Молекулярная биофизика

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ


БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ



Физический факультет
Кафедра биофизики





Молекулярная биофизика

Конспект лекций для студентов
специальности 1-31 04 01 – «Физика»
специализация (1-31 04 01 01 03 – «Биофизика»)

(электронный вариант)











Минск 2007
Оглавление

Предисловие

Глава 1. Введение ...
Физика и биология .
Молекулярная биофизика и её задачи ..
Методы, используемые в молекулярной биофизике .......

Глава 2. Физика макромолекул
Элементы стереохимии и поворотно-изомерная теория макромолекул ...
Внутреннее вращение и поворотная изомерия
Конформационная теория макромолекул
Поворотно-изомерная теория макромолекул ..
Объемные взаимодействия и переходы глобула-клубок в полимерных макромолекулах ..
Упругость полимерной цепи с исключенным объемом .
Осмотическое давление полимерного раствора ..
Статистика линейных полимеров .

Глава 3. Физика белка ...
3.1. Общая характеристика белков ..
3.2. Функции белков ..
3.3. Аминокислоты
3.4. Первичная структура ..
3.5. Вторичная структура .........
3.6. Третичная структура ..
3.7. Четвертичная структура .....
3.8. Физико-химические свойства белков ...
3.9. Простые и сложные белки
3.10. Химические реакции пептидов .........
3.11. Кислотно-основные свойства белков ...
3.12. Осаждение белков в виде солей ............
3.13. Растворимость белков
3.14. Растворы высокомолекулярных соединений ...
3.15. Влияние растворителя на растворимость белка ..
3.16. Влияние температуры на растворимость белка ...
3.17. Осмос и мембранное равновесие белков ..
3.18. Термодинамическое сродство полимера и растворителя ...
3.19. Диффузия .........
3.20. Характеристическая вязкость
3.21. Седиментация .........
3.22. Электрофоретическая подвижность .
3.23. Конформационные переходы у пептидов
3.24. Метод Линдерштрема и Ланга ..
3.25. Метод измерения удельного вращения плоскости поляризации света .
3.26. Поглощение света ...
3.27. Спектроскопия в инфракрасной области .........
3.28. Дисперсия оптической активности ...
3.29. Переходы “спираль-клубок” ..
3.30. Денатурация глобулярных белков ........




3

4
4
6
8

9
9
12
17
18

23
28
29
30

36
36
37
40
43
44
46
47
48
50
51
51
52
52
54
54
55
55
55
56
57
57
58
59
60
60
61
62
62
63
67
3.31. Метод Тенфорда определения разности свободной энергии
денатурированного и нативного белка по денатурации в растворе
мочевины .....
3.32. Калориметрические измерения денатурационных изменений в белках ...

Глава 4. Физика ферментов ..
4.1. Общая характеристика действия ферментов (определения) ..
4.2. Химическая кинетика и катализ
4.3. Кинетика простых ферментативных реакций ..
4.4. Химические аспекты действия ферментов ..
4.5. Конформационные свойства ферментов ..
4.6. Физика фермент-субстратного взаимодействия ..
4.7. Электронно-конформационные взаимодействия
4.8. Ферментативная активность лизоцима ....

Глава 5. Физика нуклеиновых кислот .
5.1. Основная характеристика .
5.2. Первичная структура ..
5.3. Состав ДНК .
5.4. Состав РНК ..
5.5. Вторичная структура нуклеиновых кислот ..
5.6. Природа межнуклеотидных связей ...
5.7. Межнуклеотидная связь в ДНК
5.8. Конформационный анализ ДНК ...
5.9. Необычные структуры ДНК ..
5.10. Физические модели ДНК ...
5.11. Третичная структура ДНК .....
5.12. Межнуклеотидная связь в РНК .
5.13. Макромолекулярная структура тРНК ...
5.14. Физико-химические свойства ДНК ..
5.15. Денатурация и ренатурация ...
5.16. Кинетика расплетания двойной спирали
5.17. Термодинамика плавления двойной спирали
(переходов спираль-клубок).
5.18. Процессинг ДНК и РНК .
5.19. Репликация ..
5.20. Транскрипция ..
5.21. Синтез белка

Глава 6. Регуляция генной активности
6.1. Генетический код
6.2. Транспортные РНК и супрессия
6.3. Регуляция активности генов ...

Приложение

Рекомендуемая литература







69
69

90
90
95
99
103
106
106
108
114

118
118
124
124
125
126
130
131
133
135
136
137
139
141
141
144
146

147
151
152
155
158

161
161
163
164

165

187



Предисловие

В настоящее время интерес к изучению биологически важных молекул неуклонно растет в связи с открывающимися перспективами использования знания их структуры и физико-химических свойств в фундаментальной и прикладной биологии, медицине, биотехнологии, практической генной инженерии, микроэлектронике и нанотехнологии. В частности, все большее значение приобретает проблема создания диагностических систем, характеризующихся высокой специфичностью, чувствительностью, миниатюрностью.
Программа курса «Молекулярная биофизика» дает достаточно полное представление о структурной организации важнейших биополимеров - белков и нуклеиновых кислот, их физико-химических свойствах и особенностях функционирования в клетке.
Программа составлена таким образом, что последующие разделы являются логическим продолжением предыдущих: сначала рассматривается термодинамика и статистика макромолекул, а затем на этой основе физика белков и нуклеиновых кислот. Изложение материала предполагает знание студентами-биофизиками основных базовых разделов общей физики и некоторых разделов биологии, что к 4-му курсу обучения на физфаке БГУ является вполне реальным.
В целом, учебная программа дисциплины «Молекулярная биофизика» охватывает вопросы, необходимые для изложения современного состояния дел в области биофизики и может быть рекомендована в качестве базовой.


Доцент кафедры биофизики
Физического факультета БГУ
В.И. Крот

Глава 1. Введение.

1.1. Физика и биология
К важнейшим свойствам живого организма (раздражимость, обмен веществ, рост, движение протоплазмы, размножение, наследственность, изменчивость) в биофизике добавляют такие характеристики, как авторегуляция и авторегистрация, микро и макроэволюция, биопотенциалы, дискретность, адаптация и адеквация (избирательная настройка функционирования биосистем). Живой организм открытая, саморегулируемая, самовоспроизводящаяся и развивающаяся гетерогенная система. Важнейшими функциональными веществами её являются белки и нуклеиновые кислоты. Организм система историческая, в том смысле, что он является результатом филогенетического, эволюционного развития и сам проходит путь онтогенетического развития от зиготы до старости и смерти, (Земля существует 13 EMBED Equation.3 1415лет, а жизнь на Земле 13 EMBED Equation.3 1415 лет).
Теоретические подходы, основанные на теории информации и рассмотрении устойчивости динамических систем, в принципе являются общими для физики живой и неживой природы, так как и в космологии, и в биологии имеем дело с созданием новой информации при возникновении новых звёзд или новых видов или особей. Новая информация создаётся в результате неустойчивостей предшествующих состояний. Они имеют характер фазовых переходов. Сейчас известно 13 EMBED Equation.3 1415 видов различных живых существ. Число различных особей многоклеточных растений или беспозвоночных животных вообще не поддаётся оценке. Мы не различаем пока индивидуальности представителей данного штамма одноклеточных, но и они, очевидно, существуют, так как нет двух одинаковых организмов на Земле. Это объясняется генетической изменчивостью, реализуемой в широких пределах, и различиями во взаимодействии со средой. Дарвиновская эволюция неразрывно связана с изменчивостью, с неограниченной индивидуализацией организмов.
Каковы молекулярные основы безграничного разнообразия живых систем? Они определяются макромолекулярным строением генов и организмов. Полимерные цепи, макромолекулы не подчиняются основному закону химии закону постоянства состава. Если число звеньев макромолекулы равно ста, то число различных цепей, содержащих два типа звеньев 13 EMBED Equation.3 1415~13 EMBED Equation.3 1415. Таким образом, в данном макроскопическом образце сополимера может не быть двух одинаковых макромолекул. Биологическая изменчивость определяется разнообразием генов, то есть достаточно протяжённых участков макромолекул ДНК (сополимер из 4-х звеньев).
Достаточно ли современной физики для решения биологических проблем, для обоснования теоретической биологии? Не понадобится ли новая ещё не существующая физика? В физике часто ранее разработанная теория встречалась с границами своей применимости и возникала новая (например, квантовая механика, теория относительности). Так, в принципе не исключено что, и подлинная биофизика должна быть построена на основе ещё не известной будущей физики.
Но нельзя эту проблему отожествлять с витализмом (непостижимость биологических явлений на основе физики и химии, так как существует жизненная сила, энтелехия, не подлежащая физическому толкованию). Витализм не научен, он отрицает единство природы, приводит к теологии.
Биология тоже влияла на физику: Майер, Джоуль и Гельмгольц, открывая закон сохранения энергии, учитывали наблюдения над живыми организмами. Боровская концепция дополнительности (частным случаем её является принцип неопределённости квантовой механики): он считал дополнительными исследования живых организмов на атомно-молекулярном уровне с одной стороны, и как целостных систем с другой. Эти два вида исследования, по его мнению, не совместимы. Но ведь хорошо известно, что ни один результат биологического исследования не может быть однозначно описан иначе, как на основе понятий физики и химии. Согласно Бору, жизнь следует рассматривать как основной постулат биологии, не поддающийся дальнейшему анализу, подобно кванту действия в атомной физике. Под влиянием успехов молекулярной биологии в конце жизни Н.Бор изменил свою позицию, сказав, что дополнительность имеет не принципиальный, а практический характер, связанный с чрезвычайной сложностью живой системы. Точку зрения Бора в той или иной мере поддерживали и другие учёные. Например, Эльзассер рассматривал биообъекты как замкнутые системы, отсюда из-за трудностей со вторым началом термодинамики, он приходил к отрицанию познания живых систем с точки зрения физики. Винер считал, что квантовая механика не может объяснить биопроцессы, так как гамильтониан, управляющий поведением сложной системы, он представлял беспорядочной симметричной матрицей. Он не учёл самоинструктирующий характер матрицы. У него оказалось число неизвестных больше числа уравнений. Отсюда вывод: либо квантовая механика не может описывать биосистемы, либо нужна новая физика. Ошибочность таких представлений показана рядом других учёных: Дирак (жизнь есть там, где существует делокализация электронов), Убелодде (организм паразит энтропийного фонда Вселенной), Шрёдингер (организм открытая система с вытекающими отсюда последствиями). Остановимся более внимательно на позиции Шрёдингера. Шрёдингер в 1945 году написал книгу «Что такое жизнь с точки зрения физики». В ней даны:
Термодинамические основы жизни;
Рассмотрены общие структурные особенности организмов. По Шрёдингеру организм есть апериодический кристалл, то есть высокоупорядоченная система, подобная твёрдому телу, но лишённая периодичности в расположении клеток, молекул, атомов. Это утверждение справедливо для строения организмов, клетки, биомакромолекул (белки, нуклеиновые кислоты);
Рассмотрена проблема соответствия биологических явлений законам квантовой механики. Он, анализируя работы Тимофеева-Ресовского, Циммера и Дельбрюка, отмечает квантовую природу радиационного мутагенеза. Но организмы макроскопичны и применения квантовой механики не тривиальны. Число атомов в наименьшей бактериальной клетке ~13 EMBED Equation.3 1415 и необходимая для жизни упорядоченность возможна только на макроуровне (макросистема), в противном случае порядок разрушался бы флуктуациями.
Итак, сегодня современная физика не встречается с границами своей применимости к рассмотрению биоявлений. Трудно думать, что такие границы обнаружатся в будущем. Свидетельствует об этом и развитие биофизики.


1.2. Молекулярная биофизика и её задачи
БИОФИЗИКА это область физики. Исследование относиться к биофизике, если задача его поставлена как физическая задача. Задачи биофизики состоят в познании явлений жизни, основанном на общих принципах физики, и изучении атомно-молекулярной структуры вещества (пишет Волькенштейн). Методы решения этих задач могут быть и нефизическими.
Молекулярная биофизика физика белков и нуклеиновых кислот. Это область биофизики наиболее развитая в настоящее время. В молекулярной биофизике мы встречаемся со специфическими свойствами и строением очень сложных молекул, определяющими явления жизни. Однако, к изучению этих проблем можно и нужно подойти, опираясь на хорошо разработанные молекулярные представления. Тем самым, молекулярная биофизика должна служить основой для рассмотрения процессов жизнедеятельности клеток и организмов на всех уровнях структуры и функциональности.
От молекул переходят к надмолекулярным системам, к клеткам и организмам. Физическое истолкование явлений регуляции и развития требует как молекулярно-физических, так и общих феноменологических преставлений.
Молекулярная биофизика может быть определена, как область перекрывания молекулярной физики (в частности, физики макромолекул) и молекулярной биологии. Следовательно, она является частью этих областей естествознания. Она развивалась одновременно с молекулярной биологией и неотделима от неё.
Молекулы, которыми занимается биофизика, характеризуются особенностями, которые отличают их от молекул неживой природы. Будучи макромолекулами, белки и нуклеиновые кислоты не являются статистическими системами, в отличие от макромолекул синтетических полимеров (с этим высказыванием Волькенштейна не совсем согласен Рубин и ниже об этом будет сказано). Это динамические системы, своего рода машины, поведение которых определяется положением и функциональностью каждого элемента, образующего молекулу.
Основная задача молекулярной биофизики состоит в исследовании специфических особенностей, определяющих строение и свойства биомолекул. Физическая теория, с которой приходится иметь дело в молекулярной биофизике, есть теория строения и физических свойств этих молекул и одновременно теория методов исследования, применяемых в эксперименте (М.В. Волькенштейн «Молекулярная биофизика» Наука, М.1975г.).
Специфика полимерных молекул в отличие от малых молекул определяется большим числом однотипных звеньев (мономеров), связанных в линейную цепь. Тепловое движение входящих в полимерную цепь атомов и атомных групп, повороты и вращение их вокруг единичных связей обуславливают большое число внутренних степеней свободы макромолекул. Это заставляет рассматривать макромолекулы как макроскопическую систему, статистический характер поведения которой проявляется в наличии средних значений таких параметров, как размеры, форма, степень свёрнутости макромолекулы (но ведь и биомолекулы характеризуются такими параметрами, пишет Рубин). Вместе с тем, существующие между атомами связи (химические связи) и взаимодействие ближнего и дальнего порядка накладывают определённые ограничения на число возможных конформаций макромолекул. Изменения конформации биополимеров, происходящие в процессах клеточного метаболизма и трансформации энергии, также носят вполне определённый характер и отражают внутримолекулярную динамическую организацию биополимеров. Таким образом, своеобразие биологической макромолекулы как физического объекта заключается в тесном сочетании статистических и детерминистских особенностей её поведения: с одной стороны, большое число взаимодействующих атомов и внутримолекулярных степеней свободы, и, как следствие, возможность осуществления огромного числа разных конформаций, с другой определённый химический характер и конформационные изменения при функционировании биополимеров.
В макромолекулах происходят сложные процессы трансформации энергии, включающие миграцию энергии электронного возбуждения и транспорт электронов. В основе функционирования макромолекул лежат электронно-конформационные взаимодействия (ЭКВ), которые проявляются в самых различных процессах, где участвуют биологически активные макромолекулярные комплексы.
Основная проблема заключается в том, чтобы раскрыть природу взаимодействий атомных групп, определяющих конформационные особенности и внутреннюю динамику биологических макромолекул, и на этой основе понять механизмы функционирования биополимеров в живых системах. Именно это и составляет предмет молекулярной биофизики (А.Б.Рубин «Биофизика», М.1987г.).
В данных определениях молекулярной биофизики, её предмета и задач, стоящих перед ней, вполне достаточно (для введения) освещены обсуждаемые нами сегодня вопросы. Более детально характеристика биополимеров (и полимеров вообще) будет дана буквально на первых же последующих лекциях. Важнейшие классы биополимеров (белки, нуклеиновые кислоты – ДНК, тРНК, иРНК, рРНК, надмолекулярные комплексы) будут рассмотрены с привлечением важнейших экспериментальных данных и теоретических подходов к описанию их структурных особенностей, свойств и функционирования.


1.3. Методы, используемые в молекулярной биофизике
1.Методы, используемые в физике биомакромолекул для определения их молекулярных масс, размеров и формы это седиментация в центрифуге (ультрацентрифуге), рассеяние света и рассеяние рентгеновских лучей растворами исследуемых веществ и т.д., методы определения молекулярной массы с помощью вискозиметров или осмометров и т.д.
2.Методы исследования структуры молекул, основанные на взаимодействии вещества со светом, начиная с рентгеновских лучей и кончая радиочастотным излучением. Методы оптики и спектроскопии, включая рентгеноструктурный анализ, гамма-резонансную спектроскопию (эффект Мёсбауэра), электронные и колебательные спектры, т.е. спектры поглощения и люминесценции в ультрафиолетовой и видимой областях, инфракрасные спектры и спектры комбинационного рассеяния. Сюда же относятся спектрополяриметрия, т.е. исследования естественного и магнитного вращения плоскости поляризации света и кругового дихроизма. Ценную информацию дают спектры ЭПР и ЯМР (в ЭПР метод спиновых меток).
3.Методы калориметрии, применяемые для изучения превращений биомакромолекул.
4.Прямое изучение белков, НК посредством электронной микроскопии.
5.Методы хроматографии (гельхроматография, тонкослойная хроматография и т.д.), электрофорез и др.
6.Электрохимические методы (часто электрофорез относят тоже к ним) такие как полярография, потенциометрическое титрование, электропроводимость и др.
7.Механохимические, реологические методы.
8.Методы теоретического моделирования. Теоретический аппарат молекулярной биофизики равновесная термодинамика, статистическая механика, квантовая механика, нелинейная физика и др.
Глава 2. Физика макромолекул.

2.1. Элементы стереохимии и поворотно-изомерная теория макромолекул
Общие закономерности, установленные для синтетических макромолекул, имеют фундаментальное значение и для более сложных биополимеров. Синтетические макромолекулы моделируют основную цепь белка или ДНК (РНК). Макромолекула гомополимера не несет информации, не содержит "текста". Её свойства моделируют лишь те свойства биологических макромолекул, которые не зависят от особенностей первичной структуры. Вместе с тем полимерная цепь имеет специфические возможности передачи информации об электронных и конформационных перестройках.
Полимерная цепь характеризуется прежде всего своей конфигурацией – фиксированным расположением химических связей, которое может быть изменено только в результате разрыва связей. Как правило мы говорим о макромолекулах, находящихся в цис-, транс- и гош- (свернутая) конформациях. Так цис- и транс- полиизопрен различаются именно конфигурациями.

Транс-полиизопрен
13 EMBED Equation.DSMT4 1415

цис-полиизопрен (каучук)
13 EMBED Equation.DSMT4 1415

Полимерные цепи типа- CHR-CH2- (например, полистирол, в котором R-фенильная группа 13EMBED Equation.31415) могут существовать во множестве конфигураций. Каждая из групп может располагаться вправо и влево от основной цепи. Если число мономерных звеньев в цепи равно 13EMBED Equation.31415, то число цепей с различными конфигурациями составит 21000,т.е. больше числа макромолекул в образце полимера. Иными словами, все макромолекулы в таком образце, могут оказаться различными. Тем самым синтетические макромолекулярные вещества не подчиняются основному закону химии - закону постоянства состава и строения. Натт открыл способы получения стереорегулярных полимеров с более определенными конфигурациями мономерных звеньев. Например:

Изотактический полистирол Синдиотактический полистирол
13 EMBED Equation.DSMT4 1415 13 EMBED Equation.DSMT4 1415

Цепь с беспорядочным расположением групп R называется атактической.
Как правило, макромолекулы содержат единичные связи C-C,C-N,C-O.
В результате поворотов вокруг единичных связей возникают различные конформации цепи. Важнейшее специфическое свойство полимерной цепи - её конформационная лабильность, т.е. способность цепи фигурировать во множестве различных конформаций. Это находит своё выражение в высокоэластичности, присущей только полимерам (каучук, например). Высокоэластичность - способность блочного полимера испытывать большие упругие деформации, достигающие сотен процентов, при малом модуле упругости. Каучук, подобно другим телам подчиняется закону Гука в области малых деформаций:

13EMBED Equation.31415 ,

где 13EMBED Equation.31415-напряжение, 13 EMBED Equation.DSMT4 1415- длина нерастянутого образца, 13 EMBED Equation.DSMT4 1415-модуль упругости, l-длина растянутого образца. Для стали 13 EMBED Equation.DSMT4 1415, для резины 13 EMBED Equation.DSMT4 1415~0,02-0,8 кг/мм2.
Столь малым значением 13 EMBED Equation.DSMT4 1415 характеризуется идеальный газ, который описывается уравнением Менделеева – Клайперона:

PV=
·RT

Сожмем идеальный газ при Т=Const, увеличив давление на dP. Объём уменьшится на dV:

13 EMBED Equation.DSMT4 1415, 13 EMBED Equation.DSMT4 1415,

где 13 EMBED Equation.DSMT4 1415- начальное и конечное положение поршня.
В этом уравнении роль модуля 13 EMBED Equation.DSMT4 1415 играет давление P. Атмосферному давлению отвечает 13 EMBED Equation.DSMT4 1415 кг/мм2 (как у каучука). И идеальный газ и резина нагреваются при адиабатическом растяжении. Это означает, что в обоих случаях при деформировании происходит уменьшение энтропии.
Работа при растяжении каучука силой f на dL равна:

fdL= dF=dU–TdS,

где F-свободная энергия, U-внутренняя энергия, S-энтропия, T-абс. температура. Упругая сила при изотермическом растяжении каучука равна 13 EMBED Equation.DSMT4 1415. Для каучука f~T и кривая f(T) проходит вблизи начала координат, т.е. 13 EMBED Equation.DSMT4 1415. Подобно тому, как внутренняя энергия идеального газа не зависит от объема, внутренняя энергия каучука не зависит от длины. Возникновение упругой силы и в том, и в другом случае определяется изменением не внутренней энергии, а энтропии 13 EMBED Equation.DSMT4 1415.
В этом и состоит принципиальное отличие высокоэластичности полимера от упругости твердого тела (пружины, например), определяемой изменением внутренней энергии.
Энтропийный характер упругости идеального газа означает, что при уменьшении объёма газа возрастает число ударов молекул о стенки - упругая сила связана с тепловым движением молекул. Сжатие газа уменьшает его энтропию, т.к. газ переходит из более вероятного разреженного состояния в менее вероятное - сжатое. Растяжение каучука означает переход от более вероятного расположения независимо перемещающихся элементов к менее вероятному, т.е. тоже уменьшение энтропии.
Независимые движения элементов полимерной цепи определяются её конформационной лабильностью. Иными словами, полимерная цепь обладает гибкостью. Гибкость полимерной цепи - её важнейшее свойство. Надо различать термодинамическую гибкость и кинетическую гибкость.
Первая ответственна за равновесные свойства полимера, в частности, за высокоэластичность каучука. Она определяется числом конформаций цепи, обладающих одинаковыми или близкими энергиями.
Кинетическая гибкость характеризует скорость конформационной перестройки цепи. Она определяется высотами энергетических барьеров, которые при этом необходимо преодолеть.

Начала термодинамики

Первое начало ТД для газов:
dQ=dU+PdV
dQ-количество тепла, сообщённое системе;
dU- изменение внутренней энергии;
PdV- внешняя работа, совершаемая системой.
Изменение полной энергии системы (незамкнутой ТД-системы, которая механически взаимодействует и обменивается теплотой с окружающей средой) 13 EMBED Equation.DSMT4 1415, равно полученному системой количеству теплоты 13 EMBED Equation.DSMT4 1415 за вычетом производимой системой работы 13 EMBED Equation.DSMT4 1415. Для системы, находящейся в состоянии равновесия при отсутствии поля внешних сил полная энергия равна внутренней (U) энергии, т.е. 13 EMBED Equation.DSMT4 1415.
Адиабата13 EMBED Equation.DSMT4 1415. Для адиабатического процесса 13 EMBED Equation.DSMT4 1415. Адиабатическим называется процесс, происходящий без теплового обмена с внешней средой. Всякий быстро протекающий процесс в газе практически адиабатен, если за время его протекания теплообмен не успевает произойти. При адиабатическом процессе внешняя работа совершается газом за счет уменьшения его внутренней энергии: dA=-dU
Второе начало TД: Энтропия является функцией состояния системы и для замкнутой системы при любом процессе либо возрастает, либо остаётся неизмененной, т.е. 13 EMBED Equation.DSMT4 1415. Изменение энтропии в обратимых процессах равно нулю, а в необратимых больше нуля.
Для незамкнутых систем S может уменьшаться. Если система получает в обратимом процессе количество теплоты dQ, то изменение энтропии равно dS=dQ/T (T-температура системы).

13 EMBED Equation.DSMT4 1415

2.2. Внутреннее вращение и поворотная изомерия
Классическая органическая химия предполагала, что вращение атомных групп вокруг единичных связей происходит совершенно свободно. Тем самым любые конформации, например этана, возникающие в результате внутренних поворотов, имеют одинаковую свободную энергию (изменение угла поворота не требует затраты энергии) На рис.1 изображено вращение вокруг связи С-С в молекуле этана (CH3-CH3):

13 EMBED CorelDRAW.Graphic.11 1415

Рис.1 Расположение С-С связей этана в транс-(a), цис-(б) и гош-(свёрнутой) (в) конформациях. (Проекция на плоскость, перпендикулярную с-с связям).



Однако исследования термодинамических свойств этана и других соединений с единичными связями, а также структурные исследования, проведенные методами спектроскопии, показали, что внутреннее вращение всегда несвободно. Молекула этана имеет минимум энергии в скрещенной, или транс-конформации, и максимум – в цис-конформации.
Для поворота на 13EMBED Equation.31415,т.е. для перехода из одной транс- конформации в другую, ей тождественную, нужно преодолеть барьер (энергетический) равный 2,9 ккал/моль.

13 EMBED CorelDRAW.Graphic.11 1415

Рис.2 График зависимости потенциальной энергии внутреннего вращения в этапе от угла поворота. (U0=2, 9 ккал/моль)


Для этана и для других молекул с осевой симметрией С3 зависимость потенциальной энергии внутреннего вращения U от угла поворота 13EMBED Equation.31415 можно приближенно представить формулой: 13EMBED Equation.31415, где 13EMBED Equation.31415- высота потенциального барьера. Значение 13EMBED Equation.31415 возрастает при замене атомов Н на более объемистые атомы и группы, например, для CH3-C(CH3)3 – U0=4,4 ккал/моль. 13EMBED Equation.31415 уменьшается при удлинении оси вращения.
13EMBED Equation.31415 ккал/моль. 13EMBED Equation.31415 1 ккал/моль.
Потенциальная энергия внутреннего вращения определяется взаимодействием валентно не связанных атомов и групп. Строгий квантово-механический расчет U затруднен, т.к. она определяется как малая разность полных энергий молекулы в цис- и транс- конформациях. Тормозящий потенциал (или барьер) возникает вследствие стерического, ван-дер-ваальсового отталкивания валентно не связанных атомов и квантово- механического взаимодействия связей, примыкающих к оси вращения (эффект ориентации связей). И то, и другое делает более устойчивой транс- конформацию (принцип скрещенных связей).
Отталкивание можно оценить, зная характерные кривые зависимости энергии межмолекулярного взаимодействия от межмолекулярного расстояния для модельных веществ.
13 EMBED CorelDRAW.Graphic.11 1415



Рис.3 Зависимость энергии межмолекулярного взаимодействия от расстояния.









