДНК больного серповидноклеточной анемией ((S(S) только с (5-зондом, а ДНК индивидуума, гетерозиготного по данному гену ((A(s), с обоими зондами. Эта модельная система впервые продемонстрировала возможность определения генотипов с помощью гибридизации и положила начато молекулярной диагностике многих генетических заболеваний человека. Вслед за этим был разработан целый ряд ДНК-тестов для выявления мутаций. И хотя гибридизационный метод сейчас уступил место более совершенным методам, таким как ПЦР и ЛОЗ (лигирование олигонуклеотидных зондов), он сыграл свою роль, проиллюстрировав возможность определения точковых мутаций.

Выявление Trypanosoma cruzi
Паразитическое простейшее Trypanosoma cruzi вызывает болезнь Чагаса (южноамериканский трипаносомоз), уносящую ежегодно примерно 50 тыс. жизней. Паразит широко распространен в Латинской Америке. Он переносится клопами-хищнецами, проникает в печень, селезенку, лимфатические узлы, центральную нервную систему и, размножаясь, разрушает клетки, в которых паразитирует. Для диагностики острой формы болезни Чагаса обычно проводят микроскопическое исследование свежей пробы периферической крови. Можно использовать и другой тест, более длительный, но выявляющий паразитов с большей вероятностью. Незараженных насекомых кормят кровью пациента и через 30-40 сут исследуют под микроскопом их кишечник на предмет наличия паразитов. Оба метода весьма трудоемки, дорогостоящи и требуют длительного времени. Болезнь можно диагностировать и иммунологическими методами, однако они часто дают ложноположительные результаты. В качестве альтернативы этим менее чем удовлетворительным процедурам было разработано несколько подходов, основанных на применении ПЦР. В настояшее время ГЦР-диагностика болезни Чагаса служит дополнением к традиционным, широко используемым методам.
Один из ПЦР-тестов основан на выявлении фрагмента ДНК длиной 188 п. н., который присутствует во множестве копий в геноме Т. cruzi, но отсутствует в геномной ДНК нескольких родственных паразитов. После амплификации этот фрагмент без труда обнаруживается с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. Незначительно варьируя методику проведения ПЦР (например, изменяя нуклеотидную последовательность праймеров), последнюю можно использовать для обнаружения широкого спектра бактерий, вирусов и паразитов.

Нерадиоактивные методы детекции
В большинстве лабораторий для гибридизации используют зонды, меченные каким-либо радиоактивным изотопом, чаще всего 32Р. Такие зонды обладают высокой удельной радиоактивностью и обеспечивают хорошее отношение сигнал/шум. Радиоактивно меченный зонд наносят на фильтр с фиксированной на нем ДНК-мишенью, проводят гибридизацию, отмывают несвязавшуюся ДНК-зонд и детектируют метку с помощью радиоавтографии.
Однако 32Р является короткоживущим изотопом, испускающим высокоэнергетическое излучение; при работе с ним необходимо использовать специальное оборудование и обеспечивать безопасную утилизацию отходов. Чтобы обойти эти трудности, были созданы нерадиоактивные системы детекции. Для усиления гибридизационного сигнала в этом случае используется ферментативное превращение хромогенного или хемилюминесцентного субстрата: первый из них под действием фермента изменяет окраску, а второй испускает свет. В большинстве подобных систем применяются ДНК-зонды, содержащие биотинилированные нуклеотиды. Гибридизация и детекция сигнала проводятся более или менее стандартным образом.

1. Зонд, меченный биотином, гибридизуют с ДНК-мишенью.
2. Промывают фильтр для удаления избытка несвязавшегося зонда.
3.Добавляют авидин (белок куриного яйца) или стрептавидин (бактериальный аналог авидина).
4. Добавляют биотинилированный фермент - щелочную фосфатазу или пероксидазу хрена .
5. В зависимости от используемого фермента добавляют хромогенный или хемилюминесцентный субстрат и регистрируют изменение окраски либо люминесценцию, сопровождающую превращение субстрата в продукт.
В качестве альтернативы после гибридизации ДНК с биотинилированным зондом можно добавлять уже готовый комплекс стрептавидинфермент, имеющий сайт связывания с биотином.
Как авидин, так и стрептавидин связываются с биотином очень прочно (константа диссоциации (Kd = 10-15); кроме того, каждый из белков имеет четыре независимых биогинсвязывающих сайта, благодаря чему одна молекула авидина или стрептавидина может одновременно присоединять фермент и зонд, меченные биотином. Биотинилирование и связывание со стрептавидином не приводят к снижению ферментативной активности. В хромогенных системах детекции в том месте, где находится гибридная ДНК, под действием фермента образуется нерастворимый краситель, а в хемилюминесцентных системах продукт, который испускает свет.
Нерадиоактивные системы детекции обладают и другими преимуществами: биотинилированная ДНК остается стабильной при комнатной температуре как минимум год; методы регистрации хемилюминесценции обладают такой же чувствительностью, как и методы регистрации радиоактивного сигнала; детекция испускаемого света при помощи рентгеновской пленки или люминометра, как и регистрация изменения цвета, занимают несколько часов По-видимому, хемилюминесцентные системы регистрации сигнала, все же более чувствительные, чем хромогенные, вскоре вытеснят вес остальные, использующиеся при ДНК-диагностике. Если при этом применяется ПЦР, то амплифицируемый продукт можно пометить флуоресцентным красителем, присоединяя его к 5'-концу каждого праймера. В качестве красителей часто используют флуоресцеин и родамин, которые испускают зеленый и красный свет соответственно. После ПЦР-амплификации ДНК-мишени проводят разделение флуоресцеин-меченного праймера и продуктов амплификации, после чего регистрируют включение метки. Если ДНК-мишень в образце отсутствует, то не будет образовываться и флуоресцирующий продукт.
Один из недавно разработанных нерадиоактивных методов детекции основан на использовании зонда «молекулярного маяка». Такой зонд состоит из 25 нуклеотидов. Средние 15 из них комплементарны ДНК-мишени и не спариваются друг с другом, а 5 концевых нуклеотидов взаимно комплементарны и образуют шпильку. К 5'-концу присоединен флуоресцентный хромофор (флуорофор), а к З'-концу нефлуоресцентный хромофор (тушитель), на который передается энергия возбуждения флуорофора. В растворе при комнатной температуре «маяк» имеет такую конфигурацию, при которой флуорофор и тушитель находятся в тесном контакте, и флуоресценция флуорофора тушится. Когда же 15 средних нуклеотидов зонда гибридизуются с комплементарной последовательностью ДНК- или РНК-мишени, происходит пространственное разделение флуорофора и тушителя, и зонд испускает свет. Температура, реакционной смеси должна быть близка к комнатной, поскольку при ее повышении шпилька денатурирует, флуорофор и тушитель расходятся и происходит флуоресценция. Необходимо также, чтобы все 15 нуклеотидов зонда были комплементарны соответствующей последовательности ДНК- или РНК-мишени.
Геномная дактилоскопия
Метод геномной дактилоскопии (ДНК-типирование) часто используется в судебной медицине для идентификации биологических образцов. С его помощью можно доказать, что подозреваемый действительно совершил преступление, или, напротив, что он невиновен. Для проведения ДНК-типирования сначала берут часть биологического образца (пробу крови, сперму, кусочек кожи, волосы) и определяют, достаточно ли в нем интактной ДНК для последующего анализа. Затем ДНК подвергают эндонуклеазному расщеплению, полученные фрагменты разделяют в агарозном геле и переносят на найлоновый фильтр. Проводят последовательную гибридизацию с четырьмя или пятью радиоактивно меченными зондами, каждый из которых распознает определенную последовательность ДНК (при этом перед гибридизацией со следующим зондом предыдущий полностью удаляют с мембраны). После каждой гибридизации с помощью радиоавтографии визуализируют полосы, отвечающие продуктам гибридизации зонда с рестрицированной ДНК, и строят «лестницу фрагментов» для всех образцов. Каждый этап (гибридизация и радиоавтография) длится от 10 до 14 сут, так что вся процедура может занять много недель и даже несколько месяцев. В качестве зондов обычно используют минисателлитные ДНК, многократно встречающиеся в геноме человека и состоящие из тандемно повторяющихся участков. Длина повторов варьирует от 9 до 40 п. н., а их число от 10 до 30; при этом одни и те же минисателлитные последовательности у разных индивидов могут иметь разную длину. Эти различия возникают в результате увеличения или уменьшения числа тандемных повторов, по-видимому, в ходе репликации ДНК. Никаких биологических последствий такие вариации не имеют, поскольку минисателлитные ДНК не кодируют белков. Ребенок наследует одну минисателлитную последовательность от одного родителя, а другую - от другого. «ДНК-отпечаток» данного индивида представляет собой набор различающихся по длине фрагментов, соответствующих минисателлитным последовательностям его генома. Ввиду большого разнообразия этих повторов вероятность того, что в популяции найдется два человека с идентичными «ДНК-отпечатками», равна 10-5-10-8. Другими словами, характер расположения полос минисателлитных ДНК почти столь же индивидуален, как и отпечатки пальцев. Геномную дактилоскопию применяют также при установлении отцовства. Часть полос «ДНК-отпечатка»ребенка должна соответствовать полосам материнского «отпечатка», а часть «отцовского». Если ДНК в исследуемом образце недостаточно, но она не очень сильно разрушена, можно амплифицировать небольшие участки минисателлитной ДНК с помощью ПЦР, а затем провести их секвенирование, этот метод более чувствителен.

Использование полиморфных ДНК-маркеров
Метод «ДНК-отпечатков» может оказаться полезным и при установлении различий между растительными культурами. Один из вариантов этого метода основан на использовании полиморфных ДНК-маркеров для амплификации случайных фрагментов (random amplified polymorphic DNA, RAPD). Для этого берут произвольные праймеры длиной 910 нуклеотидов, не содержащие палиндромных последовательностей и имеющие GС-содержание 5080%, и добавляют их по отдельности к препаратам хромосомной ДНК растений. Каждая ПЦР инициируется одним праймером, который должен быть способен связываться с обеими цепями ДНК-мишени. Нуклеотидные последовательности всех олигонуклеотидов известны, но какой из них окажется эффективным инициатором ПЦР, неясно. Если праймер гибридизуется с обеими цепями ДНК-мишени в подходящей ориентации и сайты расположены на расстоянии от 100 до 3000 п. н. друг от друга, то фланкированный ими сегмент ДНК будет амплифицирован, а полученный фрагмент можно выделить с помощью гель-электрофореза и визуализировать окрашиванием. Число разных фрагментов ДНК, образующихся при амплификации, зависит от праймера и геномной ДНК. Для одних и тех же праймера и ДНК-мишени продукты амплификации будут каждый раз одинаковыми, а замена лишь одного нуклеотида в праймере приведет к полной смене набора получаемых фрагментов. Таким образом, используя один и тот же набор олигонуклеотидных праймеров, можно сравнивать RAPD-«ДНК-отпечатки» разных растительных культур, а следовательно, и сами культуры. Для выявления различий между двумя очень близкими сортами или культурами растений часто приходится использовать несколько произвольных праймеров с известной нуклеотидной последовательностью. Как и все другие молекулярные маркеры, RAPD можно применять для характеристики целых геномов, отдельных хромосом или генов.
По сравнению с другими методами идентификации сложных ДНК метод RAPD обладает следующими преимуществами: 1) для всех видов растений можно использовать один и тот же (универсальный) набор олигонуклеотидных праймеров; 2) не нужно создавать геномные библиотеки, использовать радиоактивные зонды, проводить гибридизацию, т. е. можно легко и быстро охарактеризовать большое количество образцов; 3) процесс можно автоматизировать. Кроме того, для проведения обычной ПЦР необходимо знать нуклеотидную последовательность искомого гена или его фрагмента мишени для амплификации. В случае же RAPD амплифицируется любой участок генома, содержащий две комплементарные праймеру последовательности, которые фланкируют сегмент ДНК длиной от 100 до 3000 п. н.
С помощью метода RAPD удалось отличить друг от друга шесть инбредных линий кукурузы и показать, что ПЦР-продукты гибридов кукурузы представляют собой сочетание ПЦР-продуктов родительских инбредных линий. RAPD-маркеры использовали также для скрининга разных штаммов грибов Leptosphaeria maculans, вызывающих заболевание «черная ножка» у крестоцветных. Было установлено различие между невирулентным (не приводящим к развитию болезни) и вирулентным (вызывающим заболевание) штаммами.

Молекулярная диагностика генетических заболеваний
Диагностика специфических наследственных заболеваний человека на генетическом уровне дает ответ на вопрос, входят ли обследуемые индивидуумы или их потомки в группу повышенного генетического риска. ДНК-анализ можно использовать для выявления носителей генов наследственных заболеваний, а также для пренатальной и пресимптоматической диагностики серьезных генетических нарушений.
Тесты на уровне ДНК позволяют безошибочно выявлять специфические мутации. Раньше для этого применялись биохимические методы, основанные на выявлении продукта анализируемого гена. ДНК-тесты не требуют экспрессии мутантного гена для его выявления, что позволяет разработать системы скрининга для всех моногенных заболеваний.

Серповидноклеточная анемия
Серповидноклеточная анемия генетическое заболевание, обусловленное заменой одного нуклеотида в кодоне, который соответствует шестой аминокислоте в (-цепи молекулы гемоглобина. У индивидов, гомозиготных по мутантному гену (S/S), эритроциты имеют необычную серповидную форму; это связано с искажением конформации молекулы гемоглобина вследствие замены в ней валина на глутаминовую кислоту. Мутантный гемоглобин не может с достаточной эффективностью переносить кислород, и у таких больных развивается тяжелая анемия с прогрессирующим поражением сердца, легких, мозга, суставов и других органов. У индивидов, гетерозиготных по данному гену (A/S) (носителей генетического заболевания), эритроциты имеют нормальную форму, и симптомы заболевания проявляются лишь в экстремальных условиях (на большой высоте над уровнем моря либо при слишком высоких или низких температурах, когда снижается снабжение организма кислородом). Если оба родителя гетерозиготны (имеют генотип A/S), то вероятность того, что их ребенок будет гомозиготным по мутантному гену (S/S) (т. е. будет болен серповидноклеточной анемией), составляет 25%. Ген серповидноклеточной анемии с высокой частотой встречается среди афроамериканцев и их потомков, а также среди латиноамериканцев. В США проводят скрининг для выявления носителей гена серповидноклеточной анемии, которые могут передать этот ген своим потомкам. Рассмотрим один из используемых для этого тестов.
Замена одного нуклеотида в (-глобиновом гене, приводящая к серповидноклеточной анемии, сопровождается элиминацией сайта для рестрицирующей эндонуклеазы CvnI. Этот фермент узнает последовательность CCTNAGG и расщепляет молекулу ДНК между основаниями С и Т (N любой из четырех нуклеотидов). В нормальном гене эта последовательность имеет вид CCTGAGG, а в гене серповидноклеточной анемии ССТGTGG. На этом различии основывается ДНК-диагностика данного заболевания.
Используя праймеры, фланкирующие сайт CvnI, амплифицируют с помощью ПЦР небольшое количество тестируемой ДНК. Амплифицированный фрагмент обрабатывают CvnI, продукты рестрикции разделяют с помощью гель-электрофореза и окрашивают их бромистым этидием. При наличии Cvn1-сайта на электрофореграмме появляется специфический набор полос, отличный от такового в отсутствие CvnI -сайта. Описанным способом можно без труда и достаточно быстро установить генетический статус обследуемого, не проводя при этом процедуру гибридизации.

