Основы биотехнологии

КЛЕТОЧНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ
Использование клеток, выделенных из различных органов и тканей человека, для лечения заболеваний получило название «регенераторная медицина».
В регенераторной медицине условно можно выделить 2 направления:
клеточная инженерия;
тканевая инженерия.
Клеточная инженерия основывается на выделении определенных типов клеток, придание им in vitro с помощью генетических конструкций или ряда «сигнальных» молекул специфических свойств и введения их в организм больного.
Наиболее успешными направлениями клеточной инженерии являются:
Использование дендритных клеток для модуляции иммунного статуса;
Использование стволовых клеток как инструментов для генной терапии;
Создание технологий гибридизации половых и соматических клеток, где наиболее удачным в коммерческом отношении является производство моноклональных антител (МАТ).
Однако появление и развитие этих направлений стало возможным только, при развитии метода культуры клеток (культивирование животных клеток).
Начало методу культуры клеток тканей было заложено в 1907 году. Экспериментом, который должен был внести ясность в дискуссию, происходившую среди нейробиологов. Гипотеза, правильность которой необходимо было проверить, получила название нейронной доктрины и сводилась к следующему: каждое нервное волокно образуется, вырастая из одной нервной клетки, а не путем слияния многих клеток.
Для решения этого вопроса небольшие участки спинного мозга помещали в теплую влажную камеру и наблюдали под микроскопом через равные промежутки времени. Примерно через сутки (24 часа) можно было увидеть, что от отдельных нервных клеток начинают отходить длинные тонкие отростки, что свидетельствовало в пользу нейронной доктрине, и был заложен фундамент для переворота, происшедший в клеточной биологии в результате применения метода культивирования клеток.
Основополагающие эксперименты, проведенные в 1907 г. включали использование небольших фрагментов ткани или эксплантов. В настоящее время клеточную культуру обычно выращивают в клеточной суспензии, полученной путем диссоциации ткани. Основное преимущество таких диссоциированных культур состоит в потенциальной возможности выделения из смеси различных клеток, отдельных типов клеток, их исследования и последующего клонирования.
Клон – получение идентичных потомков клетки (молекулы) при помощи бесполого размножения.
Культура, приготовленная, непосредственно из тканей организма – первичная культура.
Большинство клеток многоклеточного организма, в отличие от бактериальных органов не способны расти in vitro. Установлено, что способность клеток к культивированию находится в обратной зависимости от степени их дифференцировки и специализации. Хорошо поддавались культивированию фибробласты, другие мало дифференцированные клетки – предшественники, стволовые клетки, эмбриональные клетки, раковые клетки. Мышечные или нервные клетки, лимфоциты в культуре не размножались.
Часто эти клетки сохраняют признаки дифференцировки исходных тканей:
фибробласты способны секретировать коллаген;
миоциты эмбриональных тканей способны сливаться, и образуют спонтанно сокращающиеся гигантские мышечные волокна;
нейроны формируют аксоны, обладающие электропроводимостью и способностью образовывать синапсы с другими нервными клетками;
эпителиоциты, склонны к формированию больших слоев, сохраняющих свойства интактного эпителия.
Большой вклад в развитие методологии культуры животных клеток внесли работы Алексиса Карреля (1912) и А. Эбелинга (1913), постулировавших гипотезу «соматического бессмертия клеток» многоклеточного организма. Они культивировали фибробласты сердца цыпленка вне организма (in vitro) в стерильных условиях и отмечали, что после небольшого латентного периода начинается рост экспланта ткани, т.е. клетки мигрируют из тканей в питательную среду и делятся. Исследователи пересаживали клетки из одной среды в другую (т.е. применялась методика «пассирования» или субкультирования) и культура возобновлялась десятки лет.
Однако Э. Свимом (1956), а затем в 1965 году Хейфликом концепция Карреля была радикально пересмотрена и экспериментально опровергнута.
Хейфлик усовершенствовал методику «пассирования» Карреля, которая в настоящее время выглядит следующим образом:






















В настоящее время установлено, что клетки всех клеточных культур можно классифицировать на 3 основные клеточные линии:
Первичные клетки (образовавшиеся сразу после диссоциации ткани и несущие все признаки исходной ткани);
С ограниченным пролиферативным потенциалом (смертные или мортальные клетки) для которых характерно:
ограниченное число делений 50 ± 10;
имеют кариологическую картину ткани, из которой происходят;
зависят от прикрепления при их культивировании;
не вызывают опухоли при введении экспериментальным животным.
Иммортальные (бессмертные) линии клеток, которые;
смогли избежать кризиса - состояния терминальной остановки пролиферации;
могут вызывать опухоли, после введения лабораторным животным;
не имеют кариологическую картины клеток исходной ткани;
не зависят от прикрепление при их культивирование.
Пролиферация клеток I-ой и II-ой линий in vitro по Хейфлику выглядит следующим образом.
















1 фаза – роста – время от момента посева до образования 1-го монослоя;
2 фаза – период активного деления (с субкультивированием);
3 фаза – деградации культуры (для мортальных клеток);
3’ фаза – неограниченная пролиферация (для иммортальной культуры).

Гипотеза о потенциальном «бессмертии» соматических клеток Карреля очевидно основана на моноклональном использовании иммортальных клеток при субкультивировании.

ПРИМЕНЕНИЕ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ И ЧЕЛОВЕКА

Дендритные клетки и направленная иммунокоррекция
В связи с тем, что дендритные клетки обладают уникальной способностью предоставлять антигены (АГ) Т-лимфоцитам и, следовательно, участвуют в определении направленности иммунных реакций, - возлагается много надежд на возможное их использование в модуляции иммунного ответа в опухолях, инфекционных и аутоиммунных заболеваниях. При многочисленных заболеваниях дендритные клетки представляют собой и векторы и мишени для изменения иммунного статуса организма.
Впервые дендритные клетки были описаны Паулем Лангергансом в 1868 году в коже, как крупные клетки неправильной формы, с ветвящимися, проникающими между другими клетками отростками, с хорошо развитым аппаратом Гольджи и с овальной или неправильной формой ядер.
Дендритные клетки обнаруживаются во всех тканях организма и представляют собой незначительный клеточный пул. Из-за редкости встречаемости in vivo и отсутствия специфических маркеров этим клеткам длительное время не уделяли должного внимания.
Как антиген презентирующие клетки (АПК) дендритные клетки стали объектом пристального внимания только с 1973 года, когда в серии экспериментов Р. Штейманом и З. Кохном было показано, что лимфоидные дендритные клетки (ЛДК) являются сильными стимуляторами первичного иммунного ответа.
Дендритные клетки отличаются от других АПК (В-лимфоцитов, моноцитов и макрофагов) тем, что:
(1) их стимулирующий эффект на Т-лимфоциты в 10-100 раз сильнее,
(2) дендритные клетки являются единственными АПК, которые способны представлять Т-клеткам неизвестные антигены и усиливать иммунный ответ.



Различают следующие стадий развития дендритных клеток:
I стадия – костномозговые предшественники ДК - плюрипотентные стволовые клетки – небольшая фракция кроветворных клеток, присутствующая в костном мозге и периферической крови.
II стадия – клетки – предшественники ДК, циркулирующие в крови и лимфе, дают начало незрелым тканевым дендритным клеткам. В крови и лимфоидных органах образуются две субпопуляции: миелоидные и лимфоидные дендритные клетки.
III стадия – незрелые тканевые (антиген-захватывающие) дендритные клетки в различных органах и тканях.
IV стадия – через афферентные лимфатические пути зрелые (антиген представляющие) клетки мигрируют во вторичные лимфоидные органы.
Миелоидные дендритные клетки осуществляют «иммунный надзор» в нелимфоидных органах и тканях, где они захватывают АГ и процессируют их в пептиды.
Дендритные клетки миелоидного происхождения располагаются в эпидермисе кожи, слизистых оболочках респираторного, урогенитального и гастроинтестинального трактов, а также в сердце и почках, но отсутствуют в «иммунологически привилегированных» органах, таких как головной мозг, роговая оболочка глаза и тестикулы. «Золотым стандартом» миелоидных дендритных клеток являются дендритные клетки, располагающиеся в коже. Эти клетки, нагруженные процессированным АГ мигрируют по лимфатическим сосудам в область региональных лимфоидных узлов и здесь уже контактируют с Т-лимфоцитами, предоставляя им процессированный АГ и информацию об особенностях патогена.
Количество дендритных клеток повышается в условиях воспаления, они первые обнаруживаются в воспалительном инфильтрате на ранних стадиях аутоиммунного заболевания, они также присутствуют в сыворотке крови и синовиальной жидкости у пациентов с ревматоидным (ювенильным) артритом, а также высокий уровень дендритных клеток обнаруживают у больных с рассеянным склерозом.
Дендритные клетки лимфоидного происхождения обнаруживаются в лимфатических узлах, селезенке и тимусе. Лимфоидные дендритные клетки также как и миелоидные дендритные клетки, обладают способностью процессировать АГ и представлять их на свой поверхности, однако их дальнейшая судьба в области лимфатических узлов, не известна.

ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК

Существующие публикации по клиническому использованию дендритных клеток сфокусированы в основном на их применении при лечении опухолей.
Использование дендритных клеток в иммунотерапии онкологических заболеваний обоснованно несколькими причинами:
Способностью дендритных клеток мигрировать через ткани и проникать в опухоль, где они захватывают опухолеспецифические АГ, переваривают их и процессируют для эффективной индукции клеточно-опосредованного иммунного ответа;
Способностью дендритных клеток активировать Т-лимфоциты в региональных лимфатических узлах и определять их дифференцировку на цитотоксическое действие в отношении опухолевых клеток;
Способность дендритных клеток процессировать и представлять одновременно различный спектр антигенов, что позволяет использовать несколько путей индукции антиопухолевого иммунного ответа.
Существуют сообщения о применении дендритных клеток в качестве клеточной терапии при опухолевых заболеваниях: меланома, В-клеточная лимфома, рак предстательной железы, почечно-клеточный рак, а также - при карциномах таких органов как молочной железы, яичников, толстого кишечника, поджелудочной железы, легких.
Имеются сообщения об использовании вакцин на основе дендритных клеток при лечении неоплазий ЦНС. Существование гематоэнцефалического барьера, отсутствие лимфатических сосудов и дендритных клеток в паренхиме ЦНС, а также наличие иммуносупрессивного микроокружения делают головной мозг иммунологически привилегированным органом. Однако при патологических условиях, также как воспаление, опухолевый рост, лимфоциты могут инфильтровать головной мозг и, таким образом, может затрагивать системный иммунный ответ. У пациентов с глиобластомами, как показывает клиническая практика, существенно снижается клеточный иммунитет. Это происходит в основном из-за выработки опухолевыми клетками иммуносупрессивных факторов.

СРЕДИ МЕТОДОВ КЛЕТОЧНОЙ ИММУНОТЕРАПИИ:
введение лимфокинактивированных лимфоцитов;
введение лимфоцитов, инфильтрующих опухоль;
введение цитотоксических лимфоцитов, сенсибилизированных к опухоли;
введение облученных опухолевых клеток; Наибольшей способностью обладает метод основанный на:
введении дендритных клеток.
Применение дендритных клеток оказалось безопасным для пациентов: не было отмечено ни развития системных аутоиммунных заболеваний, ни хронического воспаления в опухолевой ткани. Кроме того, лечение дендритными клетками приводит к существенному повышению продолжительности жизни, как у животных, так и у людей.
Несмотря на положительные результаты клеточных вакцин на основе дендритных клеток при лечении онкологических заболеваний, до внедрения их в клиническую практику ещё далеко.
Для этого необходимо решить целый ряд вопросов:
- стандартизировать препараты, т.е. приготовление (включая качественный контроль) и хранение;
- формы доставки в организм реципиента;
- определение дозы и путей введения и др.
Одним из важных моментов в разработке эффективных клеточных вакцин является выбор оптимального АГ, против которого будет получен иммунный ответ. После культивирования дендритных клеток с опухолевыми антигенами их вводят в организм реципиента.
В настоящее время существует 3 основных стратегии в отношении представления АГ дендритным клеток с целью их дальнейшего клинического использования:
В форме кДНК или мРНК;
В форме опухолеспецифических АГ (используются лизаты клеток опухоли или опухолевые клетки, находящиеся в апоптозе);
В форме опухолеспецифических пептидов или пептидов с неизвестной последовательностью из аутологичных опухолей.
Такие подходы при разработке клеточных вакцин имеет ряд недостатков:
а) Приготовление лизатов клеток опухоли, опухолевых мРНК и пептидов требует существенного количества биопсийного материала, следовательно, если существуют ограничения во взятии материала, то этот метод органичен в применении.
б) Небольшое количество биопсийного материала позволяет взять мРНК и затем амплифицировать ПЦР. Однако существующие методы переноса генетического материала в дендритные клетки (катионное липидоопосредованная трансфекция, электропорация, баллистическая трансфекция и трансдукция вирусных векторов) не исключают тот факт, что у человека гуморальный ответ к аденовирусу или к вирусу коровьей оспы (или других ранее перенесенных вирусных инфекций или вакцинаций) может отменить действие вакцины.
в) Недостатком использования опухолеспецифических пептидов является их идентификация, которая относиться к группе дорогостоящих исследований.
г) Другой проблемой является развитие аутоиммунных реакций на введение. Известно, что опухолевые клетки экспрессируют разнообразный рецептор АГ, поэтому не исключена возможность перекрестной экспрессии некоторых из них и на нормальных клетках.






СВОЙСТВА СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК (СК) И ПРОБЛЕМЫ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ
История изучения стволовых клеток берет своё начало с концепции стволовых клеток, предложенной русским гистологом А. А. Максимовым в 1908 году применительно к кроветворной ткани.
В 40-60-х годах ХХ века несколько исследователей провели фундаментальные работы, в которых внутривенная инъекция костного мозга или кроветворных стволовых клеток (КСК) селезеночного происхождения мышам с летальным радиационным поражением приводила к колонизации селезёнки пораженных животных вновь введенными клетками, дифференцировке их во все клеточные фенотипы и спасению жизни животного. Проведённые таким образом эксперименты по сей день используются на мышах в качестве «золотого стандарта» при доказательстве того, что изолированные из крови или костного мозга КСК действительно являются стволовыми кроветворными клетками.
Середина 70-х годов ХХ века ознаменовалась крупным успехом в изучении клеточного состава костного мозга и открытии в его строме мезенхимальных (стромальных) стволовых клеток отечественной группой ученых во главе с А. Я. Фриденштейном. В 1976 году он сообщил об образовании колоний-образующих единиц фибробластоподобных клеток при культивировании тканей костного мозга, селезёнки и вилочковой железы мышей. А. Я. Фриденштейн назвал эти клетки мезенхимальными стволовыми клетками и впоследствии установил, что они не только важны в качестве стромальной стволовой клетки для дифференцирован КСК в костном мозге, но также генерируют in vitro предшественников, главным образом - адипоциты и остеоциты. Он также описал их культуральные свойства, роль фидерного (базового слоя, состоящего из других типов клеток) слоя и потребность в ростовых факторах.
История эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) началась с того момента, когда ранние работы А. А. Максимова, по собственному признанию основателя вспомогательной репродукции R. Edwards, вдохновили его на исследование in vitro клеток дезагрегированных предимплантационных эмбрионов в 80-х годах ХХ века.
В 1968 году докторант Эдварса R. Gardner инъецировал ЭСК крысы в бластоцеле мышиной бластоцисты. Впоследствии из последней выросла 1-я известная миру мышь-химера, в которой донорские ЭСК колонизировали все её ткани и приняли участие в формировании всех органов.
К настоящему времени известно несколько форм стволовых клеток:
Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) (из бластоциста);
Стволовые клетки эмбриональных тканей;
Стволовые клетки дифференцированных тканей (соматические стволовые клетки (ССК)) организма (кровь, костный мозг);
В последнее десятилетие стволовые клетки обнаружены в тканях, ранее не содержащих их, например головной мозг.
Помимо этого, продемонстрирована способность ССК из одной тканей дифференцироваться в клетки, характерные для других тканей. Например, стволовая кроветворная клетка, способна к дифференцировке в различные клетки крови, иммунные системы и при определенных условиях может трансформироваться в клетки, имеющие основные характеристики нейронов. Подобная трансформация стволовых клеток получила термин «пластичность».





