13 EMBED Equation.DSMT4 1415 - потенциал Букингема.
13 EMBED Equation.DSMT4 1415 - потенциал Леннарда-Джонса.
Эффект ориентации связей определить трудно. Грубую оценку можно получить, считая, что в этане из-за малого ван-дер-ваальсового радиуса атома Н 13EMBED Equation.31415 целиком определяется эффектом ориентации, и что у производных этана и у него самого этот эффект одинаков. Тогда для производных этана получают 13EMBED Equation.31415,
где 13EMBED Equation.31415- "стерическая" потенциальная энергия взаимодействия валентно не связанных атомов i и k, находящихся на расстоянии 13EMBED Equation.31415 друг от друга. 13EMBED Equation.31415 зависит от 13EMBED Equation.31415. Если молекула содержит сильно полярные связи, то к правой части последнего выражения надо добавить члены, учитывающие электростатическое взаимодействие атомов связей, примыкающих к оси вращения. Это существенно для биополимеров. Потенциал взаимодействия 13EMBED Equation.31415 атомов Н и С связей С-Н и С-С описывается эмпирическими потенциалами Хилла, Бартелла, Китайгородского и др. на основе данных о кристаллохимических и термодинамических свойствах простых углеводородов. Эти потенциалы имеют свой вид 13 EMBED Equation.DSMT4 1415, где а, K, K`- const.
Китайгородский ввел универсальную функцию 13EMBED Equation.31415 так называемый атом-атомный потенциал. В случае пары атомов он выражает взаимодействие "универсальных нейтральных атомов" и характеристических зарядов на ядрах. Функция Китайгородского имеет вид:

13 EMBED Equation.DSMT4 1415,
где 13EMBED Equation.31415, 13EMBED Equation.31415
r0 – сумма Ван-дер-Ваальсовых радиусов взаимодействия атомов, 13 EMBED Equation.DSMT4 1415 - значение U при r=2/3r0.
Для связей типа С-С, С-H, H-H Китайгородский принял значение 13 EMBED Equation.DSMT4 1415=3.5ккал/моль,
·=13. При этих значениях 13 EMBED Equation.DSMT4 1415. Приведенное выражение дает хорошие результаты при вычислении конформаций как малых, так и макромолекул.
Если молекула лишена аксиальной симметрии, то кривая U(
·) становится несимметричной и приведенное выражение для U уже непригодно. Так для бутана (13 EMBED Equation.DSMT4 1415) U(
·) имеет вид:
13 EMBED CorelDRAW.Graphic.11 1415

Рис.4 Зависимость энергии от угла вращения для бутана


Очевидно, что молекулы, характеризуемые несколькими неэквивалентными минимумами энергии U(
·),будут существовать именно в этих состояниях, переходя из одной конформации в другую со скоростями, определяемыми высотами барьеров, разделяющих минимумы.
Относительное равновесное содержание молекул Н-бутана в гош- и транс- конформациях выражается величинами:

13 EMBED Equation.DSMT4 1415

где Nt-число молекул в транс конформации, Nd и Nl-число молекул в конформациях, свёрнутых вправо и влево на 120
·
Очевидно, что Nt+Nd+Nl=N (N-полное число молекул). Таким образом, вещество представляет собой динамическую смесь конформаций, которую в этих случаях, принято называть поворотными изомерами или ротамерами, или конформерами.
Состав термодинамически равновесной смеси определяется разностью внутренних энергий поворотных изомеров и температурой. При 13 EMBED Equation.DSMT4 1415 Nt=Nd =Nl= 1/3 N. При понижении температуры вещество кристаллизуется в форме одного наиболее устойчивого ротамера.
При высотах барьера порядка нескольких ккал/моль время поворотной изомеризации, т.е. время превращения одного ротамера в другой ~10-10сек. (получено на основе теории абсолютных скоростей реакции). За такие времена ротамеры не могут быть отделены друг от друга. Наличие ротамеров в равновесной смеси устанавливается путем изучения химических и физических свойств. Пространственное строение ротамеров различно, значит, различаются и их спектры. Спектр вещества представляет собой результат наложения спектров ротамеров. За время жизни ротамера происходят приблизительно сотни и тысячи колебаний (частоты ~1012-1013 сек-1,при времени поворотной изомеризации ~10-10сек).
Впервые существование поворотной изомерии было установлено Кольраушем с помощью спектров комбинационного рассеяния. Отношение интенсивности спектральных линий, отвечающих различным ротамерам, зависит от их содержания в смеси. Оно меняется с температурой и, следовательно, разности энергии ротамеров E можно определить по температурному ходу интенсивностей спектральных линий. Так для Н-бутана E~0,6 ккал/моль. Информацию по ротамерии получают также с помощью ЯМР, электронографии, измерения дипольных моментов молекул и т.д.
Теоретический расчет величин Е можно провести с помощью потенциалов Китайгородского, Хилла и др. на полуэмпирической основе. Для молекул типа Н-бутана и более сложных приходится учитывать повороты вокруг нескольких связей. Энергия внутреннего вращения зависит соответственно от нескольких углов вращения и изображается уже не кривой, а поверхностью (вообще говоря, многомерной).
Изучение поворотной изомерии конформационных превращений молекул приобрело сейчас очень большое значение в органической и биоорганической химии. Химические и физико-химические свойства молекул существенным образом зависят от их конформаций. Главные особенности физического поведения макромолекул определяются поворотной изомерией.

Комбинационное рассеяние
Комбинационное рассеяние света исследуемым веществом, связанное со структурой его молекулы, сопровождается заметным изменением рассеиваемого света. Комбинационное рассеяние света было открыто в 1928г. Л.И.Мандельштаммом и Г.С.Ландсбергом при исследовании света в кристаллах и одновременно с В.Раманом и С.Кришнанос при изучении рассеяния света в жидкостях. В зарубежной литературе обычно называют "эффектом Рамана".
При значительной разнице частоты колебаний световой волны и частоты электронных полос поглощения вещества, её энергия не поглощаясь, может перейти на короткое время в энергию деформации электронной оболочки молекулы. В большинстве случаев эта энергия отдается молекулой в виде вторичного излучения с фазой, изменяющейся одинаковым образом у разных молекул. Световая волна, образовавшаяся в результате интерференции всех вторичных, распространяется далее в прежнем направлении. Слабое рассеяние в стороны с неизмененной частотой вызывается флуктуациями плотности вещества. В очень разных случаях энергия световой волны
·, заключённая в деформированной электронной оболочке, может перераспределиться на другие виды внутримолекулярного движения, например, на возбуждение колебательного движения. Для этого нужна энергия
·k. Остаток энергии h
·=
·-
·k отдается в пространство в виде вторичного излучения с частотой
·=
·
·-
·
·k. (стоксово рассеяние). Возможен и обратный процесс объединения колебательной энергии с электронной и отдачи её в виде излучения с суммарной частотой
·=
·
·+
·
·k (антистоксово рассеяние). Такое перераспределение может происходить также и с вращательным движением. В этом случае
·=
·e=2
·zot. Из сказанного следует, что спектр комбинационного рассеяния света отличается от спектра обычного рассеяния появлением по обе стороны от линии возбуждающего монохроматичного света двух симметрично расположенных линий спутников.
Акт комбинационного рассеяния света является маловероятным; этим объясняется его очень малая интенсивность и необходимость устранения даже очень слабой флуоресценции, на фоне которой спектр комбинационного рассеяние света может быть неразличим.
Свойства комбинационного рассеяния света:
Стоксовые спутники более интенсивны, чем антистоксовые; c повышением температуры растет интенсивность антистоксовых спутников;
Спектры комбинационного рассеяния света построены проще спектров ИК. Вращательно-колебательная полоса поглощения свободной молекулы обычно состоит из 2-х ветвей (P и R) значительно реже из З-x (P,Q,R). При комбинационном рассеянии света сильно сжатая Q-ветвь значительно превышает интенсивность остальных 2-х и обычно наблюдают только эту ветвь. Только у самой возбуждающей линии сравнительно легко наблюдается вращательный спектр комбинационного рассеяния света. В жидкостях и твердых телах основные полосы ИК и КРС (изображенные в одинаковой шкале частот) очень похожи и по расположению и по контуру.
При условии
·e>>
·o интенсивность полос комбинационного рассеяние света растет в коротковолновую область спектра примерно ~
·4. Однако, несмотря на большую интенсивность комбинационного рассеяние света в 4-ой области их наблюдение и использование затруднено из-за лёгкости возбуждения.


2.3. Конформационная теория макромолекул
В 1951г. В.М.Волькенштейн выдвинул теорию поворотно-изомерного строения биополимеров. Он предложил заменить непрерывную функцию 13EMBED Equation.31415 разрывной в соответствии с набором дискретных поворотных состояний. Такое приближение оправдано, когда минимумы энергии разделены барьерами, величина которых существенно больше 13EMBED Equation.31415. На основе поворотно-изомерной теории, зная энергии различных поворотных изомеров, можно вычислить вероятность определенной конформации молекулы.
Вращательная статсумма i-ой связи, определяемая интегралом: 13 EMBED Equation.DSMT4 1415 в поворотно-изомерном приближении заменяется на сумму из 13EMBED Equation.31415 членов, где 13EMBED Equation.31415- число поворотных изомеров данной i-связи: 13EMBED Equation.31415, где 13EMBED Equation.31415 и т.д. статистические веса, характеризующие изомеры i-ой связи. Они равны 13EMBED Equation.31415.
Статистический вес конфигурационной цепи в целом выражается следующим образом:
, где учтены изомеры уже всех n-связей в цепи. Полная конфигурационная статсумма для всей цепи формально выражается следующим образом:
13EMBED Equation.31415, где суммирование ведется по всем конфигурациям.
Статвес 13EMBED Equation.31415 конфигурации 13EMBED Equation.31415 определяет частоту, с которой она встречается в равновесном статансансамбле молекул. Вероятность 13EMBED Equation.31415 того, что данная молекула обладает именно данной конфигурацией, равна статистическому весу этой конфигурации, деленному на статсумму всех возможных конфигураций, т.е. определяется так:
13EMBED Equation.31415.
Вычисление статсуммы обычными способами оказывается весьма трудоемким, но может быть проведено матричными методами. Члены суммы состоят из произведений типа 13EMBED Equation.31415, в которых первый индекс каждого множителя должен совпадать со вторым индексом предшествующего ему в произведении множителя. Величины статвесов 13EMBED Equation.31415 можно рассматривать как элементы некоторой матрицы: 13EMBED Equation.31415, где элементы матрицы 13EMBED Equation.31415 суть статистические веса соответствующих изомеров.
Математические вычисления показывают, что статсумма Z аппроксимируется выражением: 13EMBED Equation.31415, при n >>1, где 13EMBED Equation.31415- максимальное собственное число матрицы 13EMBED Equation.31415. Из равенства 13EMBED Equation.31415 используя обычные выражения статфизики, можно, например, найти значение свободной энергии: 13 EMBED Equation.DSMT4 1415, или внутренней энергии системы
13EMBED Equation.31415.


2.4. Поворотно-изомерная теория макромолекул
Свободно-сочленённая цепь
13 EMBED CorelDRAW.Graphic.11 1415

Рис.5

В цепи полиэтилена, который состоит из единичных связей СС, внутренние повороты происходят в каждом звене цепи. Именно внутренним вращением и определяется гибкость цепи, ответственная за высокоэластичность полимера. Предположим, что цепь свободно сочленена, т.е. в ней нет фиксированных валентных углов, и повороты происходят свободно. Набор конформаций, возникающих при поворотах вокруг данного атома цепи непрерывны в интервале углов от 0 до 413EMBED Unknown1415 и энергия при поворотах не меняется. Цепь можно охарактеризовать вектором 13EMBED Unknown1415, проведенным от первого атома к последнему. Очевидно, что среднее по всем конформациям значение вектора 13EMBED Unknown1415 равно 0. т.к. при тепловом движении его направления равновероятны. Распределение вероятности осуществления тех или иных значений 13EMBED Unknown1415, которые могут меняться от 0 до максимальной длины цепи (равна 13EMBED Unknown1415, где 13EMBED Unknown1415-число звеньев, 13EMBED Unknown1415-длина звена), оказывается гауссовым – вероятность того, что расстояние между концами цепи лежит в интервале от 13EMBED Unknown1415 до 13EMBED Unknown1415 имеет вид:
13EMBED Unknown1415
Общее Гауссово распределение имеет вид 13 EMBED Equation.DSMT4 1415.
В нашем случае 13 EMBED Equation.DSMT4 1415. Длина вектора 13EMBED Unknown1415 равна: 13 EMBED Equation.DSMT4 1415, где x,y,z – проекции вектора 13EMBED Unknown1415 на оси координат. Функции распределения координат x,y,z конца цепи являются гауссовыми и имеют вид: 13 EMBED Equation.DSMT4 1415 и т.д.
Соответственно 13EMBED Unknown1415 и 13EMBED Unknown1415 т.е. цепь сильно скручена. Написанное верно при Z >>1. Тепловое движение свёртывает макромолекулу в клубок. Это состояние наиболее вероятно, т.к. клубкообразная конформация может реализовываться множеством способов (тогда, как вытянутая – только единственным способом). Поэтому клубкам соответствует максимальная энтропия(
13EMBED Unknown1415, где 13EMBED Unknown1415.
Упругая сила при растяжении цепи равна( 13EMBED Unknown1415, т.е. модуль упругости линейно зависит от Т (13EMBED Unknown1415)
В реальных макромолекулах валентные углы между связями фиксированы и повороты не свободны. Зададим положение двух первых звеньев в полиэтиленовой цепи. Третье звено может занимать различные положение на поверхности конуса с раствором 13EMBED Unknown1415 (13EMBED Unknown1415- это валентный угол между связями СС, близкий к тетраэдрическому 13EMBED Unknown1415).
Этим различным положениям, характеризуемым углом поворота 13EMBED Unknown1415 вокруг второй связи СС, отвечают разные энергии 13EMBED Unknown1415. Положение четвертой связи по отношению к первым двум менее определено, так как она ориентирована на конусе, описанном вокруг каждого из положений третьей связи и т.д. Достаточно удаленная связь (звено) располагается по отношению к первой связи практически произвольным образом. Поэтому длинная цепь свертывается в клубок. Макромолекулу можно разбить на сегменты, положения которых коррелированны друг с другом. Тогда написанные формулы сохраняются, но 13EMBED Unknown1415 и 13EMBED Unknown1415 означают число и длину свободно сочлененных сегментов (13EMBED Unknown1415 и 13EMBED Unknown1415 ). 13EMBED Unknown1415 при свободном сочленении.
Для реальной цепи с симметричными радикалами типа полиэтилена (но не полисахаридов). Ока получил
13EMBED Unknown1415,
где 13EMBED Unknown1415 - угол дополнительный к валентному, 13EMBED Unknown1415 - средний косинус внутреннего вращения (
13EMBED Unknown1415,
где 13EMBED Unknown1415- здесь больше, чем в свободно сочлененной цепи, т. к. корреляция, определяемая отсутствием свободы вращения и валентными углами, удлиняет цепь. 13EMBED Unknown1415 может рассматриваться как мера термодинамической гибкости цепи – чем меньше 13EMBED Unknown1415 при заданных 13EMBED Unknown1415 и 13EMBED Unknown1415, тем больше гибкость. Для жесткой цепи (транс- конформации) 13EMBED Unknown1415 и 13EMBED Unknown1415, тогда
13EMBED Unknown1415.
Для гибких цепей это требует знания потенциальных энергий 13EMBED Unknown1415.
Теория размеров, формы, а также дипольных моментов, анизотропной поляризуемости и т.д. полимерных цепей должна исходить из физического механизма гибкости. Гибкость определяется поворотами вокруг единичных связей.
Поворотно-изомерная теория рассматривает макромолекулу как равновесную смесь поворотных изомеров, а внутреннее вращение в цепи – как поворотную изомеризацию (перескок из одной конформации в другую). Непрерывная функция 13EMBED Unknown1415 заменяется в ПИТ разрывной функцией, содержащей ряд бесконечно узких щелей при фиксированных значениях 13EMBED Unknown1415. В действительности флуктуации крутильные колебания около значений 13EMBED Unknown1415, отвечающих поворотным изомерам. Но они случайны и в среднем компенсируют друг друга и не влияют на усредненные свойства макромолекулы, т. е. их можно не учитывать. В поворотно-изомерной теории (ПИТ) интегрирование для 13EMBED Unknown1415 заменяется суммированием по ротамерам. Так для полиэтилена(13EMBED Unknown1415
13EMBED Unknown1415
13EMBED Unknown1415.
Термодинамическая гибкость макромолекулы (степень скученности статклубка), тем больше, чем меньше 13EMBED Unknown1415, т. е. чем меньше 13EMBED Unknown1415. Если минимумы энергии расположены симметрично (13 EMBED Equation.DSMT4 1415), то при 13EMBED Unknown141513EMBED Unknown1415 13EMBED Unknown1415 макромолекула ведет себя как цепь со свободным внутренним вращением. ПИТ хороша, когда минимумы энергии разделены энергетическими барьерами больше kТ. ПИТ установлена рядом методов ИКС, доказана при деформации полимеров и легла в основу статфизики макромолекул.
Термодинамические условия кристаллизации и плавления полимеров непосредственно связаны с поворотной изомеризацией. Температура плавления Тпл выражается как отношение разности энтальпий к разности энтропий в твердом и жидком состояниях. Увеличение энтропии при плавлении полимера связано с переходом от упорядоченной конформации цепи к смеси поворотных изомеров, к статклубку.
Кристаллическое строение характерно для волокон полимеров. Макромолекулы в волокне уложены регулярно, их цепи параллельны оси волокна (шерсть, шелк, целлюлозное волокно, белки).
Рентгеноструктурные данные Натта и Коррадини показали, что в кристалле повторяющиеся структурные единицы цепи занимают геометрически эквивалентные положения относительно её оси. Это лежит в основе постулата эквивалентности геометрических положений структурных единиц. Этот постулат дает установить симметрию цепи в кристалле и конформации мономерных звеньев исходя из стереохимического строения ее цепи и конформации. Вследствие регулярности цепи и эквивалентности звеньев молекулы полиамидов и полипептидов могут кристаллизоваться лишь в виде спиралей. Так как строение их мономеров не симметрично, спираль может быть право- и левовинтовой, оптически активной. Однако образец синтетического полимера из симметричных мономеров оптически неактивен (содержит одинаковое число левых и правых спиралей их рацемическую смесь).
Фиксация определенных поворотных изомеров для всех звеньев в цепи в кристалле обеспечивает его дальнейший порядок, зная положение атомов в цепи в данном макромолекулярном звене, мы знаем их для сколь угодно удаленных звеньев, т. к. расположение атомов строго периодично. Вместе с тем в кристалле имеется и ближний порядок: определенное расположение соседних звеньев. При плавлении и растворении полимера дальний порядок исчезает, но ближний порядок сохраняется. Сохранение ближнего порядка в макромолекуле следует из того, что кристаллические структуры полимеров соответствуют минимуму потенциальной энергии. Исходя из этих соображений, Птицын и Шаронов предположили, что ближний одномерной порядок в свободной макромолекуле, образующей статклубок, аналогичен дальнему одномерному порядку в кристалле. Это подтвердилось в исследованиях по оптики и спектроскопии. Она легла в основу более точных расчетов физических свойств макромолекул, исходящих из ПИТ. ПИТ дает молекулярное истолкование растяжению полимера и предсказывает, что наряду с энтропийной упругостью должна быть и энергетическая, поскольку разность энергий ротамеров 13EMBED Unknown1415, значит должна быть отличной от 0 13EMBED Unknown1415, причем 13EMBED Unknown1415 зависит от 13EMBED Unknown1415. Это подтвердилось экспериментально.
Итак, гибкость полимера (сворачивание гибкой цепи в клубок) определяется ее термодинамической гибкостью, чем больше гибкость, тем меньше 13EMBED Unknown1415 при заданных 13EMBED Unknown1415и 13EMBED Unknown1415. В растворе наиболее вероятная конформация полимера – свернутый клубок, в котором энтропия системы максимальна. При растяжении полимера происходит развертывание клубка и уменьшение числа возможных конформаций, что сопровождается уменьшением энтропии.
Набухание макромолекулы в результате проникновения растворителя внутрь клубка, подобно растяжению каучука, также переводит ее в менее вероятную конформацию. Возникающая при этом упругая сила энтропийной природы в конце концов приводит к тому, что набухание прекращается. Это явление лежит в основе эластичности полимеров типа каучука.

Персистентная длина
Отклонение от гауссовой статистики могут наступать при небольшом числе (меньше 20-50) связей в полимерной цепи и молекулярных массах в несколько сотен единиц. Однако известны полимеры (ДНК в форме двойной спирали, спиральные полипептиды), в которых даже при 13EMBED Equation.31415 цепь не подчиняется гауссовой статистике, а длина сегмента цепи существенно увеличивается. Такие жесткие молекулы моделируются червеобразной цепью, у которой в пределе среднее значение угла 13EMBED Equation.31415 между звеньями 13EMBED Equation.31415 при 13EMBED Equation.31415, а цепь имеет непрерывную структуру (кривизну еще надо показать, т.к. бывает отрицательная).
Рис.6 Участок жесткой макромолекулы
а - персистентная длина, S – контурная длина, 13EMBED Equation.31415- угол между касательными к двум участкам цепи, разделенным достаточно большой длиной S.

Среднее значение cos13EMBED Equation.31415 между касательными к двум участкам цепи, разделенным достаточно большой длиной S вдоль нити, убывает экспоненциально с ростом S:
13 EMBED Equation.DSMT4 1415 , где а –
персистентная длина.
Из этой формулы видно, что 13EMBED Equation.31415 при S=a уменьшается в e раз. Короткий по сравнению с a участок цепи ведет себя как твердый стержень, а разные сегменты длиной a вращаются практически независимо друг от друга. Для червеобразной цепи среднеквадратичное расстояние связано с ее персистентной длиной: 13EMBED Equation.31415, где L-контурная длина цепи. При бесконечно жесткой цепи (жесткий стержень) 13 EMBED Equation.DSMT4 1415, т.е. 13EMBED Equation.31415, и 13EMBED Equation.31415. Напротив, в случае гибкого стержня 13EMBED Equation.31415 образуется обычный гауссовый клубок, где 13EMBED Equation.31415.
Для молекулы ДНК, представляющей собой жесткий полимер, персистентная длина составляет 50-60 нм, что намного больше, чем у большинства обычных гибких полимерных молекул. Жесткость ДНК определяется взаимодействием оснований, расположенных стопкой вдоль спирали и соединенных сахарофосфатными связями.

Кооперативность
Макромолекула – кооперативная система, т.к. звенья в цепи взаимосвязаны. Состояние данного звена зависит от состояний соседних звеньев. Мы уже рассмотрели такую цепочку, записали статсумму для одномерной модели, которая рассчитывается с помощью матричного метода: т.е. было показано, что вычисление ротамерной статсуммы сводится к нахождению максимального корня матрицы 13EMBED Equation.31415. Зная Z, мы можем вычислить равновесные характеристики макромолекулы. Уже фиксация валентного угла между соседними звеньями означает их корреляцию, т.е. кооперативность цепи. То же относится и к корреляции поворотных изомеров. Мерой кооперативности здесь является разность энергий 13EMBED Equation.31415. Кооперативность высока, когда 13EMBED Equation.31415, и мала, когда 13EMBED Equation.31415. Поворотная изомеризация полимера, как при плавлении кристалла, так и при растяжении, должна считаться кооперативным процессом.


2.5. Объемные взаимодействия и переходы глобула-клубок в полимерных макромолекулах
Все взаимодействия между атомами, независимо от их конкретной физической природы при формировании различных макромолекулярных структур и переходов между ними, можно разделить на два типа:
Взаимодействия ближнего порядка между атомами соседних звеньев
дальние взаимодействия (или объемные эффекты) между атомами, которые хотя и отстоят по цепи далеко друг от друга, но случайно сблизились в пространстве в результате изгибания цепи.

Клубок и глобула
Рассмотрим гомополимер. Зададим его геометрические размеры через 13EMBED Equation.31415 между его концами, а внутреннюю пространственную структуру - пространственным распределением плотности звеньев n(x). Вследствие объемных взаимодействий плотность числа звеньев в пространстве, занятом молекулой, может меняться от точки к точке.
В полимерной нити вследствие взаимосвязи звеньев или линейной памяти изменение плотности в одной точке пространства связано с изменением плотности в другой точке, т.е. существует пространственная корреляция плотности. Если в макромолекуле отсутствуют всякие объемные эффекты, то она не имеет достоверной пространственной структуры. В этом состоянии флуктуации плотности – порядка самой плотности. Такое состояние носит название клубка. Радиус корреляции (() флуктуации плотности здесь того же порядка, что и размеры макромолекулы [R=(13EMBED Equation.31415)1/2; ((R, где R(lN1/2].
Наличие объемных взаимодействий может привести к осуществлению такого состояния, в котором флуктуации плотности малы по сравнению с самой плотностью. Такое плотное образование называется глобулой. В нем радиус корреляции флуктуаций плотности много меньше размеров макромолекулы: (<
Условия существования клубка и глобулы.
Вследствие объемных взаимодействий сблизившиеся участки могут либо притягиваться, либо отталкиваться. Повышение температуры приведет к увеличению отталкивания между мономерами, понижение – к притяжению. Существует температура, при которой отталкивание мономеров полностью компенсируется их взаимным притяжением. Эта температура называется (-точкой или (-температурой. В (-точке объемные взаимодействия отсутствуют, и макромолекула представляет клубок с R(lN1/2, сохраняющийся и при T>(. Однако в области Т>( из-за увеличения сил отталкивания размеры клубка возрастают: R>lN1/2.
Таким образом 13EMBED Equation.31415, где 13EMBED Equation.31415 вычислено без учета дальних объемных взаимодействий; ( - коэффициент набухания макромолекулы; в области T>(, (>1, при T=( (=1, а при T<(, (<1.
В хороших растворителях притяжение атомов цепи и растворителя больше, чем между атомами цепи, что равносильно увеличению их взаимного отталкивания в таком растворителе (область T>(, здесь (>1).
Наоборот, в плохих растворителях взаимное притяжение звеньев полимера больше, чем их притяжение к молекулам растворителя (область T<(, (<1). В области T<( в объемном взаимодействии превалируют силы притяжения, которые могут привести к конденсации полимерного клубка в плотную, слабо флуктуирующую глобулу. Эта глобула стабилизируется самосогласованным сжимающим полем, обусловленным силами притяжения между атомами мономеров. Оказывается, что в таком поле глобула обладает дискретным спектром значений свободной энергии. Температура выше критической приводит к исчезновению дискретного спектра и глобулярного состояния.
В реальной макромолекуле объемные взаимодействия в отсутствии внешнего поля создают самосогласованное поле, приводящее к образованию глобулы. Зависимость плотности звеньев от расстояния имеет вид:
13 EMBED CorelDRAW.Graphic.11 1415

Рис.7 Зависимость плотности звеньев макромолекулы от расстояния


Энергия взаимодействия звеньев.
Изменение температуры приводит к изменению размеров макромолекулы, т.е. к изменению средней плотности n числа мономерных звеньев, а значит, и к изменению энергии их взаимодействия. Вклад сил притяжения и отталкивания в свободную энергию взаимодействия (F) звеньев зависит от n. При малом n свободная энергия (F) взаимодействия звеньев может быть разложена в ряд со степенями n:

13EMBED Equation.31415(Bn2+Cn3+),

где V – объем системы, В и С – коэффициенты разложения, называемые вириальными коэффициентами (В – второй вириальный коэффициент; С – третий и т.д.).
Первое слагаемое (Вn2 – описывает вклад парных столкновений звеньев, второе – вклад тройных столкновений и т.д. Если энергия притяжения при столкновениях велика по сравнению с kT, то силы притяжения сталкивающихся частиц играют наиболее важную роль, давая отрицательный вклад в общую энергию системы (В<0). В результате макромолекула сжимается относительно размеров идеального клубка. Обратная картина, когда энергия притяжения меньше kT, а силы отталкивания дают в свободную энергию положительный вклад, вызывая набухание клубка (B>0). В отсутствие объемных взаимодействий при (-температуре В(()=0.
Случаю плохого растворителя отвечает B<0. Случаю хорошего растворителя отвечает B>0 (звенья отталкиваются). Типичный вид зависимости F глобулы от n: зависимость свободной энергии глобулы (1) и клубка (2) от плотности звеньев.
13 EMBED CorelDRAW.Graphic.11 1415

Рис.8 Типичный вид зависимости свободной энергии макромолекулы от плотности звеньев.
1 – глобула
2 – клубок

Кривая 1 (Рис.8) соответствует B<0 и С>0, т.е. третий вириальный коэффициент положительный. Таким образом, в простейшем случае, когда B<0, вклад отталкивания (С>0) доминирует уже при столкновениях трех частиц. При изменении температуры и других условий в растворе вириальные коэффициенты изменяются и, следовательно, меняется величина F.