Метод ПЦР/ЛОЗ
Не все генетические нарушения, приводящие к появлению дефектных генов, сопровождаются утратой или изменением сайтов рестрикции, поэтому для обнаружения однонуклеотидных замен применяют и другие подходы. В одном из них объединены ПЦР и метод, основанный на дотировании олигонуклеотидных зондов (ЛОЗ), ПЦР/ЛОЗ.
Предположим, что в определенном сайте нормального гена (скажем, в 106-м положении) находится пара А-Т, а в том же сайте мутантного гена G-C. Зная нуклеотидные последовательности, фланкирующие 106-й нуклеотид, можно синтезировать два коротких (20-нуклеотидных) фрагмента, прилегающих к данному сайту и комплементарных противоположным цепям. Основная особенность этой пары олигонуклеотидов состоит в том, что З'-концевой нуклеотид одного из них (зонд X) комплементарен основанию, находящемуся в 106-м положении нормальной последовательности, а 5'-концевой нуклеотид второго (зонд Y) комплементарен нуклеотиду, примыкающему к 106-му нуклеотиду. При отжиге этих зондов с содержащей нормальную последовательность ДНК-мишенью (амплифицированной методом ПЦР) происходит их полная гибридизация, и при добавлении в реакционную смесь ДНК-лигазы зонды X и Y ковалентно сшиваются. Ecли же эти зонды отжигаются с мутантной ДНК, в которой произошла замена 106-го нуклеотида, то некомплементарный ему 3'-концевой нуклетид зонда X не может образовать с ним пару. И хотя зонд Y по-прежнему гибридизуется полностью, ДНК-лигаза не может сшить зонды X и Y.
Можно синтезировать и другие олигонуклеотидные зонды, полностью соответствующие последовательности с мутантным 106-м нуклеотидом. При таком наборе зондов лигирование будет происходить в случае их отжига с мутантной ДНК-мишенью и не будет в случае отжига с нормальной мишенью. Таким образом, метод ПЦР/ЛОЗ различает две ситуации: лигирование зондов и отсутствие лигирования.
Чтобы определить, произошло ли лигирование, 5'-конец зонда X метят биотином, а З'-конец зонда Y дигоксигенином, низкомолекулярным соединением, связывающимся с соответствующим антителом. После гибридизации и лигирования проводят денатурацию ДНК для высвобождения гибридизовавшегося зонда и переносят смесь в небольшую пластиковую лунку, покрытую стрептавидином. Лунку промывают, чтобы удалить весь материал, кроме связавшегося со стрептавидином биотинилированного зонда. Затем добавляют в лунку антитела к дигоксигенину, предварительно соединенные со щелочной фосфатазой. После промывания, в ходе которого происходит удаление несвязанного конъюгата, добавляют бесцветный хромогенный субстрат. Окрашивание раствора в лунке свидетельствует о связывании антитела к дигоксигенину с зондом, меченным дигоксигенином, т. е. о том, что этот зонд был лигирован с зондом, меченным биотином. Если же окрашивания не происходит, значит лигирования не было.
Располагая двумя парами зондов, можно установить генетический статус любого человека. Например, ДНК гетерозиготных носителей дает положительный ответ с обеими парами зондов, ДНК лиц, обладающих двумя копиями нормального гена, только с тем набором зондов, который содержит нуклеотид, комплементарный нормальному сайту, и, наконец, ДНК индивидов с двумя измененными копиями гена только с набором зондов, детектирующим мутантный сайт. Чтобы минимизировать необходимое для анализа количество исходной ДНК, перед гибридизацией участок ДНК-мишени, содержащий тестируемый сайт, амплифицируют с помощью ПЦР.
ПЦР/ЛОЗ является быстрым, чувствительным и высокоспецифичным методом. Все его стадии роботизированы, что позволяет проводить до 1200 тестов в день.
Более простым, хотя и менее чувствительным вариантом ПЦР/ЛОЗ является метод лигазной цепной реакции. Тестируемую ДНК смешивают с избытком двух индикаторных зондов, описанных выше, в присутствии термостабильной ДНК-лигазы. Проводят лигирование при 65 С. затем повышают температуру до 94 °С. чтобы произошла денатурация образовавшихся гибридов зондДНК-мишень, и вновь понижают температуру до 65 °С для гибридизации свободных нелигированных индикаторных ЛОЗ-зондов с ДНК-мишенью. Этот цикл повторяют 20 раз. Если индикаторные ЛОЗ-зонды полностью комплементарны ДНК-мишени, то лигирование будет происходить в каждом цикле, и после 20 циклоп накопится достаточно продуктов лигирования («сшитых» зондов X и Y) для того, чтобы их можно было обнаружить с помощью электрофореза или ELISA. Если комплементарность неполная то лигирование не произойдет и никаких продуктов зарегистрировано не будет.

Генотипирование с использованием флуоресцентно меченных ПЦР-праймеров
Колориметрическое генотипирование основано на применении ПЦР-праймеров, меченных различными флуоресцентными красителями. Чтобы различить мутантную ДНК и ДНК дикого типа, проводят ПЦР с двумя разными праймерами. Один из них (Р1) комплементарен ДНК дикого типа и на 5'-конце помечен родамином (красный цвет), другой (РЗ) комплементарен мутантной ДНК и на 5'-конце помечен флуоресцеином (зеленый цвет). В обоих случаях амплификацию проводят в присутствии третьего, немеченного праймера (Р2), комплементарного противоположной цепи. Поскольку ПЦР может идти только в том случае, когда праймер полностью комплементарен ДНК-мишени, в присутствии в реакционной смеси всех трех праймеров будет амплифицироваться либо ДНК дикого типа, либо мутантная ДНК, либо обе они, в зависимости от ДНК-мишени, играющей роль матрицы. Если индивид гомозиготен по ДНК дикого типа, то после проведения ПЦР и удаления лишних праймеров будет наблюдаться флуоресценция красного цвета, если он гомозиготен по мутантной ДНК зеленого, а если присутствуют и мутантная ДНК, и ДНК дикого типа (т. е. индивид гетерозиготен) желтого. Этот метод можно автоматизировать и адаптировать для любого однонуклеотидного сайта-мишени в любом гене с известной нуклеотидной последовательностью.

Мутации в разных сайтах одного гена
Далеко не все генетические заболевания обусловливаются одним специфическим изменением в гене. В большинстве случаев мутации происходят в разных сайтах в пределах одного гена, но приводят к одному генетическому заболеванию. В качестве примера можно привести (-талассемию наследственное заболевание, связанное с утратой активности (-глобина. У гетерозиготных носителей при этом обычно наблюдается небольшая анемия. Индивиды же, гомозиготные по одному из как минимум восьми возможных мутантных сайтов, для поддержания жизни нуждаются в регулярном переливании крови и другом лечении. Поскольку мутация в любом из восьми специфических сайтов (-глобинового гена может приводить к (-талассемии, необходимо провести по крайней мере восемь разных тестов. Такая диагностика возможна, хотя и весьма дорогостояща.
Поэтому для скрининга мутаций, возникающих в разных сайтах одного гена, была разработана стратегия ПЦР/гибридизация, основанная на проведении одной реакции. Для этого синтезируют набор специфических 20-нуклеотидных зондов, каждый из которых полностью комплементарен фрагменту гена-мишени, несущему известную мутацию. К 3'-концу каждого зонда присоединен гомополимер poly(dT) длиной примерно 400 нуклеотидов, с помощью которого ДНК-зонд связывается с заранее отмеченной точкой на найлоновом фильтре, а остальная его часть остается свободной и может гибридизоваться. Сегменты тестируемой ДНК, каждый из которых включает по одному из возможных мутационных сайтов, одновременно амплифицируют с помощью ПЦР, причем один праймер из каждой пары на 5'-конце помечен биотипом. Амплифицированные фрагменты ДНК-мишени гибридизуют с зондами, пришитыми к фильтру, в условиях, обеспечивающих гибридизацию только полностью комплементарных последовательностей. В гибридизационную смесь добавляют стрептавидин, связанный с щелочной фосфатазой (можно также использовать пероксидазу хрена или уреазу). После гибридизации промывают фильтр и добавляют неокрашенный субстрат. Если имеет место полное соответствие между амплифицированным сегментом ДНК-мишени и специфическим олигонуклеотидным зондом, то на фильтре появится цветная точка. На один и тот же фильтр можно нанести несколько точек, соответствующих целому ряду разных специфических олигонуклеотидных зондов. Проанализировав эту цветную мозаику, можно идентифицировать один из многих возможных сайтов мутации.

Перспективы
Молекулярная диагностика это быстро развивающееся направление. Хотя его основные принципы уже сформировались, технические детали отдельных тестов могут различаться. Для получения в достаточном количестве ДНК-мишени сейчас успешно применяют ПЦР. Использование ПЦР и специфических зондов существенно повышает чувствительность тестов и позволяет применять нерадиоактивные хромогенные, хемилюминесцентные и флуоресцентные системы регистрации. Во многих случаях для выявления мутации или экзогенной ДНК инфекционного агента в исследуемом образце достаточно провести ПЦР с последующим электрофоретическим разделением продуктов. Не вызывает сомнения, что с помощью ДНК-диагностики можно будет выявлять большинство, а возможно и все наиболее распространенные генетические и инфекционные заболевания, а также новообразования.

Заключение
Любой эффективный диагностический тест должен быть: 1) высокоспецифичным в отношении молекулы-мишени; 2) достаточно чувствительным для выявления небольших количеств мишени; 3) достаточно простым, позволяющим без труда получать однозначные результаты. Существуют два типа методов молекулярной диагностики: один основан на сродстве антитела к конкретному антигену, другой на идентификации специфических нуклеотидных последовательностей с помощью гибридизации или ПЦР.
Наиболее распространенным иммунологическим методом является ELISA. Вкратце он состоит в следующем: 1) фиксация образца на твердой подложке; 2) добавление первого антитела, специфичного к антигену-мишени, и его связывание с антигеном-мишенью; 3) добавление конъюгата второе антителофермент, который присоединяется к первому антителу; 4) добавление неокрашенного субстрата, который под действием фермента, входящего в состав конъюгата, превращается в окрашенное соединение. Изменение цвета реакционной смеси свидетельствует о присутствии в образце молекулы-мишени.
ELISA применяется для обнаружения различных белков, идентификации вирусов и бактерий, а также определения низкомолекулярных соединений в широком спектре биологических образцов. Чтобы повысить специфичность первых антител, для диагностики часто используют моноклональные антитела. При этом для уменьшения стоимости прибегают к технике клонирования их фрагментов в Е. coli и получают комбинаторную библиотеку, а на ее основе широкий спектр комбинаций Fv-фрагментов.
Высокочувствительным и специфичным методом обнаружения нуклеотидных последовательностей в биологических образцах является гибридизация. Его использовали при разработке способов идентификации патогенных микроорганизмов в клинических образцах и различных микроорганизмов в окружающей среде.
ДНК-диагностика основывается на обнаружении известных нуклеотидных последовательностей; для этого синтезируют специфические праймеры и амплифицируют последовательность-мишень. Это позволяет использовать нерадиоактивные системы детекции (например, хемилюминесцентный метод) или регистрировать ПЦР-продукты методом гель-электрофореза. Кроме того, ПЦР-продукты можно пометить флуоресцентным красителем, присоединив его к 5'-концу праймера.
В судебной медицине все более широкое применение находит метод геномной дактилоскопии, основанный на том, что ДНК каждого человека образует уникальный набор гибридизационных полос. При этом в качестве зондов обычно используют минисателлитные ДНК человека, которые не кодируют никаких белков и отличаются высокой вариабельностью.
Для характеристики ДНК растений используют набор произвольных олигонуклеотидных праймеров, проводят ПЦР-амплифицикацию случайных фрагментов ДНК, осуществляют электрофорез и получают специфичный для каждого растения набор полос ДНК; данный подход носит название RAPD.
Методы ДНК-диагностики применяют также для обнаружения точковых мутаций в данном гене. Один из подходов заключается в лигировании двух олигонуклеотидных праймеров. При несоответствии всего одного нуклеотида в месте стыковки гибридизовавшихся олигонуклеотидов лигирования не происходит.


ЛЕКЦИЯ 6.
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ ПРОИЗВОДСТВО ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ.
До появления технологии рекомбинантных ДНК многие лекарственные препараты на основе белков человека удавалось получать только в небольших количествах, их производство обходилось очень дорого, а механизм биологического действия иногда был недостаточно изучен. Предполагалось, что с помощью новой технологии можно будет получать весь спектр таких препаратов в количествах, достаточных как для их эффективного тестирования, так и для применения в клинике. И эти ожидания оправдались. На сегодняшний день клонировано более 400 генов (в основном в виде кДНК) различных белков человека, которые в принципе могут стать лекарственными препаратами. Большинство этих генов уже экспрессированы в клетках-хозяевах, и сейчас их продукты проходят проверку на возможность применения для лечения различных заболеваний человека. Впрочем, хотя более 30 таких биотехнологических препаратов и получило одобрение в США, пройдет еще несколько лет, прежде чем они будут рекомендованы для широкого использования и поступят в продажу; вначале их подвергнут проверке на животных и проведут тщательные клинические испытания. Однако фармацевтические фирмы уже сейчас проявляют к ним интерес. По подсчетам специалистов, ежегодный объем мирового рынка лекарственных препаратов на основе белков человека составляет около 150 млрд. долларов и постоянно растет. Объем мирового рынка лекарственных средств на основе рекомбинантных белков увеличивается на 1214% в год.
Разработка новых методов профилактики и лечения многих заболеваний человека внесла огромный вклад в рост благосостояния людей в XX в. Однако этот процесс никогда нельзя считать завершенным. Так называемые «старые» заболевания (например, туберкулез) могут дать о себе знать вновь, как только будут ослаблены профилактические меры или появятся резистентные штаммы. Весьма привлекательной выглядит перспектива применения в качестве терапевтических средств специфических антител; их можно будет использовать для нейтрализации токсинов, борьбы с бактериями, вирусами, для лечения раковых заболеваний. Антитело можно уподобить самонаводящейся ракете, которая либо нейтрализует «нарушителя» - чужеродный агент, либо, если она оснащена «боеголовкой», разрушает специфическую клетку-мишень. К сожалению, несмотря на многообещающие возможности, антитела довольно редко применялись для профилактики и лечения болезней и других патологий. И лишь в последнее время, с развитием технологии рекомбинантных ДНК и разработкой методов получения моноклональных антител и с расшифровкой молекулярной структуры и функии иммуноглобулинов, интерес к применению специфических антител для лечения различных заболеваний вновь пробудился.

Лекарственные препараты
Выделение кДНК интерферонов
Для выделения генов или кДНК белков человека используют разные подходы. В ряде случаев выделяют нужный белок и определяют аминикислотную последовательность соответствуйшего участка молекулы. Исходя из этого находят кодирующую его нуклеотидную последовательность, синтезируют соответствующий олигонуклеотид и используют его в качестве гибридизационного зонда для выделения нужного гена или кДНК из геномных или кДНК-библиотек. Другой подход состоит в выработке антител к очищенному белку и использовании их для скрининга библиотек, в которых происходит экспрессия определенных генов. Для белков человека, синтезируемых преимущественно в какой-то одной ткани, кДНК-библиотека, полученная на основе мРНК, выделенной из этой ткани, будет обогащена последовательностью ДНК-мишени. Например, основным белком, синтезируемым клетками островков Лангерганса поджелудочной железы, является инсулин, и 70% мРНК, выделенных из этих клеток, кодируют именно его. Однако принцип обогащения кДНК неприменим для тех белков человека, количество которых очень мало или место синтеза которых неизвестно. В этом случае могут понадобиться другие экспериментальные подходы. Интерфероны (ИФ) человека, включающие (-,(- и ( - интерфероны (ИФ(, ИФ(, ИФ(), это природные белки, каждый из которых может найти свое терапевтическое применение. При выделении их кДНК пришлось разработать новый подход, позволяющий преодолеть трудности, связанные с недостаточным содержанием соответствующих мРНК и белков. Процедура выделения кДНК интерферонов состояла в следуюшем.

1. Из лейкоцитов человека выделили мРНК и фракционировали ее по размерам; провели обратную транскрипцию и встроили в сайт PstI плазмиды pBR322.
2. Полученным продуктом трансформировали Escherichia соli. Образовавшиеся 6000 клонов подразделили на 12 групп: по 512 клонов в каждой. Тестирования проводили на группе клонов, что позволило ускорить процесс их идентификации.
3. Каждую группу клонов гибридизовали с неочищенным препаратом ИФ-мРНК.
4. Из образовавшихся гибридов, содержащих клонированную ДНК и мРНК, выделили мРНК и провели ее трансляцию в бесклеточной системе синтеза белка.
5. Определили интерферонную противовирусную активность каждой смеси, полученной в результате трансляции. Группы, проявившие интерферонную активность, содержали клон с кДНК, гибридизовшейся с ИФ-мРНК.
6. Позитивные группы разбили на 8 подгрупп, содержащих по 64 клона, и вновь провели тестирование. Разбиение на подгруппы повторяли до тех пор, пока не идентифицировали клон, содержащий полноразмерную ИФ-кДНК человека.
Если нужно получить большие количества ИФ, соответствующую кДНК можно субклонировать в экспрессирующем Е.соli-векторе, который позволяет достичь высокого уровня экспрессии.