КЛАССИФИКАЦИЯ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК
На основе проведенных исследований может быть предложена следующая классификация стволовых клеток человека по происхождению и источнику выделения:
Стволовые клетки эмбриона и тканей плода:
клетки эмбриональной карциномы;
эмбриональная герминальная (из примитивных гонад абортов 5-9 недельного развития) (ЭГК);
эмбриональная стволовая клетка (ЭСК).
Стволовые клетки взрослого организма (постнатальные, или соматические):
кроветворные стволовые клетки (КСК);
стромальные (мезенхимальные) стволовые клетки;
предшественник эндотелиальных клеток;
мышечная стволовая клетка;
нейрональная стволовая клетка;
эпидермальная стволовая клетка и др.
СВОЙСТВА СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК
СК – уникальные клеточные популяции, способные:
к самовозобновлению;
к дифференцировке в специализированные клеточные типы.
В отличие от других клеток организма они политипированы (направлены) к выполнению специфической функции, стволовые клетки остаются недифференцированными до получения сигнала к дифференцировке в специализированные клетки. Направление пути дальнейшего развития стволовых клеток – самоподдержание или дифференцировка – определяется как внутренними импульсами, контролируемыми генами, так и эпигенетическими сигналами локального микроокружения, передаваемые через контакты с соседними клетками, секретируемыми ими молекулами и компонентами внеклеточного матрикса.




Все стволовые клетки, независимо от происхождения и источника выделения, обладают 3 общими уникальными свойствами:
Они способны к самоподдержанию в течение длительного времени;
Они не специализированы, т. е. не имеют каких-либо тканеспецифических маркёров, ответственных за выполнение специальных функции;
Они способны к дифференцировке в любые специализированные ткани.
ХАРАКТЕРИСТИКА СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК
Отличительными особенностями ЭКС является их способность к бесконечной пролиферации симметричным делением в культуре и выраженная клоногенность, т.е. способность образования из одной первоначальной стволовой клетки целой линии генетически идентичных стволовых клеток.
Первые клеточные линии ЭСК были выделены из эмбрионов, полученных при помощи экстракорпорального оплодотворения и впоследствии подаренных их биологическим родителям ввиду не востребованности.
С этической точки зрения использование эмбрионов таким образом, выглядит более оправданным по сравнению с их деструкцией, таким образом, эти эмбрионы были получены с репродуктивной целью, но именно для этой цели впоследствии не понадобились.















ТЕХНОЛОГИЯ ВЫДЕЛЕНИЯ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК



















Убедительные доводы о том, что ЭСК не обладают тотипотентностью и не могут быть использованы для создания целого организма и, следовательно, сохраняют разнообразие клеток, но не жизней, не повлияли на принятие запретительных ограничений на проведение экспериментального клонирования в системе гос.учреждений ряда стран, включая Россию, США и др.
Тем не менее, исследовательская группа R. McKoy провела серию экспериментов по использованию ЭСК для получения инсулин продуцирующих клеток.


























Ряд авторов сообщают об успешной направленной дифференцировке ЭСК человека в кардиомиоциты, на основе этих достижений разрабатываются подходы к использованию ЭСК в репарантной терапии повреждений миокарда.
ПРОБЛЕМЫ, СВЯЗАННЫЕ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЭСК
Имеется 3 серьёзных аргумента против использования ЭСК в лечение заболеваний и повреждении тканей:
Иммунологическая несовместимость клеток, пересаживаемых пациенту;
Высокая вероятность иммунологического отторжения, несмотря на тщательный подбор донора и реципиента по АГ главного комплекса гистосовместимости и успехи иммуносупрессивной терапии.
Пересаживая ЭСК, подобно трансплантируемым органам, вы не излечиваете больного, а продлеваете его жизнь.
Ситуация, сложившаяся к настоящему времени с ЭСК напоминает эксперименты с генной терапией – большие надежды, большие проблемы и невысокий эффект.
Для соматических стволовых клеток определенны следующие общие характеристики:
Постнатальные стволовые клетки способны поддерживать дифференцировку клеток в тканях взрослого организма на протяжении всей жизни;
Представляют собой относительно недифференцированные клетки, обнаруживаемые в дифференцированных, специализированных тканях;
Составляют очень малую долю всего клеточного состава (1:10000) и трудны в идентификации, выделении и обогащении при поддержании в культуре;
Самоподдержание клеточной популяции соматических стволовых клеток происходит за счет ассиметричного деления в клетки, поддерживающие пул стволовых клеток.

Соматические стволовые клетки дифференцируются в ограниченное число клеточных типов, т.е. обладают потенциалом мульти – или унипотентного созревания. Ни одна из соматических стволовых клеток не продемонстрировала плюрепотентности – способности давать начало всем клеточным типам. Стволовые клетки из предимплантационных эмбрионов и некоторых фетальных тканей, напротив могут формировать in vitro любой из известных 200 клеточных типов. В этом смысле ЭСК плюрипотентны.
В последние десятилетия были разработаны различные методы, методические подходы и технологии выделения и обогащения КСК, основанные на их физических или поверхностных характеристиках:
плотностное центрифугирование;
иммуномагнитная сепарация;
проточная цитофлюорометрия;
селективная клеточная агглютинация и др.
Благодаря этим методам КСК человека успешно идентифицируются в пуповинной крови новорожденных, костном мозге, периферической крови взрослых и применяются для аллогенной или аутологической трансплантации пациента после химиотерапии по поводу онкопатологий, при гематологических нарушениях (особенно при хронической миелоидной лейкемии и апластической лейкемии), иммунодефицитных состояниях, синдромах врожденной ферментативной недостаточности, аутоиммунных заболеваниях (системная красная волчанка, ревматоидный артрит, диабет 1-го типа и др.).
Например: один из оригинальных способов лечения системной красной волчанки с применением КСК был предложен недавно и в настоящее время находится на стадии клинических испытании.

Схема лечения включает 2 этапа:
I ЭТАП: кровь пациенток с тяжелой формой заболевания
очистка in vitro от зрелых иммунных клеток, участвующих в патогенезе
выделение КСК

криоконсервация КСК
II ЭТАП: пациентки получали высокодозированную химию / радиотерапию

аутотрансплантация замороженных КСК

По результатам лечения, все женщины имеют стойкую ремиссию без необходимой поддерживающей иммуносупрессивной терапии (срок наблюдение > 3 лет).
В работах по трансплантации костного мозга продемонстрирована дифференцировка человеческих КСК в гепатоциты и холангоциты путем идентификации клеток печени и измерения экспрессии гепатоспецифических протеинов.
Кроме того, КСК являются привлекательной мишенью генного переноса лентавирусными и аденовирус-ассоциированными векторами благодаря своей способности постоянно участвовать в гемопоэзе после трансплантации и снабжать организм реципиента генетически модифицированными кроветворными клетками.




ПРОБЛЕМЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ СОМАТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК (ССК)
История изучения ССК (за исключением КСК) насчитывает всего 3 - 4 года и, в связи с этим, несмотря на отсутствие проблемы иммунологического отторжения (стволовые клетки получают из ткани самого пациента) тормозящим барьером на пути реализации всех многообещающих возможностей использования соматических стволовых клеток является 2 взаимодополняющие проблемы:
Ограниченная способность к росту в культуре (т.е. in vitro), при этом стволовые клетки стремятся дифференцироваться в зрелые клетки той ткани, из которой они первоначально выделены;
Отсутствие надежного метода идентификации истинных долгожительствующих КСК (в первую очередь).
В связи с этим в теории ЭСК кажутся более привлекательными, так как, доказана их способность (в эмбриональном микроокружении) генерировать все клеточные типы. На практике, однако, чрезвычайно трудно получить в in vitro из ЭСК тот тип клеток, который планируется.
Одним из видимых вариантов этой проблемы является получение стволовых клеток из пуповинной крови новорожденных и их хранение в банках стволовых клеток. Число кроветворных стволовых клеток в пуповинной крови гораздо выше, чем у взрослого человека и эти клетки обладают более высоким пролиферативным и дифференцированным потенциалом. Современные технологии позволяют изолировать из 60-200 мл пуповинной крови до 4 млн. КСК.