Переходы клубок-глобула
Когда F перестает иметь минимум при некотором n глобула распадается и происходит переход глобула-клубок (Г-К). Точке перехода соответствует F=0. Это переход между разными фазами (между разными агрегатными состояниями макромолекулы).
Фазовые переходы I рода происходят между двумя состояниями, каждое из которых стабильно по одну сторону от точки перехода и метастабильно – по другую. Переход между ними при изменении внешнего параметра (Т) сопровождается тепловым эффектом (например, плавление льда и образование жидкой водной фазы).
Фазовые переходы II рода происходят без тепловых эффектов, а в области перехода существует лишь один минимум свободной энергии.
При фазовых переходах I рода энтропия и внутренняя энергия меняются скачком вследствие затраты конечной теплоты перехода и конечного изменения удельного объема системы.
При фазовых переходах II рода в точке перехода 2-го рода теплоемкость меняется скачком, а энтропия и внутренняя энергия – непрерывно, удельный объем системы не испытывает скачка. (Переход Не в сверхтекучее состояние, металлов в сверхпроводящее, переход из ферромагнитного в парамагнитное состояние в точке Кюри).
Фазовые переходы определены строго для случая, когда число частиц в системе N((. В реальных полимерах, где N – большое, но конечное число, существует конечная ширина температурного перехода ((Т). Конформационный переход является фазовым, если его ширина стремится к 0: ((>( при N((. Ландау и Лившицем, Гросбергом и Хохловым было показано, что в случае жесткой цепи переход клубок - глобула происходит как фазовый переход I рода (1), хотя и с малой теплотой перехода. Для гибких молекул переход происходит как фазовый переход II рода (2).
13 EMBED CorelDRAW.Graphic.11 1415


Рис.9 Фазовые переходы для жестких (1) и гибких (2) макромолекул

Конечный скачок плотности наблюдается несколько ниже (-точки, причем 13EMBED Equation.31415(13EMBED Equation.31415. В случае гибких цепей переход происходит как плавный переход II рода, растянутый на всю (-область.

Замечания к разделу
Плавное спадание гауссовой функции наводит на представление о клубке как об объекте относительно плотном в центре и более рыхлым на периферии. Это неверно. Балабаев смоделировал на ЭВМ тепловое движение идеальной цепи из 626 звеньев и показал, что цепочка совершенно не заполняет объема клубка. Распределение Гаусса возникает только после усреднения по огромному числу разных конформаций, откуда видно, сколь значительна роль флуктуаций плотности в полимерном клубке.
Представление об идеальной цепочке плодотворно, но оно недостаточно для понимания большинства явлений в полимерных системах: необходим учет взаимодействия звеньев разных макромолекул, а также сблизившихся не соседних звеньев одной полимерной цепи, т.е. учет объемных взаимодействий. Возникает вопрос, как проявляется то факт, что полимерная цепь не бестелесная, каждое звено имеет объем, и внутренность этого объема недоступна для других звеньев. Эту проблему исключенного объема можно сформулировать также как задачу о случайных блужданиях частицы (звена), избегающей пересекать свой след.
Размер идеального Гауссова клубка R(lN1/2. Клубок занимает объем (R3(l3N3/2. Но полимерная цепь не заполняет этот объем. Если собственный объем звена V, то общий объем макромолекулы NV. При N>>1 l3N3/2>>VN, т.е. доля объема, занятого звеньями внутри клубка, очень мала:

· (13EMBED Equation.31415(13EMBED Equation.31415
Это в какой-то мере оправдывает представление об идеальном клубке: раз плотность мала, то столкновения звеньев редки. Считая клубок облаком независимых частиц-звеньев, распределенных в объеме l3N3/2, можно оценить число столкновений. Число двойных столкновений оценивают так: есть N частиц, и на каждую из них с вероятностью
· налетает партнер, значит, число двойных столкновений (N
·, число тройных N
·2, четверных N
·3 и т.д.
Число р-кратных столкновений:
Np( N
·p-1(N(3-p)/213EMBED Equation.31415.
Видно, что число многократных столкновений редко: Np<<1 при p>3. Даже число тройных столкновений (1 на всю длинную цепь. Число двойных - (N1/2, т.е. хотя и мало по сравнению с N (т.е. каждое звено сталкивается редко), но велико по сравнению с 1.
С другой стороны, клубок очень податлив, модуль упругости его мал (1/N. Поэтому можно ожидать, что парные столкновения звеньев приведут к существенному изменению фактических размеров клубка.
Первая теория набухания полимерного клубка в хорошем растворителе была предложена Флори: равновесное набухание клубка определяется компенсацией расталкивающего влияния исключенного объема и стягивающей энтропийной упругости. Как и ожидалось, несмотря на чрезвычайную рыхлость клубка и малую вероятность столкновений, эффект исключенного объема очень велик: при N13 EMBED Equation.DSMT4 1415( параметр набухания неограниченно возрастает.


2.6. Упругость полимерной цепи с исключенным объемом
Модуль упругости идеальной цепочки, растягиваемой за концы силой f: 13EMBED Equation.31415 и 13EMBED Equation.31415(13EMBED Equation.31415 (13EMBED Equation.31415).
Упругость обусловлена тепловым движением, т.е. флуктуациями конформаций, а флуктуации в клубке имеют макроскопический характер. Отсюда следует, что упругое поведение клубка должно зависеть от его общего размера R(lN( (для идеальной цепи (=1/2, для цепи с исключенным объемом (=3/5), но не от каких-либо микроскопических параметров звеньев. Поскольку для реальных цепей с исключенным объемом (=3/5, видно, что h(N в степени больше единицы: h(Nr, (r>1)
Этот результат имеет простой физический смысл: в реальной цепи связи воспринимают не только внешнюю нагрузку, как в идеальной цепи, но еще и расталкивающее действие межзвенных контактов. Для реальной цепи (=3/5 получается нелинейная зависимость растяжения от силы h(f2/3, т.е. мы видим, что полимерный клубок с исключенным объемом ведет себя под действием внешней нагрузки совсем не так, как идеальная цепь.
Анализируя эти рассуждения, можно отметить, что главным явилось предположение о том, что из всех характеристик клубка упругие свойства зависят лишь от его общего размера lN(, т.е. что этот размер является единственным характерным масштабом клубка. В этом предположении заключена так называемая гипотеза масштабной инвариантности, или скейлинга (scale – масштаб). Теории, основанные на этой гипотезе, называются скейлинговыми. Самым важным в скейлинговых теориях является учет флуктуаций плотности звеньев.


2.7. Осмотическое давление полимерного раствора
Макромолекулы создают избыток давления со своей стороны от мелкопористой перегородки (давление растворителя с обеих сторон одинаково). Этот избыток и есть осмотическое давление.
В разбавленном растворе (с<>1 (число звеньев).
Когда концентрация полимерного раствора достигает с*, клубки начинают перепутываться и в полуразбавленном растворе при c>>c*, отталкивание звеньев дает больший вклад в давление, чем поступательное броуновское движение целых клубков.
По теории Флори для осмотического давления получили бы ((kTBc2 (В – второй вириальный коэффициент, B=a3, a – размер звена).
Согласно скейлинговым рассуждениям клубки имеют единственный характерный макроскопический размер – размер R клубка как целого. Тем самым есть лишь одна характерная концентрация N/R3(c* и поэтому осмотическое давление:
13EMBED Equation.31415,
где f – функция, которую и требуется определить.
В полуразбавленном растворе, т.е. при с/с*>>1 было установлено: f(с/с*)((с/с*)5/4, т.е. 13EMBED Equation.31415.
Иными словами, был получен существенно отличающийся от теории Флори результат. Причина расхождения заключается в том, что в теории Флори флуктуации концентрации звеньев никак не учитываются. Разбавленные и неразбавленные растворы полимерных клубков сильно флуктуируют, и пренебрежение флуктуациями для этих систем приводит к значительным ошибкам.
Скейлинговые рассуждения есть, по сути дела, простой способ получить результаты точной флуктуационной теории. Эксперименты полностью подтвердили скейлинговую формулу ((с9/4 (а не ((kTBc2(kTa3c2, а – длина звена).
С ростом концентрации различие этих результатов уменьшается. Это указывает на то, что по мере концентрирования роль флуктуаций уменьшается, в концентрированном растворе они вообще несущественны.
2.8. Статистика линейных полимеров

Степень полимеризации
Проводя статистический анализ полимерных молекул, приходится определять, сколько содержится в образце молекул каждого сорта, или каково среднее число мономерных звеньев в полимерной молекуле, какова вероятность общей заданной конформации, каково среднее расстояние от одного конца молекулы до другого и тому подобные задачи. Этому и посвящен данный раздел. С точки зрения биофизики (и молекулярной биологии) ответы на эти вопросы будут во многом способствовать выяснению физико-химических свойств биомакромолекул и, в конечном итоге, особенностей их функционирования.
Степенью полимеризации полимерной молекулы называется число структурных субъединиц, содержащихся в молекуле – х. Молекула со степенью полимеризации х называется х-мером. Определение годится и для разветвленных полимеров. В простом линейном полимере идентичны все звенья, кроме концевых.
Молекулярная масса Мх х-мера является суммой молекулярных масс всех х звеньев. При больших х (х>100) концевыми эффектами можно пренебречь и считать, что все звенья имеют молекулярную массу Мо, тогда:

Мх = хМо,

где Мо – константа для полимера данного типа (не зависит от х), поэтому термины молекулярная масса и степень полимеризации в какой-то степени идентичны.

Распределение по молекулярным массам
Степень полимеризации полимеров даже одного типа (как искусственных, так и природных) может колебаться в широких пределах. Распределение по молекулярным массам описывает частоту нахождения данной степени полимеризации. Наиболее обычным является задание изменения мольной доли х-мера (Хх) как функции х, т.е. Хх = f(х)
Подобное уравнение называется функцией распределения. Хх – доля от общего числа молекул, приходящихся на х-мер.
Например, функция распределения для поликонденсации, при которой не изменяется реакционная способность функциональных групп в зависимости от х:
OH-R-COOH 13 EMBED Equation.DSMT4 1415H-[-O-R-CO-]x-OH + H2O
Пусть в начальном состоянии Nо мономеров, т.е. по No функциональных групп каждого типа. Пусть полимеризация протекает до тех пор, пока не прореагирует доля р от всех функциональных групп. Число оставшихся функциональных групп каждого типа равно тогда No(1-p). Но это же число определяет и число независимых молекул, так как каждая молекула имеет концевые не прореагировавшие группы.
Среднечисловая степень полимеризации 13EMBED Equation.31415 определяется как среднее число мономерных звеньев в молекуле и равна:

13EMBED Equation.31415

Для того, чтобы 13EMBED Equation.31415 было >100, значения р должны лежать между 0,99 и 1,00, так как говорим о макромолекулах.
Предположим, что все молекулы в конечной смеси расположены друг за другом вдоль конечного отрезка. Пусть он состоит из No звеньев структуры. В рNo местах звенья будут соединены СО-О-связями, в остальных (1-р)No местах связей нет. В нашем конечном отрезке будут точки, где кончается одна молекула и начинается другая. Если реакционная способность функциональных групп не зависит от длины цепи, размещение этих точек будет случайным.
Вычислим вероятность того, что данная структурная единица (звено) является частью х-мера. Чтобы вычислить эту вероятность, нужно сначала определить вероятность того, что выбранное звено является начальной частью х-мера. Эта вероятность равна вероятности того, что вдоль нашего отрезка расположатся (х+1) состояний в последовательности:

13 EMBED CorelDRAW.Graphic.11 1415

1 – несвязанное состояние; 2 – (х-1) СО-О-связей; 3 – следующее несвязанное состояние. Остальные состояния могут быть либо связями, либо промежутками.

Так как эти состояния являются независимыми, вероятность того, что мы имеем в данном месте начинающийся х-мер, является произведением вероятностей нужного нам события для каждого состояния. Эта вероятность равна р для имеющих связи и (1-р) для не имеющих связи состояний (так как доля связанных функциональных групп – это и есть мера вероятности того, что в данном состоянии есть связь). Таким образом, вероятность того, что выбранное звено является начальной частью х-мера, равна 13EMBED Equation.31415 или 13EMBED Equation.31415 (х-1, так как х звеньев связаны х-1 связью).
Для всех других, кроме интересующих нас (х+1) состояний вероятность равна 1, так как не имеет значения, связаны они или нет. (х+1) здесь, так как одно несвязанное состояние плюс (х-1)-связей плюс второе несвязанное состояние с другого конца х-мера. Но нам надо определить вероятность того, что данное звено является частью x-мера. Если это звено должно быть частью любого х-мера, то вдоль цепи имеется х состояний, с которых можно начать отсчет. Таким образом, полная вероятность того, что выбранное звено является частью х-мера, равна 13EMBED Equation.31415. Так как молекула может состоять из одного звена, то эта же вероятность может быть и вероятностью того, что этот х-мер является долей от общего числа х-меров.
Вероятность того, что данная структурная единица (звено) входит в х-мер, эквивалентна доле структурных единиц, составляющих х-меры. Считая, что все звенья имеют одинаковую массу, эта вероятность эквивалентна также весовой доле х-мера Wx:

13EMBED Equation.31415 (надо учитывать выделение воды при поликонденсации).

Это и есть распределение по массам (называют чаще весовым распределением). Оно показывает долю от общей массы, приходящуюся на х-мер.
Определим теперь числовое распределение, т.е. долю от общего числа молекул, приходящуюся на х-мер. Общая масса равна NoMo/NA, где Мо – молекулярная масса структурной единицы –СО-R-О-, NA – число Авогадро. Масса всех молекул х-мера равна WxNoMo/NA. Масса каждой х-мерной молекулы равна хMo/NA и число х-мерных молекул равно WxNo/х. Мы отметили, что общее число всех молекул равно No(1-p), поэтому мольная доля х-мера может быть записана так:

13EMBED Equation.31415

13 EMBED CorelDRAW.Graphic.11 1415
Рис.10 Зависимость весового и числового распределения от числа звеньев


Это и есть числовое распределение, т.е. доля от общего числа молекул, приходящаяся на х-мер (или мольная доля).
Комбинируя полученные выражения для распределений с выражением для 13EMBED Equation.31415, можно отметить, что Wx>Xx, когда х>13EMBED Equation.31415 и WxСумма всех весовых (Wx) долей и всех мольных (Xx) долей равна единице.
13EMBED Equation.31415; 13EMBED Equation.31415
Функции на этих рисунках не непрерывны (х – целочисленные), но при больших х можно эти разрывные функции заменить непрерывной функцией распределения:

13EMBED Equation.31415; 13EMBED Equation.31415,

где 13EMBED Equation.31415 - бесконечно малая доля веса полимера, имеющего степень полимеризации между х и х+dх. Преимущество функций такого рода в том, что х можно интегрировать в конечных пределах.
Приведенные распределения – это частный случай распределений, которые могут быть получены при синтезе полимеров. Тип распределения зависит от кинетики полимеризации.

Фракционирование полимеров
Фракционирование гетерогенных полимеров производят:
- используя их различия в растворимости, связанные с разными длинами цепи;
- с помощью ультрафильтрования через градуированные мембраны;
- с помощью хроматографии на колонках;
- с помощью ультрацентрифугирования.
В результате получают более гомогенные растворы полимеров, с более узким распределением.

Средние молекулярные массы
Закономерности, по которым данные физические свойства зависят от молекулярной массы, также определяют способ усреднения, который должен быть применен в каждом случае. Таким образом, при рассмотрении различных физических свойств мы неизбежно должны применить различные средние молекулярные массы. Особенно важны среднечисловая и средневесовая, встречаются также средневискозиметрическая и «Z-средняя» молекулярные массы.
Среднечисловая 13EMBED Equation.31415 получается путем суммирования количества молекул каждого сорта, умноженных на их молекулярную массу, и деления на общее число молекул. Для любой смеси молекул:
13EMBED Equation.31415, где Ni – число молекул сорта i, имеющихся в смеси, Mi – их молекулярная масса.
Вместо числа молекул Ni мы можем использовать число молей ni, число молекул или молей в единице объема или мольную долю. Удобно пользоваться мольными долями 13EMBED Equation.31415 и 13EMBED Equation.31415.
Если смесь представляет собой чистый полимерный образец, в котором молекулы различаются только по степени полимеризации, то х для различных сортов молекул будет меняться от 1 до ( и их молекулярные массы будут равны Мх=хМо так, что:
13EMBED Equation.31415
Среднечисловая степень полимеризации определяется также:
13EMBED Equation.31415,
где Nx – число х-мерных молекул или их количество в единице объема.
Средневесовая молекулярная масса. 13EMBED Equation.31415 получают путем сложения числа граммов gi полимера, молекулы которого имеют молекулярную массу Mi, умноженного на эту молекулярную массу, и деления на общую массу полимера в граммах. Можно использовать также концентрацию г/мл или весовую долю Wi :
13EMBED Equation.31415
И если полимер состоит из одинаковых звеньев, то:
13EMBED Equation.31415, 13EMBED Equation.31415
Средневесовая степень полимеризации:
13EMBED Equation.31415,
где Wx – весовая доля.
Общее определение для 13EMBED Equation.31415 можно записать другим способом.
Так как масса i-го сорта молекул gi, очевидно, равна NiMi/NA, то:
13EMBED Equation.31415

Используя выражения для Wx и Хх, полученные нами ранее для:
13EMBED Equation.31415,
13EMBED Equation.31415
и 13EMBED Equation.31415. При р(1 13EMBED Equation.31415(213EMBED Equation.31415.
13EMBED Equation.31415 и 13EMBED Equation.31415 встречаются очень часто. Реже более высокие формы средних величин:
Z-средний - 13EMBED Equation.31415
Z+1-средний - 13EMBED Equation.31415
Суммирование по всем возможностям i. Если образец полностью гомогенен, то во всех случаях
13EMBED Equation.31415=13EMBED Equation.31415=13EMBED Equation.31415=13EMBED Equation.31415
Разность вязкости полимерного раствора и соответствующего растворителя часто может быть пропорциональна произведению весовой концентрации и М(, где ( - константа (0,5-2,0=(). Для гетерогенного образца получают средневискозиметрический молекулярный вес 13EMBED Equation.31415.
13 EMBED Equation.DSMT4 1415
13EMBED Equation.31415=13EMBED Equation.31415, если (=1,0. При (<1,0 13EMBED Equation.31415 является промежуточным между 13EMBED Equation.31415 и 13EMBED Equation.31415.

Глава 3. Физика белка.

3.1. Общая характеристика белков
Белки - это сложные макромолекулярные структуры, нерегулярные полимеры, построенные из остатков аминокислот. В общем виде, в водном растворе при нейтральном рН, аминокислоты имеют вид типа:

Их структура и структура надмолекулярных комплексов определяется ковалентными химическими связями и слабыми взаимодействиями.
Нативные белки никогда не являются статистическими клубками. Физики их считают апериодическими кристаллами сложной структуры. Их поведение зависит от положения и свойств всех элементов молекул, т.е. существенно зависит от той конформации, в которой находится белковая молекула. В организме человека ~105 видов белков. Это странно, т.к. число генов приблизительно несколько десятков тысяч (один белок кодируется одним геном).
Изучая химический состав белков, мы узнаем, из каких химических элементов они состоят. Анализ показал: во всех белках примерно 50-55% углерода, 21-23% кислорода, 15-17% азота, 6-7% водорода, 0.3-2.5% серы. В составе больших белков обнаружены: фосфор, йод, железо и др. макро- и микроэлементы в разных количествах. Содержание основных химических элементов белка может различаться за исключением азота, т.к. концентрация азота постоянна и равна примерно 16%. Содержание азота в других органических веществах мало, поэтому предложили определять количество белка по входящему в его состав азоту. Зная, что 1г азота содержится в 6.25г белка, найденное количество азота умножают на 6.25.
Для определения химической природы белка, его разделяют на мономеры и выясняют их химический состав. Расщепление белка на составные части производят с помощью гидролиза (кислотного или щелочного). Кислотный гидролиз – это длительное кипячение белка с сильными кислотами. Чаще всего кипятят белок с HCL при 100єС в течение 24 часов.
2-ой этап: хроматография – это разделение веществ, входящих в состав гидролизата. Аминокислотный состав определяют с помощью анализа радикалов (гораздо сложнее определить их последовательность).
Функционирование белка связано с определенной конформацией. Нарушение в одном звене молекулы белка обязательно приведет к изменению её конформации. Денатурация – это необратимое разрушение белка. Ренатурация - это восстановление белка.
Задачи физики белков.
изучение структуры белка и надмолекулярных комплексов.
исследование динамического поведения белков (в том числе изучение денатурации).
установление связи между первичной структурой и структурами белков более высокого порядка.
изучение взаимодействия белков с нуклеиновыми кислотами.
изучение физики возникновения и эволюции белков.
изучение физических аспектов белковой изомерии.
изучение методов получения белков с заданными свойствами
изучение физических механизмов, лежащих в основе различных биологических функций.


3.2. Функции белков
Белки выполняют следующие функции:
транспортная: транспортировка и запасание кислорода, жиров, железа, меди и др. элементов;
гормональная: белки-гормоны регулируют обмен веществ. (Например, белки гипофиза, поджелудочной железы);
каталитическая: белки являются ферментами;
защитная (иммунная): белки являются антителами иммунных процессов – в гуморальном иммунитете участвуют
·-глобулины, в клеточном иммунитете участвуют лимфоциты, выполняющие свои функции благодаря белкам, расположенным на лимфоцитарных мембранах.
белки в составе крови способствуют ее свертываемости.
структурная (опорная): белки являются компонентами соединительной ткани (коллаген), кожи, волос (кератин), сосудов (эластин), хрящей. Вместе с углеводами белки входят в состав секретов (гликопротеиды). Они являются компонентами слизистых оболочек, связок, сухожилий.
сократительная (механохимическая): белки преобразуют энергию АТФ в механическую энергию.
сигнальная: обеспечение рецепции и передачи химических сигналов, участвуют в распространении нервных импульсов.
регуляторная (белки осуществляют обратную связь в метаболических цепях).
белки входят в состав рецепторных систем организма, перекодируя внешние сигналы в электрохимический импульс.
энергетическая (питательная): белки являются источниками питания для развития плода (казеин).
Многие белки являются токсинами, защищающими организм от вредных воздействий.
Белки поддерживают рН (буферы) и сохраняют онкотическое давление в клетках крови.
Существует множество иных специальных функций белков.
Гормональная функция.
Каждый белок выполняет одну узкоспециальную функцию и только в некоторых случаях выполняет несколько взаимосвязанных функций. Гормон мозгового слоя надпочечников – адреналин поступает в кровь, повышая потребление кислорода, повышает артериальное давление; с другой стороны, он повышает уровень содержания сахара в крови и стимулирует обмен веществ. У холоднокровных животных адреналин – это медиатор нервной системы.
Каталитическая функция.
Биохимические реакции в организме зачастую идут в мягких условиях (при температуре примерно 40єС и рН, стремящемся к 7.0). Но в этих условиях скорости протекания большинства биохимических реакций малы, следовательно, чтобы в организме они имели место, эволюционно возникли биологические катализаторы – ферменты.
Ферменты – это либо белки, либо комплексы белков с каким-либо ко-фактором (ион металла или какая-нибудь органическая молекула).
Ферменты обладают высокой избирательностью действия, в основе которой лежит определенная конформация белковой молекулы. Любое отклонение будет приводить к уменьшению избирательности и, следовательно, к ухудшению катализа.
Транспортная функция.
Внутрь клетки должны поступать многочисленные вещества (и строительный материал, и энергия), а биомембраны построены по одному принципу: двойной слой липидов, в который погружены различные белки, при этом гидрофильные участки макромолекул располагаются на поверхности мембраны, а гидрофобный хвост белка находится в толще мембраны. Такая структура мембран непроницаема ни для крупных молекул (аминокислоты, сахара), ни для относительно малых (ионы металлов). Их проникновение идет с помощью транспортных белков.
У многоклеточных организмов существует и другая система транспорта веществ. Это гемоглобин крови или сывороточный альбумин (обладающий способностью образовывать прочный комплекс с жирными кислотами, с гидрофобными аминокислотами (триптофан), со стероидными гормонами, с лекарственными препаратами (аспирин, пенициллин) и переносить их в различные органы), трансферрин обеспечивает перенос ионов железа, церуплазмин – ионы меди.
Рецепторная функция.
Для функционирования организма большое значение имеют белки-рецепторы, вмонтированные в плазматическую мембрану клеток, которые служат для восприятия и преобразования сигналов, поступающих в клетку (как от окружающей среды, так и от соседних клеток). Например, рецепторы ацетилхолина находятся в межнейронных контактах на мембране клеток, в том числе в коре головного мозга. Эти белки специфически взаимодействуют с ацетилхолином. Это взаимодействие приводит к такому изменению конформации белка, в результате которого становится возможной передача сигнала внутрь клетки. После получения и преобразования сигнала, нейромедиатор (ацетилхолин) удаляется, и клетка готовится к восприятию следующего сигнала. Чтобы он ушел, существует специальный фермент – ацетилхолин эстераза, катализирующий гидролиз ацетилхолина до ацетата и холина.
Многие гормоны не проникают внутрь клетки-мишени, а связываются со специфическими рецепторами на поверхности этих клеток. Это связывание уже является сигналом для запуска в клетке физиологического процесса.
Защитная функция.
Иммунная система обладает способностью отвечать на появление в организме чужеродных частиц выработкой лимфоцитов, и с другой стороны, отвечать производством белков (иммуноглобулинов). В первом случае говорим о клеточном иммунитете, во втором – о гуморальном. В ходе клеточного иммунитета лимфоциты разрушают чужеродные клетки, патогенные бактерии, раковые клетки, вирусы; во втором случае В-лимфоциты вырабатывают иммуноглобулины или антитела, которые, связываясь с чужеродными молекулами (антигенами), связывают и снимают эффект их действия.
Если в роли антигена выступает большая молекула, то антитело опознает не всю молекулу, а ее определенный участок и этот участок называется антигенной детерминантой.
Т.к. иммуноглобулины взаимодействуют с небольшой частью антигена, это позволяет лимфоцитам производить антитела, которые узнают специфические небольшие молекулы даже синтетической природы.
Согласно современным представлениям каждый тип иммуноглобулина, вырабатываемый В-лимфоцитами, произошедшими от одного общего предшественника, называется клоном.
Структурная функция.
Наряду с белками, выполняющими специализированные функции, существуют белки, которые выполняют структурные функции (прочность, эластичность и др. свойства отдельных тканей организма: коллаген – основной белковый компонент соединительной ткани (у млекопитающих он составляет до 25% массы белков)). Он синтезируется в фибробластах. Первоначально, он возникает в виде проколлагена, который проходит определенную обработку (окисление остатков пролина и лизина до гидроксипролина и гидроксилизина) в фибробластах. Коллаген – это три скрученные в спираль полипептидные цепи. Выходя из фибробластов, эти спирали объединяются в коллагеновые фибриллы (волокна) и образуют коллагеновые нити, которые можно наблюдать под микроскопом.
Двигательные белки.
Мышечные сокращения – это процесс, при котором происходит преобразование химической энергии, запасенной в пирофосфатных связях молекул АТФ, в механическую работу. Участвуют два белка актин и миозин.
Миозин состоит из длинной нитевидной части (хвоста) и двух глобулярных головок. Общая длина одной молекулы порядка 1600 нм, на головки приходится ~200 нм. Выделяют миозин в виде гексомера, образованного двумя цепями с молекулярной массой 200 тыс. и четырьмя легкими цепями с молекулярной массой около 20 тыс. Тяжелые цепи закручены спирально одна вокруг другой и образуют хвост. На одном конце нити находятся глобулярные головки, ассоциированные с легкими цепями. На головках миозина находятся два функциональных центра: 1-ый – каталитический (осуществляет расщепление пирофасфатной связи АТФ), 2-ой центр обеспечивает миозину способность специфически связываться с другим мышечным белком – актином.
Актин – это глобулярный белок, с молекулярной массой 42 тыс (G-актин в глобулярном виде). G-актин обладает способностью полимеризоваться с образованием длинной структуры F-актина. В такой форме он может взаимодействовать с головкой миозина, и это взаимодействие сильно зависит от наличия АТФ. При высокой концентрации АТФ комплекс актина и миозина разрушается. После того, как под действием миозиновой атефазы происходит гидролиз АТФ, комплекс снова восстанавливается. Этот процесс часто наблюдают в растворе, содержащем оба белка. Без АТФ
· это вязкое, высокомолекулярное соединение, добавление АТФ сразу уменьшает вязкость, а по мере разрушения АТФ опять происходит комплексообразование (конденсация). Эти превращения важны при мышечных сокращениях.


3.3. Аминокислоты
Аминокислоты – это органические кислоты, у которых атом водорода у
·-углеродного атома замещен на аминогруппу:



Все аминокислоты, кроме глицина, имеют хиральный атом C
· и существуют в виде двух энантиомеров (2-х оптических изомеров).
В настоящее время в состав всех изученных белков входят только L-аминокислоты. Биологический смысл этого заключён в том, что если это была бы смесь изомеров, то было бы бесконечно много диастереоизомеров.

Структура аминокислот в L и D формах.