Интерфероны человека, полученные методом генной инженерии
Первый ген интерферона был выделен в начале 80-х гг. С тех пор было обнаружено несколько разных интерферонов. Как мы уже говорили, исходя из химических и биологических свойств всех их можно подразделить на три группы: ИФ(, ИФ( и ИФ(. ИФ( и Иф( синтезируются клетками, обработанными препаратами вирусов или вирусной РНК, а ИФ( вырабатывается в ответ на действие веществ, стимулирующих рост клеток. ИФ( кодируется семейством генов, включающим как минимум 15 неаллельных генов, в то время как ИФ( и ИФ( кодируются одним геном каждый. Подтипы ИФ( проявляют разную специфичность. Например, при проверке эффективности ИФ(1, и ИФ(2 на обработанной вирусом линии клеток быка эти интерфероны проявляют сходную противовирусную активность, в случае же обработанных вирусом клеток человека ИФ(2 оказывается в семь раз активнее, чем Иф(1. Если противовирусная активность проверяется на клетках мыши, то ИФ(2 оказывается в 30 раз менее эффективным, чем ИФ(1.
Было предпринято несколько попыток создать ИФ с комбинированными свойствами, используя тот факт, что члены семейства ИФ( различаются по степени и специфичности своей противовирусной активности. Теоретически этого можно достичь, соединив части последовательностей генов разных ИФ(. Это приведет к образованию гибридного белка с другими свойствами, чем у каждого из исходных белков. Сравнение последовательностей кДНК ИФ(1, и ИФ(2 показало, что они содержат одинаковые сайты рестрикции в позициях 60, 92 и 150. После расщепления обеих кДНК в этих сайтах и последующего лигирования фрагментов было получено несколько гибридных генов. Эти гены экспрессировали в Е. coli, синтезированные белки очистили и исследовали их биологические функции. Проверка защитных свойств гибридных ИФ на культуре клеток млекопитающих показала, что некоторые из них проявляют большую активность, чем родительские молекулы. Кроме того, многие гибридные ИФ индуцировали образование 2'5'-олигоизоаденилатсинтетазы в контрольных клетках. Этот фермент участвует в синтезе 2'5'-связанных олигонуклеотидов, которые в свою очередь активируют латентную клеточную эндорибонуклеазу, расщепляющую вирусную мРНК. Другие гибридные ИФ проявляли большую, чем родительские молекулы, антипролиферативную активность в культурах различных раковых клеток человека.

Гормон роста человека, полученный методом генной инженерии
Стратегию конструирования новых белков путем замены функциональных доменов или с помощью направленного мутагенеза можно использовать для усиления или ослабления биологического действия белка. Например, нативный гормон роста человека (ГРЧ) связывается в разных типах клеток как с рецептором гормона роста, так и с пролактиновым рецептором.
Чтобы избежать нежелательных побочных эффектов в процессе лечения, нужно исключить присоединение ГРЧ к пролактиновому рецептору. Поскольку участок молекулы гормона роста, связывающийся с этим рецептором, по своей аминокислотной последовательности лишь частично совпадает с участком молекулы, который взаимодействует с пролактиновым рецептором, удалось избирательно снизить связывание гормона с последним. Для этого использовали сайт-специфический мутагенез, в результате которого произошли определенные изменения в боковых группах некоторых аминокислот (His-18, His-21 и Glu-174) лигандов для ионов Zn2+, необходимых для высокоаффинного связывания ГРЧ с пролактиновым рецептором. Модифицированный гормон роста связывается только со «своим» рецептором. Полученные результаты представляют несомненный интерес, но смогут ли модифицированные ГРЧ найти применение в клинике, пока неясно.

Оптимизация генной экспрессии
Недостаточно создать новый белок, важно оптимизировать экспрессию его гена. Для начала исследователи определяют возможность синтеза достаточных количеств аутентичного белка и прокариотической или эукариотической системах экспрессии. Прокариотическим системам отдается предпочтение, поскольку работа с ними обходится дешевле, а производительность выше. К сожалению, не все микроорганизмы синтезируют функциональные формы гетерологичных белков с одинаковой эффективностью, поэтому необходимо проводить сравнительные количественные оценки.
При изучении экспрессии гена интерлейкина-3 человека в различных клетках-хозяевах «наилучшим» хозяином оказалась Bacillus licheniformis. Хотя в одной из систем Е. coli был достигнут несколько более высокий уровень экспрессии, полученный белок мол. массой 20 кДа представлял собой продукт слияния интерлейкина-3 с участком (-галактозидазы Е. coli, а не зрелый аутентичный белок мол. массой 15 кДа. Как правило, подобный химерный белок нельзя использовать в качестве лекарственного средства. Клетки дрожжей Kluyveromyces lactis и Saccharomyces cerevisiae, а также клетки человека были способны гликозилировать интерлейкин-3, однако уровень экспрессии в них был относительно низок. Гликозилирование не оказывает заметного влияния на активность интерлейкина-3, но ведет к ощутимой разнице в размерах молекулы.


Ферменты
ДНКаза I
Наиболее частым летальным наследственным заболеванием среди европеоидов является муковисцидоз. В США выявлено 30 000 случаев этого заболевания, в Канаде и странах Европы - 23 000. Пациенты с муковисцидозом часто страдают инфекционными заболеваниями, поражающими легкие. Лечение рецидивирующих инфекций антибиотиками в конце концов приводит к появлению резистентных штаммов патогенных бактерий. Бактерии и продукты их лизиса вызывают накопление в легких вязкой слизи, затрудняющей дыхание. Одним из компонентов слизи является высокомолекулярная ДНК, которая высвобождается из бактериальных клеток при лизисе. Ученые из биотехнологической компании Genentech (США) выделили и экспрессировали ген ДНКазы - фермента, который расщепляет высокомолекулярную ДНК на более короткие фрагменты. Очищенный фермент вводят в составе аэрозоля в легкие больных муковисцидозом, он расщепляет ДНК, вязкость слизи снижается, что облегчает дыхание. Хотя эти меры и не излечивают муковисцидоз, они облегчают состояние больного. Применение данного фермента было недавно одобрено Департаментом по контролю за качеством пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств (США), и объем его продаж составил в 2000 г. примерно 100 млн. долларов.
Альгинат-лиаза
Альгинат это полисахарид, синтезируемый целым рядом морских водорослей, а также починными и морскими бактериями. Его мономерными единицами являются два сахарида (-D-маннуронат и (-L-гулуронат, относительное содержание и распределение которых и определяют свойства конкретного альгината. Так, остатки (-L-гулуроната образуют межцепочечные и внутрицепочечные сшивки путем связывания ионов кальция; остатки (-D-маннуроната связывают ионы других металлов. Альгинат, содержащий такие сшивки, образует эластичный гель, вязкость которого прямо пропорциональна размеру полисахаридных молекул.
Выделение альгината слизистыми штаммами Pseudomonas aeruginosa существенно повышает вязкость слизи у больных муковисцидозом. Чтобы очистить дыхательные пути и облегчить состояние больных, в дополнение к обработке ДНКазой I следует провести деполимеризацию альгината с помощью альгинат-лиазы.
Ген альгинат-лиазы был выделен из Flavobacterium sp., грамотрицательной почвенной бактерии, ативно вырабатывающей этот фермент. На основе Е. coli был создан банк клонов Flavobacterium и проведен скрининг тех из них, которые синтезируют альгинат-лиазу, путем высевания всех клонов на твердую среду, содержащую альгинат, с добавлением ионов кальция. В таких условиях весь альгинат, находящийся в среде, за исключением того, который окружает продуцирующие альгинат-лиазу колонии, образует сшивки и становится мутным. Гидролизованный альгинат теряет способность к формированию сшивок, поэтому среда вокруг синтезирующих альгинат-лиазу колоний остается прозрачной. Анализ клонированного фрагмента ДНК, присутствующего в одной из положительных колоний, показал наличие открытой рамки считывания, кодирующей полипептид мол. массой около 69 000. Более детальные биохимические и генетические исследования показали, что этот полипептид, по-видимому, является предшественником трех альгинат-лиаз, вырабатываемых Flavobacterium sp. Сначала какой-то протеолитический фермент отрезает от него N-концевой пептид массой около 6000. Оставшийся белок мол. массой 63 000 способен деполимеризовать альгинат, вырабатываемый как бактериями, так и морскими водорослями. При его последующем разрезании образуется продукт мол. массой 23 000, деполимеризующий альгинат морских водорослей, и фермент мол. массой 40 000, разрушающий альгинат бактерий. Для получения больших количеств фермента мол. массой 40 000 кодирующую его ДНК амплифицировали методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), а затем встраивали в выделенный из В. subtilis плазмидный вектор, несущий ген, кодирующий сигнальный пептид (-амилазы В. subtilis. Транскрипцию контролировали при помощи системы экспрессии гена пенициллиназы. При трансформации клеток В. subtilis полученной плазмидой и высевании их на содержащую альгинат твердую среду с добавлением ионов кальция образовались колонии с большим ореолом. Когда такие колонии выращивали в жидкой среде, рекомбинантная альгинат-лиаза выделялась в культуральную среду. Последующие тесты показали, что этот фермент способен эффективно разжижать альгинаты, синтезируемые слизистыми штаммами P. aeruginosa, которые были выделены из легких больных муковисцидозом. Для того чтобы определить, целесообразно ли проводить клиническое тестирование рекомбинантной альгинат-лиазы, нужны дополнительные исследования.

Моноклональные антитела как лекарственные средства
Примерно 100 лет назад была предпринята попытка лечения детей, больных дифтерией, с помощью неочищенной антисыворотки, полученной от лошадей, которых инфицировали Corynebacterium diphtheriae, вызывающей дифтерию у человека. С. diphtheriae инфицирует горло и миндалины, выделяя экзотоксин, приводящий к гибели клеток человека. Проникая в кровоток, этот токсин поражает органы, удаленные от места первичной инфекции, и в отсутствие лечения болезнь может иметь летальный исход. (В те времена, о которых идет речь, смертность достигала 45%.) Однако, если больному в первые несколько дней после начала инфекции ввести лошадиную антисыворотку, содержащую антитела к этому экзотоксину, то у него возникнет пассивный иммунитет, который позволяет избежать летального исхода.
К сожалению, риск, связанный с использованием антител, не позволяет широко применять этот метод терапии. Дело в том, что в организме больного часто вырабатываются собственные антитела на чужеродные белки, присутствующие в цельной или частично очищенной антисыворотке, и ее повторное введение в случае сенсибилизации организма может привести к развитию анафилактического шока и гибели пациента.
С развитием гибридомной технологии вновь появилась надежда на то, что антитела можно будет использовать в качестве терапевтических средств для поддержания постоянного уровня чистых моноспецифичных антител в организме. Однако остаются проблемы, связанные с риском развития перекрестных реакций, приводящих к развитию иммунного ответа и анафилаксии: ведь в организме больного могут вырабатываться собственные антитела на детерминанты моноклональных антител мыши. Поэтому основная задача в настоящее время состоит в том, чтобы разработать методы получения моноклональных антител человека, обладающих как специфическими иммунотерапевтическими свойствами, так и пониженной иммуногенностью.

Структура и функции антител
Молекула антитела (иммуноглобулин) состоит и: двух «легких» (L) и двух «тяжелых» (Н) белковых цепей, которые соединены водородными связями и расположенными в строго определимых местах дисульфидными мостиками. N концевые участки L- и Н-цепей образуют антигенсвязывающий сайт. Отдельные домены (области) молекулы антитела выполняют разные функции, что облегчает манипуляции с генами антител. Антигенсвязывающие сайты состоят из трех участков, определяющих комплементарность антител к антигену (CDR, от англ, complementarity-determining regions), и образующих вариабельные (VH и VL) области на N-концах Н- и L-цепей. Для CDR характерна очень высокая изменчивость последовательности аминокислот, поэтому их еще называют гипервариабельными. Помимо вариабельных (VH и VL), каждая L-цепь содержит одну константную область, или домен (CL), а каждая Н-цепь три константных области, или домена (СН1, СН2 и Снз). При обработке антитела протеолитическим ферментом папаином образуются три фрагмента: два идентичных (Fab), каждый из которых содержит интактную L-цепь, связанную дисульфидным мостиком с VH- и СН1-доменами Н-цепи, и один Fc, состоящий из двух соединенных дисульфидной связью СН2- и Снз-доменов Н-цепи. Fab-фрагмент, точнее его N-концевая часть, называемая Fv-фрагментом; обладает антигенсвязываюшей активностью, присущей интактной молекуле антитела. При этом его аминокислотная последовательность у разных молекул существенна различается.
После связывания антигена с интактным антителом запускаются следующие реакции иммунного ответа.
Активируется система комплемента. Компоненты этой системы разрушают клеточные мембраны, активируют фагоциты и генерируют сигналы, мобилизующие другие компоненты системы иммунного ответа.
В результате связывания Fc-участка антитела с Fc-рецептором эффекторной клетки запускается реакция опосредованной антителами клеточной цитотоксичности. Активированная эффекторная клетка высвобождает вещества, лизирующие чужеродную клетку, с которой связан Fab-участок молекулы антитела.
После связывания Fab-участка с растворимым антигеном Fc-участок антитела может присоединяться к Fc-рецепторам фагоцитов, которые захватывают и разрушают комплекс антигенантитело.
Профилактика отторжения трансплантированных органов
В 1970-х гг. были пересмотрены взгляды на пассивную иммунизацию: ее стали считать профилактическим средством борьбы с отторжением трансплантированных органов. Предлагалось вводить пациентам специфические антитела, которые будут связываться с лимфоцитами определенного типа, уменьшая иммунный ответ, направленный против пересаженного органа.
Первыми веществами, рекомендованными Департаментом по контролю за качеством пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств (США) для использования в качестве иммуносупрессоров при пересадке органов у человека, были моноклональные антитела мыши ОКТЗ. За отторжение органов отвечают так называемые Т-клетки лимфоциты, дифференцирующиеся в тимусе. ОКТЗ связываются с рецептором, находящимся на поверхности любой Т-клетки, который называется CD3. Это предупреждает развитие полного иммунного ответа и отторжение трансплантированного органа. Подобная иммуносупрессия весьма эффективна, хотя и оказывает некоторые побочные действия, например, вызывает лихорадку и приводит к появлению сыпи.