ТКАНЕВАЯ И ОРГАННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ

Тканевая инженерия – самостоятельная междисциплинарное направление биомедицины, в котором для замещения пораженных органов и тканей используется принципы биологии и инженерии, которые восстанавливают, поддерживают или улучшают функции органов или тканей.
Эта форма терапии отличается от стандартной тем, что сформированная инженерным путем ткань интегрируется в организм пациента, осуществляя постоянное и специфическое лечение болезни.
Таким образом основной задачей тканевой инженерии является реконструкция тканей или органов на основе создания гистотипических структур с соблюдением принципов пространственного и/или функционального подобия.
С этой точки зрения «золотым стандартом» тканевой инженерий является создание полностью аутогенных имплантатов на основе использования собственных клеток пациента, размноженных вне организма и ретрансплантированных в составе новой реконструированной ткани. Только такой подход может явиться достойной альтернативной классической трансплантологии.
При создании новой ткани используется один из 3-х общих подходов:
Дизайн и выращивание ткани человека in vitro с последующей её имплантаций для восстановления или замещения поврежденных тканей.
Наиболее ярким примером подобной терапии является пересадка компонентов кожи при лечении ожогов, использующихся в клинике более 10 лет.
Имплантация клеток, содержащих вещества, индуцирующие репарацию или регенерацию функции поврежденных тканей.
Существенным моментом является перенос клеток в биоматериалы, обеспечивающие регенерацию тканей.
Наиболее часто в качестве биоматериалов используют новые полимеры, образующие 3-х мерные структуры, удобные для прикрепления и роста клеток, реконструирующих поврежденные ткани. Примером такого биоматериала является биоматрикс, стимулирующий рост костной ткани при заболеваниях периодонта.
Использование внутренних потенциалов тканей для восстановления функции поврежденных органов и тканей.
Этот подход использует технику выделения стволовых клеток, которые имплантируются пациенту либо непосредственно в суспензии или в структуру матрикса.
КОЖНЫЙ ЭКВИВАЛЕНТ И ПРИНЦИПЫ ВОССТАНОВЛЕНИЯ ЭПИТЕЛИАЛЬНО-СТРОМАЛЬНЫХ ДЕФЕКТОВ
Принципиальная возможность культивирования клеток кожи была впервые показана в работах Р. Medawara. В 1968 году был разработан метод трансплантации первичных культур эпидермальных кератиноцитов в эксперименте.
Однако возникли трудности при выращивании клеток в больших масштабах, что было необходимо для закрытия ран. Новый импульс в решении этой проблемы был дан работами J. Rheinwald и H. Green (1975), которые достигли большого прогресса в получении больших по площади пластов культивированных клеток, используя облученные мышиные фибробласты в качестве фидерного слоя.
Попытки культивирования кератиноцитов на поверхности живых фибробластов не могли увенчаться успехом из-за выраженной неприхотливости последних (бурной их пролиферации или быстрого вытеснения кератиноцитов из культуры). Появилась необходимость найти субстрат, позволяющий:
изолировать фибробласты от непосредственного контакта с эпидермальными клетками и в тоже время
сохранить их стимулирующие влияние на рост эпителия.
Наиболее физиологичным явился трехмерный коллагеновый гель, позволивший моделировать те условия, в которых они находятся в организме. Добавление культивированных фибробластов дермы в 3-х мерный коллагеновый гель привело к созданию in vitro «живого эквивалента дермы».






Технология получения эквивалента кожи включает 4 этапа:
Предварительная подготовка и соединение основных (клеточного и внеклеточного) компонентов дермы при рН - 7,4;
Тщательное перемешивание и перенесение в культуральную посуду и образование коллагенового геля с заключенными в него фибробластами в результате полимеризации коллагена;
Дальнейшее упорядочивание коллагенового геля во время инкубации и образование эквивалента дермы;
Получение эквивалента кожи в результате внесения суспензии кератиноцитов и их культивирования на поверхности дермального эквивалента.


























Установлено, что именно фибробласты определяют направленность и исход процессов восстановления структуры ткани.
В результате клинического применения дермального эквивалента при лечении гранулирующих ран и трофических язв было установлено стимулирующее влияние фибробластов на течение раневого процесса (сокращение сроков эпителизации, формирование нежных грануляций), в том числе и в условиях инфицированной раны.
Таким образом, относительная простота и дешевизна получения дермального эквивалента и получения культур фибробластов позволили начать их применение в клинической практике:
фармакология (при доклинической апробации лекарственных средств);
косметология (при апробации косметических средств);
токсикология, дерматология (при различных инфекционно- аллергических заболеваниях кожи);
хирургия и травматология (при заживлении ран и трансплантации кожи).
ИНЖЕНЕРНАЯ ЭНЗИМОЛОГИЯ
ПРИКЛАДНАЯ ЭНЗИМОЛОГИЯ
В современной БТХ одно из центральных мест принадлежит ферментам (Е). Всё живое содержит Е и без них невозможен обмен веществ. Возможность препаративного получения ферментов позволило использовать их в различных областях народного хозяйства: промышленности (пищевой, производство ПАВ (моющих и косметических средств), текстильной, бумажной, кожевенной, фармацевтической и т.д.); Сельском хозяйстве, а также в научных исследованиях (медицине, тонком органическом синтезе, химическом анализе).
Применение ферментов позволило изменить технологические процессы, методы анализов, обеспечить более высокие показатели продуктивности и качества производства.
В отличие от многих технологических процессов химические технологий, требующих высоких величин P, t, pH-среды, ионной силы, биотехнологий производства с применением ферментов осуществлялось с меньшими энергозатратами и в более «мягких» условиях:
При t не более 60 0С;
Нормальным атмосферным давлением Р;
рН среду 4,5-8,0;
Ферменты обладают высокой субстратной, специфичностью к обратимости биохимических реакций.
В связи с этим, не удивительно, что начиная с середины XIX в. получение ферментов и их использование в различных технологических процессах составляет один из важнейших разделов БТХ. Только за период 1965-1980 г. ферментативная промышленность в ведущих странах мира увеличила объем производства в среднем на 15%.
Принципиально новые перспективы перед прикладной энзимологией открыты в результате создание нового типа биоорганических катализаторов – гетерогенных катализаторов, так называемых иммобилизованные ферменты, т.е. ферменты, связанных с носителем и несколько позднее было получена возможность производства гетерогенных катализаторов на основе клеток.






















Продукт
Примеры
Применение в пищевой промышленности

Аминокислоты
Цистеин, метионин, лизин
Повышение питательной ценности пищи (в том числе белка одноклеточных)


Глутамат
Усиление аромата мясных, рыбных, грибных изделий


Глицин, аспартат
Придание кондитерским изделиям и напиткам кисло-сладкого вкуса

Олигопептиды
Аспартам, тауматин, монеллин
Низкокалорийные, очень сладкие вещества

Ферменты

·-Амилаза
Гидролиз крахмала при производстве спирта, вин, в пивоварении, хлебопечении, изготовлении кондитерских изделий и детского питания


Глюкоамилаза
Получение глюкозы, удаление остаточных декстринов из пива


Инвертаза
Производство кондитерских изделий


Пуллуланаза
Производство мальтозных (в сочетании с
·-амилазой) или глюкозных (в сочетании с глюкоамилазой) сиропов из крахмала, предварительно обработанного
·- амилазой



·-Галактози-даза
Производство безлактозного молока, освобождение молочной сыворотки от лактозы, приготовление мороженого


Целлюлозы
Приготовление растворимого кофе, морковного джема, улучшение консистенции грибов и овощей, обработка цитрусовых


Пектиназы
Осветление вин и фруктовых соков, обработка цитрусовых


Микробные протеазы
Сыроварение, ускорение созревания теста, производство крекеров


Пепсин, па-паин
Осветление пива


Фицин, трипсин, бромелаин
Ускорение маринования рыбы, удаление мяса с костей


Липазы
Придание специфического аромата сыру, шоколаду, молочным продуктам, улучшение качества взбитых яичных белков


Глюкозооксидаза в сочетании с каталазой
Удаление кислорода из сухого молока, кофе, пива майонезов, лимонных, апельсиновых и виноградных соков

Витамины
А, В1, В2, В6, В12, С, D, Е, никотиновая кислота С, Е
Повышение питательной ценности пищевых продуктов
Антиоксиданты

Терпены и родственные соединения
Гераниол, нерол
Ароматизаторы

Органические кислоты
Уксусная, бензойная, молочная, глюконовая, лимонная
Консерванты, ароматизаторы

Таблица 1. Перспективы использования биотехнологических продуктов в пищевой промышленности (по П. П. Клесову, 1984; М. Haas, 1984; J.Kas, 1984; O. Volfova, 1984; O. Sahai, M. Knuth, 1985)


ИСПОЛЬЗОВАНИЕ СВОБОДНЫХ (ГОМОГЕННЫХ) ФЕРМЕНТОВ
Начиная с середины 90-х годов ХХ в. применение гомогенных биоорганических катализаторов носит лавинообразный характер, затрагивающий самые разнообразные отрасли экономики, преимущественно в пищевой, фармацевтической, косметической промышленности.