D-аминокислоты широко распространены в живой природе. Они входят в состав олигопептидов.
Из 20 основных
·-аминокислот строятся белки. Некоторые аминокислоты образуются из этих 20-ти аминокислотных остатков, но в составе белковой молекулы. Например, при окислении двух сблизившихся остатков цистеина за счёт возникновения связи
·S
·S
· образуется диаминодикарбоновая кислота – цистин (R=SH). Сшивка S–S может возникать как между различными полипептидными цепями, так и внутри одной цепи.
Фосфорилирование остатков серина:

Такие ферменты как трипсин, химотрипсин, холинэстераза активны благодаря ОН группе, которая становится неактивной после фосфорилирования. ОН группа находится в активном центре фермента.
Аминокислоты в водном растворе существуют в ионизированном состоянии за счет диссоциации амино- и карбоксильных групп. Они могут существовать как кислоты (доноры) или как основания (акцепторы протонов). Природные аминокислоты делят на 3 группы:
алифатические (ациклические соединения жирного ряда);
циклические;
иминокислотный остаток
·пролин.
Ациклические:
аминокислотные остатки с углеводородными хвостами (аланин, валин, глицин, лейцин, изолейцин);
аминокислотные остатки с гидроксильной группой (серин, треонин);
аминокислотные остатки с кислотным остатком (аспарагиновая и глутаминовая кислоты);
аминокислотные остатки с группой СОNH2 (аспарагин и глутамин);
аминокислотные остатки с аминогруппой (аргинин и лизин) (т.е. R содержит дополнительную аминогруппу);
аминокислотные остатки, содержащие серу (метионин, цистеин).
Глицин участвует в образовании нуклеиновых и желчных кислот, в образовании гема, необходим для обезвреживания в печени токсичных продуктов.
Аланин используется организмом в различных процессах обмена углеводов.
Серин входит в состав различных ферментов, липопротеинов. Заменимая аминокислота.
Треонин – незаменимая аминокислота, участвует в биосинтезе белка.
Цистеин – заменимая аминокислота, которая легко окисляется, защищая организм от веществ с высокой окислительной способностью.
Метионин – незаменимая аминокислота. Характеризуется высокой подвижностью. Она содержит СН3 группу и участвует в синтезе холина, кератина, адреналина.
Валин, лейцин и изолейцин активно участвуют в обмен веществ, в организме не синтезируются.
Аспарагин и глутамин входят в состав тормозных медиаторов нервной систем.
Циклические:
Аминокислотные остатки, содержащие
·-электронные циклы,
· гистидин, тирозин, триптофан, фенилаланин.
Гистидин:



Незаменимая аминокислота, входит в состав большинства белков.
Тирозин:

Заменимая аминокислота (в организме человека образуется при окислении фенилаланина). Это активная часть гормона щитовидной железы.
Триптофан:

Незаменимая аминокислота (суточная потребность для человека
· 0,25г). Много триптофана в
·-глобулине, в белке фибриногене (основном компоненте системы свёртывания крови).
Фенилаланин:

Незаменимая аминокислота (суточная потребность для человека
· 1,1г). Входит в состав почти всех белков (яичный белок, гемоглобин и т.д.).
Иминокислота
· пролин:

Заменимая кислота (в организме человека синтезируется из глутаминовой кислоты). Входит в состав почти всех белков. При её биохимическом окислении образуется оксипролин.
Помимо основных аминокислотных остатков встречаются несколько производных уже названных аминокислот: оксилизин, оксипролин, и др. Найдены пиролизин, фосфосерин, тироксин и др. редкие аминокислоты.


3.4. Первичная структура
Цепочка аминокислотных остатков в белковой молекуле возникает при образовании пептидной связи :



Белки имеют молекулярную массу от 6000 до нескольких миллионов. Для того чтобы установить первичную структуру (последовательность аминокислотных остатков), надо определить количество цепей, разделить их и определить аминокислоты в цепях. Число цепей можно узнать по количеству N и C концов.
Для определения N-концевой аминокислоты предложен ряд методов, в частности метод Сенгера:
реакции амино- и оксигрупп с 2,4-динитрофторбензолом;
полный гидролиз;
хроматография для определения аминокислоты.
Для определения природы С-концевой аминокислоты чаще всего пользуются ферментативным путем.
Все четыре атома пептидной группировки лежат в одной плоскости. Это следует из рентгеноструктурного анализа. Было показано, что пептидная связь вследствие сопряжения С=О и N-атома, на р-орбитали которого находится неподеленная пара электронов, не может рассматриваться как ординарная и вращение практически отсутствует. По этой же причине хиральный атом С
· и карбонильный атом группировки С=О и N-C
· находятся в одной плоскости, но в этой же плоскости и О, и Н. Следовательно, все атомы находятся в одной плоскости. Геометрически полипептидную цепочку можно рассматривать как образованную плоскими фрагментами структуру (по шесть атомов в одной плоскости). Возникают торсионные углы : угол
· между С
· и С и угол
· между N и С
·.. Выражение для потенциальной энергии внутреннего вращения выглядит следующим образом:

U(
·,
·)=U0/2*(1-cos3
·)+U0/2*(1-cos3
·)+13 EMBED Equation.3 1415+Uкул
Первичная структура определена генетически; она определена составом и порядком следования аминокислот.
Реакция поликонденсации сопровождается выделением воды.


3.5. Вторичная структура
Фрагменты пространственной структуры любого биополимера, имеющие периодическое строение рассматриваются как элементы вторичной структуры. Под вторичной структурой белка подразумевают конфигурацию полипептидной цепи, т.е. способ свертывания, скручивания полипептидной цепи в спиральную или какую-либо другую конформацию. Различают две основные конфигурации:
·-спирали и
·-структуры.
Спиральная структура белка (
·-спираль).
Для полипептидных цепей известны13 EMBED Equation.3 1415 несколько типов спиралей. Наиболее распространенной является
·-спираль. Полинг и Кори основывались на данных рентгеноструктурного анализа
·-спирали, которая была экспериментально доказана. Они исходили из того, что:
- пептидная группа плоская;
О

·
·
- связь C-N сопряжена;
- все аминокислотные остатки эквивалентны;
- на каждую пептидную группу в спирали возникают две водородные связи, (каждая карбонильная группировка связывается водородной связью с NH-группой каждой 4-ой пептидной связи). В одном витке
·-спирали3,6 аминокислотных остатка (13 атомов), высота витка 5,4 Е, трансляция (перемещение вдоль оси на 1 аминогруппу )
· 1,5 Е.
Существуют и другие спирали: 4,4 (16) –
·-спираль; 5,1 (19)
·
·-спираль; 3 (10) – спираль.
Полипептидные цепи могут иметь несколько порядков закручивания, т.е. могут образовывать суперспирали.
Чаще на практике встречаются правые (образованные левыми аминокислотами) спирали.
Факторы стабилизации спиральной конформации белка:
-водородные связи, которые расположены параллельно оси
·-спирали;
-параллельная ориентация дипольных моментов пептидных связей, которые располагаются параллельно друг другу.
Стабилизировать структуру будут и гидрофобные взаимодействия, и водородные связи боковых радикалов, и электростатические взаимодействия.

·-структура.
Она стабилизируется водородными связями между отрезками одной и той же цепи или между соседними цепями.
13 SHAPE \* MERGEFORMAT 141513 SHAPE \* MERGEFORMAT 141513 SHAPE \* MERGEFORMAT 1415
Водородные связи перпендикулярны к оси цепи.

Отрезки, между которыми в складчатой структуре возникают водородные связи, могут быть направлены как в одну, так и в другую сторону.
Значительная часть вторичной структуры глобулярного белка, приходится на неупорядоченные участки (петли), которые изменяют направление полипептидной цепи. Наиболее экономичный структурный элемент, который поворачивает пептид на 180є, используя всего 3 пептидные группировки, называется
·-изгибом (стабилизируется одной водородной связью).
Существует несколько причин нарушения регулярной структуры белков:
Пролин (оксипролин) – это аминокислота, нарушающая структуру, т.к. она не образовывает водородных связей. В местах, где расположены эти иминокислотные остатки, направление цепи поворачивается резко, примерно на 180є.
В местах, где локализованы дисульфидные мостики, возникает напряжение (т.е. деформация) и вторичная структура искажается.
Изменение свободной энергии взаимодействия боковых групп аминокислотных остатков (гидрофобные взаимодействия, т.к. боковые радикалы в большинстве являются углеводородными радикалами, которые взаимодействуют друг с другом с большим повышением энтропии при малом изменении энергии). Энтропийная выгодность процесса связана со свойствами Н2О, молекулы которой стремятся образовать водородные связи и вытеснить углеводороды. Следовательно, усиливаются все типы Ван-дер-ваальсовых взаимодействий между этими боковыми радикалами.
Вторичная структура белка – это сочетание регулярных участков с нерегулярными (аморфными), в которых система водородных связей нарушена. Т.к. вторичная структура связана с первичной, а первичная генетически предопределена, то и вторичная структура предопределена.


3.6. Третичная структура
Третичная структура – это полная укладка в пространстве всей полипептидной цепи, включая укладку боковых радикалов. Полное представление о третичной структуре дают координаты атомов белка, полученные благодаря рентгеноструктурному анализу. Такие данные получены для большинства белков. Компьютерное моделирование позволяет выявить геометрию полипептидной цепи в целом, а также
·-складки, нерегулярные фрагменты, торсионные углы.
Силы, определяющие третичную структуру белка:
- Ван-дер-ваальсовы силы между боковыми радикалами;
- дисульфидные связи, придающие жесткость структуре глобулы.
Трехмерные структуры белков характеризуются плотной упаковкой атомов. Коэффициенты упаковки белковых молекул в нативном состоянии приблизительно такие же, как у правильных сферических тел. Нативные структуры белка имеют незначительные коэффициенты сжимаемости (как у каменной соли). Высокая компактность глобулярных белков подтверждается высокой плотностью, малой вязкостью и малыми объемами нативных белков в растворе.
Белкам свойственен следующий способ организации пространственной структуры:
- формируются гидрофобное ядро и мозаичная поверхность, содержащая гидрофобные и гидрофильные элементы.
Начиная с молекулярной массы 14-16 тыс. наблюдается тенденция к формированию белковой молекулы из двух или большего числа независимо формирующихся глобул, каждая из которых имеет гидрофобное ядро. Называются эти глобулы доменами. Домены формируются различными участками одной и той же цепи. Часто они выполняют свои функциональные задачи.
Гидрофобные взаимодействия стабилизируют структуру белка за счет энтропийного эффекта, связанного с термодинамическими свойствами воды. На каждую алифатическую неполярную боковую цепь, которая выходит из водного окружения, увеличение энтропийного эффекта составляет 20 кал/моль*градус. Переход в неполярную область этой алифатической цепи связан также с увеличением энтальпии. Гидрофобные взаимодействия понижают свободную энергию системы белок-вода (
·F~3-5 ккал/моль в расчете на одну полярную группу).
Различают глобулярные и волокнистые (фибриллярные) белки. Форму глобулярных белков аппроксимируют эллипсоидом вращения в первом приближении, у которого отношение полуосей 2:1.

Основные типы движения в белковой молекуле.
Тип движения
Амплитуда, Е

Время, с

Атомные флуктуации (несогласованные перемещения отдельных атомов, т.е. повороты вокруг простых связей боковых групп)
0.01 – 1
10-11 – 10-15

Согласованные коллективные перемещения групп атомов
10-2-5
10-12 – 10-3

Индуцированные внешними воздействиями изменения конформации
0.5 - 10
10-9 - 103


Источником первых двух типов движения могут быть тепловые колебания, а третий тип возникает за счет энергии взаимодействия белков с лигандами.
Механизм сборки белка при формировании третичной структуры можно характеризовать как бифуркационный процесс. Согласно теории, свертывание белковой цепи обладает двойственным характером. С одной стороны, весь процесс, начиная с состояния флуктуирующего статистического клубка и заканчивая трехмерной структурой, осуществляется исключительно по беспорядочно поисковому механизму, иначе бы этот процесс не мог бы быть самопроизвольным. С другой стороны, структурная организация белка – это детерминированный процесс, который протекает по определенному пути со строго последовательным рядом стадий. Если бы это было не так, то сборка белковой цепи не совершалось бы так быстро и безостановочно.


3.7. Четвертичная структура
Она формируется в результате ассоциации двух или большего числа белков. Эта структура обусловлена действием локальных сил между функциональными группами, расположенными на поверхности белковых молекул.
При выделении белка из тканей или клеток, сначала разрушают клеточную структуру. Это осуществляют с помощью механических методов, с помощью ультразвука, химических или ферментативных агентов. Т.к. многие химические реакции при понижении температуры протекают медленнее, в том числе и гидролиз, чтобы не повредить структуру белков при гидролизе клеточными ферментами, используют температуру 4-6 єС.
Растворимость белка зависит от концентрации соли и рН. Для разных белков их величины различны и этим пользуются для очистки и идентификации белков. Выпадение белка в осадок наблюдается при высокой концентрации соли – эффект высаливания (это обратимое явление и его часто используют как 1-ый этап в очистке белка). Для дальнейшей очистки и обогащения белков используют различия следующих свойств:
молекулярной массы (гель-электрофорез, метод молекулярного сита, ультрацентрифугирование);
растворимости;
электрического заряда (ионообмен);
хроматографии, адсорбируемости белков различными веществами;
сродства белков с различными молекулами.




3.8. Физико-химические свойства белков
На поверхности белковой глобулы сосредоточены в основном полярные и заряженные атомы, которые взаимодействуют с водным окружением. Именно группы основной цепи и заряженные атомы боковых цепей, а также полярные боковые цепи находятся на поверхности. Между противоположно заряженными группами образуются солевые мостики (ионные связи). Дисульфидные мостики могут быть расположены как внутри, так и на поверхности белковой глобулы. Внутренность белковой глобулы – это неполярная среда, защищенная от контакта с растворителем плотной упаковкой атомов.
Полярной или заряженной группе энергетически невыгодно находиться в таком гидрофобном окружении, если она не взаимодействует с другой гидрофобной группой или атомом с противоположным зарядом. Поэтому оставшиеся внутри амино- и карбоксигруппы основной цепи белка образуют водородные связи, формируя
·-спирали и
·-структуры, а заряженные группы глутаминовой кислоты и лизина образуют солевые мостики.
Сворачивание белковой молекулы осуществляется немногими путями. Информация о сворачивании белка заложена в его аминокислотной последовательности. Одно из предположений: отдельные участки белковой молекулы, например,
·-спираль, формируются в первую очередь и служат как бы центрами конденсации для остальных частей молекулы. Стабильность свернутой молекулы белка в водном окружении приблизительно оценивается величиной в 40 кДж/моль.
Основной движущей силой процесса сворачивания является энтропийный гидрофобный эффект, из-за которого неполярные группы выходят из водного окружения и оказываются внутри глобулы. В дальнейшем стабилизация приводит к образованию внутренних водородных связей, а также дисульфидных и солевых мостиков, но существует и энтропийный эффект, препятствующий сворачиванию. Речь идет о том, что у свернутой молекулы число конформаций меньше, чем у развернутой. А уменьшение числа конформаций энтропийно невыгодно.
В крупных белках большая вероятность того, что молекула будет состоять из двух доменов. По своей структуре каждый домен представляет собой белок (приблизительно 40 – 300 аминокислотных остатков).
Классификация доменов:
-
·/
·-домены, когда белковая цепь состоит из
·-спирали, а
·-участок почти отсутствует;
·-цепи располагаются так, что неполярные боковые цепи оказываются внутри.
-
·/
·-домены, когда возникает несколько
·-цепей и нет или почти нет
·-спиральных участков (иммуноглобулин G),
·-слои частично скручены.
-
·-
·-домены, когда
·- и
·-участки чередуются вдоль цепи и
·-участки формируют параллельный слой, окруженный
·-спиралями.
-
·+
·-домены, когда
·- и
·-участки расположены в различных местах молекулы.
Четвертичная структура характерна для белков, построенных из нескольких пептидных цепей. Такие белки называются олигомерами, одну цепь называют протомером. Четвертичная структура – это и количество, и способ укладки протомеров в пространстве.
Протомеры связаны друг с другом посредством водородных связей, ионных и гидрофобных взаимодействий. Они взаимодействуют друг с другом определенными участками своей поверхности (контактами). Взаимное узнавание контактных участков происходит по принципу комплементарности (взаимное дополнение). Следовательно, ошибочные комплексы в олигомере практически невозможны, каждый протомер взаимодействует с другим во многих точках. Олигомерные белки способны взаимодействовать с несколькими лигандами в центрах, удаленных друг от друга. Связывание одного протомера с лигандом изменяет конформацию этого протомера и всего олигомера. При этом изменяется сродство к другим лигандам. Такие лиганды называются аллостерическими.
Функциональная активность олигомерных белков может регулироваться аллостерическими лигандами. Например, гемоглобин – это олигомер, состоящий из четырех промеров. Основная функция гемоглобина
· связывание с кислородом в легких, где парциальное давление кислорода высокое. Он взаимодействует с четырьмя молекулами кислорода. Аллостерический эффект проявляется следующим образом: первый связанный лиганд (молекула кислорода) облегчает связывание со вторым; в свою очередь это облегчает связывание с третьим, затем с четвертым. В ткани СО2 и Н2О, которые образуются при катаболизме пищевых веществ, взаимодействуют с гемоглобином и уменьшает его сродство с кислородом, в результате регулируется содержание молекул кислорода в ткани.
В эритроцитах имеется аллостерический лиганд 2-3 дифосфоглицерат, способный взаимодействовать с дезоксигемоглобином. Следовательно, связывание гемоглобина с этим лигандом препятствует обратному связыванию освобожденного кислорода с гемоглобином. Этот эффект является результатом связывания лиганда со специфическим участком белка. Это вызывают изменение в молекуле белка, которое влияет на активность другого пространственно удаленного участка. Кооперативные изменения конформации олигомерных белков составляют основу механизма регуляции функциональной активности многих белков.
13 EMBED MSGraph.Chart.8 \s 1415


3.9. Простые и сложные белки
Если белки кроме полипептидных цепей содержат компоненты неаминокислотной природы, то они являются сложными.
Небелковая часть называется простетической группой, а белковая часть – апопротеином.
Сложный белок называется холопротеином. Простетической группой могут быть органические вещества, ионы металлов, углеводы, липиды и т. п.


3.10. Химические реакции пептидов
Для свободных аминоконцевых групп пептидов характерны те же реакции, что и для свободных аминокислот:
ацетилирование – это замещение водорода в органическом соединении остатком карбоновой кислоты RC = О. Это значит, что эти реакции можно использовать для определения белков.
СOОН-концевая группа белков, как и свободная группа в аминокислотах, может этерифицироваться (восстанавливаться). Этерификация – это получение эфиров из кислот и спиртов:
RCOOH+R’OH 13 EMBED Equation.3 1415RCOOR’+H2O
реакция обратима (H2SO4 связывает воду).
NH2-концевой остаток белка также количественно реагирует с нингидрином, с образованием окрашенных продуктов, как и свободные аминокислоты. Это используется для обнаружения и количественного определения пептидов (белков) при разделении их хроматографическим методом.
Широко используется известная реакция для белков (но не для свободных аминокислот) – биуретовая реакция. В результате обработки белка CuSO4 в щелочном растворе образуется комплексное соединение Cu2+ и белка окрашенного в фиолетовый цвет. Концентрацию белка в этом комплексе можно определить с помощью спектрофотометра.


3.11. Кислотно-основные свойства белков
Эти свойства нативных белков зависят от числа ионизированных боковых групп (R- групп):
·-амино- и
·-карбоксильная группы не вносят существенного вклада в эти свойства.
Свойства зависят от типов остатков и их последовательности. Для белков характерны определенные изоэлектрические значения рН, при которых они (белки) в целом не несут электрического заряда. В изоэлектрической точке значение рН определяется числом ионизированных R-групп, а также их рК. Это значение будет больше 7, если белок содержит большое число остатков основных аминокислот, и меньше 7, если в белке содержатся кислые аминокислотные остатки (глутаминовая, аспарагиновая кислоты).
У большинства глобулярных белков изоэлектрическая точка лежит в интервале рН 4,5-7. Из кривых титрования можно определить знак и величину суммарного заряда этого белка при любом значении рН. При значениях рН, лежащих выше изоэлектрической точки белок будет обладать отрицательным зарядом. Этот заряд будет увеличиваться с возрастанием рН в соответствии с кривой титрования, и наоборот.
рН изоэлектрической точки может существенно измениться при изменении концентрации солей в растворе, которые по-разному влияют на степень ионизации боковых групп.


3.12. Осаждение белков в виде солей
Большинство белков можно осадить из водного раствора добавляя кислоты (хлорную, 3-CL-уксусную кислоты), которые образуют с белками кислотонерастворимые соли. Эти реактивы используют для “осветления” биожидкостей и клеточных экстрактов, когда проводят анализ содержания низкомолекулярных компонент раствора. Осаждают белки метафосфорная, вольфрамовая и фосфо-вольфрамовая кислоты. Белки можно осадить и с помощью высоких концентраций солей.


3.13. Растворимость белков
Глобулярные белки сильно отличаются по своей растворимости в водном растворе. Эти различия используются для разделения белковых смесей. На растворимость влияют:
- рН;
- ионная сила (I);
- диэлектрические свойства (
·);
-температура (Т);
рН.
Практически для всех глобулярных белков характерна особенность: значение рН, при котором белок обладает наименьшей растворимостью, совпадает с его изоэлектрической точкой. Объясняется это тем, что в изоэлектрической точке молекула белка не несёт суммарного заряда и, следовательно, между соседними молекулами отсутствует электростатическое отталкивание. При значениях рН выше или ниже изоэлектрической точки все молекулы белка имеют суммарный заряд одного знака, вследствие чего они отталкиваются друг от друга, так что слипание в нерастворимые агрегаты оказывается невозможным. Некоторые белки в отсутствие солей практически нерастворимы при рН, соответствующем изоэлектрической точке.
Поскольку разные белки имеют разные изоэлектрические точки, то при достижении рН, соответствующего изоэлектрической точке одного из компонентов белковой смеси, этот компонент практически полностью выпадает в осадок, тогда как белки, изоэлектрические точки которых лежат при более низких или более высоких значениях рН, остаются в растворе. Метод разделения белков на основе данного свойства называется методом изоэлектрического осаждения.


Ионная сила.
На растворимость белков влияют концентрации солей. При низкой концентрации, соли повышают растворимость белков. Эффект не зависит от природы нейтральной соли, а зависит от ее концентрации и числа зарядов каждого из ионов, присутствующих в растворе. Соли, содержащие двухвалентные ионы, например, HgCl2 , значительно эффективнее повышают растворимость белков, чем NaCl, KCl, NH4Cl. Повышение растворимости белка вызывается изменением степени диссоциации, ионизируемых групп белка. В области малых концентраций добавление соли приводит к изменению рН соответствующей изоэлектрической точке и это тоже увеличивает растворимость. При значительном увеличении концентрации нейтральной соли растворимость белка снижается, и при очень высоких концентрациях соли белок полностью выпадает в осадок (высаливание). Разрушение гидратной оболочки ведет к высаливанию, т.к. ее образование улучшает растворимость.
Гидратация – это присоединение молекул Н2О к другим веществам как в растворенном, так и в свободном состоянии. Это частный случай сольватации. Гидратация электролитов в растворе – это главная причина их диссоциации на ионы. Она обуславливает устойчивость ионов в растворе и затрудняет их объединение – ассоциацию. В разбавленных растворах энергия, выделяемая при взаимодействии ионов с Н2О, компенсирует энергию диссоциации. Теплота гидратации ~10 – 102 ккал/г*ион.
Гидратацию характеризуют гидратационным числом. Это число молекул Н2О, которые находятся во взаимодействии с ионами и составляют его гидратную оболочку. Гидратная оболочка влияет на подвижность ионов, коэффициент диффузии и т.д. В свою очередь вхождение воды в состав гидратных оболочек уменьшает концентрацию свободных молекул воды в растворе, а это влияет на растворимость в ней веществ, на активность воды в растворе, на вязкость воды, самодиффузию и другие свойства. Числа гидратации растут с ростом заряда и уменьшением размера иона.
В стабилизации гидратной оболочки существенную роль играют водородные связи. Гидратная оболочка может составлять приблизительно 20% массы. Следовательно, ее учет существенно влияет на определение гидродинамических констант. При формировании третичной структуры белка происходит маскирование функциональных групп. Из-за этого, когда мы рассчитываем заряд белковой молекулы как функцию рН, отнести заряд к ионизации отдельных групп без дополнительных исследований невозможно.
Многие ионы прочно связываются с ближайшими молекулами воды и образуют прочные агрегаты, которые в тепловом движении и при движении в электрическом поле ведут себя как отдельные частицы. Образование вокруг иона прочно удерживаемого слоя молекул воды называется первичной гидратацией. Этот слой характеризуется пониженной способностью молекул воды к трансляционному движению. Второй слой молекул воды, окружающий ион, притягивается к иону слабее и трансляционное движение молекул воды в нем существенно не отличается от движения в толще жидкости. Совокупность изменений, вызываемых ионом во втором слое и более удаленных слоях, называется вторичной гидратацией.
Гидратация наиболее ярко выражается у веществ и полиэлектролитов, у которых макромолекулы содержат СООН, СО, СНО и др. группы. Общее число молекул воды в оболочке уменьшается с возрастанием температуры и сильно зависит от природы иона. Наиболее высокое значение чисел гидратации у сульфанатов двухзарядных катионов с малыми кристаллохимическими радиусами (MgІ+).
Гидратация оказывает сильное влияние на термодинамику и кинетику реакций ионного обмена. Она является важнейшей причиной набухания высокомолекулярных соединений.


3.14. Растворы высокомолекулярных соединений
Истинный раствор высокомолекулярного соединения – это термодинамически устойчивая гомогенная, равновесная система, которая образуется самопроизвольно при контакте полимера с низкомолекулярной жидкостью при наличии сродства между ними. Растворению предшествует набухание. В очень разбавленных растворах макромолекулы изолированы, практически не взаимодействуют друг с другом и непрерывно изменяют свою конформацию при тепловом движении. Чем сильнее взаимодействует полимер с растворителем, тем больше клубок разбухает. С увеличением концентрации полимера клубки в растворе разворачиваются и макромолекулы взаимодействуют друг с другом с образованием неупорядоченных ассоциатов. В очень концентрированных растворах образуются упорядоченные надмолекулярные ассоциаты типа пачек.
Следует иметь в виду, что потенциальная энергия гидратации:
U = (p*q)*cos
·/r2

· - угол между направлением диполя и линией, связывающей молекулу воды и ион,
q - заряд иона,
p - дипольный момент молекулы воды,
r - сумма кристаллохимических радиусов молекулы воды и иона.


3.15. Влияние растворителя на растворимость белка
Добавление органического растворителя (этанола, ацетона) в воду уменьшает растворимость большинства белков до такой степени, что они выпадают в осадок. Было выявлено, что растворимость белков при определенных значениях рН и ионной силы зависит от диэлектрической проницаемости среды и от способности добавленного растворителя понижать степень гидратации ионных групп. Т.к. при снижении диэлектрической проницаемости силы притяжения между двумя противоположными зарядами возрастают, то создаются условия для образования ионных пар. Этанол, у которого диэлектрическая постоянная меньше, чем у воды, способствует агрегации белка, т.е. снижает их растворимость. Это можно использовать для выделения и разделения белков.


3.16. Влияние температуры на растворимость белка
В интервале от 0 до 40єС растворимость белков возрастает. Однако существуют исключения. При температуре 40-50єС большинство белков денатурируют (утрачивают стабильность), а денатурация сопровождается резким снижением растворимости в области нейтральных рН.


3.17. Осмос и мембранное равновесие белков
Многие важные свойства белков в растворе объясняются очень большими размерами белковых молекул. Они не диффундируют через полупроницаемые мембраны, через которые проходит вода и низкомолекулярные вещества. Например, изготавливают целлофановые мембраны, которые используют для удаления низкомолекулярных веществ из растворов, которые содержат белки – это диализ. Если отделить раствор белков от чистой воды полупроницаемой мембраной, то наблюдается осмос (т.к. термодинамическая активность молекул воды в белковом растворе меньше, чем в чистой воде). Система компенсирует различие в активности за счет перемещения молекул чистой воды в пространство, содержащее раствор белка. Перемещение продолжается до тех пор, пока концентрация воды с обеих сторон не выровняется.
Осмотическое давление – это сила, которую нужно приложить, чтобы предотвратить осмотическое движение молекул воды. Посредством измерения осмотического давления можно разработать метод определения молекулярной массы белков: из уравнения Вант-Гоффа (
· = RTC) следует, что, как и все энтропийные термодинамические эффекты, осмотическое давление в разбавленных растворах не зависит от природы растворителя и растворенного вещества, а при постоянной температуре определяется только общим числом кинетических элементов (ионов, молекул, коллоидных частиц) в единице объема раствора. Это и позволяет определить среднечисловую молекулярную массу белков:
M = RTС/
·;
С
· концентрация белка, взятого для измерения.