Лекарственные вещества, связанные с моноклональными антителами Лекарственные вещества, проявляющие высокую активность при тестировании in vitro (обычно в культуре клеток), зачастую оказываются значительно менее эффективными in vivo. Kажущееся снижение их активности объясняется тем, что они не достигают органа или клетки-мишени в нужной концентрации. Увеличение дозы принимаемого препарата не решает проблему, поскольку при этом часто возникают побочные эффекты. Более того, чтобы избежать таких эффектов, многие терапевтические cpедства заведомо вводят в дозах, не достигают оптимальных, что дополнительно снижает их эффективность. Для облегчения доставки лекарственного вещества к месту его действия используют несколько приемов. 1. Заключают его в особые частицы липосомы, липидная.точка которых имеет высокое сродство к нужным органам.
2. Встраивают гены специфических токсинов в инфильтрирующие опухоль лимфоциты, которые высвобождают эти токсины непосредственно в опухоли.
3. Присоединяют молекулы лекарственных веществ к моноклональным антителам, специфичным по отношению к белкам, находящимся на поверхности строго определенных клеток, например опухолевых.
4. Используют лекарственные вещества в неактивной форме, переводя их в активное состояние при помощи ферментов. Чтобы такое превращение происходило только вблизи клетки-мишени, фермент присоединяют к моноклональному антителу, специфичному к поверхностному антигену этой клетки.
Для эффективной работы последней из описанных систем необходимо, чтобы а) моноклональное антитело, связанное с ферментом, переводящим лекарственное вещество в активную форму, было в достаточной степени очищено и имелось в нужном количестве; б) связывалось с высокоспецифичным для клетки-мишени белком: в) было стабильным в физиологических условиях, но в то же время быстро выводилось из кровотока; 2) при необходимости могло проникать в опухолевую ткань, обеспечивая действие препарата на все ее клетки. В этом случае мишенями оказываются строго определенные клетки, что позволяет использовать лекарственное вещество в гораздо меньших дозах, чем при прямом введении. Применение в такой системе моноклональных антител мыши может приводить к развитию иммунного ответа, поэтому очень важно использовать фрагменты антител человека или антител, максимально сходных с ними по структуре.
Наиболее частой причиной смерти в странах Северной Америки и Европы является тромбоэмболия мозговых или сердечных артерий. Тромб состоит из молекул фибрина, фактора связывающей системы крови, образующего сеть в ответ на повреждение сосудистой стенки. В норме молекулы фибрина в образовавшемся тромбе расщепляются с помощью плазмина сериновой протеиназы, который образуется из плазминогена под действием активатора. Однако нередко эта биологическая система работает недостаточно эффективно, что приводит к закупорке артерий. В таких ситуациях для повышения уровня плазмина в крови было предложено использовать активатор плазминогена в качестве терапевтического средства.
Однако плазмин способен разрушать и предшественник фибрина фибриноген, и если уровень последнего в результате терапии с использованием активатора плазминогена снизится слишком сильно, могут произойти обширные внутренние кровотечения. Это привело к необходимости создания тромболитических препаратов, разрушающих только фибрин в тромбе. Ученые исходили из того, что если к активатору плазминогена «пришить» антитело, специфичное к фибрину, то будет происходить только локальное повышение концентрации плазмина вблизи тромба. Для проверки этой гипотезы тканеспецифичный активатор плазминогена был присоединен к моноклональному антителу, специфичному в отношении фибрина. Испытания на модельных системах показали, что комплекс присоединялся к сгусткам крови и лизировал их, не вызывая значительного разрушения фибриногена. Были созданы и другие типы конъюгатов антителоактиватор плазминогена, тоже приводящие к локальному образованию плазмина, разрушающего кровяные сгустки.

Моноклинальные антитела человека.
Несмотря на кажущуюся перспективность иммунотерапии, этот метод имеет и ряд ограничений, связанных с применением моноклональных антител животных и процедурой присоединения к ним нужных молекул. Сам процесс химического присоединения весьма неэффективен, присоединение происходит случайным образом, а кроме того, при этом может снижаться ферментативная активность активатора плазминогена или других веществ, используемых в терапии. И наконец, если предполагается многократное введение препарата, необходимо использовать антитела человека, а не животных, чтобы предотвратить возникновение перекрестных иммунных реакций и сенсибилизацию пациента.
Создание специфических антител, не вызываюших перекрестных реакций, представляет собой довольно трудную задачу, поскольку получение антител человека путем традиционной гибридомной технологии сталкивается с рядом проблем.
Хромосомы человека в клетках, полученных слиянием лимфоцитов человека с клетками миеломы мыши, нестабильны, поэтому трудно получить клетки, способные вырабатывать моноклональные антитела человека.
Пока не удалось получить эффективые клеточные линии миеломы человека, которые могли бы заменить мышиные.
Иммунизация человека различными антигенами не проводится по соображениям этического характера.
Таким образом, для получения антител человека необходимо разрабатывать другие подходы.
В одной из схем В-лимфоциты человека, активно продуцирующие специфические антитела, обработали флуоресцентно меченным антигеном, затем с помощью клеточного сортера провели обогащение образца В-лимфоцитами, вырабатывающими эти антитела. Поскольку В-клетки плохо растут в культуре, для улучшения роста их трансформировали вирусом ЭпштейнаБарр. Некоторые клоны трансформированных В-клеток вырабатывают моноклональные антитела человека, взаимодействующие с селектирующим антигеном. К сожалению, выход моноклональных антител был очень небольшим и они обладали низкой антигенсвязывающей активностью. К тому же вероятность того, что в неиммунизированном организме найдутся секретирующие антитела клетки, которые будут распознавать селектирующий антиген, очень мала.
Еще один подход заключается во введении иммунных клеток человека мутантным мышам, которые практически лишены собственной иммунной системы. После трансплантации иммунных стволовых клеток человека таким мышам, страдающим тяжелым сочетанным иммунодефицитом (scid-мыши), они приобретают клетки иммунной системы человека и в ответ на введение антигена могут вырабатывать антитела человека.
Предпринимаются попытки ввести зародышам мышей гены иммуноглобулинов человека с целью создания трансгенных мышей, которые в ответ на иммунизацию конкретным антигеном смогут вырабатывать иммуноглобулины человека. Чтобы получить от трансгенных животных клетки, секретирующие специфические моноклональные антитела, можно использовать стандартную гибридомную технологию, затем провести скрининг таких положительных клеточных линий и определить, какие из них вырабатывают антитела, кодируемые генами иммуноглобулинов человека. Недавно появилось сообщение о том, что уже получена трансгенная мышь, экспрессируюшая нативные формы Н- и L-цепей иммуноглобулинов человека.
Трансплантация стволовых клеток иммунной системы человека scid-мышам и получение линий трансгенных мышей весьма трудоемкие способы производства моноклональных антител человека. Поэтому ученые пытаются создать генноинженерные методы получения антител человека, которые можно использовать в качестве терапевтических средств, и эффективных бифункциональных белков, способных связываться с мишенью и разрушать ее.


Полипептид, обладающий действием лейкоцитарного интерферона человека, синтезируется в Е. coli.
В конце 70-хначале 80-х гг. молекулярная биотехнология стала привлекать к себе внимание общественности и крупных инвесторов. Одним из биотехнологических продуктов был интерферон, на который в то время возлагали надежды как на чудодейственное средство против множества вирусных заболеваний и рака. О выделении кДНК интерферона человека и его последующей экспрессии в Escherichia coli сообщали газеты и журналы всего мира.
Некоторые особенности интерферона сделали выделение его кДНК особенно сложным. Во-первых, несмотря на то что интерферон был очищен более чем в 80 000 раз, его удавалось получать лишь в очень небольших количествах, поэтому в то время не была известна его точная мол. масса. Во-вторых, в отличие от многих белков интерферон не обладает легко идентифицируемой химической или биологической активностью: ее оценивали только по снижению цитопатического действия вируса животных на культуру клеток, а это сложный и длительный процесс. В-третьих, в отличие от инсулина было неизвестно, есть ли клетки человека, способные вырабатывать интерферон в достаточно больших количествах, т. е. существует ли источник мРНК интерферона. Несмотря на все эти трудности, в конце концов была выделена и охарактеризована кДНК, кодирующая интерферон. С тех пор было обнаружено несколько разных типов интерферонов. Были выделены гены нескольких интерферонов и показана их эффективность при лечении различных вирусных заболеваний, но, к сожалению, интерферон не стал панацеей.

Гибридные моноклональные антитела человека и мыши
Тот факт, что разные участки молекулы иммуноглобулина выполняют разные функции, позволяет модифицировать моноклональное антитело мыши таким образом, что оно приобретает некоторые сегменты антитела человека, сохраняя в то же время свою исходную антигенсвязываюшую специфичность. Такое гибридное антитело называют химерным. Первым участком моноклонального антитела мыши, который был заменен соответствующим участком антитела человека, был Fc-фрагмент. Выбор объяснялся тем, что Fc-фрагмент антитела мыши выполнял роль эффектора иммунного ответа у человека недостаточно хорошо; кроме того, он с большой вероятностью индуцировал образование антител в организме человека. Чтобы снизить иммуногенность и усилить эффекторные функции, провели замену последовательностей ДНК, кодирующих Fv-области L- и Н-цепей иммуноглобулина человека, на аналогичные фрагменты специфического моноклонального антитела мыши. Такую замену можно осуществить разными путями: реплицировать ДНК in vitro с применением олигонуклеотидов в качестве затравки либо использовать субклонированные фрагменты ДНК. Сегменты ДНК, кодирующие химерные цепи, встраивали в экспрессирующий вектор и вводили в культуру В-лимфоцитов, из которой выделяли наработанные антитела.
Химерные антитела, несущие антигенсвязывающий участок моноклонального антитела мыши к поверхностному антигену клеток рака толстой кишки человека, тестировали на больных с раком толстой и прямой кишки. Антитела оставались в кровотоке примерно в шесть раз дольше обычных антител мыши, тем самым оказывая свое действие в течение большего времени. При этом лишь у одного пациента из 10 наблюдался слабо выраженный иммунный ответ. К сожалению, в этих испытаниях не удалось получить противоопухолевого эффекта антител: возможно, это было связано с введением их в слишком малых дозах или с тем, что раковый процесс находился на поздних стадиях. В опытах in vitro химерные антитела проявляли высокую эффекторную активность, что позволяет надеяться на успешное их применение в других случаях.
Конструирование химерных молекул, о которых шла речь выше, это первый этап в сочетании моноклональных антител мышей и крыс, обладающих сходством с антителами человека. Другой подход состоит в замещении только CDR-участков человеческих антител фрагментами моноклональных антител грызунов. Такие «восстановившие форму» антитела человека могут стать эффективным терапевтическим средством, поскольку они по своей антигенсвязывающей способности приближены к исходным моноклональным антителам грызунов.
Моноклональные антитела грызунов, сходные с антителами человека, можно получить, выделив кДНК L- и Н-цепей из клеточной линии гибридомы грызунов и амплифицировав их вариабельные области с помощью ПЦР. В качестве праймеров для амплификации можно использовать олигонуклеотиды, комплементарные высококонсервативным сегментам ДНК, фланкирующим с 5'- и 3'-концов последовательность, кодирующую вариабельную область. Зная нуклеотидные последовательности кДНК вариабельных областей легкой и тяжелой цепей (VL и vh), легко определить границы CDR, основываясь на том, что соответствующие им последовательности гипервариабельны, в то время как каркасные области относительно консервативны. Исходя из данных о нуклеотидных последовательностях ДНК, кодирующих CDR грызунов, синтезировали шесть пар олигонуклеотидных праймеров. Каждая пара инициировала синтез ДНК, кодирующей одну из шести CDR грызунов: три, локализованных на L-цепи, и три на Н-цепи. Кроме того, на 5'-конце каждого праймеpa находилось 12 дополнительных нуклеотидов, комплементарных фланкирующим последовательностям каркасных участков ДНК человека, по которым происходило встраивание CDR-ДНК грызунов. Далее с помощью олигонуклеотид-направленного мутагенеза осуществляли последовательную замену CDR-ДНК человека амплифицированной CDR-ДНК грызунов фактическую «пересадку» CDR от грызунов в каркасные участки молекулы антитела человека. Модифицированную таким образом кДНК антител встраивали в векторы экспрессии и трансформировали ими подходящие клетки-хозяева, обычно Е. coll или клетки млекопитающих, в которых и вырабатывались антитела.
Данный метод предполагает, что за антиген-связывающую способность антитела отвечают только CDR-участки, а не каркасные области. Однако, если связывание «гибридного» антитела с антигеном происходит недостаточно эффективно, может возникнуть необходимость в замене некоторых аминокислот в каркасных областях с помощью олигонуклеотид-направленного мутагенеза.
К настоящему времени этим методом получено более 50 различных моноклональных антител, обладающих сходством с антителами человека. К сожалению, данная технология, являясь весьма эффективной и универсальной, довольно дорогостоящая и требует больших затрат времени. Возможно, более предпочтительным способом получения антител человека и их фрагментов окажется метод, основанный на использовании фаговых «комбинаторных» библиотек, созданных на основе мРНК, полученной из В-клеток неиммунизированных доноров.


Производство антител с помощью Е. coli
Гибридомы, подобно большинству других клеточных культур животных, растут относительно медленно, не достигают высокой плотности и требуют сложных и дорогих сред. Получаемые таким образом моноклональные антитела очень дороги, что не позволяет широко использовать их в клинике. Чтобы решить эту проблему, были предприняты попытки создания своего рода «биореакторов» на основе генетически модифицированных бактерий, растений и животных. Для эффективной доставки и функционирования некоторых иммунотерапевтических средств зачастую достаточно одной антигенсвязывающей области антитела (Fab- или Fv-фрагмента), т. е. присутствие Fc-фрагмента антитела необязательно.
Методика получения функциональных антител с помощью Е. coli.
1. Используя мРНК, выделенную из вырабатывающих антитела клеток (В-лимфоцитов) мыши или человека, синтезируют кДНК.
2. Проводят раздельную ПЦР-амплифицикацию кДНК, кодирующих Н- и L-цепи.
3. Амплифицированные кДНК обрабатывают специфическими рестрицирующими эндонуклеазами, а затем встраивают в вектор на основе бактериофага (. кДНК Н- и L-цепей содержат разные, характерные для каждой из них эндонуклеазные сайты, что облегчает специфическое встраивание каждой нуклеотидной последовательности в свой вектор. На этом этапе происходит клонирование множества разных сегментов Н- и L-цепей
4. кДНК одной Н- и одной L-цепи встраивают в общий «комбинаторный» вектор, так что в бактериофаге синтезируются обе цепи и образуется «полноценный» Fv-фрагмент..
Синтез Н- и L-цепей происходит во время литического цикла бактериофага (, поэтому можно провести скрининг библиотеки клонов комбинаторных бактериофагов с целью определения их антигенсвязывающей активности.
На этапе соединения кДНК Н- и L-цепей в одном векторе образуется широкий спектр генов различных антител. Некоторые из них кодируют уникальные сайты связывания, получить которые с помощью обычной гибридомной технологии было бы невозможно. Пул антител млекопитающих включает 106108 разных антител. Фаговая библиотека содержит примерно столько же клонов, поэтому можно ожидать, что одна комбинаторная библиотека будет вырабатывать такое же количество различных антител (Fv-молекул), как любое млекопитающее. Кроме того, однажды создав исходную комбинаторную библиотеку, можно комбинировать L- и Н-цепи и получать Fv-фрагменты, распознающие необычные эпитопы. Еще большего разнообразия можно достичь, используя неспецифический мутагенез. Поскольку за относительно короткое время можно провести скрининг миллионов фаговых бляшек, идентификация Fv-фрагментов с нужной специфичностью занимает от 7 до 14 дней. Для сравнения: скрининг нескольких сотен гибридомных клеточных линий обычно занимает месяцы.
Векторы на основе бактериофага ( не очень пригодны для получения больших количеств белковых молекул. Чтобы решить эту проблему, сконструировали такой вектор, в котором ДНК Н-и L-цепей встраиваются в сайт, фланкированный плазмидной ДНК. Такую плазмиду, содержащую ДНК Н- и L-цепи, можно вырезать из вектора и трансформировать ею Е. coli. Являясь частью плазмиды, ДНК Fv-фрагментов будет многократно реплицироваться в клетках Е. coli образованием большого количества продукта, который можно использовать как в диагностических, так и в терапевтических целях.
При создании комбинаторных библиотек вместо фага ( можно использовать нитевидные бактериофаги М13 или fd. В этих случаях соответствующий фрагмент антитела синтезируется как часть химерного белка, локализованного на поверхности фаговой частицы. Скрининг комбинаторной библиотеки фрагментов антител можно провести при помощи ферментного иммуносорбентного анализа (ELISA). Суть метода состоит в следующем: образцы (аликвоты) из библиотеки помещают в ячейки планшеты, содержащие антиген-мишень. Ячейки промывают, чтобы удалить несвязанные фаговые частицы. В каждую ячейку вносят конъюгат, состоящий из антитела, связывающегося с белком фаговой оболочки, и фермента. Ячейки промывают для удаления несвязанного конъюгата и добавляют в каждую из них хромогенный субстрат, который расщепляется ферментом, связанным с фагом, и окрашивает те ячейки, в которых находятся фаговые частицы, несущие антитела, к антигену-мишени. Процесс отбора и последующая очистка бактериофагов, синтезирующих фрагмент антитела, специфичный к нужному антигену, в этом случае гораздо проще, чем тогда, когда проводится подсчет бляшек бактериофага (. Выделив фаг, синтезирующий желаемый фрагмент антитела, можно экстрагировать кодирующую этот фрагмент ДНК и субклонировать ее в экспрессирующем векторе. Разные варианты антител с повышенным сродством к антигену-мишени можно получать замещением фрагментов ДНК VL- и Ун-областей или с помощью неспецифического мутагенеза.
Разработав методы получения Fv-фрагментов, исследователи попытались определить, способна ли отдельная белковая цепочка, состоящая только из vL- и Ун-доменов, образовать функциональную молекулу, связывающую антиген. Компьютерное моделирование трехмерной структуры предполагаемого одноцепочечного антитела показало, что для образования конформации, необходимой для связывания антигена, VL- и VH-домены должны быть разделены линкерным пептидом. Имея это в виду, VL- и УН-ДНК, синтезированные на кДНК-матрице клонированного моноклонального антитела, присоединили к химически синтезированному ДНК-линкеру, создав конструкцию Vь-ДНК-линкер-Vн-ДНК. Соответствующий одноцепочечный белок синтезировали в Е. coli. очистили и обнаружили, что его сродство и специфичность к антигену сходны с таковыми интактного моноклонального антитела. Таким образом, с помощью Е. coli можно без труда получать функциональные одноцепочечные антитела.
Одноцепочечные антитела могут найти широкое применение в клинике в тех случаях, когда проявление Fc-эффекторных функций не является необходимым, а малый размер молекулы (мол. масса одноцепочечного антитела составляет примерно 27 кДа, а иммуноглобулина G - 150 кДа) дает определенные преимущества. Кроме того, к одноцепочечному антителу можно присоединить последовательность, кодирующую тот или иной белок, получив бифункциональную молекулу, которая сможет связываться с определенной мишенью, проявляя при этом специфическую активность.
Был проведен также еще один эксперимент: вместо того чтобы соединять VL- и Vн-цепи коротким пептидом, аминокислоты каркасной области модифицировали таким образом, чтобы между ними образовывался дисулmфидный мостик. Эффективность такой стабилизированной дисульфидной связью Fv-молекулы, связанной с токсином, разрушающим раковые клетки, сравнили с эффективностью одноцепочечной Fv-молекулы, связанной с тем же токсином. Обнаружилось, что стабилизированный дисульфидной связью и одноцепочечный Fv-иммунотоксины обладают одинаковой активностью и специфичностью, но первый в несколько раз стабильнее. Можно предположить, что в каких-то ситуациях стабилизированные Fv-молекулы могут оказаться предпочтительнее одноцепочечных Fv-молекул.