Ферменты
Области применения


·-амилаза (слюна) и панкреатическая амилаза (из поджелудочной железы крупного рогатого скота)
Хлебопечение;
Пивоварение;
Производство кондитерских изделий;

Обработка текстильных изделий;
Производство высококачественной бумаги.

Лактаза(моллюск)
Производство мороженого

Пектиназа(фермент клеточной стенки плодов и фруктов)
Производство и осветление вин и фруктовых соков;
Производство кофе (растворимый)

Протеиназа
Микробного происхождения
Размягчение мяса;
Осветление вин и пива;
Стабилизация сгущенного молока;

Обработка текстильных изделий;
Выделка кожи.

Животного происхождения: папаин, трипсин, пепсин, липаза, сычужные ферменты
Осветление пива;
Размягчение мяса;
Сыроделие;
Модификация вкуса молочных продуктов (производство йогуртов);
Приготовление майонезов
Выделка кож;
Фармацевтическая (вобэнзим, лизим, фестал и д.р.)

Рестриктазы I-IV классов: лигазы, ревертазы, терм. ДНК – полимер. (Taq-пол.) набор стандартов – для электрофореза.
Биомедицинские производства («Reanal», Венгрия, «Bio-Rad», «Serva» «Flura» США, «Pharmacia» Швеция).


Процесс создания гетерогенных катализаторов путем связывания фермента с носителями различной природы получил название иммобилизация. При иммобилизации водорастворимые фермент переходит в нерастворимые форму, превращаясь, таким образом, из гомогенного катализатора в гетерогенный. В результате такого превращения катализатор приобретает новые свойства.
ГЕТЕРОГЕННЫЕ КАТАЛИЗАТОРЫ НА ОСНОВЕ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ФЕРМЕНТОВ
Первое целенаправленной работой по созданию системы носитель – химически связанный фермент была работа Д. Кэмпбелла (1951) по ковалентной иммобилизации Е на целлюлозу.
В России в 1974 году в МГУ создана кафедра химической энзимологии под руководством академика И. В. Березина.
Свойство иммобилизованных ферментов (ИЕ), как и всех гетерогенных катализаторов:
Легко отделить фермент от продукта реакции, что является существенным шагом к технологизаций каталитического процесса;
Возможность проводить реакции в специальных технологических устройствах – химических реакторах. Различают 3 типа реакторов:













Е используется многократно (повторно);
Иммобилизация ферментов приводит к росту устойчивости против тепловой денатурации.
Получать продукт, незагрязненный ферментами, что особенно важно для пищевого, косметического и фармакологического производства.
Иммобилизация позволяет целенаправленно изменять свойства ферментов, в том числе их специфичность, зависимость активности от рН среды.
Носители для иммобилизации фермента:
Носитель должен быть абсолютно нерастворимым, химически стойким в Н2О и не подвергаться биологическому разрушению;
Носитель должен быть высокопроницаемым для S и продукта реакции; т.е. создавать min диффузные затруднения для достижения активного центра фермента;
Носитель должен быть механически прочным в условиях гидродинамических потоков (проточного реактора);
Носитель должен иметь химически активные группы, обеспечивающие химическое связывание (хемосорбцию) фермента с поверхностью носителя.
ПРИМЕНЯЕМЫЕ НОСИТЕЛИ

ПРИРОДНЫЕ
СИНТЕТИЧЕСКИЕ

Органической природы
Неорганической природы


производные целлюлозы (поли 1,4
·D- глюкониранозил, D-глюкопиранозы)
кварц
Сефадексы – сшитые декстраны эпихлоргидрином или диэпоксидами

производные декстрана
стекло


производные агарозы
селикогели (sio2)
Сефароза – сшитые агарозаэпихлоргидрином или диэпоксидами

Гели желатины или коллаген
Al2O3 и др. оксиды металлов
Ионообменные смолы – Dowex, Amberlit (сополимер стирола, сшитые дивинилбензолом)


Для создания электропроводящих систем
Полиамидные волокна нейлона


Графит



сажа



стеклоуглерод



графитированные ткани





Способы активации носителей для последующей иммобилизации:
Химия активизации весьма разнообразна и зависит от химической природы носителя и иммобилизованного фермента.
Окисление поверхности носителя (HIO4; HCO4) индуцирует образование (СОН) альдегидных групп, образующих с белками на последующей стадии основания Шиффа.





Традиционным методом является «прививка» на полимер NH2- группы, например реакция с BrCNили с хлорангидридами ароматических кислот.
Химическая модификация ОН – групп носителя путем обработки глутаровым диальдегидом как бифункциональным сшивающим агентом позволяет ввести на поверхность носителя альдегидную группу, с которой эффективно связывается NH2 – группа иммобилизуемого фермента и др. методы.
МЕТОДЫ ИММОБИЛИЗАЦИИ ФЕРМЕНТОВ
Различают два основных метода иммобилизации:
Химическая иммобилизация;
Физические способы иммобилизации.
Однако методов подходов связывания ферментов с носителем несколько:
Абсорбция и сополимиризация Е и носителей с образованием ионных, Н+ и гидрофобных связей, чаще всего на керамике, стекле, силиколле, гидроксидах металлов, органических смолах и др.;
Методы химического (ковалентного) присоединения к носителю через функциональную группу R-аминокислот ферментов (NH2, COO-, SH-, OH- и др.), как к неорганическому носителю (пористое стекло, керамика и др.), так и природным материалам (целлюлоза, хитин, декстрона и др.) или к синтетическим полимерам;
Метод механического включения (захвата = микрокопсулирование) т.е. Е могут быть переведены в гетерогенное состояние путем их включения в микрокапсулы, образуемые полупроницаемые полимерные оболочками. Оболочка непроницаема для фермента, находящегося внутри полой сферы, но проницаема для растворов S и продуктов.

Различают 3 способа получения микрокапсул с иммобилизованным ферментами:
Межфазная полимеризация – полимерная пленка образуется путем полимеризации мономеров на границе раздела фаз – микрокапсулы, покрытыми полиамидными полупроницаемыми оболочками.
Межфазная коацервация – полупроницаемая оболочка образуется за счет осаждения органорастворимого полимера на границе раздела фаз Н2О – органический растворитель - сферы, получаемые путем осаждения коллоидной системы на частицах эмульсии Н2О в органических растворителях.
Включение фермента в липосомы.
Липосомы – система концентрических бислойных замкнутых липидных мембран.
ИММОБИЛИЗОВАННЫЕ КЛЕТКИ МИКРООРГАНИЗМОВ
Если сравнивать Е и клетки, содержащие эти Е, то с технологической точки зрения иммобилизованные клетки в ряде случаев предпочтительны:
отсутствует трудоёмкая и дорогостоящая процедура выделения Е;
методы генной инженерии можно получать клетки с высоким содержанием необходимого Е;
в клетках Е часто, но не всегда, гораздо стабильнее, чем в растворе или на матрице после их иммобилизации;
клетки способны регенерировать Е и 13 QUOTE 1415 поддерживать высокий уровень их активности.
Разработано несколько методов иммобилизации клеток:
Иммобилизация за счет физическихсорбции на поверхности носителя;
Химическая иммобилизация за счет образование ковалентной связей между носителем и компонентами клеток;
Включение в природный и синтетические гидрогели.
Химическая иммобилизация предполагает использование различных химических бифункциональных агентов, обладающих токсичностью для клеток.
Наиболее эффективны методы получения «живых» иммобилизованных клеток «арестованных» в матрице геля (полисахарида типа агар, желатина, а так же криогели, возникающие при охлаждении растворов полимераз поливинилового спирта, за счет криоконструирования).
Процесс иммобилизации происходит в мягких условиях, клетки сохраняют основные физиологические функции, такие как дыхание, синтез АТФ, трансляция и т.д.
ОСНОВНЫЕ ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ФЕРМЕНТОВ
МЕДИЦИНА.