3.18.Термодинамическое сродство полимера и растворителя
Мерой термодинамического сродства полимера к растворителю является разность химического потенциала растворителя в растворе (
·1) и химического потенциала чистого растворителя (
·10):

·
· =
·1 –
·10
При самопроизвольном процессе растворения
·
· < 0. Чем больше |
·
·|, тем выше сродство. Растворитель с большим сродством к полимеру – хороший, с малым – плохой. Термодинамическое сродство оценивают, измеряя осмотическое давление разбавленных растворов:

·
· = -
·Vp,
где Vp – парциальный молярный объем растворителя. Термодинамическое сродство компонентов в растворе зависит от парциального изменения энтальпии и энтропии смешения (
·Нс,
·Sc):

·Нс – определяет энергетические изменения при растворении;

·Sc – определяет изменения во взаимном расположении молекул и изменении конформации макромолекул;

·
· =
·Нс - Т
·Sc
Самопроизвольное растворение, сопровождающееся уменьшением химических потенциалов, может происходить только при:
(
·Нс - Т
·Sc ) < 0.
Для гибких цепей
·Нс
· 0, а
·Sc
·.0. Это означает, что их растворимость
· это следствие резкого возрастания энтропии системы. Растворение полимера с жесткими цепями сопровождается выделением тепла и
·Нс< 0,
·Sc
· 0, следовательно изменение энтропии системы падает. Это показывает, что способность полимера растворяться зависит:
от соотношения полярности полимера и растворителя;
от фазового состояния полимера;
от гибкости макромолекулы;
от плотности их упаковки.
Сильно полярные полимеры с жесткими цепями с неполярными жидкостями вообще не взаимодействуют. Они набухают в полярных растворителях и растворяются только в очень активных растворителях. Аморфные полимеры растворяются гораздо легче кристаллических. Неполярные полимеры с гибкими молекулами неограниченно растворяются в неполярных растворителях. Плотная упаковка макромолекул с сильными межмолекулярным взаимодействием ухудшает их растворимость.


3.19. Диффузия
В растворе в состоянии равновесия суммарное перемещение молекул растворенного вещества за некоторый промежуток времени равно нулю. Если в растворе создать градиент концентрации, то молекулы белка из области с высокой концентрацией будут перемещаться в область с низкой до тех пор, пока не установится равновесие.
Суммарное перемещение молекул растворенного вещества под влиянием градиента концентрации называется диффузией. Диффузия является следствием 2-го начала термодинамики. Следовательно, все процессы протекают в сторону возрастания энтропии, т.е. к уменьшению упорядоченности системы.
Скорость диффузии: 13 EMBED Equation.3 1415 = -AD 13 EMBED Equation.3 1415 (закон Фика) определяется некоторым количеством растворенного вещества (13 EMBED Equation.3 1415), диффундирующего через перпендикулярно направленную площадку А и пропорциональна изменению концентрации. Коэффициент диффузии (D) – это количество растворенного вещества, диффундирующее за 1с через поверхность площадью 1см2 при градиенте концентрации, равном единице (минус т.к. диффузия идет против градиента концентрации). Коэффициент диффузии зависит от размера и формы молекулы, а также от сопротивления, обусловленного внутренним трением (вязкостью молекул). Для сферических молекул, которые по размеру >> молекул воды коэффициент диффузии
D ~ 13 EMBED Equation.3 1415; D ~13 EMBED Equation.3 1415.
В принципе величина коэффициента диффузии уменьшается при увеличении молекулярной массы растворенного вещества, однако, в случае очень больших молекул зависимость коэффициента диффузии от молекулярной массы выражается слабо. Это объясняется тем, что процессу диффузии противодействует сопротивление, обусловленное внутренним трением между молекулами белка и растворителя, следовательно, коэффициент диффузии не может служить мерой молекулярной массы белка.


3.20. Характеристическая вязкость
[
·] = 13 EMBED Equation.3 141513 EMBED Equation.3 1415;

·уд = 13 EMBED Equation.3 1415;
13 EMBED Equation.3 1415 - вязкость растворителя,
13 EMBED Equation.3 1415 - вязкость раствора.
[
·] = kM
·;
k,
· = const.
Для определения молекулярной массы белков используют разбавленный раствор. Если раствор концентрированный, то в области высоких молекулярных масс справедливо:
lg
· = 3,4lgM + c.
c=const (зависит от природы полимера и температуры).


3.21. Седиментация
Молекулярная масса белка от 600013 EMBED Equation.3 14156 млн. Ультрацентрифугирование позволяет определить константу седиментации (S):
S = 13 EMBED Equation.3 1415,
где 13 EMBED Equation.3 1415 - скорость перемещения молекулы белка в пробирке центрифуги, r – расстояние от оси вращения до белковой полосы в пробирке.
S = 13 EMBED Equation.3 1415,
V – удельный объем,
f – константа поступательного трения или гидродинамический коэффициент белка, зависит от размера и формы макромолекулы,

· – плотность растворителя.
f·D = k·T,
где D – это коэффициент диффузии в том же растворителе, т.к. kNa = R, то:
M = 13 EMBED Equation.3 1415.


3.22. Электрофоретическая подвижность
Подвижность белка в изоэлектрической точке равна нулю. При сдвиге рН на две единицы в любую сторону, подвижность белка становится сравнима с подвижностью малых ионов. Она зависит также от ионной силы и температуры, поэтому о подвижности следует говорить, когда хорошо известны условия среды. Основной причиной различий подвижности является белковый заряд. Но нельзя все сводить только к заряду. Согласно теории Дебая-Хюккеля в растворе электролита каждый заряд экранирован диффузной атмосферой противоионов, плотность которой убывает с расстоянием по закону:

· =
·0е-жr ,
r – расстояние,
13 EMBED Equation.3 1415=1/ж – средняя толщина ионной атмосферы.
ж = 13 EMBED Equation.3 1415,
J = 13 EMBED Equation.3 141513 EMBED Equation.3 1415 – ионная сила, е – заряд электрона, 13 EMBED Equation.3 1415
· число Авогадро, 13 EMBED Equation.3 1415
· диэлектрическая проницаемость.
Подвижность сферических частиц, движущихся при электрофорезе, с точностью до коэффициента определяется формулой Смолуховского:
U = 13 EMBED Equation.3 1415,
13 EMBED Equation.3 1415 - это вязкость среды, 13 EMBED Equation.3 1415 - разность потенциала в двойном слое, окружающем частицу.
Рассмотрим два случая:
1) низкие ионные силы (разбавленный раствор электролита): J << 0,01.
В этих растворах толщина дебаевской диффузной оболочки больше размеров частиц. При таких условиях:
13 EMBED Equation.3 1415 = 13 EMBED Equation.3 1415, где z - заряд белковой частицы, 13 EMBED Equation.3 1415 – ее радиус.
Заряд глобулы пропорционален её поверхности:
z = 4
·a2
·e , где
·е – заряд единицы поверхности. Тогда электрофоретическая подвижность:
U = 13 EMBED Equation.3 1415.
2) ионная сила J13 EMBED Equation.3 14150,1.
Толщина ионной атмосферы 13 EMBED Equation.3 1415<10 Е (т. е. меньше размера белковой глобулы 13 EMBED Equation.3 1415<13 EMBED Equation.3 1415). Скачок потенциала 13 EMBED Equation.3 1415 сосредоточен полностью в слое 13 EMBED Equation.3 14151/ж. В этих условиях:
13 EMBED Equation.3 1415ж-1 13 EMBED Equation.3 1415 U = 13 EMBED Equation.3 1415ж-1.
В этом случае подвижность не зависит от размера частицы, от молекулярной массы белка. Это ближе к реальным условиям электрофореза белков, который при не слишком низких ионных силах буферных растворов определяется зарядом, но не сильно чувствителен к молекулярным массам и размерам белков.


3.23. Конформационные переходы у пептидов
Различить ту или иную структуру белка (
·,
· или неупорядоченную) сложно. Равновесная конформация в белках обеспечивается взаимодействием боковых групп аминокислотных остатков друг с другом и с растворителем, а с другой стороны - водородными связями между пептидными группами. Роль водородных связей растет в неполярных растворителях и падает в сильнополярных. Сильнополярные растворители сами образуют водородные связи с CO и NH группами пептидных группировок. Если боковые группы заряжены одноименно, то упорядоченность исчезает, а если они не заряжены, то в зависимости от их взаимодействия друг с другом и с растворителем можно наблюдать
·,
· структуры и стат. клубок. При изменении температуры, рН, состава растворителя обнаруживаются конформационные переходы между этими тремя типами структур. Эти переходы кооперативны и происходят внутри каждой макромолекулы.
Полилизин в заряженном состоянии не образует регулярных структур (
·–спиралей) и ведет себя как линейный полиэлектролит. При рН > 10,5 – разряжен и образует
·-спираль, которая устойчива в воде при температуре ниже 20 0С. При нагревании до 200 – 350С молекулы полилизина переходят в состояние статического клубка. При температуре выше 350С наблюдается второй конформационный переход и возникают
·-складчатые структуры.
При отливке пленок из растворов, содержащих белки, макромолекулы белков сохраняют ту конформацию, которую они имели в этом растворителе. Структура и упаковка в твердой фазе этих молекул определяется свойствами растворителя, из которого полимер выделяется при испарении жидкости.



3.24. Метод Линдерштрема и Ланга
Большинство методов дают суммарное число аминокислотных остатков в
·-спиральных и
·-структурных участках макромолекулы, а т.к их различить сложно, то используется понятие степени регулярности структуры белка. По скорости замены атомов водорода (Н) в NH-группах пептидной группировки на Н2 или Н3 удобно определять степень регулярности структуры белка. Н1 в NH-группах обменивается на дейтерий быстро, если полипептид имеет низкую молекулярную массу и если он неупорядочен, и наоборот.
Скорость обмена зависит от условий эксперимента. Переход от быстрого обмена к медленному – признак образования внутримолекулярных водородных связей.
В молекуле РНК-азы из 123 пептидных атомов водорода 70 обмениваются медленно, следовательно, степень регулярности равна 57%. Оказалось, что из этих 70 пептидных групп, стабилизированных водородными связями, 25 способны медленно обмениваться при 00С, еще 25 – при 380С и 20 не обмениваются до 600С. При нагревании возле 600С происходит разрыв водородных связей между пептидными группировками,
·-спираль превращается в стат. клубок (денатурация).


3.25. Метод измерения удельного вращения плоскости поляризации света
Линейно поляризованную волну всегда можно разложить на две волны, поляризованные по кругу вправо и влево. Если в среде одна волна обгоняет другую, то плоскость поляризации падающей волны, или вектор напряженности электрического поля, поворачиваются на угол
·.
Оптическая активность – это результат кругового двулучепреломления, т.е. разных скоростей распространения света поляризованного по кругу влево и вправо.
[
·]D =13 EMBED Equation.3 1415,
где [
·]D – удельная оптическая активность,

· – угол вращения плоскости поляризации,
13 EMBED Equation.3 1415– толщина слоя вещества,
с – концентрация.

· =13 EMBED Equation.3 1415, где nl и nD – показатели преломления.
[
·]D – зависит от природы оптически активного вещества и растворителя, температуры и длины волны.
Вследствие различия в поглощении правой и левой волн оптически активное вещество вблизи длины волны собственного поглощения не только поворачивает плоскость поляризации, но и превращает линейно поляризованное излучение в эллиптически поляризованное.
13 EMBED Equation.3 1415= 13 EMBED Equation.3 1415(жL – жD) – мера эллиптичности.
ж– показатель поглощения света, поляризованного по кругу влево или вправо:
ж=
·13 EMBED Equation.3 1415, где
·- коэффициент молярной экстинкции (J= J0e-
·cl).
Если вещество обладает круговым двулучепреломлением, то оно по-разному поглощает свет, поляризованный по кругу вправо или влево, т. е обладает круговым дихроизмом. Аминокислоты вращают плоскость поляризации влево. Но величина оптического вращения в полимерах состоит из двух величин: из отрицательной (это вклад всех асимметричных атомов углерода) и из положительной (это вклад
·-спиралей как целого).
Для поли-
·-бензилглутамата Доти экспериментально определил, что [
·]D=-300, если использовать растворитель, в котором поли-
·-бензилглутаматат не имеет водородных связей, и [
·]D=+180 в хлороформе (малополярный растворитель) полная величина инкремента
·-спирали равна 480 (
·-спираль является правой, т.к состоит из левых аминокислот).


3.26. Поглощение света
В видимой области поглощают только хромопротеины (гемоглобин, миоглобин, каталаза и др.).
В УФ области все белки (кроме протаминов) имеют широкую полосу поглощения (275 – 278 нм). Свет здесь поглощается сопряженными ядрами триптофана, фенилаланина и тирозина. Коэффициент молярной экстинкции вблизи этих длин волн зависит от количества в белке хромофорных групп, содержащих сопряжённые
·-электроны. Эта полоса (~ 280 нм) объясняется возбуждением
·-электронов. От белка к белку эта полоса может деформироваться и смещаться т.к. зависит от аминокислотного состава. На спектр поглощения влияют различные типы комплексообразования, ионные и дипольные взаимодействия, водородные связи групп, присоединенных к хромофору, pH среды и т.д. Поглощает также пептидная связь при длине волны ~ 190 нм. Но измерениям при этой длине волны мешает поглощение боковых радикалов, поэтому спектр надо поправлять с учетом поглощения боковых групп.
Экстинкция статических клубков экспериментально оказывается выше, чем спирали (для полиглутаминовой кислоты на 42%). Уменьшение оптической плотности при переходе конформации белка от клубка к спирали, называется гипохромным эффектом. Интенсивность поглощения зависит от дипольного момента перехода. Когда белок не имеет регулярной (спиральной) структуры, дипольные моменты перехода, ориентация которых связана с ориентацией пептидных групп, никак не коррелированны, поэтому их взаимодействие компенсируется. Когда возникает спираль – пептидные группы (и дипольные моменты) ориентированы примерно параллельно. При такой пространственной ориентации между ними возникают электростатические силы, которые и приводят к ослаблению поглощения света.


3.27. Спектроскопия в инфракрасной области
С помощью метода ИК-дихроизма, когда измеряют разность поглощения света поляризованного вдоль ориентации молекул и перпендикулярно этой оси, можно определить, в какой конформации находится белковая молекула, т. е можно определить, как направлены группы CO и NH пептидных группировок по отношению к оси макромолекул. Для валентного колебания NH-группы частота равна 3330 см-1, а для валентного колебания CO-группы частота равна 1660 см-1. Для деформационного колебания NH группы – 1550 см-1
В пленках с белками в
·-спиральной конформации в ориентированных образцах направления валентных колебаний совпадают с направлением оси макромолекулы.
В
·-пленках направления валентных колебаний перпендикулярны оси макромолекулы, в результате возникает возможность исследовать переходы от
·- к
·-конформации и наоборот.
По характерным сдвигам полос валентных колебаний CO-групп и деформационных колебаний NH-групп можно качественно отличать 3 конформации:
Валентные колебания СО
Деформационные колебания NH


1655-1660см-1
1530-1535см-1
Статистический клубок

1650-1655см-1
1540-1545см-1

·-спираль

1630-1635см-1
1520-1530см-1

·-форма


3.28. Дисперсия оптической активности
Дисперсия оптической активности – это зависимость оптических характеристик вещества от длины волны падающего света. Чаще говорят о зависимости показателя преломления от длины волны и зависимости оптической активности от длины волны.
Дисперсия:
- нормальная, если показатель преломления убывает монотонно с ростом длины волны.
- аномальная, если показатель преломления изменяется резко.
Теория дисперсии оптической активности рассмотрена Кирквудом, а для спирали Моффитом.
Для обычных случаев оптической активности, когда эффект определяется асимметричными атомами углерода:
[m] = 13 EMBED Equation.3 141513 EMBED Equation.3 1415[
·] = 13 EMBED Equation.3 1415 (формула Друде),
где 13 EMBED Equation.3 1415
· полоса поглощения атомов, соседних с асимметричным атомом углерода (C13 EMBED Equation.3 1415).
На практике получается большое значение оптической активности.
Моффит получил выражение для дисперсии [m] макромолекул, содержащих спиральные участки:
[m] = 13 EMBED Equation.3 141513 EMBED Equation.3 1415[
·] = 13 EMBED Equation.3 1415 + 13 EMBED Equation.3 1415.
b0 – это коэффициент, пропорциональный содержанию
·-спиральных структур.
b0 <0 для правых спиралей и положителен для левых.
13 EMBED Equation.3 1415 - множитель Лорентца, он характеризует влияние растворителя.
Часто вместо реальных полос берут эффективную полосу. Вблизи полосы поглощения оптическая активность становится очень большой, проходя через максимум, опускается, затем проходит через минимум. Резкое изменение оптической активности с сопровождающим круговым дихроизмом называется Коттон-эффектом. Измерение Коттон-эффекта в области 220–230 нм позволяет измерить характеристики вторичной структуры белков. Максимум при 230 нм характерен для всех белков, имеющих спиральную структуру. Величина максимума пропорциональна количеству спиральных областей.


3.29. Переходы “спираль-клубок”
Переходы “спираль-клубок” связаны с изменением конформации. Этот процесс происходит при изменении рН, ионной силы, состава растворителя. Эти процессы протекают кооперативно, и причины кооперативности связаны со структурой
·-спирали или
·-формы.
Конформации звеньев цепи взаимозависимы, т.к. водородная связь между i-ой и i
·4-ой пептидной группировками накладывает жёсткие ограничения на конформации i
·1-го, i
·2-го и i
·3-го звена. Для освобождения какой-либо пептидной единицы (а это означает выигрыш энтропии) необходимо одновременно разорвать как минимум три водородные связи кряду, а на это необходима определенная энергия. Поэтому пептидные звенья могут освобождаться только кооперативно.
Зимм и Бреггг разработали теорию перехода “спираль - клубок”, воспользовавшись моделью Изинга. Основная задача в их теории – это нахождение стат. суммы. Согласно этой теории рассматривается два типа состояний звеньев цепи:
1-ое состояние – это состояние связанного водородной связью звена
·
·i=1.
2-ое состояние
· это состояние свободного звена
·
·i=0.
Свободная энергия цепи зависит от значений
·i, причем непосредственно взаимозависимы конформации четырех последовательных звеньев:
F(
·1,
·2,
·N) = 13 EMBED Equation.3 1415.
13 EMBED Equation.3 1415 - это свободная энергия i-го звена, в котором учтена корреляция с предыдущими звеньями.
Считаем цепь очень длинной N >> 1 и пренебрегаем концевыми эффектами. Свободная энергия свободного звена не зависит от состояний предшествующих звеньев, т.е. Fсвоб.13 EMBED Equation.3 141513 EMBED Equation.3 1415(
·i-3,
·i-2,
·i-1, 0).
Свободная энергия связанного звена , следующего за связанным:
Fсвяз..13 EMBED Equation.3 141513 EMBED Equation.3 1415(
·i-3,
·i-2, 1, 1)
Свободная энергия связанного звена при такой записи не зависит от состояний i
·3 и i
·2, т.к. ограничения, которые накладываются предшествующим звеном (i
·1), уже учли эту зависимость. Таким образом, изменение свободной энергии цепи при увеличении числа звеньев на единицу за счет соседнего несвязанного звена:

·F = Fсвяз. – Fсвободн. = 13 EMBED Equation.3 1415(
·i-3,
·i-2, 1, 1) - 13 EMBED Equation.3 1415(
·i-3,
·i-2,
·i-1, 0).
Если связанное звено появляется после трех свободных, то для этого нужна дополнительная энергия сверх
·F. Связывание звена в этом случае означает инициирование спирали (возникновение) и она накладывает ограничения на четыре звена.
13 EMBED Equation.3 1415(0, 0, 0, 1) = Fсвяз. + Fиниц.
Свободная энергия инициации определяется уменьшением энтропии связываемых звеньев:
Fиниц = 4RTln3 13 EMBED Equation.3 1415 2,5 13 EMBED Equation.3 1415 (при вращении свободного звена возможно возникновение трёх поворотных изомеров).
R = 213 EMBED Equation.3 1415 ; Т = 300 0К.
Свободная энергия для освобождения одного или двух звеньев, заключенных между связанными звеньями, должна быть очень большой, т.к. звенья при этом остаются в спирали. Энергия, затрачиваемая на разрыв водородной связи, не компенсируются повышением энтропии, поэтому
13 EMBED Equation.3 1415(
·i-3, 1, 0, 1)13 EMBED Equation.3 1415,
13 EMBED Equation.3 1415(1, 0, 0, 1) 13 EMBED Equation.3 1415.
Зная эти значения для свободной энергии, запишем статистическую сумму, введя систему множителей:
1 для каждого звена в свободном состоянии (
·i=0).
S для звена в связанном состоянии (
·i=1):

S = e-
·F/kT .
Физический смысл S – это константа равновесия для реакции образования водородной связи в звене, следующем за связанным.

· – для каждого связанного звена, следующего за тремя и более свободными:

· = е-Fиниц./кТ.
Физический смысл
· – это константа равновесия для реакции образования одного разрыва в последовательности водородных связей.
Для Fиниц.13 EMBED Equation.3 1415 2,5 13 EMBED Equation.3 1415
·13 EMBED Equation.3 141510-2.

· играет роль фактора кооперативности. Чем выше кооперативность процесса, тем меньше
·.
4) 0 для каждого связанного звена, следующего за одним или двумя несвязанными.
Все это приводит к тому, что можно записать стат. сумму:
Z= 13 EMBED Equation.3 1415.
Зимм и Брегг показали, что задача упрощается, если ограничиться рассмотрением состояний всего лишь двух последующих звеньев:
F (
·1,
·2,
·N) = 13 EMBED Equation.3 1415.
Fсвоб. = 13 EMBED Equation.3 1415(
·i-1, 0).
Fсвяз.. = 13 EMBED Equation.3 1415(1, 1).
Fсвяз. + Fиниц = 13 EMBED Equation.3 1415(0, 1).
Считаем, что свободная энергия несвязанного звена равна нулю, для него множитель равен 1. Для каждого связанного звена – множитель S и для каждого первого из связанных звеньев, следующего за одним или большим числом свободных, множитель
·.
Z = 13 EMBED Equation.3 1415.
Z в виде суммы произведений можно представить как след матрицы (сумму диагональных элементов):
Z = Sp(pN) =
·1N +
·2N.
Характеристическое уравнение:
Z = (
· – 1)(
· – S) =
·S.
Рассмотрим два крайних случая:

· =0 – полная кооперативность (Fиниц 13 EMBED Equation.3 1415):

·1 = 1;
·2 = S
Z = 1+ SN
При N>> 1
Z = SN (S>1) или Z =1(S<1).
Видно, что переход “спираль - клубок”, осуществляется в точке S=1 и происходит по типу “все или ничего”.
Доля связанных пептидных единиц равна:
13 EMBED Equation.3 1415 = 13 EMBED Equation.3 1415
13 EMBED Equation.3 1415 =13 EMBED Equation.3 1415 (13 EMBED Equation.3 1415 =13 EMBED Equation.3 1415; Z = 1+ SN) и при N >>1
· = 1 (S>1) или
· = 0 (S<1).
Если
· мало, но не равно нулю, то решение характеристического уравнения дает переход не в одной точке, а в некотором интервале значений S. Этот интервал
·S тем уже, чем меньше
·.
2)
· =1 - кооперативности нет (Fиниц=0):
(
·-1)(
·-S) =
·S

·1 = 1+S;
·2 = 0
Z = (1+ S)N , т.е. представляет собой произведение стат. сумм отдельных единиц. Это означает, что разрыв водородных связей в каждом звене происходит независимо. Доля связанных пептидных единиц равна:
13 EMBED Equation.3 1415 =13 EMBED Equation.3 1415;
Т.к S = e-
·F/kT , то зависимость
·(S) одновременно является зависимостью
·(Т).
Плавлению спирали отвечает S = 1
Тплав = Тm = 13 EMBED Equation.3 1415, где13 EMBED Equation.3 1415 и 13 EMBED Equation.3 1415
· разность энтальпии и энтропии клубка и спирали.
Расчеты показывают, что интервал значений
·Т, в котором происходит плавление, оказывается:
13 EMBED Equation.3 1415;
3) промежуточный случай.
0 <
· < 1
13 EMBED Equation.3 1415 =13 EMBED Equation.3 1415
1 < n < N
13 EMBED Equation.3 1415.
13 EMBED Equation.3 1415 - константа равновесия для реакций, в которых одновременно участвуют n единиц.
13 EMBED Equation.3 1415 = 13 EMBED Equation.3 1415 - это эффективные значения изменения энтропии и энтальпии, зависящие от n. Т.к 13 EMBED Equation.3 1415, то
·Hэф =
·hn.
·h – это изменение энтальпии при освобождении одного звена.
Когда: n=N,
· = 0

· = 0, n = 1.
При N >> 1, Z =
·1N
13 EMBED Equation.3 1415 = 13 EMBED Equation.3 1415
· 13 EMBED Equation.3 1415
· 13 EMBED Equation.3 1415 (1);
С другой стороны, 13 EMBED Equation.3 1415 =13 EMBED Equation.3 1415 (2).
Приравняв (1) и (2) получим: 13 EMBED Equation.3 1415 = 13 EMBED Equation.3 1415

·Hэф = 13 EMBED Equation.3 1415 = 13 EMBED Equation.3 141513 EMBED Equation.3 1415 = 13 EMBED Equation.3 141513 EMBED Equation.3 1415;
S = 1
13 EMBED Equation.3 1415

·Hэф =
·hn
и n = 13 EMBED Equation.3 1415;
Величину
·Hэф находят по углу наклона зависимости степени спиральности
· от 1/кТ и области перехода. Т.к. в этой области 13 EMBED Equation.3 1415
·1, то
13 EMBED Equation.3 1415 =
· 13 EMBED Equation.3 1415 =
· 13 EMBED Equation.3 1415 =
· 13 EMBED Equation.3 141513 EMBED Equation.3 1415 =
· 13 EMBED Equation.3 1415n
·h.
Параметры перехода “спираль - клубок” зависят от молекулярной массы, от условий эксперимента (рН, ионной силы), от гидрофобности и типа белка (состав, последовательность аминокислот).
Т.к. in vitro не определяются функциональные характеристики белков, то не следует такой процесс плавления белка в растворе называть денатурацией. Денатурация – это конформационное изменение биологической макромолекулы, приводящее к утрате ею способности к выполнению определенной биологической функции. Эта утрата может быть необратимой и обратимой. Процесс, обратный денатурации, называют ренатурацией. Когда речь идет о сложных белках и надмолекулярных комплексах, в которых участвуют белки, восстановление структуры по физико-химическим критериям – это недостаточное основание для суждения о восстановлении функциональной активности.