Лекарственные средства против ВИЧ
Ученым пока не удалось получить вакцину, достаточно эффективную против вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), который вызывает развитие синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД). Параллельно с созданием такой вакцины идет поиск других средств, позволяющих замедлить патологический процесс.
ВИЧ поражает один из видов лимфоцитов, а именно Т-хелперы (Тн-клетки). В норме в процессе развития иммунного ответа Тн-клетки связывают продукты деградации специфических антигенов и высвобождают факторы, стимулирующие другие клетки иммунной системы к участию в иммунном ответе. Тн-клетки играют в этом процессе ключевую роль, а при ВИЧ-инфекции они перестают функционировать. Как только вирус внедряется в Тн-клетку, он становится защищенным от иммунной системы организма и начинает оказывать свое разрушающее действие на Тн-клетки.
В результате размножения вируса в инфицированной клетке происходит ее лизис.
Пораженная клетка действует как фабрика по производству ВИЧ-гликопротеина (gp120), который вызывает разрушение Тн-клеток и других Т-лимфоцитов.
Пораженная клетка сливается с другими Тн-клетками, формируя синцитий, который не способен выполнять функции, свойственные индивидуальным Тн-клеткам.
Основным следствием ВИЧ-инфекции является неспособность иммунной системы организма обеспечивать его защиту от обычных бактериальных и вирусных инфекций, которые в конце концов приводят к гибели больного, несмотря на лечение антибиотиками и другими средствами.
На первом этапе ВИЧ-инфекции происходит взаимодействие между гликопротеином оболочки вируса мол. массой 120 кДа (gp120) и рецептором на поверхности Тн-клеток - CD4. In vitro поражение Тн-клеток блокируется антителами к CD4; процесс замедляется также при избытке свободного белка CD4. Однако ни один из этих способов не приводит к уничтожению вируса. Один из подходов, обеспечивающих как защиту Тн-клеток, так и инактивацию вируса, заключается в создании химерного белка, состоящего из фрагмента молекулы CD4 и Fc-фрагмента иммуноглобулина. Свойства этого белка, называемого СD4-иммуноадгезином, определяются составными частями его молекулы: СD4-компонент связывает gp120 и блокирует ВИЧ, а иммуноглобулиновый обеспечивает замедление разрушения молекулы в плазме и ее связывание с клетками, несушими рецептор к антителу. После присоединения СD4-иммуноадгезина к свободной вирусной частице или к инфицированной клетке запускается реакция опосредованной антителами клеточной цитотоксичности, которая обеспечивает уничтожение вируса или пораженной им клетки.
Другой подход, позволяющий контролировать развитие ВИЧ-инфекции, заключается в создании системы мечения ВИЧ-пораженных клеток для их специфического уничтожения. Например, если сшить два фрагмента ДНК, один из которых кодирует рецептор CD4, а другой - внутриклеточный токсин Pseudomonas (экзотоксин А), мы получим ген, кодирующий химерный белок с комбинированными свойствами. Экзотоксин A Pseudomonas это белок с мол. массой 66 кДа, состоящий из трех доменов: домен I отвечает за связывание с клеткой, II за проникновение белка в клетку, III за присоединение ADP-рибозы к эукариотическому фактору элонгации (EF-2), что приводит к его инактивации. Химерный белок СD4-экзотоксин A Pseudomonas вместо домена I содержит большую часть последовательности CD4, в результате чего обладает и цитотоксической активностью экзотоксина Pseudomonas, и gр120-связывающей активностью СD4. На поверхности всех ВИЧ-пораженных клеток находится гликопротеин gp120, поэтому СD4-домен химерного белка соединяется исключительно с этими клетками. Присоединившись к инфицированной клетке, химерный белок проникает внутрь нее при участии домена II экзотоксина A Pseudomonas. Затем экзотоксиновая часть химерного белка инактивирует фактор элонгации EF-2, участвующий в синтезе белка. Это препятствует дальнейшему синтезу белка, что в конце концов приводит к гибели клетки. Таким образом, СD4-домен «помечает» ВИЧ-пораженные клетки, а экзотоксин выступает в роли «наемного убийцы».
Синтезируясь в Е. coli, химерный белок образует нерастворимые цитоплазматические включения. Их растворяют в гуанидингидрохлориде и выделяют с помощью быстрого разведения и анион-обменной хроматографии. Полученный таким образом белок с успехом выдержал проверку в контрольной культуре клеток. Однако в организме человека на Pseudomonas-компонет химерного белка может возникнуть иммунная реакция, и не исключено, что его придется вводить вместе с каким-либо иммуносупрессантом, например циклоспорином. Нужно иметь в виду, что описанный выше способ борьбы с ВИЧ-инфекцией находится на начальной стадии разработки, хотя в будущем и может оказаться весьма эффективным.
Подобные иммунопрепараты обладают достаточно высокой эффективностью, что позволяет применять их в низких дозах и свести к минимуму побочное действие на иммунную систему. Кроме того, они могут оказаться полезными для лечения различных новообразований, а иногда и заменять химиотерапию. На пораженные клетки можно «нацелить» и другие цитотоксичные белки, например дифтерийный токсин или растительный токсин рицин. Впрочем, даже при оптимальном развитии событий пройдет еще несколько лет, прежде чем терапевтическое применение рекомбинантных экзотоксинов станет рутинным.

Заключение
С помощью клонирования специфических генов и последующей их экспрессии в бактериях получен целый ряд белков, которые можно будет использовать в качестве лекарственных препаратов. Большинство этих белков имеют эукариотическое происхождение, так что для выделения нужного гена сначала получают препарат мРНК, обогащенный интересующими исследователя фракциями, затем создают кДНК-библиотеку и встраивают соответствующую ДНК в подходящий вектор для экспрессии. Произведя обмен участков родственных генов, кодирующих аналогичные белковые домены, или прямо заменяя сегменты клонированного гена, кодирующие функциональные части белка, можно создавать новые модификации таких белков. В качестве лекарственных средств можно использовать и некоторые ферменты. Например, для снижения вязкости слизи, которая накапливается в легких больных муковисцидозом, применяют в виде аэрозоля рекомбинантную ДНКазу I и альгинатлиазу.
С развитием технологии рекомбинантных ДНК и разработкой способов получения моноклональных антител, а также с установлением структуры и функций иммуноглобулинов появился интерес к использованию специфических антител для лечения различных заболеваний. Работа с генами антител облегчается тем, что отдельные домены молекулы антитела выполняют разные функции.
Лекарственные вещества или ферменты можно присоединять к моноклональным антителам или их Fv-фрагментам, специфичным в отношении поверхностных белков определенных клеток, например опухолевых. При этом лекарственное вещество может находиться в инертной форме. Если предполагаются многократные введения таких комплексов, то их иммуноглобулиновый компонент должен представлять собой антитело или фрагмент антитела человека; это позволяет предотвратить равитие перекрестной иммунной реакции и сенсибилизацию больного. Если же предполагается использовать в этих целях моноклональные антитела грызунов, их структуру следует максимально приблизить к структуре антител человека. Для этого в последних достаточно заменим, CDR-участки на аналогичные фрагменты антител грызунов. Недавно удалось провести отбор и синтез моноклональных антител человека с помощью Е. coli.
Генноинженерные методы позволяют получать уникальные лекарственные средства, которые представляют собой комплекс белка, связывающегося со специфическими клетками, например ВИЧ-инфицированными, и токсина. Этот подход пока только разрабатывается, но его перспективы обнадеживают.

ЛЕКЦИЯ 7.
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ КОММЕРЧЕСКИХ ПРОДУКТОВ.
До настоящего времени основной целью исследований в области молекулярной биотехнологии было получение различных белков. Однако технологию рекомбинантных ДНК можно использовать также для крупномасштабного производства многих ценных низкомолекулярных соединений витаминов, аминокислот, антибиотиков и т. д.
При наличии эффективной системы экспрессии получение белка продукта специфического гена - не составляет особого труда. Белок может представлять собой либо тот конечный продукт, который хотят получить (например, рестрицирующую эндонуклеазу), либо фермент, катализирующий oпpeдeлeннvю химическую реакцию (например, одну из реакций биосинтеза антибиотиков). Иногда в результате кинетических манипуляций микроорганизм приобретает способность к синтезу нового фермента и может использоваться для получения in vivo низкомолекулярных соединений - витаминов, аминокислот, красителей, антибиотиков, предшественников различных биополимеров и т. д. Такой микроорганизм становится «фабрикой» по производству полезных метаболитов.
Эндонуклеазы рестрикции
Развитие технологии рекомбинантных ДНК было бы невозможно, если бы в распоряжении исследователей не было нужных эндонуклеаз рестрикции (рестриктаз). В настоящее время в продаже имеется более 300 различных рестриктаз. Эти ферменты синтезируются самыми разными микроорганизмами: аэробными, анаэробами, фотосинтезирующими, диазотрофными, мезотрофными, термофильными, психрофильными, медленно- и быстрорастущими. Для культивирования каждого из них необходимо подобрать оптимальные условия ферментации температуру, рН, состав среды, концентрацию кислорода с тем чтобы максимизировать выход необходимого фермента. Чтобы не пришлось выращивать большое число разных микроорганизмов, готовить многокомпонентные среды, разрабатывать разные ферментеры и тратить время на подбор оптимальных условий роста для многочисленных организмов, часто клонируют гены эндонуклеаз рестрикции в Escherichia coli. Это позволяет стандартизовать условия получения необходимых продуктов. Кроме того, культура клеток Е.coli быстро достигает высокой плотности и может быть приспособлена для сверхпродукции необходимого фермента.
Технология выделения и экспрессии чужеродных генов в Е. coli и в некоторых других микроорганизмах достаточно хорошо отработана, однако не стоит забывать, что синтез гетерологичного белка в организме-хозяине может оказывать на него негативное влияние. Например, сверхпродукция такого белка может привести к истощению метаболических ресурсов хозяйского организма и отрицательно повлиять на его рост. Присутствие гетерологичного белка может оказаться даже губительным для клетки-хозяина. Так, сайты рестрикции имеются во всех молекулах ДНК, и если продуктом клонированного гена является эндонуклеаза рестрикции, то в отсутствие специальных защитных механизмов хозяйская ДНК будет расщепляться ею.
Микроорганизмы, синтезирующие эндонуклеазы рестрикции, выработали систему самозащиты: они метилируют одно или несколько оснований рестриктазного сайта, и расщепление ДНК в этом сайте гомологичной эндонуклеазой рестрикции блокируется. Грамотрицательные микроорганизмы имеют еще один механизм защиты: эндонуклеазы рестрикции у них локализованы в периплазматическом пространстве. Благодаря такой компартментализации происходит физическое разделение рестриктаз и ДНК и при этом обеспечивается свободный доступ метилирующего (модифицирующего) фермента к хромосомной ДНК. Кроме того, это защищает клетку от проникновения в нее любой чужеродной ДНК, например вирусной.
Один из подходов к решению проблемы деградации хозяйской ДНК гетерологичными эндонуклеазами рестрикции состоит в клонировании и экспрессии в реципиентном организме как гена фермента рестрикции, так и гена соответствующего модифицирующего фермента. Однако клонирование обоих этих генов в одном микроорганизме технически затруднено, если они расположены на хромосоме донорного организма далеко друг от друга. Кроме того, чтобы не допустить расщепления хозяйской ДНК эндонуклеазами рестрикции, метилирующий фермент после трансформации должен синтезироваться еще до начала синтеза рестриктазы.
1. ДНК P. stuartii расщепляют с помощью Hindlll и встраивают фрагменты в Hindlll-сайт плазмиды pBR322.
2. Рекомбинантными плазмидами трансформируют клетки Е. coli HB101 и выращивают их в жидкой среде, а затем инфицируют бактериофагом (. Если в хозяйской клетке экспрессируется ген фермента рестрикции, то она оказывается устойчивой к литическому действию фагов типа (, ДНК которых активно расщепляется синтезируемой рестриктазой.
3. Трансформированные клетки, устойчивые к фагу (, подвергают осмотическому шоку, чтобы высвободить периплазматические белки. Определяют активность рестриктазы PstI в белковом экстракте.
4. Положительные клоны тестируют на наличие PstI -метилирующей активности.
Один положительный клон, выявленный в этом эксперименте, содержал встроенный фрагмент ДНК длиной 4 т. п. н. с интактным опероном рестриктазы и метилазы Pstl и промотором P. stuartii. В клоне, несущем эту генетическую конструкцию, соблюдался естественный временной порядок синтеза: вначале синтезировался метилирующий фермент, затем эндонуклеаза рестрикции. Уровень экспрессии гена рестриктазы Pstl в Е. coli был примерно в 10 раз выше, чем в P. stuartii. Как и предполагалось, рестриктаза находилась в периплазматическом пространстве, а метилаза в цитоплазме. Метод получения PstI клонированием соответствующего гена в E. соli гораздо более эффективен, чем выделение этого фермента из P.stuartii.
Для выделения генов, кодирующих ферменты рестрикции и модификации (метилирования), можно использовать также другой подход, который состоит в следующем.
1. Создают банк клонов ДНК организма-донора, продуцирующего известную эндонуклеазу рестрикции. Используемый при этом плазмидный вектор должен содержать по крайней мере один сайт узнавания для этом рестриктазы.
2. Трансформируют Е. coli гибридными плазмидами.
3. Из трансформированных клеток, выросших в жидкой селективной среде (т. е. из клеток. содержащих плазмиду), выделяют плазмидную ДНК.
4. Обрабатывают ее интересующей исследователя эндонуклеазой рестрикции.
5. Трансформируют Е. coli плазмидными ДНК, обработанными эндонуклеазой рестрикции.
Ключевым моментом этого метода являете то, что плазмидная ДНК клонов, несущих и экспрессирующих ген фермента модификации, оказывается устойчивой к расщеплению соответствующей эндонуклеазой рестрикции, поскольку сайты узнавания в ней метилированы.
Рассмотрим следующий пример. В плазмиду pBR322 встраивали Hind III-фрагменты ДНК Desulfovibrio desulfuricans и трансформировали ею клетки Е. coli. Выделенную из трансформированных клеток плазмидную ДНК обрабатывали рестриктазой Ddel. Плазмиды, несущие и экспрессирующие ген метилирующего фермента, не расщеплялись, поскольку все восемь сайтов узнавания Ddel в pBR322 были метилированы. Смесь плазмид, обработанных Ddel, использовали для трансформации Е. coli. Образование трансформантов, несущих ген функционального модифицирующего фермента Ddel, обеспечивали только целые кольцевые молекулы плазмидных ДНК. Остальные плазмиды были расщеплены эндонуклеазой рестрикции. Для того чтобы определить, какие клоны содержат и ген фермента модификации, и ген эндонуклеазы рестрикции, трансформанты тестировали на наличие в них активной рестриктазы Ddel. Описанный подход можно с успехом использовать для выделения гена любой рестриктазы, лишь бы он находился достаточно близко к гену соответствующего модифицирующего фермента и был встроен в плазмидный вектор, имеющий по меньшей мере один сайт узнавания для данного фермента.