Иммобилизация фермента открыли в медицине:
Пути к созданию лекарственных препаратов пролонгированного действия, со сниженной токсичностью и аллергогенностью;
Иммобилизация подхода способствует решению проблемы направленного транспорта лекарств в организме.

Все ферменты как лекарственные препараты можно разделить на 4 группы:
Ферменты коррекции пищеварения. Липаза, протеаза из различных источников используются как дополнительные ферменты облегчающие расщепление жиров, белков и др. в процессе их пищеварения - вобэнзим, лизим, фестал;
Ферменты наружного применения - созданы перевязочные материалы, улучшающие заживление ран;
Тромболитические ферменты - для растворения фибриновых тромбов, возникающих при сердечно-сосудистых патологиях. Стрептокиназа и стафилокиназа (бактериального происхождения), урокиназа. Создание эффективных тромболитических агентов связывают с тканевым активатором плазминогена и протеолитическим ферментом - урокиназой. Получены генно-инженерные варианты урокиназы, и на этой основе создан доступный фармакологический препарат;
Е противоопухолевой терапии. Торможение роста опухоли в этом случае основано на селективнойферментативной модификации ряда аминокислот, используемых раковыми клетками для пролиферации роста. Терапевтически значимыми ферментами являются лизиноксидаза и аспарагиназа.

ФЕРМЕНТЫ В АНАЛИТИЧЕСКОЙ ХИМИЙ И ХИМИЧЕСКОМ АНАЛИЗЕ.

Фермент в химическом анализе нашли широкое применение для решения разнообразных задач, включая:
Анализ низкомолекулярных соединений в сложных биохимических смесях;
Количественный анализ белков в сложных белковых композициях;
Качественный и количественный анализ НК.
Наиболее известными и широко применяемыми аналитическими направлениями являются:
Ферментативный анализ метаболитов;
Анализ с использованием биосенсоров;
ИФА (иммуноферментный анализ);
Анализ НК с использованием ПЦР (полимеразная цепная реакция);
Биолюминесцентный анализ.
БИОСЕНСОРЫ – аналитические устройства, использующие биологические материалы для «узнавания» определенных молекул и выдающие информацию об их присутствии, количестве в виде электрического сигнала.
Первый биосенсор создан 1967 году Л. Кларк и С. Лионе. Идея Л. Кларка состояла в использование ферментного электрода, т.е. электрохимического датчика с иммобилизацией на его поверхности фермента.
Структура биосенсора
Любой биосенсор состоит из 2-х элементов:
биоселективной мембраны, использующей различные биологические структуры;
физического преобразователя сигналов (трансдьюсера), трансформирующий концентрационный сигнал в электрический.
Для считывания и записи информации используют электронные системы усиления и регистрации сигнала.
В качестве биоселективного материала используют все типы биологических структур: ферменты, антитела, рецепторы, НК и живые клетки.
Трансдьюсерами могут быть электрохимические преобразователи (электроды), различного рода оптические преобразователи, колориметрические, резонансные системы и т.д.












1-ый биосенсор на основе фермента, предложенный Л. Кларком - глюкозо-оксидазный, позволяет определить концентрацию глюкозы в крови у больных сахарным диабетом, и реализован для случая, когда S или P ферментативной реакцииэлектрохимическим активны, т. е. способны быстро и обратимо окислиться или восстанавливаться на электроде при наложении на него соответствующего потенциала.
Например, биосенсор на C6H12O6 основан на реакции окисления с участием глюкозооксидазы с последующей регистрации тока восстановления О2 или Н2О2.