3.30. Денатурация глобулярных белков
Денатурацию глобулярных белков вызывают: нагревание, воздействие ультразвуком, радиационное воздействие, рН, состав растворителя.
Экспериментально было показано, что денатурацию вызывают слабополярные органические растворители. Их действие связано с контактами с гидрофобными группами белка. Было обнаружено, что денатурирующее действие спиртов на белки возрастает с увеличением размера алифатического радикала.
Глобула имеет фиксированную пространственную структуру и переход “глобула клубок” отличен от перехода “спираль - клубок” потому, что он происходит в трехмерной системе. С другой стороны, кооперативность перехода (которая определяет величину изменения температуры (интервал
·T, в котором происходит переход), а
·T примерно одинаково при плавлении
·-спирали и глобулярного белка) связана не только с взаимодействием ближнего порядка, но и дальнего. Показательны денатурационные превращения в зависимости от рН. При уменьшении рН уменьшается изменение энтальпии и температура перехода.
Например, для химотрипсиногена:

рН
Тm, 0С

·Н, ккал/моль

2.3
43
78

2.8
51
110

3.4
58
130

5.0
62
148


Конформационные переходы белковых молекул связаны с разворачиванием полипептидной цепи и часто происходят малые, локальные и трудно наблюдаемые изменения, которые не сопровождаются сильными изменениями теплоемкости. Когда изменения теплоемкости при денатурации нативных белков велики, их связывают с нарушением гидрофобных взаимодействий. По существенным изменениям теплоемкости можно судить о характере перехода. Т.к. при денатурации глобулярных белков изменяется структура молекулы, то исследования могут способствовать установлению факторов, стабилизирующих белковую глобулу.
Факторы:
В ходе денатурации белки характеризуются большей поворотной гибкостью цепи, и поэтому среднее изменение энтропии
·13 EMBED Equation.3 1415 является первой существенной составляющей свободной энергии для дестабилизации глобулярных белков. В расчете на стабильный (развернутый) остаток
·13 EMBED Equation.3 141513 EMBED Equation.3 14152-613 EMBED Equation.3 1415.
Изменение энтальпии
·13 EMBED Equation.3 1415 (связано с разрушением водородных связей).
·13 EMBED Equation.3 141513 EMBED Equation.3 1415 2 13 EMBED Equation.3 1415.
Изменение свободной энергии
·13 EMBED Equation.3 1415 при нарушении гидрофобного взаимодействия в ходе денатурации.
Реакции денатурации белка сильно зависят от рН. Факторы, определяющие эту зависимость, делят на две группы:
а) дальнодействие электростатического взаимодействия;
б) аномальные группы и эффекты, связанные с титрованием.
Многие белки содержат ионизированные группы, рК которых отличаются на несколько единиц от нормального значения рК для этих групп в развёрнутом состоянии. В ходе денатурации происходит нормализация рК этих групп, т.е. изменяется связывание протонов с этими группами. Это приводит к появлению титрационной составляющей изменения свободной энергии (
·Fтитр.).

·Fg = p(N 13 EMBED Equation.DSMT4 1415 - NT
·13 EMBED Equation.3 1415 + 13 EMBED Equation.3 1415
·13 EMBED Equation.3 1415i) +
·Fэл +
·Fтитр..

р – доля пептидной цепи, развернутой в ходе денатурации, или степень разворачивания.
N – число звеньев в молекуле.


3.31. Метод Тенфорда определения разности свободной энергии денатурированного и нативного белка по денатурации в растворе мочевины
Для изменения свободной энергии денатурации белка в растворе мочевины можно записать:

·
·Fu = RTlnKu = RTln13 EMBED Equation.3 1415, где 13 EMBED Equation.3 1415 и 13 EMBED Equation.3 1415
· концентрации денатурированного и нативного белка.

·(
·F) =
·Fu -
·FH13 EMBED Equation.3 1415O =
·FД –
·FN.

·(
·F) = 13 EMBED Equation.3 1415.
ni – число групп (звеньев) типа i в белке.

·i – численный параметр, зависящий от степени доступности растворителю групп данного типа в нативной конформации.

·Fi – вклад групп типа i в свободную энергию перехода.

·i (пептидн.) 13 EMBED Equation.3 1415 0.5;

·i (полярн.) 13 EMBED Equation.3 1415 0.25;

·i (гидроф.) 13 EMBED Equation.3 1415 0.75;

·Fi определяется из данных о растворимости аминокислот в воде и в растворе мочевины данной концентрации. Для концентрации мочевины (C13 EMBED Equation.3 1415), при которой [Д] = [N] (
·Fu = 0), тогда

·FH13 EMBED Equation.3 1415O =
·
·(
·F)13 EMBED Equation.3 1415 =
·13 EMBED Equation.3 1415.


3.32. Калориметрические измерения денатурационных изменений в белках
Денатурацию рассматривают как мономолекулярную реакцию перехода из нативного состояния белка (N) в денатурированное (Д):
N Д
В калориметрии измеряют
·Н или
·Ср, сопровождающие эти переходы. В соответствии с формулой Киргоффа изменение энтальпии при плавлении:

·Н = 13 EMBED Equation.3 1415, где Cp(T)
· теплоёмкость при постоянном давлении.
В обычных измерениях подводят теплоту к образцу: 13 EMBED Equation.3 1415 и регистрируют скорость повышения температуры образца 13 EMBED Equation.3 1415 (13 EMBED Equation.3 1415).
Чувствительность микрокалориметров высокая, примерно 10-7 Вт.
13 EMBED PBrush 1415
13 EMBED PBrush 1415

·Сpd – это разность теплоемкостей белка в нативном и денатурированном состояниях при температуре перехода Td.

·Нден = 13 EMBED Equation.3 1415 - 13 EMBED Equation.3 1415 - 13 EMBED Equation.3 1415 =
·Нd - 13 EMBED Equation.3 1415,
где
·Нd
· молярная энтальпия перехода.
Для энтропии:

·Sден = 13 EMBED Equation.3 1415 - 13 EMBED Equation.3 1415.
Свободная энергия Гиббса для процесса денатурации (
·Fден ) запишется в виде:

·Fден =
·Нден - T1
·Sден =
·Нd13 EMBED Equation.3 1415 - 13 EMBED Equation.3 1415.


МИОГЛОБИН
Миоглобин - сложный белок третьего уровня структурной организации. Состоит из одной полипептидной цепи (153 остатка). Третичная структура белка образована, главным образом, альфа-спиралями вторичной структуры, на которые приходится около 70 процентов АКО, остальные - на повороты и начальный и конечный участки. Белок содержит в себе так называемый ГЕМ- комплекс порфирина и иона железа в степени окисления +2.

Ион железа встроен в кольцо порфирина таким образом, что четыре координационные связи из шести затрачены на образование связей с атомами азота, еще одна связана с азотом имидазольного остатка ГИС полипептидной цепи (проксимальный Гистидин F8), а другая - также с имидазольным остатком другого ГИС (дистальный ГИС Е7). Молекула кислорода присоединяется между остатком дистального ГИС и железом. Изменения степени окисления железа при этом не происходит. Порфириновое кольцо (ГЕМ) частично погружено в молекулу белка. Молекула кислорода присоединяется к нему, входя как бы через открывающуюся дверцу. Пока остается неясным, дожидается молекула кислорода случайного открывания двери, или существует какой-то механизм, пропускающий кислород к нему.

Миоглобин сосредоточен, главным образом, в мышцах и его главной функцией является хранение кислорода. Скорость насыщения миоглобина кислородом намного превышает таковую для гемоглобина. Миоглобин мало приспособлен для транспортировки кислорода из легких в ткани, поскольку скорость отдачи кислорода в тканях невелика (при давлении 1 мм рт. ст. примерно половина миоглобина все еще не отдает кислород).
Вопросы транспортировки кислорода решаются при участии гемоглобина.

ГЕМОГЛОБИН
Гемоглобин представляет собой белок четвертичной структуры, состоящий из двух пар субъединиц альфа- (141 АКО) и бета- (147 АКО- аминокислотных остатков). Субъединицы миоглобина и гемоглобина очень сходны между собой, как весьма сходна и третичная структура обоих белков.
Главное отличие гемоглобина от миоглобина заключается в проявлении особого рода эффектов - кооперативных, влияющих на скорости присоединения- отсоединения молекул кислорода. Каждая молекула гемоглобина способна присоединять и переносить четыре молекулы кислорода, при этом кооперативность проявляется в том, что как присоединение, так и отсоединение каждой последующей молекулы кислорода облегчается в результате структурных изменений в конформации молекулы, которых у гемоглобина имеется две - оксигенированная и дезоксигенированная. Промежуточные состояния нестабильны. Предполагается следующий механизм кооперативного эффекта. Присоединение первой молекулы кислорода приводит тому, что атом железа смещается от своего места примерно на 0,4-0,6 ангстрем, вызывая изменения конформации субъединицы. Изменившаяся конформация по аллостерическому эффекту облегчает присоединение кислорода к другой субъединице и т.д. Это позволяет максимально ускорить процесс присоединения кислорода в легких (РО2 = 100 мм рт. ст.). При переносе оксигенированного гемоглобина в капилляры тканей (РО2 = 5 мм рт. ст.) отсоединение молекул кислорода протекает также быстро, по кооперативному эффекту. Известны, впрочем, и химические регуляторы скорости и полноты присоединения кислорода. К ним, в частности, относится 2,3- дифосфоглицериновая кислота. Она облегчает присоединение кислорода у организмов, обитающих в высокогорных районах.

Транспорт газов

Большинство тканей для поддержания своего окислительного потенциала постоянно снабжаются молекулярным кислородом (О2). Из-за плохой растворимости О2 связывается и транспортируется в крови гемоглобином. Свойства Нb таковы, что он не только обеспечивает транспорт кислорода, но и создает благоприятные условия для связывания О2 в легких и передачи его тканям.
Если фермент реагирует на эффекторы (субстрат, активатор или ингибитор) повышением или понижением активности благодаря конформационным изменениям, то в этом случае говорят об аллостерической регуляции. Аллостерические ферменты являются, как правило, олигомерами, состоящими из нескольких субъединиц, которые взаимно влияют друг на друга.
Гемоглобин не является ферментом и имеет все признаки аллостерического белка. Он связывает и отдает кислород неизмененным. Его эффектором служит кислород, который как положительный гомотропный эффектор с повышением концентрации увеличивает константу связывания. Кривая насыщения гемоглобина О2 имеет ярко выраженный сигмоидальный характер (2, кривая 2). Для сравнения приведена не сигмоидальная кривая насыщения мышечного белка миоглобина (2, кривая 1). Миоглобин похож по структуре на гемоглобины, но, являясь мономером, не обнаруживает аллостерических свойств.
Гемоглобин участвует также в транспорте диоксида углерода (СО2) от тканей к легким. Примерно 5% образующегося в тканях СО2 ковалентно связываются с N-концом гемоглобина и транспортируется как карбамино-НЬ. Около 90% СО2 превращается в более растворимый гидрокарбонат (НСОз-). В легких из него снова регенерируется СО2, который выводится легкими.
Высокая концентрация СО2, существующая в тканях с интенсивным обменом веществ, увеличивает локальную концентрацию Н+ и снижает сродство гемоглобина к О2 (эффект Бора). Это ведет к усиленному освобождению О2 и вместе с тем к лучшему снабжению кислородом.
Без катализатора равновесие между СО2 и НСОз- устанавливается относительно медленно. В эритроцитах эта реакция ускоряется карбонат-дегидратазой («карбоангидразой»), присутствующей в достаточно высокой концентрации.


ГУМОРАЛЬНЫЙ ИММУНИТЕТ
ГАММАГЛОБУЛИНЫ
Иммунитет – это комплекс реакций, направленных на защиту организма от инфекционных агентов и веществ, отличающихся биологическими (антигенными) свойствами.
Иммунный ответ состоит из сложного ряда клеточных взаимодействий, активируемых попаданием в организм чужеродного антигенного материала. После обработки макрофагами, антиген предоставляется лимфоцитам, которые являются главными клетками исполнительного звена иммунной системы. Активация лимфоцита антигеном приводит к пролиферации и трансформации лимфоцитов. Существует два главных типа иммунного ответа:
Клеточный иммунитет – это функция T-лимфоцитов; при клеточном иммунитете происходит образование эффекторных клеток – T-киллеров, способных уничтожать клетки, имеющие антигенную структуру, путем прямой цитотоксичности и путем синтеза определенных веществ, названных лимфокинами, которые участвуют в процессах взаимодействия клеток (макрофагов, T-клеток, B-клеток) при иммунном ответе. Кроме того, два подтипа T-клеток участвуют в регуляции иммунного ответа: T-хелперы усиливают иммунный ответ; T-супрессоры оказывают противоположное влияние.
Гуморальный иммунитет – это функция B-клеток и характеризуется преобразованием B-клеток в плазматические клетки, секретирующие иммуноглобулины (антитела), которые имеют специфическую активность против внедрившегося антигена.


Антитела - это гаммаглобулины, способные соединяться с гомологичными антигенами, вызывать лизис микробов, фиксировать комплемент, проникать через физиологические барьеры. Согласно международной классификации антитела называют иммуноглобулинами и обозначают символом Ig.
Иммуноглобулины представляют собой молекулы белка, образованные комбинациями аминокислот (всего 12 видов). Они имеют небольшую рецепторную группу, с помощью которой прочно соединяются со специфическими антигенами. Большинство молекул иммуноглобулинов составлены из двух тяжелых (H) цепей и двух легких (L) цепей, соединенных дисульфидными связями. Легкие цепи состоят или из двух k цепей, или из двух l цепей. Тяжелые цепи могут быть одного из пяти классов IgA, IgG, IgM, IgD, и IgE - 5 видов иммуноглобулинов. Существует несколько подклассов тяжелых цепей (изотипы). Эти различные цепи иммуноглобулинов являются антигенами для животных и имеют отличающиеся антигенные детерминанты, поэтому, при введении их животным, антитела, производимые против них, могут использоваться для распознавания и определения различных типов легких цепей и классов тяжелых цепей у человека.

Классы иммуноглобулинов

Признак
IgG
IgM
IgA
IgD
IgE

Тяжелая цепь

·

·

·

·

·

Подклассы
4
2
2
-
-

Легкая цепь

· или
·

· или
·

· или
·

· или
·

· или
·

Молекулярный вес
150 000
900 000
160 000
180 000
190 000

Валентность
2
10
2
2
2

Фикс комплемента
+
+
-
-
-

Трансплацентарн.передача
+
-
-
-
-

Kонц. в крови (мг/мл)
13-15
0.5
1.9
0.03
0.0003

Срок полураспада (дней)
14-21
5
5
3
1


Каждая цепь имеет постоянный и вариабельный участок. Постоянный участок остается постоянным в последовательности аминокислот и антигенности в пределах данного класса иммуноглобулинов; вариабельный участок, напротив, характеризуется большой непостоянностью последовательности аминокислот. Именно в вариабельной части цепи происходит реакция соединения с антигеном.

Рис. 1 Строение иммуноглобулинов (IgG)

Каждая молекула IgG состоит из двух соединенных цепей, которые формируют два антигенсвязывающих участка. На вариабельном участке каждой цепи имеются гипервариабильные участки – три в легких цепях и четыре в тяжелых цепях. Разновидности последовательности аминокислот в этих гипервариабильных участках определяют специфичность антитела. При определенных условиях эти гипервариабильные области могут также выступать в роли антигенов (идиотипы). Антитело против идиотипов, т.е. производимое против гипервариабильной области антител, имеет ограниченный диапазон реактивности и соединяется только с молекулами иммуноглобулина, имеющими данную гипервариабильную область. В сущности, реактивность антител против идиотипов ограничена исключительно специфическими антителами, полученными из единственного клона. Хотя вышеописанное относится строго к IgG, другие классы иммуноглобулинов имеют такую же основную структуру, за исключением того, что IgM является пентамером (т.е. состоит из 5 основных единиц (молекул), связанных в области Fc-концов), а IgA обычно существует как димер.
IgD и IgE имеют сходную структуру. IgA – димер, а IgM – пентамер. Антиген-связывающие места формируются концами тяжелой и легкой цепей; каждая молекула IgG имеет два места связывания. При энзиматическом расщеплении образуются следующие фрагменты: Fc-фрагмент содержит участки обеих постоянных частей; Fab-фрагмент содержит легкую и часть тяжелой цепи с одним антиген-связывающим участком. F(ab)’2-фрагмент состоит из двух связанных между собой Fab-фрагментов. Н - область «вилки»; HV,LV - вариабельные концы тяжелой и легкой цепей; HC, LC - постоянные концы тяжелой и легкой цепей.
Постоянный участок каждой молекулы иммуноглобулина имеет рецепторы для комплемента, а также имеется на Fc-фрагменте участок, который связывается с клетками, имеющими Fc-рецепторы (что необходимо для осуществления клеточного иммунитета). Унаследованные антигенные различия между тяжелыми цепями составляют аллотипы. Молекулы иммуноглобулинов можно разбить на части различными протеолитическими ферментами. При воздействии папаина молекула разделяется в области расхождения тяжелых цепей (“вилки”) на два Fab-фрагмента и один Fc-фрагмент (кристаллизующийся). Пепсин разрывает молекулу на F(ab)’2-фрагмент и Fc-фрагмент. Fc-фрагмент представляет собой постоянный участок; отсутствие изменяемости последовательности аминокислот – главная причина возможности кристаллизации данного фрагмента. Fab и F(ab)’2-фрагменты несут один и два антиген-связывающих участка соответственно. Fc-фрагмент несет специфические антигены, включая те, которые определяют иммунологическое различие пяти главных классов антител. Участок фиксации комплемента также расположен на Fc-фрагменте. Метод ферментативного расщепления имеет историческое значение в процессе выяснения структуры иммуноглобулинов.
IgA в основном участвуют в реализации иммунных реакций на поверхности слизистых оболочек. Поэтому им принадлежит важная роль в защите организма от микробов, которые проникают в него через слизистые оболочки.
IgM относятся к макроглобулинам. Они нейтрализуют микробов в крови. Данная реакция протекает с участием комплемента. Обычно для разрушения одной микробной клетки достаточно одной молекулы IgM. Подобного эффекта можно достигнуть и с помощью IgG. Но в этом случае должно участвовать не менее 2 молекул антител или даже больше.
IgG являются преимущественно антитоксинами и составляют основную часть из всего количества циркулирующих в крови антител. Значение иммуноглобулинов D до настоящего времени не раскрыто. Их также называют реагинами и цитофильными антителами. Последнее их название связано с тем, что они обладают сродством к тучным клеткам организма. Адсорбируясь на этих клетках, IgE, как правило, не циркулируют в крови или же находятся в ней в весьма незначительном количестве. В таком случае при проникновении в организм антигенов, к которым уже имеются антитела, относящиеся к IgE, иммунная реакция с их участием протекает не в крови, а на поверхности тучных клеток и приводит к их разрушению. Высвобождающиеся при этом в большом количестве гистамин, серотонин, брадикинин и другие биологические вещества, которыми богаты тучные клетки, обусловливают картину реакции немедленного типа, классическим проявлением которой является анафилактический шок.

Синтез иммуноглобулинов
Иммуноглобулины синтезируются плазматическими клетками, которые образуются из трансформированных, стимулированных антигеном B-лимфоцитов (B-иммунобластов). Все молекулы иммуноглобулинов, синтезированных отдельной плазматической клеткой, идентичны и имеют специфическую реактивность против единственной антигенной детерминанты. Аналогично, все плазматические клетки, полученные путем трансформации и пролиферации одного B-лимфоцита-предшественника, идентичны; то есть, они составляют клон. Молекулы иммуноглобулинов, синтезированные клетками различных клонов плазматических клеток, имеют различные последовательности аминокислот, что обусловливает различную третичную структуру молекул и придает иную специфичность антителу, то есть, они реагируют с разными антигенами. Эти различия в последовательности аминокислот происходят в так называемом V (вариабельном, переменном) участке молекулы иммуноглобулина.
Регулирование производства антител: производство антител начинается после активации B-клеток антигеном. Максимальная концентрация антител в сыворотке наблюдается с 1 по 2 неделю и затем начинает снижаться. Непрерывное присутствие свободного антигена поддерживает ответ до тех пор, пока увеличение уровня антител не приведет к усиленному удалению антигена и, таким образом, прекращению стимуляции B-клеток. Существуют также более тонкие механизмы регуляции синтеза иммуноглобулинов. T-хелперы (CD4-позитивные) играют важную роль в регуляции ответа В-клеток на большое количество антигенов и их постоянное присутствие увеличивает производство антител. Этот эффект возникает благодаря высвобождению лимфокинов. T-супрессоры (CD8-позитивные) оказывают противоположное влияние, вызывая снижение иммунного ответа; сильное подавление ответа может быть одним из механизмов, лежащих в основе толерантности. Одним из дополнительных регулирующих механизмов является выработка анти-идиотипов (т.е. антител против собственных антител (аутоантител)). Предполагается, что при иммунном ответе производство специфического антитела обязательно сопровождается производством второго антитела (анти-идиотипного) со специфичностью против вариабельных (V) последовательностей (идиотипов или антиген-связывающих участков) первого антитела. Анти-идиотипное антитело способно к распознаванию идиотипов на антигенном рецепторе B-клеток (который построен из иммуноглобулина, идентичного по строению идиотипу первого антитела), таким образом, оно конкурирует с антигеном и служит для ингибирования активации B-клетки.
Следует отметить, что иммуноглобулины синтезируются не только при инфекционных заболеваниях. Они продуцируются непрерывно у каждого здорового человека. В результате в организме людей имеется определенный уровень различных видов антител, практически против всех микробных антигенов, в том числе и против тех возбудителей, с которыми они никогда не встречались. Это объясняется тем, что способность организма к синтезу антител выработалась у людей в процессе эволюционного развития и является генетически обусловленной. Эти антитела (иммуноглобулины) носят название нормальных. Нормальные антитела играют большую роль в защите организма от инфекции в момент внедрения возбудителей в организм, а также в начальный период болезни (т. е. тогда, когда иммунные реакции на инфекцию еще не успели сформироваться). Обычно первые проявления инфекционного иммунитета появляются не раньше 4-го дня с момента заболевания и достигают максимальной выраженности на 14 сутки и позже.
Заслуживает отдельного внимания тот факт, что продуцируемые подэпителиально расположенными лимфоцитами антитела секретируются не в кровь, а на поверхность слизистых оболочек. В то же время циркулирующие в крови антитела в норме не проникают на поверхность слизистых оболочек. Следовательно, лимфоидные клетки слизистых оболочек в значительной мере функционируют автономно. Секретируемые ими антитела образуют первую линию защиты организма от возбудителей инфекционных заболеваний.
Антитела слизистых оболочек представлены в основном IgA. Только на поверхности миндалин, а также слизистой нижних отделов респираторного тракта, наряду с IgA, имеется довольно большая концентрация IgG. На модели стрептококковой инфекции установлено, что IgA блокируют рецепторы микробов, с помощью которых последние фиксируются к эпителиальным клеткам и получают условия для размножения. Биологическое значение IgG определяется их выраженным опсонизирующим эффектом. IgA не секретируются только у новорожденных детей.



МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ
МЫШЕЧНОГО СОКРАЩЕНИЯ

МЫШЕЧНОЕ СОКРАЩЕНИЕ

Модель скользящих нитей
Скелетные мышцы состоят из многоядерных клеток, связанных возбудимой плазматической мембраной, по которой приходит нервный импульс, инициирующий сокращение мышцы. Мышечные клетки состоят из множества сократительных волокон - миофибрилл, расположенных параллельно друг другу. Структурно-функциональными единицами миофибрилл являются саркомеры, которые располагаются вдоль мышечных волокон через каждые 2,3 мкм. На электронно-микроскопических снимках продольного среза мышечной ткани видно, что саркомер состоит из параллельных рядов толстых и тонких нитей. Взаимное расположение толстых и тонких нитей саркомера схематически показано на рис. 1,а. Вертикальные темные линии Z соответствуют специальным структурным белкам, разделяющим миофибриллы на саркомеры. Между ними видны горизонтальные нити сократительного аппарата. От Z-линий отходят тонкие нити, которым на электронно-микроскопических снимках соответствуют светлые полосы I. В центральной части саркомера расположены толстые нити, которым соответствуют темные полосы А. В середине каждой полосы А видна более светлая полоса Н. Наличие двух темных участков полосы А определяется тем, что в этих зонах толстые нити перекрываются с тонкими нитями. Более светлая полоса (зона Н) соответствует участку саркомера, где толстые нити не перекрываются с тонкими нитями.

Рис. 1. Схематическое изображение строения саркомеров мышечного волокна: а - продольный разрез, б - поперечный разрез в области пересечения толстых и тонких нитей, в - изменение длины саркомера в результате движения толстых и тонких нитей.

Толстые нити, имеющие диаметр 15 нм, состоят главным образом из молекул миозина. Тонкие нити имеют диаметр 9 нм. Они содержат белки трех типов: актин, тропомиозин и тропониновый комплекс. Если посмотреть на поперечный срез саркомера в области, где соседствуют толстые и тонкие нити (темный участок полосы А), то можно увидеть, что каждая тонкая нить окружена тремя толстыми нитями, а каждая толстая нить окружена шестью тонкими нитями (рис. 1,б ). Толстые и тонкие нити взаимодействуют друг с другом с помощью поперечных мостиков длиной около 13 нм, которые через регулярные промежутки выходят из толстых нитей и заполняют щели между соседними толстыми и тонкими нитями.
При сокращении мышцы ее длина укорачивается на одну треть. Как это происходит, стало понятно в начале 50-х годов, когда Эндрю и Хью Хаксли, Р. Нидергерк и Ж. Хэнсон на основании исследования структуры мышечных волокон методами рентгеноструктурного анализа, оптической и электронной микроскопии независимо пришли к модели скользящих нитей. В основе этой модели лежат следующие факты:
1) при сокращении мышцы длины толстых и тонких нитей саркомера не изменяются;
2) саркомер укорачивается за счет перекрывания толстых и тонких нитей, которые скользят друг относительно друга во время сокращения мышцы. Это проявляется в том, что при сокращении мышцы полосы H и I укорачиваются (рис. 1, в);
3) сила, развиваемая мышцей, создается в процессе движения соседних нитей.
Скольжение толстых и тонких нитей друг относительно друга совершается за счет энергии, выделяемой при гидролизе АТР до ADP и неорганического фосфата (Pi). Открытие АТРазной активности миозина было сделано в 1939 году супругами В.А. Энгельгардтом и М.Н. Любимовой, которые показали, что препараты миозина способны расщеплять АТР на ADP и Pi. Ими было также показано, что добавление АТР к белковому препарату, состоящему из нитей миозина, влияет на его механические свойства. Вскоре после этого А. Стент-Дьорди (удостоенный впоследствии Нобелевской премии) установил, что в растворе актин и миозин образуют так называемый актомиозиновый комплекс. Примечательно, что при отсутствии актина миозин плохо гидролизует АТР. В присутствии актина АТРазная активность миозина возрастает приблизительно в 200 раз.

Строение толстых и тонких нитей мышечного волокна
Элементарной структурной единицей толстых нитей саркомера является молекула миозина. Миозин скелетных мышц (миозин класса II) является довольно крупным белком, состоящим из шести полипептидных цепей. Эта молекула представляет собой димер, образованный из двух сплетенных друг с другом одинаковых мономеров миозина (рис. 2,а). Каждый из этих мономеров состоит из одной тяжелой цепи (молекулярная масса 230 кДа) и двух легких цепей (молекулярная масса 20 кДа). Тяжелая цепь миозина неоднородна по своему строению. На одном конце ее полипептидная цепь свернута в виде глобулы, образующей своеобразную "головку" миозина (фрагмент S1). С помощью более тонкой шейки (фрагмент S2) головка миозина соединяется с длинным хвостом, который образован протяженной полипептидной цепью, уложенной в виде вытянутой a-спирали. Хвосты двух мономерных единиц миозина сплетены друг с другом и образуют вытянутый стержень длиной 170 нм и толщиной 2 нм. Две подвижные головки, выступающие вбок из этого стержня (рис. 2,а), выполняют моторные функции - в ходе работы сократительного аппарата наклон головок миозина относительно его хвоста изменяется, в результате чего обеспечивается взаимодействие миозина с актином.

Рис. 2. Строение молекулы миозина (а) и тонкой нити (б). В расслабленной мышце тропомиозин препятствует взаимодействию головки миозина с актином. Внизу (в) схематически показано различие геометрических характеристик моторных участков молекул миозина трех разных типов.

Моторный фрагмент миозина (S1) непосредственно взаимодействует с тонкой актиновой нитью. Фрагмент S1 включает в себя каталитический центр, с которым связывается молекула АТР и где происходит ее гидролиз до ADP и Pi . В ходе реакции гидролиза АТР выделяется энергия, за счет которой работает миозин. В 1993 году Айвэн Рэймент и его коллеги методом рентгеноструктурного анализа установили пространственное строение головки миозина. Согласно их данным, фрагмент S1 представляет собой глобулу размером 16,5 x 6,5 x 4 нм. На картине трехмерного строения S1, полученной с разрешением 2,8 Е, четко видны оба функционально важных участка: место посадки АТР и выступающий наружу участок полипептидной цепи, который непосредственно взаимодействует с актином. Вращательная подвижность головки миозина обеспечивается за счет шарниров, которые представляют собой гибкие участки полипептидной цепи. Один из них находится в месте соединения фрагментов S1 и S2, другой расположен между фрагментом S2 и хвостом миозина (рис. 2,а). Наличие молекулярных шарниров дает возможность фрагменту S1 присоединяться и отсоединяться от нити актина, а также изменять свою ориентацию в ходе сократительного цикла (рис. 3, 4).

Рис. 3. Схема, показывающая изменение положения головки миозина (S1) относительно тонкой нити в ходе структурных перестроек актомиозинового комплекса, которые приводят к возникновению силы, тянущей хвост миозина.

Рис. 4. Цикл структурных превращений актомиозинового комплекса, приводящих к смещению молекулы миозина вдоль нити актина.