Малые биологические молекулы
Используя технологию рекомбинантных ДНК, можно направленно изменять метаболизм микроорганизмов, вводя в них новые гены или модифицируя уже существующие. Основной целью таких изменений является создание рекомбинантного микроорганизма с новой ферментативной активностью, способного превращать существующий субстрат в ценный продукт, который обычно получают только сочетанием химических и микробиологических методов.

Синтез L-аскорбиновой кислоты
В настоящее время для крупномасштабного производства L-аскорбиновой кислоты (витамина С) используют весьма трудоемкий процесс, включающий одну микробиологическую стадию и несколько химических; исходным субстратом для него является D-глюкоза. На последнем этапе этого процесса 2-кето-L-гулоновая кислота (2-KLG) превращается в кислых условиях в L-аскорбиновую кислоту. Биохимические исследования метаболизма различных микроорганизмов показали, что 2-KLG можно получить другим путем. Так, одни бактерии (Acetobacter, Gluconobacter и Erwinia) могут превращать глюкозу в 2,5-дикето-D-глюконовую кислоту (2,5-DKG), а другие (Corynebacterium, Brevibacterium и Arthrobacter), синтезирующие фермент 2,5-DKG-редуктазу, преобразовывать 2,5-DKG в 2-KLG.
Использующийся в настоящее время способ получения аскорбиновой кислоты можно усовершенствовать, если включить в него совместное культивирование указанных микроорганизмов для превращения глюкозы в 2-KLG. К сожалению, такое культивирование имеет свои трудности. Например, используемые микроорганизмы могут иметь разные оптимумы температуры и рН, могут различаться также состав среды и скорость роста. Иными словами, условия культивирования, оптимальные для одного организма, могут быть неприемлемы для другого, что приведет к спонтанному «вымыванию» из среды одного из них. В подобных случаях можно культивировать микроорганизмы последовательно, правда такой процесс трудно буди сделать непрерывным, если для роста микроорганизмов необходимы существенно разные среды. Наилучшим выходом из этой ситуации было бы создание одного микроорганизма, синтезирующего все ферменты, необходимые для превращения глюкозы в 2-KLG. Erwinia herbicola осуществляет превращение D-глюкозы в 2,5-DKG и несколько стадий, катализируемых разными ферментами, в то время как Corynebacterium sp. для превращения 2,5-DKG в 2-KLG необходима только одна стадия. Следовательно, наиболее простой способ создания одного микроорганизма, способного превращать D-глюкозу в 2-KLG, состоит в выделении гена 2,5-DКG-редуктазы Corynebacterium sp. и введении его в Erwinia herbicola.
Первый шаг на этом пути состоит в выделении и очистке 2,5-DKG-редуктазы Corynebacterium sp. и определении последовательности ее первых 40 N-концевых аминокислот. Исходя из этих данных были синтезированы два 43-нуклеотидных гибридизационных зонда, соответствовавших разным частям белковой молекулы. Поскольку 71% нуклеотидов ДНК Corynebacterium sp. представляют собой либо G, либо С, зонды синтезировали таким образом, чтобы в третьем положении кодонов по возможности находились именно они. Это позволяло минимизировать число неспаренных оснований между зондами и искомой ДНК.
Синтезированные зонды использовали для скрининга банка клонов ДНК Corynebacterium; клоны, гибридизующиеся только с одним из зондов, исключали из дальнейшего рассмотрения, считая, что соответствующая ДНК не является искомой. Выделяли клон, содержащий ген 2,5-DKG-редуктазы, и секвенировали его. Нуклеотидные последовательности, расположенньи до стартового кодона ATG, вырезали и заменяли их сигналами транскрипции и трансляции, функционирующими в Е. coli, поскольку регуляторные последовательности грамположительных микроорганизмов типа Corynebacterium spр. не функционируют в клетках этого микроорганизма. Полученную конструкцию вводили в Е. coll (при этом синтезировалась активная 2,5-DKG-редуктаза), а затем переклонировали в векторе с широким кругом хозяев и трансформировали им Erwinia herbicola.
Трансформированные клетки Erwinia активно превращали D-глюкозу непосредственно в 2-KLG, при этом собственные ферменты Erwinia, локализованные во внутренней мембране бактериальной клетки, преобразовывали глюкозу в 2,5-DKG, а 2,5-DKG--редуктаза, локализованная в цитоплазме, катализировала превращение 2,5-DKG в 2-KLG. Таким образом, с помощью генетических манипуляций метаболические реакции, протекающие в столь разных микроорганизмах, удалось осуществить в одном из них. Этот гибрид приобрел способность синтезировать конечный продукт комбинированного метаболического пути. Такой организм нужно использовать как фабрику для производства 2-KLG, заменяющую первые три стадии в том процессе получения L-аскорбиновой кислоты, который используется в настоящее время.
Коммерческую ценность 2,5-DKG-редуктазы можно повысить, если произвести аминокислотные замены, повышающие каталитическую активность фермента и его термостабильность. В то время, когда был идентифицирован ген 2,5-DKG-редуктазы, аминокислотные остатки, участвующие в образовании активного центра этого фермента, еще не были установлены. Однако, исходя из данных об аминокислотной последовательности фермента, была воссоздана его вторичная структура, состоящая из восьми тесно расположенных параллельных ,(-слоев, перемежающихся восемью (-спиралями, которые соединялись с (-слоями петлями разной длины. Такой характер укладки полипептидной цепи был установлен для 17 других ферментов с уже известной кристаллической структурой, и по аналогии с ними были идентифицированы три петли, возможно участвующие в связывании субстрата. С помошью олигонуклеотид-направленного мутагенеза были получены 12 мутантных белков, каждый из которых содержал одну аминокислотную замену в одной из петель. 11 мутантных форм 2,5-DKG-редуктазы обладали более низкой удельной активностью, чем нативный фермент, а 12-я, у которой остаток глутамина в положении 192 был заменен на аргинин, была примерно в два раза более активной. По данным кинетических исследований, повышение активности было связано с увеличением в 1,8 раз максимальной скорости (Vmax) и уменьшением на 25% константы Михаэлиса (Км) реакции, катализируемой ферментом. Замена глициновых остатков в положениях 55 и 57 на аланиновые позволила получить более термостабильный фермент по сравнению с нативной формой. Дальнейшие усилия будут вероятно, направлены на получение фермента сочетающего оба этих свойства.

Синтез индиго
Множество бактерий, особенно бактерии вида Pseudomonas, способны утилизировать различные органические соединения типа нафталина, толуола, ксилола и фенола, которые являются для них единственным источником углерода. Очень часто гены ферментов, катализирующих расщепление этих органических соединении, располагаются в крупных природных плазмидах (длиной 50200 т.п.н.). Чтобы ставить эксперименты с этими бактериями, в частности проводить целенаправленную модификацию генов ферментов, катализирующих те или иные метаболические реакции, приходится предпринимать детальные генетические и биохимические исследования, и нередко в ходе этих исследований делаются неожиданные и весьма интересные открытия. Рассмотрим следующий пример. Плазмида NAH7 содержит два разных оперона, которые позволяют несушим ее псевдомонадам использовать нафталин как единственный источник углерода. Для характеристики соответствующих генов расщепили плазмидную ДНК с помощью HindIII и лигировали фрагменты с линеаризованной HindIII плазмидой pBR322. Полученные гибридные молекулы ввели в клетки Е. coli и отобрали трансформантов, устойчивых к ампициллину, но чувствительных к тетрациклину. Затем проверили всех трансформантов на способность образовывать нелетучие метаболиты возможные продукты гидролиза радиоактивно меченного нафталина.
При исследовании одного из трансформантов, содержащего вставку длиной 10,5 т.п.н. и способного превращать нафталин в салициловую кислоту, обнаружилось, что минимальна ростовая среда, содержащая триптофан, приобретает синюю окраску. Тщательный анализ этого явления показал, что трансформированные клетки Е. coli синтезировали краситель индиго. Синтез происходил в четыре стадии.
1. Превращение триптофана в индол с помощью триптофаназ, которая синтезируется в хозяйских клетках E.coli.
2. Окисление индола до цис-индол-2,3-дигидродиола под действием нафталин-диоксигеназы, которая кодируется ДНК, переклонированной из плазмиды NAH7.
3. Спонтанная дегидратация.
4. Окисление на воздухе с образованием индиго.
Таким образом, комбинация ферментов двух разных метаболических путей двух разных организмов привела к неожиданному синтезу красителя индиго. Введение в Е. coli гена ксилолоксидазы, содержащегося в плазмиде TOL, может обеспечить превращение триптофана в индоксил, спонтанно окисляющийся до индиго.
Индиго, синий пигмент, который применяется для окрашивания хлопка и шерсти, был впервые выделен из растений; сейчас его получают путем химического синтеза. По оценкам, в год производится примерно 1,5-107 кг этого красителя на сумму около 200 млн. долл. Индию окрашивают джинсовую ткань, и объем его продаж больше, чем любого другого красителя. Возможность получения индиго с помощью микроорганизмов позволяет разработать весьма эффективный и экономичный крупномасштабный микробиологический способ его производства, что дает возможность обойтись без использования таких токсичных веществ, как анилин, формальдегид и цианид, которые необходимы при химическом синтезе индиго. В настоящее время биотехнологи пытаются подобрать оптимальные условия выращивания больших количеств штамма Е. coli, способного к синтезу индиго. Среди подбираемых параметров -температура, рН и количество триптофана в среде, обеспечивающее максимальный выход продукта. Эта система еще не готова для коммерческого использования, но уже ясно, что микробиологический процесс мог бы проходить в биореакторе, в котором рекомбинантные Е. coli химически иммобилизованы на твердой матрице (например, на целлюлозе или силикагеле). Реактор мог бы работать в непрерывном режиме, с поступлением триптофана с одной его стороны и удалением индиго с другой.

Синтез аминокислот
Аминокислоты широко применяются в пишевой промышленности в качестве усилителей вкуса и аромата, антиоксидантов и пищевых добавок; в сельском хозяйстве в качестве кормовых добавок; в медицине для терапии послеоперационных больных; в химической промышленности в качестве исходных веществ при синтезе полимеров и производстве косметических средств. По оценкам, ежегодно в мире производится более 800 000 т аминокислот стоимостью более 5 млрд. долларов. При этом больше половины общего объема производства приходится на долю L-глутаминовой кислоты, которая используется для получения широко известного усилителя вкуса и аромата глутамата натрия.
В промышленном масштабе аминокислоты получают в основном либо экстракцией из белковых гидролизатов, либо как продукты метаболизма двух неспорулируюших грамположительных почвенных бактерий, Corynebacterium или Brevjbacterium spp. Обычно для повышения продуктивности этих микроорганизмов используется мутагенез с последующим отбором штаммов сверхпродуцентов определенных аминокислот. Однако такой способ получения штаммов требует много времени, а эффективность его невелика. Альтернативный подход мог бы состоять в выделении и изменении специфических генов, кодирующих ключевые ферменты определенных биохимических реакций, на основании детальных биохимических данных об этих ферментах. Впрочем, такой генноинженерный подход может оказаться не столь простым. Так, в биосинтезе некоторых аминокислот могут участвовать несколько ферментов, которые активируются или ингибируются различными метаболитами, присутствующими в клетке. В такой ситуации трудно определить, какой фермент нужно модифицировать, чтобы увеличить выход конечного продукта. Кроме того, ученые пока не располагают исчерпывающими данными о биохимических свойствах указанных выше микроорганизмов, а соответствующие генноинженерные подходы находятся на стадии разработки. В частности, только создаются экспрессирующие векторы и методики трансформации для грамположительных организмов типа Corynebacterium и Brevibacterium spp.
Большинство плазмидных векторов с широким кругом хозяев реплицируются только в грамотрицательных микроорганизмах, поэтому необходимо создать векторы, специально предназначенные для экспрессии в Corynebacterium и Brevibacterium spp. Это могли бы быть челночные векторы Е. coliCorynebacterium. Та их часть, которая происходит из плазмид Е. coli, может содержать гены устойчивости к тетрациклину, хлорамфениколу или канамицину. Поскольку и Е. coli, и Corynebacterium spp. чувствительны к данным антибиотикам, эти гены могли бы служить селективными маркерами для обоих микроорганизмов.
Эффективный метод трансформации С. glutamicum, одного из видов Corynebacterium, часто используемых в такого рода экспериментах, до сих пор не разработан. Многие гены С. glutamicum неэффективно экспрессируются в Е. coli. Поэтому для систем отбора, основанных на экспрессии гена (например, при комплементации), клетки С. glutamicum должны быть трансформированы полным банком клонов. К сожалению, частота трансформации при введении ДНК в С. glutamicum обычным способом или электропорацией очень низка. Ее можно существенно повысить, если для введения чужеродной ДНК использовать конъюгацию или удалить клеточные стенки трансформируемых клеток лизоцимом (использовать протопласты). Проникновение экзогенной плазмидной ДНК в протопласты облегчается в присутствии полиэтиленгликоля.
Получены первые положительные результаты в увеличении выхода незаменимой аминокислоты триптофана, синтезируемой С. glutamicum. Для этого в клетки С. glutamicum дикого типа была введена вторая копия гена, кодирующего антранилатсинтазу, фермент, лимитирующий синтез триптофана. Ниже описан один из способов выделения этого гена.
1. Библиотеку хромосомной ДНК Brevibacterium flavum клонировали в челночном векторе С. glutamicumЕ. coli и ввели в мутантнын штамм С. glutamicum, не синтезирующий активной антранилатсинтазы.
2. Трансформантов отобрали по их способности расти в отсутствие антраниловой кислоты. Этим они отличались от мутантных нетрансформированных клеток.
3. Вектор, содержащий ген антранилатсинтазы, перенесли в штамм С. glutamicum дикого типа.
В качестве альтернативы для синтеза аминокислот можно использовать Е. coli. Этот микроорганизм хорошо изучен, а генноинженерные методы работы с ним более или менее детально разработаны.