Биосенсоры на основе клеток, иммобилизованных в матрице природного происхождения (желатина, агар, альгинат Са и др.) или в растворы полимеров (замораживание суспензии клеток с получением криоструктурированных гелей), применяются для селективного определения фенолов, Pro, Gln, Tyr, лактата, аскорбиновой кислоты, С6Н12О6, 13 QUOTE 1415, 13 QUOTE 1415, монометилсульфаты и т.д. Они наиболее востребованы при экспресс-анализе качества Н2О и сточных вод.
ОРГАНИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ.
БИОКОНВЕРСИЯ Е И МАССЫ – иммобилизованные ферменты вносят ощутимый вклад в осуществление биофотолиза Н2О и биоэлектродиализе и с их участием становиться реальными создание топливных элементов.
ПРОМЫШЛЕННЫЕ ПРОЦЕССЫ ПРЕИМУЩЕСТВЕННО В ПИЩЕВОЙ ПРОМЫШЛЕНОСТИ.
ОСНОВА ДЛЯ СОЗДАНИЯ РЯДА НОВЫХ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ
К настоящему времени 6 процессов с использованием иммобилизованных ферментов или клеток нашли крупномасштабное применение в пищевой промышленности ряда развитых стран мира:
Получение глюкозо-фруктозных сиропов и далее фруктозы из глюкозы;
Получение оптически активных L-аминокислот на их рацемических смесях;
Синтез L-Asp из фумаровой кислоты;
Синтез L-яблочной кислоты из фумаровой кислоты;
Получение диетического безлактозного молока;
Получение сахаров из молочной сыворотки.
ПОЛУЧЕНИЕ ГЛЮКОЗО-ФРУКТОЗНЫХ СИРОПОВ
Фруктоза, или иначе фруктовый, плодовый или медовый сахар широко распространены в природе. Этот особый сахар содержится во многих плодах и фруктах, особенно богаты им яблоки и помидоры, а также пчелиный мед, который на Ѕ состоит из фруктозы.
По сравнению с обычным сахаром (в состав молекулы которого фруктоза такжевходит, но в виде дисахарида с менее сладкой глюкозой), фруктоза обладает более приятным вкусом, и, согласно профессиональной терминологии, вкус фруктозы «медовый», а обычного сахара – «приторный».
Далее, по сладости фруктоза на 60-70 % слаще сахара, и соответственно, ее меньшее потребление влечет за собой меньшую калорийность продукта. Это важно с точки зрения диетологии питания. Наконец, фруктозу в отличие от глюкозы или сахара могут потреблять больные сахарным диабетом, и вообще, замена сахара фруктозой существенно снижает вероятность этого заболевания. Дело в том, что физиологический путь использование человеческим организмом фруктозы совершенно другой, чем сахара или глюкозы, и не связан с превращениями инсулина. К этому остается добавить, что фруктоза значительно менее вредна для зубов (из-за кариеса), чем сахар, в смеси с глюкозой не кристаллизуется, что важно в производстве мороженного, кондитерских изделий и т.д.
Несмотря на все эти неоспоримые преимущества фруктозы по сравнению с обычным сахаром, ее производство в мире практически отсутствовало вплоть до начала 70-х годовXX века. Однако, после того как 1973 году американской компанией «Клинтон корн» был введен в промышленность процесс превращения глюкозы во фруктозу под действием иммобилизованного фермента глюкоизомеразы. Этот процесс стал самым крупным в мире по сравнению с другими, в которых используются иммобилизованные ферменты.
Научная основа процесса довольно проста. Фермент глюкоизомераза катализирует превращение (изомеризацию) глюкозы во фруктозу в 1 стадию, и реакция протекает до тех пор, пока в реакционной системе количества глюкозы и фруктозы не станут примерно равными. После этого реакция останавливается, и полученную смесь можно использовать либо в виде глюкозо-фруктозного сиропа, либо отделить фруктозу и оставшуюся глюкозу опять подвергнуть изомеризации.
Этот процесс проводят непрерывно в реакционных колонках высотой примерно 5 метров, которые предварительно заполняют иммобилизованным ферментом в виде гранул, полых нитей, кусочков гелей (в виде желатина) и т.д. В колонку непрерывным потоком подают раствор глюкозы (предварительно полученной при гидролизе кукурузного или картофельного крахмала) из колонки вытекает глюкозо-фруктозный сироп.
Об эффективности такой технологии свидетельствует следующие данные: на 1 кг иммобилизованного фермента за 100 дней работы получают примерно 4 тонны фруктозы (в пересчете на сухой продукт).
Современный завод по производству глюкозо-фруктозных сиропов с помощью иммобилизованных ферментов, которых в мире насчитываетсяпримерно несколько десятков, производит до 400 тонн продукта в день в пересчете на сухое вещество.
В целом мировое производство глюкозо-фруктозного сиропа в 1980 году составляло 2,5 млн. т., а в1990 году 5 млн. т.
В США уже в 1978 году потребление населением фруктозы составило 12% от потребления сахара и ожидается дальнейший прирост.
Прогнозируется, что к 2000 годам этот прирост составит до 30-40 % от потребления сахара населением.
ПОЛУЧЕНИЕ БЕЗЛАКТОЗНОГО МОЛОКА
Лактоза, или молочный сахар, содержит в достаточныхколичествах в молоке и молочной сыворотке. Этот сахар характеризуется малой сладостью и низкой растворимостью, и именно из-за его присутствия происходит кристаллизация мороженого и других молочных изделий и продуктов, которая иногда случается и приводит к малоприятным вкусовым ощущениям.
Молекулы лактозы (дисахарид) состоит из гл. и галактозы и распадаются на них при гидролизе под действием лактазы и
·-галактозидазы.
Молоко после такой обработки приобретает новый диетический качества, т.к. определенная часть населения в виду генетических дефектов или возрастных изменений (особенно это характерно для ряда национальностей еврей, арабы и т.д.) не имей названых ферментов, и не может употреблять молоко именно из-за наличия в нем лактозы. Это качество организма получило название лактозной недостаточности. В целом по направлению с севера на юг нашей планеты доля людей испытывающих лактозную недостаточность заметно возрастает. В Африке, например, целые племена и этнические группы не могут пить молоко домашних животных из-за сильных аллергических откликов или неприятных физиологических ощущении. В то же время они нормально усваивают молоко, не содержащее лактозы.
Первый коммерческий процесс получения безлактозного молока с использованием иммобилизованной лактозы был осуществлен итальянской фирмой «Сентраледель Латте» в Милане. Получаемое диетические молоко несколько слаще обычного т.е. глюкоза более сладкая, чем лактоза однако это не мешает его употреблению. В настоящее время завод в Милане производит приблизительно 10 тонн безлактозного молока в день.
ФЕРМЕНТЫ МЕДИЦИНСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ
Многообразно применение ферментных препаратов в медицине. Их используют для растворения тромбов, лечения наследственных заболеваний (вместо отсутствующих эндогенных ферментов) удаление нежизнеспособных, денатурированных структур, клеточных и тканевых фрагментов, освобождения организма от токсических веществ.
Яркий пример спасение жизни больных с тромбозом конечностей, легких, коронарных сосудов сердца при помощи тромботических ферментов (стрептокиназы, урокиназы). В СССР такие препараты созданы в иммобилизованной форме под руководством Е. И. Чазова и И. В. Березина. Ген урокиназы клонирован в бактериях. В современной медицине протеазы применяются для очистки очагов гнойно- некротических процессов от патологических продуктов, а также для лечения ожогов. Лечение рака связано с использованием L-аспарагиназы, которая лишает раковые клетки ресурсов необходимого для их развития аспарагина, поступающего с током крови. Здоровые клетки в отличие от раковых (некоторых типов) способны к самостоятельному синтезу аспарагина.
Известно около 200 наследственных заболеваний, обусловленных дефицитом какого-либо фермента или иного белкового фактора. В настоящее время делают попытки лечения этих заболеваний с применением ферментов. Так, пытаются лечить болезнь Готе, при которой организм не способен расщеплять глюкоцереброиды.
В последние годы все больше внимание уделяют ингибиторам ферментов. Ингибиторы протеаз, получаемые из актиномицетов (лейпаеатин, антипаин, химостатин и др.) и генно-инженервных штаммов E. Colli (эглин) и дрожжей, (
·-1 антитрипсин) оказывают полезными при септических процессах, инфаркте миокарда, эмфиземе легких, панкреатите. Уменьшение концентрации глюкозы в крови больных сахарным диабетом может быть достигнуто при использовании ингибиторов кишечных инвертаз и амилаз, отвечающих за превращение крахмала и сахарозы в глюкозу.
ФЕРМЕНТЫ И БЕЛКОВЫЕ ПРЕПАРАТЫ В МЕДИЦИНЕ
Применение ферментов и других физиологических активных веществ (ФАВ) белковой природы в терапии имеет давние традиции. Современнаямедицина все шире использует высокоочищенные препараты белковой природы в самых различных отраслях клинической медицины в качестве перспективных средств.
В настоящее время наметились следующие основные направления энзимотерапии:
Устранение дефицита фермента с целью компенсации врожденной или приобретенной функций недостаточности;
Удаление нежизнеспособных, денатурированных структур, клеточных и тканевых осколков;
Лизис тромбов;
Комплексная терапия злокачественных новообразований;
Детоксикация организма.
Рассмотрим более подробно некоторые из перечисленных выше направлений.
Лечение врожденных энзимопатий, которых за последние 2 десятилетия описано более 150, являются важной проблемой медицины, также наследственные заболевания, как гликогенозы, липидозы, «лизосомальные» болезни и др. пытались лечить внутренним введением соответствующих ферментов выделенных на биологических жидкостей и тканей человека.
Однако получить удовлетворительные результаты не удалось, особенно для лизосомных болезней, характеризующих патологическим накоплением субстрата в клетках. Причина неудач в быстром выведении нативных ферментов из кровотока и захвате печенью и в основном в непреодолимости гематоэнцефалического барьера и невозможность проникновения фермента в лизосомы нейронов.
Клиническое применение ферментов (протеазы, коллагеназы, гиалуронидазы) для лечения различных гнойно-воспалительных процессов основано на их противоотёчном, некролитическом действии и способности снижать антибиотикорезистентность микробной флоры.
Протеаза животного и бактериального происхождения используется в хирургии при лечении гнойных заболеваний мягких тканей, костей (при остеомиелитах и гнойных артритах), легких и плеврите, при туберкулёзе.
Одной из важнейших областей применения протеиназ является термические ожоги. Местная энзимотерапия при глубоких ожогах позволяет ощущать летальность, ускорить ощущение и заживление раны, в большинстве случаев избегать пересадки кожи.
Фермент.терапия эффективна в травматологии ортопедии, она способствует сокращению сроков лечения переломов, вывихов, растяжения связок, разрывов мышц.
Весьма активно энзимотерапия используется в отоларингологии для лечения дифтерии, тонзиллита, ларингита и отита.
В стоматологической практике протеазы являются многообещающими в гнойной хирургии челюстно-лицевой части в лечениетканейпародонта.
Таким образом, приведены данные свидетельствования о том, что области применения протеиназ для лечения воспалительных реакций практически безграничны.
В медицинской энзимологии вряд ли существует проблема, которая исследовалось бы так же всесторонне и интенсивно, как проблемам лизиса тромбов. Острый тромбоз сосудов по прежнемуостается основной причиной заболеваемости и смертности людей зрелого возраста. Образование и лизис тромба представляют собой весьма сложный каскад протеолитических процессов, в котором ключевой позициямотводят плазмину, тромбину и фибрину.
Возможны 2 основных подхода к тромботической терапии:
использование активаторов превращение плазминогена в плазмин;
использование протеаз, оказывающих прямое фибринолитическое действие, таких как сам плазмин, трипсин,












ОГЛАВЛЕНИЕ
13 TOC \o "1-3" \h \z \u 1413 LINK \l "_Toc377647870" 14КЛЕТОЧНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ 13 PAGEREF _Toc377647870 \h 1411515
13 LINK \l "_Toc377647871" 14ПРИМЕНЕНИЕ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ И ЧЕЛОВЕКА 13 PAGEREF _Toc377647871 \h 1451515
13 LINK \l "_Toc377647872" 14ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК 13 PAGEREF _Toc377647872 \h 1471515
13 LINK \l "_Toc377647873" 14СВОЙСТВА СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК (СК) И ПРОБЛЕМЫ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ 13 PAGEREF _Toc377647873 \h 14101515
13 LINK \l "_Toc377647874" 14КЛАССИФИКАЦИЯ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК 13 PAGEREF _Toc377647874 \h 14131515
13 LINK \l "_Toc377647875" 14СВОЙСТВА СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК 13 PAGEREF _Toc377647875 \h 14131515
13 LINK \l "_Toc377647876" 14ХАРАКТЕРИСТИКА СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК 13 PAGEREF _Toc377647876 \h 14141515
13 LINK \l "_Toc377647877" 14ТЕХНОЛОГИЯ ВЫДЕЛЕНИЯ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК 13 PAGEREF _Toc377647877 \h 14151515
13 LINK \l "_Toc377647878" 14ПРОБЛЕМЫ, СВЯЗАННЫЕ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЭСК 13 PAGEREF _Toc377647878 \h 14161515
13 LINK \l "_Toc377647879" 14ПРОБЛЕМЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ СОМАТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК (ССК) 13 PAGEREF _Toc377647879 \h 14191515
13 LINK \l "_Toc377647880" 14ТКАНЕВАЯ И ОРГАННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ 13 PAGEREF _Toc377647880 \h 14201515
13 LINK \l "_Toc377647881" 14КОЖНЫЙ ЭКВИВАЛЕНТ И ПРИНЦИПЫ ВОССТАНОВЛЕНИЯ ЭПИТЕЛИАЛЬНО-СТРОМАЛЬНЫХ ДЕФЕКТОВ 13 PAGEREF _Toc377647881 \h 14211515
13 LINK \l "_Toc377647882" 14ИНЖЕНЕРНАЯ ЭНЗИМОЛОГИЯ 13 PAGEREF _Toc377647882 \h 14231515
13 LINK \l "_Toc377647883" 14ПРИКЛАДНАЯ ЭНЗИМОЛОГИЯ 13 PAGEREF _Toc377647883 \h 14231515
13 LINK \l "_Toc377647884" 14ИСПОЛЬЗОВАНИЕ СВОБОДНЫХ (ГОМОГЕННЫХ) ФЕРМЕНТОВ 13 PAGEREF _Toc377647884 \h 14261515
13 LINK \l "_Toc377647885" 14ГЕТЕРОГЕННЫЕ КАТАЛИЗАТОРЫ НА ОСНОВЕ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ФЕРМЕНТОВ 13 PAGEREF _Toc377647885 \h 14281515
13 LINK \l "_Toc377647886" 14МЕТОДЫ ИММОБИЛИЗАЦИИ ФЕРМЕНТОВ 13 PAGEREF _Toc377647886 \h 14301515
13 LINK \l "_Toc377647887" 14ИММОБИЛИЗОВАННЫЕ КЛЕТКИ МИКРООРГАНИЗМОВ 13 PAGEREF _Toc377647887 \h 14311515
13 LINK \l "_Toc377647888" 14ОСНОВНЫЕ ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ФЕРМЕНТОВ 13 PAGEREF _Toc377647888 \h 14321515
13 LINK \l "_Toc377647889" 14ОСНОВА ДЛЯ СОЗДАНИЯ РЯДА НОВЫХ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ 13 PAGEREF _Toc377647889 \h 14351515
13 LINK \l "_Toc377647890" 14ПОЛУЧЕНИЕ ГЛЮКОЗО-ФРУКТОЗНЫХ СИРОПОВ 13 PAGEREF _Toc377647890 \h 14361515
13 LINK \l "_Toc377647891" 14ПОЛУЧЕНИЕ БЕЗЛАКТОЗНОГО МОЛОКА 13 PAGEREF _Toc377647891 \h 14371515
13 LINK \l "_Toc377647892" 14ФЕРМЕНТЫ МЕДИЦИНСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ 13 PAGEREF _Toc377647892 \h 14381515
13 LINK \l "_Toc377647893" 14ФЕРМЕНТЫ И БЕЛКОВЫЕ ПРЕПАРАТЫ В МЕДИЦИНЕ 13 PAGEREF _Toc377647893 \h 1439151515








13PAGE \* MERGEFORMAT144115



Фрагмент эмбриональных тканей человека
получение диссоциированной культуры (обработка раствором трипсина и освобождение клеток)

Помещение в культуральные флаконы с питательной средой
латентный период

Образование непрерывного клеточного монослоя

Замедление (прекращение) деления клеток
Ѕ популяция клеток
Инициация новой субкультуры
50 ±10 делений
t генерации культуры

Гибель клеточной культуры



10

20

30

40

50

60

Число пассажей

Суммарное число клеток

Время (мес.)

Фаза 1

Фаза 2

Фаза 3

Фаза 3 ’

РАННЯЯ ДИФФЕРЕНЦИРОВКА
эмбриона человека приводит к образованию
2-х индивидуальных клеточных линий:

ВНУТРЕННЕЙ КЛЕТОЧНОЙ МАССЫ
(ВКМ)
клетки ВКМ плюрипотентны и
представляют собой собственно ЭСК

ТРОФИЧЕСКАЯ ЭКТОДЕРМА
клетки трофической эктодермы
коммитированы исключительно
в клетки зародышевой оболочки
и плаценты

ВКМ

ЭСК

Бластоциста
мыши

Фидерный слой
клеток

5-ти дневные бластоцисты
(200-250 клеток)
удаление трофэктодермы микрохирургическим или
иммунохирургическим путем (АТ к трофэктодерме разрушают ее, высвобождая ВКМ)

ВКМ
(30-34 клетки)

Культивирование
в бессыворотной среде на фидерных слоях митотических инактивированных мышиных эмбриональных фибробластах


Дифференцировка ЭСК

Бластоциста мыши

Субпопуляция клеток

Направленная 5-ступенчатая дифференцировка клеток

Инсулин продуцирующие островковоподобные клетки поджелудочной железы

Имплантация клеток в область плечевого сустава мыши больной диабетом

Васкуляризация области инъекции

Пожизненное нормальное функционирование с поддержанием всех физических характеристик, характерных для
·-клеток островков Лангерганса



культуральная
среда

2. раствор
коллагена

3. суспензия
фибробластов

I

II

III

IV

ЭКВИВАЛЕНТ КОЖИ


Эквивалент дермы

введение суспензии
10 суток, 370С

суспензия
кератинацитов

рН 7.4 и перемешивание

Коллагеновый гель с фибробластами

370С, 5 суток

Современная
прикладная энзимология

ГОМОГЕННЫЕ КАТАЛИЗАТОРЫ
использование свободных Е в различных областях экономики и биомедицинских исследованиях

ГЕТЕРОГЕННЫЕ КАТАЛИЗАТОРЫ
на основе

Наана

Иммобилизованных Е

Иммобилизованных
клеток

Реакторы с иммобилизованными ферментами

Протоный безградиентный (идеального перемешивания) – замкнутный объем, содержащий ферментом, куда с постоянной скоростью подается раствор S и откуда товодиться с постоянной скоростью растрора продукта и непрорегированного S.

Мембраный реактор –замкнутый объем с фнрментом, массовый перенос S в которой осуществляется путем диффузии через полупроницаимую мембрану постояной велечены.


Проточный реактор идеального вытеснения – объем, равномерное заполняется ферментом, в который с const скоростью подается раствор S
(хроматографическая колонка)

Н

·


·
Н


- С =О

- ОН
- ОН




актив.

- С =О




Е

- Е
- Е

ВЕЩЕСТВО,
КОНЦЕНТРАЦИОННЫЙ СИГНАЛ


БИОСЕЛЕКТОР


ТРАНСДЬЮСЕР

ЗАПИСЬ И ПРЕОБРАЗОВАНИЕ ИНФОРМАЦИИ

ферменты

антитела

НК

Рецепторы

Клетки

Электрическии сигнал

С6Н12О6 + О2 Глюконолактон + Н2О2

Н2О
Глюконовая кислота



Схема 356Cђ Заголовок 1їђ Заголовок 2їђ Заголовок 3їђ Заголовок 415

Приложенные файлы

  • doc 8842245
    Размер файла: 981 kB Загрузок: 0

Добавить комментарий