Антибиотики
Со времени открытия пенициллина в конце 1920-х годов из различных микроорганизмов были выделены более 6000 антибиотиков, обладающих разной специфичностью и разным механизмом действия. Их широкое применение для лечения инфекционных заболеваний помогло сохранить миллионы жизней. Подавляющее большинство основных антибиотиков было выделено из грамположительной почвенной бактерии Streptomyces, хотя их продуцируют также грибы и другие грамположительные и грамотрицательные бактерии. Ежегодно во всем мире производится 100 000 т антибиотиков на сумму примерно 5 млрд. долларов, в том числе более 100 млн. долларов приходится на долю антибиотиков, добавляемых в корм скоту в качестве добавок или ускорителей роста.
По оценкам, каждый год ученые обнаруживают от 100 до 200 новых антибиотиков, прежде всего в рамках обширных исследовательских программ по поиску среди тысяч различных микроорганизмов таких, которые синтезировали бы уникальные антибиотики. Получение и клинические испытания новых препаратов обходятся очень дорого, и в продажу поступают только те из них, которые имеют большую терапевтическую ценность и представляют экономический интерес. На их долю приходится 12% всех обнаруживаемых антибиотиков. Большой эффект здесь может дать технология рекомбинантных ДНК. Во-первых, с ее помощью можно создавать новые антибиотики с уникальной структурой, оказывающие более мощное воздействие на определенные микроорганизмы и обладающие минимальными побочными эффектами. Во-вторых, генноинженерные подходы могут использоваться для увеличения выхода антибиотиков и соответственно для снижения стоимости их производства.
При создании рекомбинантных штаммов Streptomyces основного микроорганизма, используемого для получения антибиотиков, важно помнить, что трансформация и отбор трансформированных клеток не должны быть слишком сложными. Однако в отличие от Е. coli Streptomyces существуют не в виде изолированных клеток, а в виде протяженных мицелл, поэтому перед трансформацией необходимо разрушить клеточную стенку и высвободить отдельные протопласты. Без этого будет невозможно отличить трансформированные клетки от нетрансформированных, поскольку видимые колонии на твердой среде будут образовываться из группы клеток, а не из индивидуальной клетки; соответственно колонии, растущие в присутствии селективного антибиотика, будут представлять собой смесь трансформированных и нетрансформированных клеток. Проникновение плазмидной ДНК в протопласты Streptomyces облегчается в присутствии полиэтиленгликоля. После трансформации протопласты сначала высевают на твердую среду, чтобы образовалась клеточная стенка, а затем для отбора трансформированных клеток переносят на селективную среду, обычно содержащую либо неомицин, либо тиострептон.

Клонирование генов биосинтеза антибиотиков
Процесс биосинтеза одного антибиотика может состоять из 1030 ферментативных реакций, так что клонирование всех генов его биосинтеза задача не из легких. Один из подходов к выделению полного набора таких генов основан на трансформации одного или нескольких мутантных штаммов, не способных синтезировать данный антибиотик, банком клонов, созданным из хромосомной ДНК штамма дикого типа. После введения банка клонов в мутантные клетки проводят отбор трансформантов, способных синтезировать антибиотик. Затем выделяют плазмидную ДНК клона, содержащего функциональный экспрессирующийся ген антибиотика [т.е. ген, восстанавливающий (комплементирующий) утраченную мутантным штаммом функцию], и используют ее в качестве зонда для скрининга другого банка клонов хромосомной ДНК штамма дикого типа, из которого отбирают клоны, содержащие нуклеотидные последовательности, которые перекрываются с последовательностью зонда. Таким образом, идентифицируют, а затем клонируют элементы ДНК, примыкающие к комплементирующей последовательности, и воссоздают полный кластер генов биосинтеза антибиотика. Описанная процедура относится к случаю, когда эти гены сгруппированы в одном сайте хромосомной ДНК. Если же гены биосинтеза разбросаны в виде небольших кластеров по разным сайтам, то нужно иметь по крайней мере по одному мутанту на кластер, чтобы получить клоны ДНК, с помощью которых можно идентифицировать остальные гены кластеров.
Этот подход с успехом использовался для идентификации некоторых генов биосинтеза ундецилпродигиозина из Streptomyces coelicolor A3. В этом случае комплементационный анализ основывается на сравнении цвета колоний: колонии микроорганизмов дикого типа имеют красный цвет, а колонии мутантных микроорганизмов - кремовый. Таким образом, в результате комплементации образуется красная колония.
Помимо комплементации, для идентификации генов биосинтеза антибиотиков могут использоваться и более прямые подходы. Так, с помощью генетических или биохимических экспериментов можно идентифицировать, а затем выделить один или несколько ключевых ферментов биосинтеза, определить их N-концевые аминокислотные последовательности и, исходя из этих данных, синтезировать олигонуклеотидные зонды. Этот подход использовался для выделения из Penicillium chrysogenum гена синтетазы изопенициллина N. Этот фермент катализирует окислительную конденсацию (-(L-(-аминоадипил)-L-цистеинил-D-валина в изопенициллин N, ключевое промежуточное звено в биосинтезе пенициллинов, цефалоспоринов и цефамицинов.

Синтез новых антибиотиков
Новые антибиотики с уникальными свойствами и специфичностью можно получить, проводя генноинженерные манипуляции с генами, участвующими в биосинтезе уже известных антибиотиков. Один из первых экспериментов, в ходе которого был получен новый антибиотик, состоял в объединении в одном микроорганизме двух немного различающихся путей биосинтеза антибиотика.
Одна из плазмид Streptomyces, рIJ2303, несущая фрагмент хромосомной ДНК S. coelicolor длиной 32,5 т.п.н., содержит все гены ферментов, ответственных за биосинтез из ацетата антибиотика актинородина, представителя семейства изохроманхиноновых антибиотиков. Целую плазмиду и различные субклоны, несущие части 32,5 т.п.н.-фрагмента (например, рIJ2315), вводили либо в штамм АМ-7161 Streptomyces sp., синтезирующий родственный антибиотик медермицин, либо в штамм В1140 или Tii22 S. violaceoruber, синтезирующие родственные антибиотики гранатицин и дигидрогранатицин.
Все указанные антибиотики являются кислотно-щелочными индикаторами, которые придают растущей культуре характерный цвет, зависящий от рН среды. В свою очередь рН (и цвет) среды зависят от того, какое соединение синтезируется. Мутанты родительского штамма S. coelicolor, не способные синтезировать актинородин, бесцветные. Появление окраски после трансформации штамма АМ-7161 Streptomyces sp. либо штаммов В1140 или Тu22 S. violaceoruber плазмидой, несущей все или несколько генов, кодирующих ферменты биосинтеза актинородина, свидетельствует о синтезе нового антибиотика. Трансформанты штамма АМ-7161 Streptomyces sp. и штамма В1140 S.violaceoruber, содержащие плазмиду рIJ2303, синтезируют антибиотики, кодируемые и плазмидой, и хромосомной ДНК. Однако при трансформации штамма Tu22 S. violaceoruber плазмидой рIJ2303 наряду с актинородином синтезируется новый антибиотик дигидрогранатиродин, а при трансформации штамма АМ-7161 Streptomuces sp. плазмbдой pIJ2315 синтезируется еще один новый антибиотик медерродин А.
В структурном отношении эти новые антибиотики мало отличаются от актинородина, медермицина, гранатицина и гидрогранатицина и, вероятно, образуются в том случае, когда промежуточный продукт одного пути биосинтеза служит субстратом для фермента другого пути. Когда будут детально изучены биохимические свойства различных путей биосинтеза антибиотиков появится возможность создавать новые уникальные высокоспецифичные антибиотики, манипулируя генами, которые кодируют соответствующие ферменты.

Разработка новых методов получения поликетидных антибиотиков
Термин «поликетидные» относится к классу антибиотиков, которые образуются в результате последовательной ферментативной конденсации карбоновых кислот типа ацетата, пропионата и бутирата. Некоторые поликетидные антибиотики синтезируются растениями и грибами, но большая их часть образуется актиномицетами в виде вторичных метаболитов. Прежде чем проводить манипуляции с генами, кодирующими ферменты биосинтеза поликетидных антибиотиков, необходимо выяснить механизм действия этих ферментов.
Поликетидные антибиотики синтезируются по тому же пути, что и длинноцепочечные жирные кислоты. В результате каждого цикла конденсации к растущей углеродной цепи добавляется (-кетогруппа. Процесс состоит из ряда повторяющихся стадий, включающих восстановление кетогруппы, дегидратацию и восстановление (-еноильных групп в растущей поликетидной цепи. Существуют два класса поликетидсинтаз ферментных комплексов, ответственных за синтез поликетидных антибиотиков. Первый класс составляют синтазы, катализирующие реакции биосинтеза ароматических подикетидов; каждая синтаза представляет собой один полипептид с одним активным центром, который последовательно катализирует биосинтетические реакции. Второй класс включает синтазы, образованные несколькими полипептидами (А-Е); каждый из них имеет свой активный центр и обладает специфической ферментативной активностью, катализирующей определенную реакцию биосинтеза.
Если каждый домен субъединицы многофункциональной поликетидсинтазы, обладающий ферментативной активностью, катализирует определенную реакцию, то утрата любой из активностей затронет только одну реакцию биосинтеза, а изменение домена с известной функцией приведет к предсказуемым изменениям структуры синтезируемого антибиотика. Так, детально изучив генетические и биохимические составляющие биосинтеза эритромицина в клетках Saccharopolyspora erythraea, удалось внести специфические изменения в гены, ассоциированные с биосинтезом этого антибиотика, и синтезировать производные эритромицина с другими свойствами. Вначале была определена первичная структура фрагмента ДНК S. erythraea длиной 56 т. п. н., содержащего кластер генов еrу, затем двумя разными способами модифицирована эритромицинполикетидсинтаза. Для этого 1) удаляли участок ДНК, кодирующий (-кеторедуктазу, либо 2) вносили изменение в участок ДНК, кодирующий еноилредуктазу. Делеция (-кеторедуктазного гена приводила к накоплению промежуточного продукта, у которого к С-5-атому кольца была присоединена карбонильная группа, а не гидроксильная, а мутация в гене еноилредуктазы - к образованию двойной связи между атомами С-6 и С-7. Из этих экспериментов следует, что если идентифицировать и охарактеризовать кластер генов, кодирующих ферменты биосинтеза определенного поликетидного антибиотика, то, внося в них специфические изменения, можно будет направленно изменять структуру антибиотика. Кроме того, вырезая и соединяя те или иные участки ДНК, можно перемещать домены поликетидсинтазы и получать новые поликетидные антибиотики.
Все кластеры генов ароматических поликетидов содержат три гена, кодирующих так называемую минимальную поликетидсинтазу. Этот ферментный комплекс включает кетосинтазe (с ацилтрансферазным доменом), фактор, определяющий длину цепи, и ацилпереносящий белок. Минимальная поликетидсинтаза отвечает за синтез ароматического поликетидного остова, а его модификации осуществляются другими ферментами, действующими соглаванно с ней. Гены, кодирующие все эти ферменты, обычно организованы в один кластер. Каждый кластер генов кодирует синтез определенного антибиотика. С помощью обмена генами между кластерами были синтезированы два новых ароматических поликетидных антибиотика, что еще раз иллюстрирует возможности генной инженерии.

Усовершенствование производства антибиотиков
С помощью генной инженерии можно не только создавать новые антибиотики, но и увеличивать эффективность синтеза уже известных. Лимитирующим фактором в промышленном производстве антибиотиков с помощью Streptomyces spp. часто является количество доступного клеткам кислорода. Вследствие плохой растворимости кислорода в воде и высокой плотности культуры Streptomyces его часто оказывается недостаточно, рост клеток замедляется и выход антибиотика снижается. Чтобы решить эту проблему, можно, во-первых, изменить конструкцию биореакторов, в которых выращивается культура Streptomyces, а во-вторых, используя методы генной инженерии, создать штаммы Streptomyces, более эффективно использующие имеющийся кислород. Эти два подхода не исключают друг друга.
Одна из стратегий, используемых некоторыми аэробными микроорганизмами для выживания в условиях недостатка кислорода, состоит в синтезе гемоглобинподобного продукта, способного аккумулировать кислород и доставлять его в клетки. Например, аэробная бактерия Vitreoscilla sp. синтезирует гомодимерный гемсодержащий белок, функционально подобный эукариотическому гемоглобину. Ген «гемоглобина» Vitreoscilla был выделен, встроен в плазмидный вектор Streptomyces и введен в клетки этого микроорганизма. После его экспрессии на долю гемоглобина Vitreoscilla приходилось примерно 0,1% всех клеточных белков S. coelicolor даже в том случае, когда экспрессия осуществлялась под контролем собственного промотора гена гемоглобина Vitreoscilla, а не промотора Streptomyces. Tpaнсформированные клетки S. coelicolor, растущие при низком содержании растворенного кислорода (примерно 5% от насыщающей концентрации), синтезировали в 10 раз больше актиноролина на 1 г сухой клеточной массы и имели большую скорость роста, чем нетрансформированные. Этот подход можно использовать и для обеспечения кислородом других микроорганизмов, растущих в условиях недостатка кислорода. Исходным материалом при химическом синтезе некоторых цефалоспоринов антибиотиков, обладающих незначительным побочным эффектом и активных в отношении множества бактерий, является 7-аминоцефалоспорановая кислота (7АСА), которая в свою очередь синтезируется из антибиотика цефалоспорина С. К сожалению, природных микроорганизмов, способных синтезировать 7АСА, до сих пор не выявлено. Новый путь биосинтеза 7АСА был сконструирован включением специфических генов в плазмиду гриба Acremonium chrysogenum, который обычно синтеризует только цефалоспорин С. Один из этих генов был представлен кДНК гриба Fusarium solani. кодирующей оксидазу D-аминокислот, а другой происходил из геномной ДНК Pseudomonas diminuta и кодировал цефалоспоринацилазу. В плазмиде гены находились под контролем промотора A. chrysogenum. На первом этапе нового биосинтетического пути цефатоспорин С превращается в 7-(-(5-карбокси-5-оксопентанамид) цефалоспорановую кислоту (кето-АD-7АСА) при помощи оксидазы D-аминокислот. Часть этого продукта, вступая в реакцию с пероксидом водорода, одним из побочных продуктов, превращается в 7-(-(4-карбоксибутанамид) цефалоспорановую кислоту (GL-7ACA). И цефалоспорин С, и кето-АD-7АСА, и GL-7ACA могут подвергаться гидролизу цефалоспоринацилазой с образованием 7АСА, однако только 5% цефалоспорина С напрямую гидролизуется до 7АСА. Следовательно, для образования 7АСА с высоким выходом необходимы оба фермента.

Получение 2-кето-L -гулоната промежуточного продукта синтеза
L-аскорбиновой кислоты с помощью рекомбинантной
бактерии Erwinia herbicola

Для направленного изменения прокариот, синтезирующих определенные метаболиты, в принципе есть два пути. Во-первых, можно изменить активность или содержание одного или нескольких ферментов того или иного биосинтетического пути с тем, чтобы увеличить продукцию нужного метаболита. Во-вторых, в прокариотический геном можно ввести чужеродные гены, кодирующие ферменты, которые, используя эндогенный метаболит в качестве субстрата, обеспечат синтез метаболита, изначально не продуцируемого хозяйской клеткой. Такого рода манипуляции представляются достаточно простыми, однако далеко не всегда удается выделить нужный ген и подобрать подходящие условия для его экспрессии.
Чтобы создать бактерию, синтезирующую 2-кето-L-гулоновую кислоту, непосредственного предшественника витамина С в промышленном производстве этого витамина, Андерсон и др. выделили из Coiynebacteriuin ген фермента, катализирующего превращение 2,5-дикето-D-глюконовой кислоты в 2-кето-L-гулоновую кислоту, и ввели этот ген в клетки Erwinia sp. - бактерии, синтезирующей 2,5-дикето-D-глюконовую кислоту из D-глюкозы. Выделение этого гена осложнялось тем, что сам фермент практически не был изучен. Таким образом, прежде чем идентифицировать ген, нужно было очистить соответствующий белок и частично секвенировать его, а затем на основании данных об аминокислотной последовательности сконструировать зонды для гибридизации.
Это была одна из первых работ, относящихся к той области исследований, которую иногда называют инженерией метаболизма. В такого рода работах из одного микроорганизма в другой переносят гены, ответственные за какую-то часть метаболического пути, так что второй микроорганизм приобретает способность синтезировать новые метаболиты.

Биополимеры
Биополимеры это высокомолекулярные соединения, синтезируемые живыми организмами. Некоторые из них обладают ценными физическими и химическими свойствами и могут использоваться в пищевой, перерабатывающей и фармацевтической промышленности. С возникновением технологии рекомбинантных ДНК появилась возможность создавать новые биополимеры, заменять синтетические продукты их биологическими аналогами, модифицировать уже существующие биополимеры с целью улучшения их физических и структурных характеристик, повышать эффективность соответствующих промышленных процессов, уменьшать их стоимость.

Создание рекомбинантной бактерии Xanthomonas campestris с целью получения ксантановой слизи
Xanthomonas campestris грамотрицательная облигатно аэробная почвенная бактерия, синтезирующая ценный коммерческий биополимер ксантановую слизь, высокомолекулярный экзополисахарид. Его структурный каркас составляет линейная полимерная цепь из молекул глюкозы. К каждому второму глюкозному остатку присоединена трисахаридная боковая цепь, состоящая из одного остатка глюкуроновой кислоты и двух остатков маннозы. Ксантановая слизь имеет высокую вязкость, не разрушается в агрессивных физических и химических средах и по физическим и химическим свойствам напоминает пластик. В частности, ее можно использовать как стабилизирующий, эмульгирующий, загущающий или суспендирующий агент. Для успешного коммерческого производства ксантановой слизи необходимо выращивать X. campestris на недорогом и доступном источнике углерода. X. campestris дикого типа эффективно утилизирует глюкозу, сахарозу и крахмал, но не лактозу. При производстве сыра в большом количестве образуется такой побочный продукт, как сыворотка. Она состоит из воды (9495%), лактозы (3,54%) и небольших количеств белка, минеральных веществ и низкомолекулярных органических соединений. Огромные количества сыворотки дает молочная промышленность, и ее утилизация это большая проблема. Часто сыворотку сливают в реки и озера, что приводит к уменьшению в них количества доступного кислорода и гибели многих водных организмов. Транспортировка сыворотки к местам захоронения мусора обходится очень дорого, к тому же серьезную проблему создает риск загрязнения ею грунтовых вод. Наконец, большие средства уходят на удаление твердых компонентов сыворотки. Все это заставило попытаться найти способы выгодной переработки сыворотки.
Сыворотку можно использовать как источник углерода при выращивании ценных промышленных микроорганизмов. Чтобы X. campestris приобрела способность расти на сыворотке, было проделано следующее. Гены lacZY E. coli, кодирующие ферменты (-галактозидазу и лактозопермеазу, встроили в плазмиду с широким кругом хозяев так, чтобы они находились под транскрипционным контролем промотора одного из бактериофагов X. campestris. Эту конструкцию ввели в E. coli, а затем перенесли из E. coli в X. campestris тройным скрещиванием. Трансформанты, содержащие плазмиду, синтезировали (-галактозидазу и лактозопермеазу, используя лактозу как единственный источник углерода, а также продуцировали в больших количествах ксантановую слизь, используя в качестве источников углерода глюкозу, лактозу и сыворотку. Подчеркнем еще раз, что X. campestris дикого типа синтезирует много ксантановой слизи, только когда растет на глюкозе.

Выделение генов биосинтеза меланина
Меланины образуют многочисленное семейство различных поглощающих свет биополимеров; их синтеризуют животные, растения, бактерии и грибы. Эти пигменты можно было бы использовать при изготовлении солнцезащитных экранов и покрытий, в качестве добавки к косметическим средствам. В настоящее время меланины получают в небольших количествах либо экстракцией из природных источников, либо путем химического синтеза. С помощью технологии рекомбинантных ДНК, возможно, удастся создать недорогое крупномасштабное производство меланинов с различными физическими свойствами.
Меланины это нерегулярные полимеры, состоящие из остатков индола, бензотиазола и аминокислот. Первый этап их биосинтеза катализируется медьсодержащим ферментом монооксигеназой тирозиназы и представляет собой окисление тирозина до дигидроксифенилаланинхинона. Последние этапы полимеризации не являются каталитическими реакциями и в зависимости от химической природы нехинонных соединений, включающихся в полимерную структуру, дают конечные продукты разных цветов: черного, коричневого, желтого, красного или фиолетового.
Выделены и охарактеризованы гены биосинтеза меланина в бактериальных клетках Streptomyces antibioticus. Они содержат две открытые рамки считывания (ORF), одна из которых кодирует тирозиназу (мол. масса 30 600), а вторая (ORF438) - белок (мол. масса примерно 14 800) с неизвестными функциями. Чтобы проверить, нужны ли оба этих гена для синтеза меланина, гены сначала переклонировали в экспрессирующий вектор Е. соli, при этом одна конструкция содержала только ген тирозиназы, а другая и ген тирозиназы, и ORF438. Вектор, несущий ген тирозиназы, обеспечивал синтез больших количеств тирозиназы, чем вектор, содержащий оба указанных гена. Однако оказалось, что уровень тирозиназы не имеет особого значения, а для биосинтеза меланина необходимы продукты обоих генов. Возможно, белок, кодируемый ORF438, поставляет ионы меди неактивному предшественнику тирозиназы апотирозиназе, которая активируется в их присутствии. В естественных условиях после образования дигидроксифенилаланинхинона при участии тирозиназы в полимер включаются различные низкомолекулярные соединения (нехиноны). С учетом этого можно изменять химические и физические свойства меланина, синтезируемого в клетках Е. coli с введенными в них ключевыми генами биосинтеза этого полимера, если добавлять в среду определенные низкомолекулярные соединения в разных количествах.

Микробиологический синтез животного биополимера с адгезивными свойствами
Весьма перспективной представляется также разработка недорогого способа получения белка с адгезивными свойствами, впервые выделенного из мидий Mytilus edulis. Этот водостойкий белок образует очень прочные нити, с помощью которых моллюски прикрепляются к разнообразным поверхностям. Сразу после секреции биополимера так называемой биссаловой железой между полимерными цепями образуются многочисленные поперечные сшивки, что затрудняет определение их аминокислотной последовательности. Это в свою очередь не позволяет установить нуклеотидную последовательность кодирующих их генов и синтезировать гибридизационные зонды. К счастью, удалось выделить внутриклеточный предшественник адгезивного белка (130 кДа-предшественник). Как показали биохимические исследования, он богат серином, треонином, лизином, пролином и тирозином. От 60 до 70% этих аминокислот содержат гидроксильную группу, при этом большинство остатков пролина и тирозина гидроксилированы до 3- или 4-гидроксипролина (Hyp) и 3,4-дигидроксифенилаланина (DOPA) соответственно. Кроме того, после определения аминокислотной последовательности выяснилось, что предшественник состоит в основном из повторяющихся декапептидов Ala-Lys-(Pro или Hyp)-Ser-(Tyr или DOPA)-Hyp-Hyp-Thr-DOPA-Lys.
Из библиотеки кДНК, которая была получена на основе мРНК, выделенной из биссаловой железы, была изолирована кДНК 130 кДа-предшественника адгезивного белка. И адгезивный белок, и его кДНК обладают весьма необычными свойствами, затрудняющими клонирование и экспрессию соответствующих генов и получение функционального адгезивного белка. Во-первых, кДНК содержит большое число повторов, что повышает частоту гомологичной рекомбинации и вероятность утраты части клонированной последовательности. Во-вторых, поскольку примерно 70% всех аминокислот белка приходится на долю пролина, лизина и тирозина, вряд ли его удастся получить в большом количестве вследствие ограниченности внутриклеточного пула аминоацил-тРНК.
Чтобы преодолеть все эти трудности, полноразмерную кДНК адгезивного белка или ее фрагменты встроили в дрожжевые экспрессирующие векторы и ввели эти векторы в дрожжевые клетки. После экспрессии были получены новые активные формы адгезивного белка мол. массой от 20 до 100 кДа, причем на их долю приходилось от 2 до 5% суммарного количества клеточных белков. Значительно более высокого уровня экспрессии удалось достичь после того, как был химически синтезирован ген адгезивного белка. Используя повторы ДНК, кодирующие декапептид адгезивного белка, создали синтетический ген длиной 600 п. н., который кодировал белок мол. массой примерно 25 кДа. Его основная повторяющаяся единица длиной 30 п. н. состояла из кодонов, оптимальных для экспрессии в Е. coli, а эффективная экспрессия происходила, когда он находился под контролем промотора фага Т7. Большинство микроорганизмов обладают лишь ограниченной способностью осуществлять посттрансляционное гидроксилирование аминокислот, так что образующийся белок бывает не до конца гидроксилирован. Так, некоторые из его тирозиновых остатков не превращаются в DOPA, что снижает число образующихся поперечных сшивок. Чтобы решить эту проблему, была создана система гидроксилирования in vitro, в которой бактериальная тирозиназа в присутствии аскорбиновой кислоты гидроксилировала остатки тирозина. Аскорбиновую кислоту добавляли в реакционную смесь для того, чтобы предотвратить окисление остатков DOPA в о-хинон. Этот процесс должен строго контролироваться, поскольку он приводит к сшиванию субъединиц адгезивного белка. Как и многие другие клеи или адгезивы, адгезивный белок необходимо активировать непосредственно перед использованием.
При окислении предшественника адгезивного белка и образовании сшивок белок может связываться с разнообразными поверхностями из стекла, полистирола, коллагена и т. д. Прочность и специфичность связывания можно изменять добавлением к смеси адгезивных белков до окисления и образования сшивок других белков. Это позволяет создавать клеи с уникальными свойствами, в том числе и такие, которые можно будет использовать в медицине, в частности в стоматологии.

Микробиологический синтез каучука
Натуральный каучук, цис-1,4-полиизопрен, -это широко используемый биополимер, который получают из различных растений. Его биосинтез начинается с превращения простых сахаров и включает 17 ферментативных реакций. В ходе последней из них происходит полимеризация изопентенилпирофосфата с образованием аллилпирофосфата.
Ввиду большой коммерческой ценности каучука были проведены исследования, направленные на то, чтобы выяснить, можно ли использовать для его получения рекомбинантные микроорганизмы. Прежде всего с помощью мРНК из растения Hevea brasiliensis, синтезирующего каучук, была создана соответствующая кДНК-библиотека. Затем проведена гибридизация с коротким ДНК-зондом, синтезированным исходя из данных об аминокислотной последовательности одного из участков молекулы полимеразы каучука. Для того чтобы доказать, что клонированная кДНК действительно кодирует этот фермент, использовали антитела к очищенному ферменту. Теперь, используя этот клон кДНК, а также, возможно, другие гены биосинтеза каучука, можно попытаться синтезировать натуральный каучук микробиологическими методами. С другой стороны, с помощью этой кДНК можно также получить полимеразу каучука и создать каталитическую систему in vitro. В любом случае исследования, которые могли бы привести к разработке нового пути биосинтеза каучука имеет смысл продолжить.

Микробиологический синтез полигидроксиалканоатов
Полигидроксиалканоаты это биодеградируемые полимеры, синтезируемые множеством микроорганизмов (прежде всего Alcaligenes eutphus) и использующиеся ими как внутриклеточный источник углерода и энергии. Они обладают разными свойствами в зависимости от состава и могут применяться для получения биодеградируемых пластмасс, используемых, например, для изготовления упаковочного материала. По оценкам, годовой объем продаж биодеградируемых пластмасс составляет примерно 1,3 млрд. долларов.
Из всех полигидроксиалканоатов наиболее полно изучена и охарактеризована поли(3-гидроксимасляная кислота). Это относится как к самому полимеру, так и к кодирующим его синтез генам A. eutrophus. Поли(3-гидроксимасляную кислоту), ее сополимер поли(3-гидроксибутират-со-3-гидроксивалерат) и другой полиоксиалканоат, поли(3-гидроксивалериановую кислоту), получают в Великобритании в промышленном масштабе ферментацией при участии A. eutrophus.
Однако этот микроорганизм растет относительно медленно и использует лишь ограниченное число источников углерода, что делает производство довольно дорогим. Можно использовать другой путь: при перенесении генов биосинтеза этого полимера в Е. coli получаются быстрорастущие трансформанты, накапливающие в большом количестве (до 95% сухой массы клетки) поли(3-гидроксимасляную кислоту). Поли(3-гидроксимасляная кислота) синтезируется из ацетил-СоА в три стадии, катализируемые тремя разными ферментами. Оперон, содержащий эти гены, был встроен в плазмиду в составе фрагмента длиной 5,2 т.п.н., однако в отсутствие селективного давления, например при росте в отсутствие антибиотиков, примерно половина клеток Е. coli теряла данную плазмиду уже после 50 генераций. Это не очень существенно, когда масштабы культивирования малы, но становится серьезной проблемой при крупномасштабной или непрерывной ферментации. Чтобы обойти эту трудность, в плазмиду, несущую оперон поли (3-гидроксимасляной кислоты), встроили локус раrВ из другой плазмиды, который обеспечивал стабилизацию плазмид, обусловливая гибель клеток, не содержащих плазмиды после сегрегации. Модифицированные плазмиды оставались стабильными даже при конститутивном синтезе поли (3-гидрокси-масляной кислоты). Трансформанты Е. coli, синтезирующие данный продукт, образовывали лишь очень небольшое количество ацетата, гибельного для клеток, по-видимому, вследствие того, что весь избыточный ацетил-СоА превращался в поли(3-гидроксимасляную кислоту), а не в ацетат. Еще одно преимущество синтеза поли(3-гидроксимасляной кислоты) в Е. coli состоит в том, что когда ее экстрагируют щелочным раствором хлорноватистокислого натрия (калия), то она разлагается в меньшей степени, чем при экстракции из A. eutrophus. По-видимому, это связано с тем, что большая часть полимера, синтезируемого в Е. coli, находится в кристаллическом виде, в то время как в A. eutrophus в аморфном. При этом полимеры, получаемые этими двумя способами, идентичны.
Поли (3-гидроксибутират-со-3-гидроксивалерат) аналогичен по своим свойствам широко использующемуся полипропилену, так что получение его микробиологическими методами может представлять коммерческий интерес. Однако штаммы Е. соli, в которых экспрессируются гены биосинтеза полимера, синтезируют только поли(3-гидроксимасляную кислоту), а не сополимер. Эту проблему можно решить, используя для экспрессии клетки Е. coli, несущие мутации в fadR и atoC. fadR ответствен за негативную регуляцию биосинтеза жирных кислот, a atoC за позитивную регуляцию их поглощения. Роль локуса fadR в индукции биосинтеза сополимера неясна, но продукт гена аtоС влияет на синтез белков, кодируемых генами atoA и atoD и облегчающих поглощение бактериями пропионата из культуральной среды. Последний превращается в пропионил-СоА и затем реагирует с ацетил-СоА с образованием 3- кетовалерил-СоА, который в свою очередь может превращаться в 3-гидроксивалерил-СоА, включаемый в сополимер.

Заключение
Бактерии можно не только использовать как «фабрики» для синтеза белков типа рестриктаз, но и получать с их помощью новые продукты, изменяя метаболизм бактериальных клеток введением в них чужеродных генов или модификацией уже существующих. Можно создавать рекомбинантные микроорганизмы, способные синтезировать самые разные низкомолекулярные соединения: L-аскорбиновую кислоту, краситель индиго, аминокислоты, антибиотики, мономерные единицы различных биополимеров. Общая стратегия при этом состоит во введении в организм хозяина-специфических генов, клонированных в подходящем векторе, которые кодируют один или несколько ферментов, катализирующих не свойственные микроорганизму метаболические реакции или влияющих на осуществляемый им в норме биосинтез определенных соединений. По имеющимся данным, создание новых метаболических путей не является технически неосуществимым. Этот подход поможет создать необычные, более эффективные пути синтеза самых разных соединений.









n Заголовок 1t Заголовок 2^ Заголовок 3N Заголовок 4P Заголовок 5 Заголовок 6 Заголовок 7Ў: 15тD Основной текст 2b Основной текст с отступом 3P Основной текст 3v Основной текст с отступомR Основной текстx Основной текст с отступом 2v Стандартный HTML
VasilevC:\Мои документы\ВСТУПЛЕНИЕ.doc
VasilevC:\Мои документы\ВСТУПЛЕНИЕ.doc
VasilevCC:\WINDOWS\Application Data\Microsoft\Word\Автокопия ВСТУПЛЕНИЕ.asd
VasilevCC:\WINDOWS\Application Data\Microsoft\Word\Автокопия ВСТУПЛЕНИЕ.asd
VasilevCC:\WINDOWS\Application Data\Microsoft\Word\Автокопия ВСТУПЛЕНИЕ.asd1&C:\Мои документы старые\ВСТУПЛЕНИЕ.doc1(C:\WINDOWS\TEMP\Автокопия ВСТУПЛЕНИЕ.asd1(C:\WINDOWS\TEMP\Автокопия ВСТУПЛЕНИЕ.asd1(C:\WINDOWS\TEMP\Автокопия ВСТУПЛЕНИЕ.asd1(C:\WINDOWS\TEMP\Автокопия ВСТУПЛЕНИЕ.asd
·
·
·
·
·q q

Приложенные файлы

  • doc 8842244
    Размер файла: 958 kB Загрузок: 0

Добавить комментарий