Функционально важным звеном молекулы миозина является ее регуляторный участок, расположенный в области шейки, соединяющей каталитическую головку с хвостом молекулы миозина. Шейка образована альфа-спиралью полипептидной цепи длиной 8-9 нм, которая окружена двумя легкими полипептидными цепями S2. Шейка, по сути дела, является рычагом, через который структурные изменения в каталитическом центре передаются хвостовой части молекулы миозина. Легкие цепи придают этому рычагу необходимую жесткость и выполняют важную роль в регуляции каталитической активности миозина.
Молекулы миозина в мышцах работают не поодиночке, а образуют сравнительно толстые жгуты из сплетенных друг с другом димеров. В саркомерах поперечнополосатых мышц каждая толстая нить состоит приблизительно из 300 сплетенных димеров миозина. С обоих концов толстой нити выступают многочисленные подвижные мостики, которые могут связываться с окружающими их тонкими нитями актина (рис. 1,б).
Тонкие нити мышечных волокон состоят из нескольких белков (рис. 2,б). Основной составляющей тонких нитей является актин, присутствующий в них в форме вытянутых полимерных нитей. Эти нити образованы из мономеров глобулярного белка (G-актин), имеющего молекулярную массу 42 кДа. В растворе мономеры G-актина могут связываться друг с другом, образуя вытянутые линейные полимеры (F-актин) диаметром 6-7 нм, называемые микрофиламентами. Тонкие нити сократительного аппарата мышц, с которыми взаимодействуют миозиновые мостики, наряду с актином содержат также другие белки - тропомиозин и три белка тропонинового комплекса (рис. 2,б), которые играют решающую роль в регуляции взаимодействия миозина с актином. По своей массе они составляют приблизительно треть от всей массы тонких нитей. Молекула тропомиозина состоит из двух вытянутых альфа-спиралей длиной около 38 нм, инкрустированных в гораздо более протяженную нить F-актина. Тропониновый комплекс состоит из трех белков (TnC, TnI и TnT). Белок TnI непосредственно связан с актином, а белок TnT - с тропомиозином. Белок TnC принадлежит к классу регуляторных белков, называемых кальмодулинами. Этот белок активируется при его взаимодействии с ионами Ca2+. Тропониновые комплексы расположены вдоль тонкой нити через регулярные интервалы, длина которых составляет 38,5 нм, что соответствует длине молекулы тропомиозина.

Элементарный акт мышечного сокращения
Молекулы миозина и актина, взаимодействуя друг с другом, образуют актомиозиновый комплекс, в котором и разыгрываются основные события, приводящие к созданию силы, вызывающей сокращение мышцы. В покоящейся мышце миозиновые мостики не проявляют ATP-азной активности, поскольку тропомиозин и белки тропонинового комплекса препятствуют взаимодействию головок миозина с нитью актина. Активация актомиозинового комплекса инициируется ионами Ca2+. Концентрация ионов Ca2+ в цитоплазме клеток покоящейся (расслабленной) мышцы понижена (< 0,1 мкМ). Это обусловлено работой кальциевого насоса саркоплазматического ретикулума, который использует энергию молекул АТР для перекачивания ионов Ca2+ из цитоплазмы в специальные цистерны. Под действием нервного импульса ионы Ca2+ выходят из кальциевых цистерн и связываются с TnC, регуляторным белком тропонинового комплекса. В результате этого запускается цепь конформационных превращений остальных белков тропонинового комплекса, что в конечном итоге вызывает изменение положения тропомиозина относительно нити F-актина. Таким образом, благодаря последовательным структурным перестройкам белков тонкой нити (тропонин-тропомиозин-актин), инициированным повышением концентрации ионов Ca2+, головка миозина приобретает возможность связываться с актином.
Тянущая сила, которая вызывает движение молекул миозина вдоль нитей актина, возникает за счет структурных изменений, происходящих в каталитическом центре миозина после гидролиза молекулы AТP. Работа миозина напоминает функционирование механического устройства, в котором головка и шейка миозинового мостика играют роль своеобразного рычага, позволяющего существенно увеличить амплитуду смещения миозинового хвоста. Этот рычаг одним из своих концов опирается на актиновую нить, другой конец рычага соединен с хвостом молекулы миозина (рис. 3). После гидролиза АТР и диссоциации Pi и ADP из каталитического центра в головке миозина происходят структурные перестройки, в результате которых зацепленная за нить актина головка миозина поворачивается, увлекая за собой хвост миозина (см. рис. 3). Так возникает сила, вызывающая скольжение толстых нитей миозина вдоль нитей актина.
Структурные перестройки, которые происходят в каталитическом центре фрагмента S1, характеризуются сравнительно небольшими смещениями атомов в активном центре. Однако эти изменения вызывают значительное перемещение хвоста миозина (3-5 нм для миозина скелетных мышц). Это происходит в результате того, что рычаг, передающий смещение от каталитического центра к хвосту миозина, имеет неравные плечи - точка опоры рычага находится существенно ближе к активному центру моторного фрагмента S1, чем конец шейки миозинового мостика, соединяющийся с хвостом миозиновой нити (см. рис. 3). Интересно, что у молекул миозина, принадлежащих различным классам, амплитуда смещения хвоста за один рабочий шаг может заметно отличаться. Это определяется тем, что длина рычага у разных форм миозина неодинакова (рис. 2,в). Так, например, у молекул миозина V, выполняющего функции транспортного белка, шейка в несколько раз длиннее, чем у миозина скелетных мышц (миозина II). Поворот головки миозина V приводит к смещению хвоста на расстояние 20 нм, что приблизительно в пять раз больше рабочего шага миозина скелетных мышц.

Рабочий цикл актомиозинового комплекса
В процессе сокращения мышцы каждая головка миозина совершает многократные повороты, периодически изменяя угол своего наклона относительно нити актина. В расслабленной мышце миозиновый мостик отделен от актиновой цепи (рис. 4, состояния 1 и 2). Свободная головка миозина обладает определенной степенью подвижности; за счет шарниров, расположенных в местах соединения фрагментов S1 и S2, угол ее наклона относительно хвоста может изменяться. При связывании молекулы АТР с активным центром миозина его головка остается отсоединенной от актина (рис. 4, состояние 1). В каталитическом центре миозина молекула АТР расщепляется на ADP и Pi (рис. 4, переход "состояние 1" ( "состояние 2"). Образующиеся при этом молекулы ADP и Pi остаются прочно связанными с каталитическим центром. Однако вслед за гидролизом молекулы АТР происходит присоединение головки миозина к актиновой нити: сначала образуется слабая связь (состояние 3), затем возникает более прочная связь (состояние 4). При этом вращательная подвижность миозинового мостика становится ограниченной. Прочное связывание головки миозина с актином инициирует освобождение фосфата Рi из активного центра (переход "состояние 4 " ("состояние 5 "). Изменения, происходящие в каталитическом центре после диссоциации Рi , вызывают дополнительное увеличение сродства миозина к актину. В результате этого появляется сила, вызывающая поворот мостика в сторону хвоста (переход "состояние 5 "( "состояние 6 "). Вместе с поворотом мостика смещается вдоль нити актина хвост миозина, который соединен с мостиком с помощью "шарнирного" сочленения. Благодаря продольному смещению хвоста миозина происходит сокращение длины саркомера. После смещения головки миозина, инициированного диссоциацией фосфата, молекула ADP диссоциирует из каталитического центра, а ее место занимает новая молекула АТР (переход "состояние 7 "( "состояние 1 "). Это превращение сопровождается отсоединением головки миозина от актина, завершающим цикл структурных преобразований, происходящих в активном центре миозина. В результате многократно повторяющихся циклов гидролиза АТР возникает направленное скольжение нитей миозина и актина друг относительно друга.

Кооперативная и "индивидуальная трудовая деятельность" миозина
В мышечных волокнах молекулы миозина работают не индивидуально, а кооперативно, в составе крупных макромолекулярных ансамблей. Как мы уже отмечали, в миофибриллах молекулы миозина собраны в жгуты, из которых выступает множество миозиновых мостиков в сторону нитей актина (см. рис. 1). Установлено, что во время сокращения мышцы лишь сравнительно небольшая часть мостиков (10-15%) одновременно находится в контакте с окружающими их нитями актина. Это значит, что каждый из мостиков большую часть времени проводит в свободном состоянии, когда он непосредственно не создает тянущей силы. При этом молекулы миозина, у которых мостики отсоединены от актиновых нитей, во время сокращения саркомера перемещаются вместе с остальными молекулами миозинового жгута. Такое движение свободных (несвязанных) мостиков происходит за счет работы других мостиков, которые в это время непосредственно взаимодействуют с нитями актина. Это значит, что каждый мостик не просто шагает вдоль нити, равномерно ступая между соседними звеньями актиновой цепи, а как бы прыгает вдоль нее. Длина таких прыжков составляет 36-38 нм (рис. 5, а), что многократно превышает размер индивидуального шага (Ds ~ 4 нм). Таким образом, сокращение мышечных волокон обеспечивается за счет кооперативной работы большого количества молекул миозина, собранных в толстые нити.

Рис. 5. Схема перемещения молекулы миозина вдоль нити актина.

Движение пучка молекул миозина вдоль нити актина можно сравнить с перетаскиванием бревна большой группой работников, из которых лишь небольшая часть тружеников (10-15%) опирается ногами на землю, в то время как остальные работники в это время висят на бревне, не касаясь земли. Подобно мостикам миозина, работники периодически меняются ролями, однако в каждый момент времени активно работает лишь небольшая часть тружеников, несущих бревно вместе с висящими на нем товарищами (рис. 5, б)
Кооперативный способ работы молекул миозина, характерный для скелетных мышц, встречается также в некоторых других сократительных системах. Известна, однако, большая группа моторных белков, которые работают индивидуально; цикл их механохимических превращений протекает в равномерном режиме, а перемещение происходит отдельными шагами, без длинных прыжков, характерных для миозина скелетных мышц. К таким молекулярным моторам относятся некоторые классы внемышечных миозинов, работающих в клетках животных и растений в качестве перевозчиков мембранных частиц. Простейшие молекулы миозина, выполняющие работу индивидуальных переносчиков (например, миозин класса I), имеют глобулярную головку и короткий хвост. Двигаясь вдоль нити актина цитоскелета, молекула-переносчик может тащить за собой органеллу, к которой она прикрепляется своим хвостом. Таким способом молекулы миозина обеспечивают работу транспортной системы, предназначенной для переноса различных частиц и органелл в клетке.
Движение органелл легко наблюдать в некоторых крупных клетках, таких, как гигантские клетки зеленой водоросли Nitella. Интересна структурная организация транспортной системы, обеспечивающей циркуляцию цитоплазмы в клетках зеленых водорослей. На периферии клетки, рядом с плазматической мембраной, находится слой хлоропластов. Хлоропласты примыкают к так называемому кортикальному слою, который содержит пучки актиновых нитей. Между неподвижными кортикальным слоем и мембраной вакуоли расположен слой движущейся цитоплазмы, в котором находятся ядра, митохондрии и другие органеллы. Молекулы миозина совершают круговое движения внутри клетки, равномерно перемещаясь вдоль нитей актина и увлекая за собой сравнительно крупные органеллы (митохондрии, эндоплазматический ретикулум, ядра и др.). Скорость перемещения органелл составляет 50-75 мкм/с. Благодаря такому движению в гигантской клетке водоросли возникает циркуляция цитоплазмы, за счет которой ее содержимое перемешивается гораздо быстрее, чем это происходило бы путем простой диффузии. Гигантские клетки зеленых водорослей достигают длины 2-5 см, поэтому без принудительной циркуляции цитоплазмы молекулам белков потребовалось бы около 10 дней для диффузии с одного конца клетки на другой.
Глава 4. Физика ферментов.

4.1. Общая характеристика действия ферментов (определения)
1. Фермент (Е) это белок, увеличивающий скорость биохимических реакций, т.е. работающий как катализатор (увеличивает скорость до 1010 раз).
2. Субстрат (S)это молекула, которая после взаимодействия с ферментом Е превращается в продукт Р.
3. Активный центр фермента это особый участок молекулы белка, с которым связывается субстрат S с образованием ФСК Е-S (почти всегда он построен из нескольких пространственно-сблизившихся АК-остатков, т.к. в линейной последовательности они могут быть расположены далеко друг от друга). Формирование E-S комплекса осуществляется слабыми взаимодействиями (Н-связями, солевыми мостиками, гидрофобными взаимодействиями), но иногда и ковалентными связями (сериновые протеазы образуют промежуточный продукт с помощью ковалентной связи).
4. Специфичность фермента это его способность отличить свой собственный (истинный) субстрат от других родственных молекул. Избирательность обусловлена высокой специфичностью фермент-субстратных взаимодействий. Ранняя модель этого взаимодействия "замок (Е) - ключ (S)", аналог которой был предложен Фишером 100 лет назад: "к ферменту (замку) подходит только свой субстрат (ключ)", была дополнена моделью "индуцированного соответствия" Кошландом в 1959 году. Согласно этой общепризнанной гипотезе, связывание ферментом правильного субстрата индуцирует в белке небольшие конформационные изменения. В результате этих изменений каталитические группы фермента ориентируются таким образом, что становится возможным превращение субстрата в продукт (рис.1). Дальнейшее развитие модели индуцированного соответствия связано с учётом того, что конформация субстрата при связывании с ферментом также может слегка изменяться (Рис.2).

Рис.1. Модель фермент-субстратного взаимодействия “замок (Е)-ключ (S)”.


Рис.2. Индуцированное соответствие и напряжение в молекуле субстрата.

В этом случае говорят о напряжении в молекуле субстрата. Гипотеза о существовании конформационных изменений в ферменте и субстрате при их связывании друг с другом объяснила тот факт, что молекулы, очень похожие по форме на истинный субстрат, могут связываться с ферментом, но не превращаться в продукт, т.е. действуют как ингибиторы. Таким образом, правильный субстратэто больше, чем просто “ключ” к соответствующему “замку”.
Специфичность узнавания у разных ферментов варьирует некоторые ферменты могут катализировать реакцию с участием только одного субстрата, тогда как другие с несколькими химически родственными веществами (формамидаза гидролизует только формамид, а амидаза гидролизует любой алифатический амид).

Рис.3. Структура ферментативных реакций.

5. Положение равновесия реакции не зависит от присутствия или отсутствия фермента в реакционной смеси. Свободная энергия реакции dG0 равна разности свободных энергий S и P и определяет положение равновесия реакции. В присутствии любого катализатора, в том числе и фермента, свободная энергия исходных реагентов (S) и продуктов реакции (P) не изменяется и, следовательно, не изменяется dG0 (Рис.4).
6. Переходное состояние, или активированный комплекс (обозначается Х) это высокоэнергетическая промежуточная структура, которая образуется во время реакции. Разность свободных энергий реагентов (S) и переходного состояния называется свободной энергией активации и обозначается dGА. Скорость реакции зависит от величины dGА: чем она меньше, тем больше скорость реакции (Рис.4).
7. Фермент увеличивает скорость реакции следующими способами:
7.1. понижая свободную энергию переходного состояния путём стабилизации активированного комплекса;
7.2. увеличивая энергию субстрата (S), когда тот связывается с ферментом (E) при образовании ФСК (E-S). В итоге уменьшается разность свободных энергий E-S комплекса и переходного состояния;
7.3. поддерживая микроокружение активного центра (АЦ) в состоянии, отличном от такового в водной среде;
7.4. располагая реагирующие атомы в правильной ориентации, на необходимом расстоянии друг от друга так, чтобы обеспечить оптимальное протекание реакции.


Рис.4. Изменение свободной энергии реакции с катализатором и без него.

8. Ингибиторами называются молекулы, которые, связываясь с ферментом, блокируют какую-то стадию ферментативной реакции. Ингибиторы бывают обратимыми и необратимыми. Обратимое ингибирование подразделяют на конкурентное, неконкурентное и бесконкурентное.
8.1. Конкурентный ингибитор это молекула, похожая на субстрат S настолько, что фермент E не может их различить. В результате конкурентного ингибирования падает концентрация ФСК и, следовательно, скорость реакции. Ингибитор обычно в продукт не превращается.
8.2 Неконкурентный ингибитор это молекула, связывающаяся не с АЦ, а с каким-то другим участком фермента. Поскольку связывание с неконкурентным ингибитором не мешает ферменту образовывать ФСК, то этот ингибитор не понижает концентрацию таких комплексов, а влияет на эффективность превращения S в P.
8.3. Бесконкурентный ингибитор это молекула, которая связывается только с ФСК и не может связываться со свободным ферментом. В односубстратных ферментных системах этот тип ингибирования редок.
8.4. Необратимый ингибитор непрерывно модифицирует молекулы фермента, в результате чего они частично или полностью теряют свою активность.
9. Регуляция активности фермента может осуществляться с помощью активного зимогена (профермента), ковалентной модификации, ингибирования по принципу отрицательной обратной связи, за счёт кооперативных или аллостерических эффектов.
9.1. Зимоген это неактивный предшественник фермента. Чтобы зимоген превратился в активный фермент, какая-то часть его полипептидной цепи должна быть отщеплена. Например, в семействе сериновых протеаз химотрипсиноген и трипсиноген являются зимогенами химотрипсина и трипсина соответственно.
9.2. Ковалентной модификацией называется ковалентное присоединение или отщепление от фермента небольшой химической группы, регулирующее его активность. С помощью модификации либо полностью неактивная форма фермента становится активной, либо, наоборот, полностью активный фермент инактивируется. Например, гликоген-синтетаза, превращающая глюкозу в гликоген, инактивируется после ковалентного присоединения фосфатной группы к боковой цепи одного из сериновых остатков и снова активируется при отщеплении фосфата.
9.3. Ингибирование по принципу отрицательной обратной связи характерно для ферментных систем, в которых субстрат претерпевает несколько последовательных превращений, причём каждая реакция катализируется своим ферментом.


Ингибирование имеет место, если конечный продукт Т блокирует одну из ранних стадий в цепи реакций. А для этого продукт Т должен быть либо структурно похожим на S (т.е. действовать как конкурентный ингибитор), либо связываться с какой-либо другой частью фермента, регулируя т.о. его активность (т.е. выступая в роли неконкурентного ингибитора).
9.4. Кооперативные эффекты характерны для мультимерных белков, в том числе и для ферментов. Если имеет место кооперативный эффект, то кинетические свойства фермента уже не описываются уравнением Михаэлиса-Ментен: график зависимости v от [S] в этом случае представляет собой S-образную кривую, а не гиперболу, а график Лайнунвера-Берка перестаёт быть прямой. При этом небольшое увеличение концентрации [S] будет приводить к значительному возрастанию скорости реакции. Для объяснения этого эффекта были предложены модель МУШ (Моно, Уаймена и Шанжё), или симметричная модель, и последовательная модель (Кошланда, Нимети и Филмера).
В симметричной модели предполагается, что каждый мультимерный ферментный комплекс может существовать в двух разных состояниях с различной четвертичной структурой, причём в каждом состоянии все субъединицы имеют одинаковую третичную структуру. В простейшем случае (рис. 3) рассматриваются два состояния, находящиеся в равновесии друг с другом. В одном из них белок имеет высокое сродство к субстрату (R-состояние), в другом низкое (T-состояние). Добавленный субстрат будет предпочтительно связываться с R-конформерами фермента, а связывание его с Т-конформером приведёт к возникновению напряжения в субъединицах фермента, что вызовет одновременный переход всех субъединиц (мономеров) в R-состояние, в котором напряжение отсутствует. При этом согласованном переходе сохраняется молекулярная симметрия каждой мультимерной молекулы. При дальнейшем добавлении субстрата всё большее количество молекул будет переходить из Т в R-состояние. Такой сдвиг равновесия в присутствии субстрата представляет собой эффект положительной кооперативности. В результате этого эффекта график зависимости v от [S] будет иметь S-образную форму.
В последовательной модели предполагается, что отдельные субъединицы мультимерной молекулы в одно и то же время могут иметь разные третичные структуры. Причём, связывание субстрата одной субъединицей может вызывать изменение третичной структуры соседней субъединицы и в результате увеличивать (положительная кооперативность) или уменьшать (отрицательная кооперативность) их сродство к субстрату.
9.5. Аллостерическая регуляция представляет собой эффект, когда небольшие молекулы (эффекторы), связываясь с ферментом ВНЕ области АЦФ, изменяют скорость реакции. Подобная регуляция может быть гомотропной, когда молекула S, взаимодействуя с Е, изменяет его сродство к молекулам того же S, и гетеротропной, когда сродство к S изменяется при взаимодействии Е с молекулой, не похожей на молекулу S. Гомотропные и гетеротропные эффекторы могут быть ингибиторами или активаторами. Аллостерический активатор, действующий на фермент, описываемый симметричной моделью, будет связываться предпочтительно с R-конфомером, стабилизируя это состояние. В результате активатор будет увеличивать начальную концентрацию R-конфомеров по сравнению с концентрацией Т-конформеров и, следовательно, увеличивать сродство фермента к своему субстрату (положительная кооперативность).
Аллостерический ингибитор, наоборот, предпочтительно связывает и стабилизирует фермент, находящийся в Т-состоянии, вызывая, таким образом, уменьшение сродства фермента к своему субстрату (отрицательная кооперативность).
В целом, роль аллостерических ферментов заключается в том, чтобы расширить (в случае ингибитора), либо сузить (в случае активатора) интервал концентрации субстрата, в котором фермент способен увеличивать скорость реакции.
10. Большая часть ферментов функционирует в комплексах с низкомолекулярными кофакторами, коферментами. Такой фермент в целом называется холоферментом, его белковая часть апоферментом. Коферментами являются ионы металлов (например, Mg++). Среди алифатических кофакторов есть содержащие серу это глутатион, линолевая кислота, есть и дифосфаты углеводов (участвуют в реакциях переноса фосфатных групп), витамины (играют каталитическую роль).

Рис.5. Витамин С (аскорбиновая кислота).

Большинство важнейших коферментов
·–электронные сопряжённые системы, содержат ароматические циклы, или гетероциклы (рибофлавины или витамин В2). Аденин входит в состав кобамидных ферментов, связанных с кобаламином (или В12).
11. Молекулярной активностью (или “числом оборотов”) фермента называют число молей субстрата, превращённых в продукт за одну минуту одним молем фермента при избытке субстрата (S>>E).


4.2. Химическая кинетика и катализ
Ферменты – катализаторы (ускорители) всех биохимических реакций, в реакциях они не расходуются.
Скорости химических реакций зависят от температуры. Формула Аррениуса для константы скорости реакции.
13 EMBED Equation.DSMT4 1415 13 MACROBUTTON MTPlaceRef \* MERGEFORMAT 13 SEQ MTEqn \h \* MERGEFORMAT 15(13 SEQ MTEqn \c \* Arabic \* MERGEFORMAT 14115)15
где 13EMBED Equation.31415- энергия активации, характеризующая барьер, который частица должна преодолеть для осуществления реакции.
Эта формула следует из распределения Больцмана по энергиям; экспонента указывает на долю молекул, обладающих достаточной для реакции энергией активации 13EMBED Equation.31415 при данной температуре T. k – определяет скорость реакции.
В обратимой реакции скорости равны 13EMBED Equation.31415 и 13EMBED Equation.31415.
13EMBED Equation.31415,
где [A] и [B] – концентрации веществ А и В.
13 EMBED Equation.DSMT4 1415. 13 MACROBUTTON MTPlaceRef \* MERGEFORMAT 13 SEQ MTEqn \h \* MERGEFORMAT 15(13 SEQ MTEqn \c \* Arabic \* MERGEFORMAT 14215)15
В равновесии 13EMBED Equation.31415=13EMBED Equation.31415, и константа равновесия K = 13EMBED Equation.31415/13EMBED Equation.31415

13 EMBED Equation.DSMT4 1415. 13 MACROBUTTON MTPlaceRef \* MERGEFORMAT 13 SEQ MTEqn \h \* MERGEFORMAT 15(13 SEQ MTEqn \c \* Arabic \* MERGEFORMAT 14315)15
Разность свободных энергий продуктов реакции и исходных реагентов равна:
13 EMBED Equation.DSMT4 1415; 13 MACROBUTTON MTPlaceRef \* MERGEFORMAT 13 SEQ MTEqn \h \* MERGEFORMAT 15(13 SEQ MTEqn \c \* Arabic \* MERGEFORMAT 14415)15
где dH и dS – разность энтальпий и энтропий. Реакция возможна, если
dG < 0 (свободная энергия понижается).
Это необходимое условие, но не достаточное для реакции. 13EMBED Equation.31415 может быть большой, при этом константа скорости мала, и реакция не идет.
Катализатор служит для понижения активационного барьера, т.е. уменьшения разности между энергией фермент-субстратного комплекса и энергией активации реагентов.
Эйринг предложил теорию абсолютных скоростей реакции (теория переходных состояний или активированного комплекса). При этом в теории вводятся следующие допущения:
1. Предполагается, что ход реакции не нарушает больцмановского распределения молекул по состояниям с разной энергией.
2. Прохождение реакции требует преодоления энергетического барьера.
dG =G1-G2 , dG- разность свободных энергий начального и конечного состояний.
13EMBED Equation.31415 - свободная энергия активации в процессе 113EMBED Equation.314152

Находят число систем, находящихся в некотором интервале
· реакционной координаты
· на вершине барьера. Среднее время прохождения через барьер: 13 EMBED Equation.DSMT4 1415, где 13 EMBED Equation.DSMT4 1415- средняя скорость перемещения частиц на вершине барьера.
Скорость реакции это число систем, преодолевающих энергетический барьер в единицу времени. Средняя скорость движения системы равна:
13 EMBED Equation.DSMT4 1415. 13 MACROBUTTON MTPlaceRef \* MERGEFORMAT 13 SEQ MTEqn \h \* MERGEFORMAT 15(13 SEQ MTEqn \c \* Arabic \* MERGEFORMAT 14515)15
В уравнении (5) воспользовались распределением Максвелла-Больцмана по кинетическим энергиям 13EMBED Equation.31415. Скорость реакции, т.е. число переходов через барьер в единицу времени:
13 EMBED Equation.DSMT4 1415, 13 MACROBUTTON MTPlaceRef \* MERGEFORMAT 13 SEQ MTEqn \h \* MERGEFORMAT 15(13 SEQ MTEqn \c \* Arabic \* MERGEFORMAT 14615)15
где 13EMBED Equation.31415- число систем в единице объема, находящихся в пределах отрезка
·.
Вместе с тем
13 EMBED Equation.DSMT4 1415 13 MACROBUTTON MTPlaceRef \* MERGEFORMAT 13 SEQ MTEqn \h \* MERGEFORMAT 15(13 SEQ MTEqn \c \* Arabic \* MERGEFORMAT 14715)15

где 13EMBED Equation.31415, 13EMBED Equation.31415- концентрации реагентов
Из (6) и (7) имеем
13 EMBED Equation.DSMT4 1415. 13 MACROBUTTON MTPlaceRef \* MERGEFORMAT 13 SEQ MTEqn \h \* MERGEFORMAT 15(13 SEQ MTEqn \c \* Arabic \* MERGEFORMAT 14815)15
13EMBED Equation.31415 константа равновесия для перехода реагентов A,B. в активированное состояние.
Константа равновесия выражается через статсуммы z:
13 EMBED Equation.DSMT4 1415 13 MACROBUTTON MTPlaceRef \* MERGEFORMAT 13 SEQ MTEqn \h \* MERGEFORMAT 15(13 SEQ MTEqn \c \* Arabic \* MERGEFORMAT 14915)15
где 13EMBED Equation.31415- энергия i-го состояния системы. Суммирование ведётся по всем состояниям. В нашем случае:

13 EMBED Equation.3 1415 13 MACROBUTTON MTPlaceRef \* MERGEFORMAT 13 SEQ MTEqn \h \* MERGEFORMAT 15(13 SEQ MTEqn \c \* Arabic \* MERGEFORMAT 141015)15
где 13EMBED Equation.31415, 13EMBED Equation.31415 статсуммы для активированного комплекса и реагентов.
Для поступательного движения частицы набор состояний непрерывен, сумма (9) заменяется интегралом, который равен
13 EMBED Equation.3 1415 13 MACROBUTTON MTPlaceRef \* MERGEFORMAT 13 SEQ MTEqn \h \* MERGEFORMAT 15(13 SEQ MTEqn \c \* Arabic \* MERGEFORMAT 141115)15
где h – постоянная Планка, m- масса частицы, 13EMBED Equation.31415- это статсумма по трем степеням свободы поступательного движения.
Т.к. система имеет только одну такую степень свободы вдоль направления реакции, получаем
13 EMBED Equation.3 1415 13 MACROBUTTON MTPlaceRef \* MERGEFORMAT 13 SEQ MTEqn \h \* MERGEFORMAT 15(13 SEQ MTEqn \c \* Arabic \* MERGEFORMAT 141215)15
где 13EMBED Equation.31415- статсумма для активированного комплекса по всем степеням свободы, кроме поступательной.
Из (8), (10), (12) получаем:
13 EMBED Equation.DSMT4 1415 13 MACROBUTTON MTPlaceRef \* MERGEFORMAT 13 SEQ MTEqn \h \* MERGEFORMAT 15(13 SEQ MTEqn \c \* Arabic \* MERGEFORMAT 141315)15
Условная длина сократилась
13EMBED Equation.31415 13 MACROBUTTON MTPlaceRef \* MERGEFORMAT 13 SEQ MTEqn \h \* MERGEFORMAT 15(13 SEQ MTEqn \c \* Arabic \* MERGEFORMAT 141415)15
и, следовательно,
13 EMBED Equation.DSMT4 1415 13 MACROBUTTON MTPlaceRef \* MERGEFORMAT 13 SEQ MTEqn \h \* MERGEFORMAT 15(13 SEQ MTEqn \c \* Arabic \* MERGEFORMAT 141515)15
Здесь 13EMBED Equation.31415 избыток свободной энергии активированного комплекса по сравнению с суммарной свободной энергией реагентов, т.е. свободная энергия активации. При выводе (15) полагалось, что, достигнув активационного барьера, система обязательно вступит в реакцию. Этого может и не быть. Поэтому вводят трансмиссионный коэффициент
·
· 1
Тогда формула Эйринга для константы скорости гомогенной газовой реакции:
13 EMBED Equation.DSMT4 1415 13 MACROBUTTON MTPlaceRef \* MERGEFORMAT 13 SEQ MTEqn \h \* MERGEFORMAT 15(13 SEQ MTEqn \c \* Arabic \* MERGEFORMAT 141615)15
13EMBED Equation.31415, 13EMBED Equation.31415 энтропия и энтальпия активации. Условие
· = 1 отвечает адиабатическому течению реакции (т. е. когда параметры изменяются медленно);
· << 1 для неадиабатического процесса (может достигать ~13EMBED Equation.31415). В газовых реакциях
· обычно стремится к 1 (т.е. реакции эти обычно адиабатичны; kT/h при обычных T ~ 13EMBED Equation.31415 13EMBED Equation.31415).
Сравнивая (1) и (16) видим, (отождествляя энтальпию и энергию активации) что в формуле Аррениуса
13 EMBED Equation.DSMT4 1415 13 MACROBUTTON MTPlaceRef \* MERGEFORMAT 13 SEQ MTEqn \h \* MERGEFORMAT 15(13 SEQ MTEqn \c \* Arabic \* MERGEFORMAT 141715)15
Значения параметров активации определяют по температурной зависимости k. При
· = 1
13 EMBED Equation.DSMT4 1415 13 MACROBUTTON MTPlaceRef \* MERGEFORMAT 13 SEQ MTEqn \h \* MERGEFORMAT 15(13 SEQ MTEqn \c \* Arabic \* MERGEFORMAT 141815)15
13EMBED Equation.31415 слабо зависит от T, и этим членом можно пренебречь. По наклону прямой lnk от 1/T находят 13EMBED Equation.31415, а по отрезку, отсекаемому на оси ординат, 13EMBED Equation.31415.
Нелинейность зависимости lnk от 1/T свидетельствует об усложнении процесса (о его кооперативности, в таком процессе 13EMBED Equation.31415 зависит от числа уже прореагировавших систем и тем самым от 1/T, т.е. не постоянна). Нельзя трактовать h/(kT) как время существования активированного комплекса, т.к. за 13EMBED Equation.31415 с не может установиться статистическое равновесие. В реальности время существования системы в состоянии, отвечающем значениям реакционной координаты от
· до
· +
·, пропорционально
·. Это время аналогично времени существования состояний в теории Максвелла-Больцмана. Из малости h/(kT) нельзя делать вывод о невозможности установления равновесия между активированным комплексом и реагентами. Термин "активированный комплекс" относится к атомной системе, претерпевающей превращения, и не означает состояние метастабильного комплекса.
Теория Эйринга применима к реакциям в газах, но не в жидкой фазе. Общий метод качественного рассмотрения пригоден для различных кинетических процессов (диффузия, вязкое течение и т.д.).
В ряде случаев реакция идет без преодоления активационного барьера, посредством туннельного эффекта (квантовомеханического просачивания через барьер в реакциях переноса 13EMBED Equation.31415 или протона). В этом случае скорость реакции практически не зависит от T).

Катализ
Роль катализатора снизить свободную энергию активации 13EMBED Equation.31415, т.е. увеличить константу скорости реакции.
Гетерогенный катализ.
Катализатор образует отдельную фазу, и реакция протекает на поверхности раздела фаз. Процесс начинается с адсорбции реагентов на поверхности катализатора (твердого), ускоряющего реакцию газе или в жидкости. Адсорбция сопровождается изменением электронной структуры реагентов и понижением свободной энергии активации. После прохождения реакции продукты десорбируются с поверхности.
Гомогенный катализ.
Катализатор и реагенты находятся в одной фазе, например, в растворе. Катализатор образует промежуточное соединение с реагентами, далее распадающееся на катализатор продукты реакции.
Ферменты работают либо в растворах, или в надмолекулярных структурах. Сорбция реагентов и реакция протекают на некоторой поверхности большой молекулы белка. В этом смысле ферментативный катализ сходен с гетерогенным. Однако белок-фермент и малые молекулы субстратов находятся в одной фазе в растворе, поэтому ферментативный катализ в растворе гомогенный катализ.
Фермент преобразует молекулу субстрата в молекулу продукта. Механизмы работы можно изучать:
а) исследуя молекулярную структуру фермента и ФСК
б) исследуя кинетику ферментативных реакций.


4.3. Кинетика простых ферментативных реакций
Превращение субстрата S в продукт P в одностадийном процессе:
13EMBED Equation.31415 ; 13EMBED Equation.31415 свободный фермент, 13EMBED Equation.31415- ФСК.
Для простоты пренебрегают обратной 13EMBED Equation.31415 реакцией. Далее S, P, 13EMBED Equation.31415 будут концентрациями субстрата, продукта и фермент-субстратного комплекса без скобок [ ].
Кинетические уравнения имеют вид:
13 EMBED Equation.DSMT4 1415 13 MACROBUTTON MTPlaceRef \* MERGEFORMAT 13 SEQ MTEqn \h \* MERGEFORMAT 15(13 SEQ MTEqn \c \* Arabic \* MERGEFORMAT 141915)15
Общая концентрация фермента постоянна:
13 EMBED Equation.DSMT4 1415 13 MACROBUTTON MTPlaceRef \* MERGEFORMAT 13 SEQ MTEqn \h \* MERGEFORMAT 15(13 SEQ MTEqn \c \* Arabic \* MERGEFORMAT 142015)15
Из (19) и (20), исключая 13EMBED Equation.31415, получим:
13 EMBED Equation.DSMT4 1415 13 MACROBUTTON MTPlaceRef \* MERGEFORMAT 13 SEQ MTEqn \h \* MERGEFORMAT 15(13 SEQ MTEqn \c \* Arabic \* MERGEFORMAT 142115)15
Система при S>>E находится в стационарном состоянии, где 13EMBED Equation.31415 и. Тогда из (21) получим
13 EMBED Equation.DSMT4 1415 13 MACROBUTTON MTPlaceRef \* MERGEFORMAT 13 SEQ MTEqn \h \* MERGEFORMAT 15(13 SEQ MTEqn \c \* Arabic \* MERGEFORMAT 142215)15
а из (19): 13EMBED Equation.31415.
13 EMBED Equation.DSMT4 1415 13 MACROBUTTON MTPlaceRef \* MERGEFORMAT 13 SEQ MTEqn \h \* MERGEFORMAT 15(13 SEQ MTEqn \c \* Arabic \* MERGEFORMAT 142315)15
v скорость реакции. Разделим на 13EMBED Equation.31415 числитель и знаменатель:
13 EMBED Equation.DSMT4 1415 13 MACROBUTTON MTPlaceRef \* MERGEFORMAT 13 SEQ MTEqn \h \* MERGEFORMAT 15(13 SEQ MTEqn \c \* Arabic \* MERGEFORMAT 142415)15
Уравнение (24) называется уравнением Михаэлиса-Ментен с константой Михаэлиса:
13 EMBED Equation.DSMT4 1415 (24а)
Зависимость v(S) подобна изотерме Ленгмюра:

Рис.7. Кривая Михаэлиса-Ментен.
13 EMBED Equation.DSMT4 1415 13 MACROBUTTON MTPlaceRef \* MERGEFORMAT 13 SEQ MTEqn \h \* MERGEFORMAT 15(13 SEQ MTEqn \c \* Arabic \* MERGEFORMAT 142515)15
т.е.
13 EMBED Equation.DSMT4 1415 13 MACROBUTTON MTPlaceRef \* MERGEFORMAT 13 SEQ MTEqn \h \* MERGEFORMAT 15(13 SEQ MTEqn \c \* Arabic \* MERGEFORMAT 142615)15
При 13EMBED Equation.31415, 13EMBED Equation.31415, т.е. константа Михаэлиса это концентрация субстрата, при которой скорость реакции равна 13EMBED Equation.31415.
Преобразовав (26), получим:
13 EMBED Equation.DSMT4 1415 13 MACROBUTTON MTPlaceRef \* MERGEFORMAT 13 SEQ MTEqn \h \* MERGEFORMAT 15(13 SEQ MTEqn \c \* Arabic \* MERGEFORMAT 142715)15
Строя график 1/v от 1/S, находим 13EMBED Equation.31415 по точке пересечения прямой с осью ординат и 13EMBED Equation.31415 по наклону прямой.

Рис.8. Сравнение модели Михаэлиса-Ментен и положительной кооперации.

Различные модификаторы (ингибиторы или активаторы) изменяют скорости реакции. Например, при ингибировании это может происходить посредством неконкурентного ингибирования, (неактивный комплекс образуется при взаимодействии ФСК с ингибитором), или посредством конкурентного ингибирования (тут фермент наряду с ФСК образует еще и неактивный комплекс с ингибитором).
Конкурентный тип ингибирования
13EMBED Equation.31415,
13EMBED Equation.31415 - неактивный комплекс, I - ингибитор
т.е. фермент дает и 13EMBED Equation.31415 по одной цепи, и 13EMBED Equation.31415 по другой
13EMBED Equation.31415; 13EMBED Equation.31415.
В случае конкурентного ингибирования 13EMBED Equation.31415 растет.

Рис.9. Зависимость 1/V от 1/[S] при конкурентном,
неконкурентном ингибировании и без ингибитора вовсе.

2. Неконкурентный тип ингибирования:
13EMBED Equation.31415
13EMBED Equation.31415; 13EMBED Equation.31415,
13EMBED Equation.31415 не меняется, т.к. такой ингибитор не мешает образованию ФСК (Рис.8.).
Ингибирование по типу отрицательной обратной связи схематически выглядит следующим образом:
13 EMBED Equation.DSMT4 1415
При исследовании ферментативных реакций был установлен "компенсационный эффект". Изменения энтальпии
·H в процессах, протекающих в водных растворах, часто пропорциональны изменениям энтропии
·S. То же относится и к активационным параметрам: 13EMBED Equation.31415 пропорционально 13EMBED Equation.31415. Ламри предположил, что этот эффект определяется свойствами 13EMBED Equation.31415: изменение конформации белка, сопровождаемое вытеснением 13EMBED Equation.31415 из активной полости глобулы, вызывает перестройку окружающей водной структуры.
Активационные параметры (13EMBED Equation.31415, 13EMBED Equation.31415) сильно зависят от pH и ионного состава среды. При этом уравнение Аррениуса может не выполняться, т.к. глобула испытывает структурные перестройки, зависящие от T. И объяснение "компенсационного эффекта" может быть иным.
Зависимость ферментативной активности от pH определяется полиэлектролитной природой фермента.


4.4. Химические аспекты действия ферментов
Особенности ферментативного катализа большая активность и строгая специфичность по отношению к субстрату.
Молекулярной активностью фермента (или числом оборотов) называется число молей субстрата, превращаемых в одну минуту одним молем фермента при значительном избытке субстрата S>>E (Многие ферменты получены в кристаллической форме и изучаются in vitro)
Активный центр полифункционален: способен связывать субстрат и проявляет каталитическую активность, причем сорбция предшествует катализу; разрываются старые связи и образуются новые.
Ферментативная реакция многостадийна (идёт через ряд химических превращений).
Пример креатинкиназы, катализирующей реакцию:
13 EMBED Equation.3 1415.


Рис.10. Схема действия креатинкиназы.

На рисунке изображена схема переходного состояния для этой реакции. 13EMBED Equation.31415 кофактор. Важна роль SH группы в активном центре.
Фермент инактивируется йодацетамидом и йодацетатом. В присутствии 13EMBED Equation.31415 и обоих субстратов (креатина и ATP) SH группа защищена от действия блокирующих агентов. Очевидно, SH группа соединена H-связью с одной из основных групп фермента. Благодаря лёгкому переходу протона в системе кислота-основание, соединённых H-связью, такая система обладает высокой каталитической активностью. (Стрелки показывают сдвиги электронов в субстратах и группах активного центра).
При образовании ФСК существенна точная взаимная ориентация функциональных групп фермента и субстрата или модификатора. Активный центр хирален и стереоспецифичен.
Пример: превращение аминомалоновой кислоты в глицин.
13EMBED Equation.31415;
* радиоактивная метка.
Реакции таких молекул происходят на поверхности фермента асимметрично.
В реакцию вступает только одна группа COOH. Это объясняется асимметрией активного центра Т.к. группы фермента, связывающиеся с COOH, различны, то различны и реакции.
Ферменты хорошо различают стереоизомеры, и оптический антипод данного субстрата субстратом уже не является.
Для ряда ферментов подробно изучена последовательность химических превращений в активном центре ФСК.
Пример: химия аспартат-аминотрансферазы (ААТ).
Этот фермент содержит пиридоксальфосфат (ПАЛФ) в качестве кофермента. ПАЛФ, присоединённый к белку, реагирует с субстратом аминокислотой, химически образуя альдимин (шиффово основание):

Рис.11. Атом 13EMBED Equation.31415 легко диссоциирует в альдимине.


Рис 12. При реакциях переаминирования альдимин таутомеризуется в кетимин, который гидролизуется водой с образованием кетокислоты.

Возникает пиридоксаминная форма фермента, реагирующая с другой кетокислотой, содержащей 13EMBED Equation.31415 вместо 13EMBED Equation.31415, причём регенерируется исходный фермент и получается новая аминокислота 13EMBED Equation.31415. Такова схема реакции трансаминирования переноса аминогруппы.
Практически все реакции могут протекать без фермента, но с малой скоростью.
Эти примеры показаны, чтобы проиллюстрировать возможности расшифровки взаимодействий активного центра фермента и лиганда (субстрата).
Химия выявляет поведение функциональных групп фермента и кофакторов. Но этого недостаточно для количественного объяснения ферментативной активности, характеризуемой понижением энергии активации. Для ферментативного катализа нужна вся белковая глобула. Нельзя отрезать часть белковой цепи без нарушения активности фермента. Химия не говорит о роли глобулярной структуры. Это задача физики.
Суммируя результаты химических исследований ферментов, Браунштейн указал на факторы, ответственные за их действие:
Большое сродство фермента к субстрату, т.е. большая вероятность образования ФСК, что эквивалентно резкому увеличению концентрации реагентов (эффект сближения).
Строгая взаимная ориентация реагентов (S), кофакторов и активного центра (эффект ориентации).
Воздействие на субстрат нуклеофильных и электрофильных групп активного центра (эффект синхронного кислотно-основного катализа). Кооперация кислотных и основных групп, их совместное действие резко ускоряют реакцию
Активация субстрата путём перераспределения электронной плотности под действием активных групп фермента (эффект поляризации)
Изменение конформации белка и субстрата в ФСК (эффект индуцированного контакта).
Отношение скорости ферментативного процесса по отношению к скорости неферментативного для ряда ферментов (лизоцим, химотрипсин,
·-амилаза, фумараза) составлет ~13EMBED Equation.31415.

4.5. Конформационные свойства ферментов
Основная идея состоит в определяющей роли конформационной лабильности взаимодействующих молекул для ферментативного катализа.
Ряд ферментов в присутствии S становятся более жёсткими, другие более лабильными (легче денатурируют при нагревании), изменяются
·-спирали, изменения можно обнаружить методом ЭПР, также изменяются спектры люминесценции и т.д.
Рентгенография ФСК даёт прямую информацию о конформационных превращениях. При вхождении аналога субстрата S глицилтирозина в полость карбоксипептидазы полость сужается и более плотно зажимает субстрат. Изменяется и субстрат. "Щупальца" направляют субстрат к кофактору Zn.
Методы рентгенодинамического анализа, мессбауэровской спектроскопии, рэлеевского рассеяния мессбауэровского излучения показали, что конформационная подвижность в белках сохраняется и при низких Т.
В ФСК достигается структурное соответствие, реализуемое в полости фермента. Внутренняя поверхность полости образована преимущественно неполярными остатками. Из-за гидрофобного взаимодействия полярные остатки остаются снаружи. Неполярное "нутро" белковой молекулы имеет малую диэлектрическую проницаемость (порядка 3), что облегчает электрические взаимодействия. Неполярные внутренние области ферментов обеспечивают живую клетку эквивалентами органических растворителей.
Но в целом теория поля не создана.


4.6. Физика фермент-субстратного взаимодействия
Электростатические взаимодействия.
Физические особенности определяются белковой глобулой, которая по размерам больше субстрата. При сорбции S находится в полости с малой
·, т.е. там, где могут реализоваться сильные электростатические взаимодействия между реагентами и полярными группами фермента. Перутц считает, что это даёт главный вклад в энергетику ферментативного катализа, т.е. в понижение энергии активации. Отличие фермента от водного раствора состоит в том, что в активном центре АЦ фермента располагаются диполи с фиксированной ориентацией по отношению к заряженным группам субстрата, даже если поле этих зарядов мало. Вследствие такой ориентации ферменты могут стабилизировать пары ионов и другие распределения зарядов значительно лучше, чем H2O. В водных растворах электростатическое притяжение невелико, т.к. любая сила, создаваемая сближением противоположных зарядов, уравновешивается ориентацией диполей растворителя. В ферментах такая переориентация невозможна. Количественные расчёты на этой основе согласуются с экспериментом (снижение энергии активации для лизоцима).
При сорбции субстрата выделяется энергия. Предполагается, что она накапливается и идёт на упругие колебания глобулы, ведущей себя подобно капле жидкости. Частоты таких колебаний попадают в гиперзвуковую область и достигают 10-13 с-1. Энергия этих колебаний может активировать молекулу субстрата S. Расчёты показали, что энергия упругих колебаний глобулы может достигать 20-40 кДж/моль и обеспечивать значительное понижение эффективного активационного барьера. Но экспериментальных доказательств у гипотезы нет.
Стоячие волны в капле могут образовывать пучность в области активного центра и энергия упругих колебаний может активировать S. Но неясно, с какой скоростью энергия глобулы диссипирует в окружающую среду.
Оценим ускорение реакции при трансформации энергии сорбции в энергию ФСК. Для начала, предположим, что структурное соответствие фермент-субстрат в ФСК приводит и фермент, и субстрат в напряжённое состояние ("модель дыбы"). Пусть L0 длина нерастянутой молекулы S, а L длина полости фермента (Ф), в которую вошёл S. Изменения длины молекул S и Ф равны x и y. Тогда х + у=L - L0 и условие равенства упругих сил приобретёт вид:
13EMBED Equation.31415
ks и ke коэффициенты упругости S и Ф. Находим
13EMBED Equation.31415; 13EMBED Equation.31415.
Упругая энергия субстрата, определяющая понижение энергии активации равна: 13EMBED Equation.31415.
Порядок 13EMBED Equation.31415.
L линейный размер глобулы,
· модуль упругости глобулы. Для белка L
· 5 нм, е
· 103 Дж/см3 , значит ke
· 5
·10-2 Н/см.
Наибольшая энергия упругой деформации сосредотачивается в наиболее слабом месте молекулы S. Деформация валентных углов происходит легче, чем валентных связей. Вместе с тем, энергия, запасённая на угловых степенях свободы молекулы, может "перейти" на валентную связь и уменьшить энергию активации её разрыва. ks, отвечающий низкочастотным деформационным колебаниям (
·
· 1013 с-1), равен
· 0,15 Н/см. Допустим, что
·Е = 31,5 кДж/моль (при уменьшении энергии активации на такую величину скорость реакции увеличивается в 105 раз). Тогда х
· 0,08 нм, у
· 0,23 нм, упругая энергия фермента
13EMBED Equation.31415.
Значит, суммарная энергия расходуется при сорбции на упругую деформацию, составляет 171 кДж/моль. Это не столь высокая Е, если учесть что сорбция происходит за счёт многоточечного связывания, т.е. образования многих химических и слабых связей между Ф и S. Наблюдаемая энергия сорбции представляет собой разность истинной энергии сорбции и энергии упругой деформации Ф и S.
Модель "дыбы" статическая. Если предположить, что упругая система является динамической и возникает резонанс колебаний молекул S и Ф, то для такого же ускорения реакции потребуется средняя упругая энергия в 4 раза меньше, чем в статическом случае, т.к. биения периодически удваивают амплитуду колебаний.
В таких процессах рассматриваются колебания атомных ядер, возникающих при образовании ФСК. При взаимодействии Ф с S изменяются состояния электронных оболочек субстрата и атомных групп активного центра. Электронные оболочки испытывают возмущение вследствие взаимодействий в ФСК. Превращение S в P (продукт) это химический процесс, т.е. изменение состояния электронных оболочек молекул. При этом происходит перемещение атомных ядер, среди которых наименьшей энергии требуют низкочастотные деформационные колебания и повороты вокруг единичных связей, т.е. изменение конформаций. Для ферментативного катализа важнейшее значение имеют взаимодействия электронных и конформационных степеней свободы ЭКВ.


4.7. Электронно-конформационные взаимодействия
Концепция ЭКВ исходит из того, что изменение зарядового или электронного состояния системы приводит к изменению конформации, что в свою очередь индуцирует изменение электронного состояния. Амплитуды конформационных движений относительно велики. Для их описания непригодна модель гармонических колебаний, применяемая в теории электронно-колебательных взаимодействий. Нужно иметь дело с уравнением Ланжевена для осциллятора в системе с трением:
13EMBED Equation.31415
m эффективная масса сегмента, b коэффициент трения,
·0 круговая частота осциллятора, F(t) случайная сила, действующая на осциллятор со стороны окружающих частиц. F(t) обусловлена тепловыми флуктуациями среды. Частоты этих конформационных движений значительно меньше частот амидных групп (
· < 200 см -1 для крутильных колебаний вокруг C – N - связи).
Предполагают, что конформационное движение представляет собой ограниченную непрерывную диффузию в протяжённой потенциальной яме малой глубины. Такое движение описывается уравнением Фоккера-Планка:
13EMBED Equation.31415.
P(x, t) плотность вероятности найти систему в момент t в конформации со значением координаты x; D(x, t) коэффициент конформационной диффузии, U(x) конформационный потенциал;
13EMBED Equation.31415.
b(x) коэффициент трения.
Температурная зависимость давления определяется зависимостью D(x) от энергии активации е(x):
D(x) = D0 exp (- е(x)/kT).
Сравнительно крупные конформационные движения в белковой глобуле возможны вследствие наличия или возникновения в ней свободных, “пустых” участков дырок.
Таким образом, с точки зрения динамики белковая глобула сложная структурированная система, обладающая целым набором конформационных движений с различными временами.
Перемещение любого лиганда, начиная с электрона, в макромолекуле вызывает изменение электронной плотности и, вслед за ним, конформационого состояния системы. Система “электронная плотность лиганда + конформационная деформация фермента (или макромолекулы)” подобна полярону в физике твёрдого тела и называется конформоном. (Волькенштейн).
Конформон отличается от полярона сильной нелинейностью. Конформон не может перемещаться на большие расстояния без диссипации энергии. Быстрая диссипация определяется неоднородностью, апериодичностью глобулы. Для реализации ферментативного процесса достаточно коонформационной перестройки в пределах нескольких связей.
Движение к активному центру это движение конформона. Оно происходит путём конформационного раскрытия некоторой щели в глобуле, характеризуемой определённой микровязкостью. Структурное соответствие E-S имеет динамический характер; количественной мерой соответствия может служить критическая энергия деформации щели, соответствующей размеру и форме молекулы субстрата. Движение конформона описывается уравнением Фокккера-Планка.
Экспериментально было показано, что электронные изменения в АЦ фермента сильно влияют на конформационные свойства белка как целого. При этом в ферментативной системе происходит выравнивание энергетических уровней различных промежуточных форм и понижение активационных барьеров. В этом и проявляется комплементарность профилей химической (электронной) и конформационной свободных энергий. Комплементарность определяется ЭКВ.
Теоретические подходы к ЭКВ развиты Догонадзе (и сотрудниками), и Шайтаном. Движения атомных ядер в белках характеризуются амплитудами и временами, представленными в таблице №1:

Табл. №1. Характерные амплитуды и времена тепловых флуктуаций элементов структуры белка при Т=300 К.
Процесс
Амплитуда, нм
Время, с

Валентные колебания
0,001 – 0,01
10 -12

Микроконформационные движения боковых групп
0,03 – 0,1
10 -8 – 10 -9

Изгибные движения (от
· или
· участков цепи)
0,2 – 0,7
10 -5 – 10 -7


При попадании электрона в поляризуемую среду, образованную группами макромолекулы, происходят ЭКВ. Среда поляризуется и образуется самосогласованное поле, эквивалентное потенциальной яме для электрона. Такое образование в физике твёрдого тела называют поляроном. Если поляризационная деформация приводит к состоянию, отделённому от исходного энергетическим барьером, то имеем дело с нелинейным поляроном. В биополимерах поляризация приводит к движению по конформационым степеням свободы нелинейный полярон является конформоном. Чернавский и Чернавская дают грубую оценку энергии и размеров конформона. В среде, содержащей равномерно распределённые ионы массы М, взаимодействующие по закону Кулона, согласно теореме вириала имеем:
13EMBED Equation.31415.
Скорости v и расстоянию r соответствует частота колебаний ионов:
13EMBED Equation.31415,
где 13EMBED Equation.31415 число ионов в единице объёма.
Взаимодействуя с колебаниями ионов, электрон приобретает энергию 13EMBED Equation.31415и импульс:
13EMBED Equation.31415,
где m масса электрона. Согласно соотношению неопределённостей, соответствующий размер электронного облака равен
13EMBED Equation.31415.
Размеры нелинейного полярона (конформона) должны быть такого же порядка. Энергия поляризации по порядку величины равна 13EMBED Equation.31415, где е микроскопическая диэлектрическая проницаемость. Наконец, отношение Ер к энергии колебаний даёт число квантов, участвующих в образовании полярона:
13EMBED Equation.31415
Для белков среднее значение плотности зарядов n~1021 см -3, т.е. расстояние между зарядами ~10Е. Если заряды расположить на протонах, то М
· (6,02
·1023)-1 г. Величину
· можно считать равной 3. Получаем
·k
· 1013 с-1, размеры полярона
·
· 15Е, т.е. поляризацией охвачена практически вся макромолекула. Энергия поляризации
· 0,35eV. Сдвиг уровней электрона того же порядка. Наконец, N
· 15.
В кинетике ЭКВ можно выделить 4 процесса:
1. Колебания электрона внутри одной потенциальной ямы размером в несколько Е, с частотами ~1017 с-1.
2. Колебания атомов с частотами ~ kТ/h~1013 c-1 и с амплитудами ~ 10-1 – 10-2Е; частоты упругих колебаний белковой глобулы как целого ~ 1011 – 1012 с-1.
3. Туннелирование электрона с характерными временами 10-6 – 10-7 с и расстояниями 10-20 Е.
4. Конформационные переходы в молекуле со временами 10-3 – 10-1 с; возможны и значительно более медленные процессы.
Однако до сих пор нет строгой теории, количественно описывающей скорость ферментативной реакции.
При рассмотрении пути реакции следует учитывать “конформационную” природу явления. Иными словами, положения электронных уровней энергии зависят от динамического состояния среды белка, обладающего конформационными степенями свободы. Вследствие малой скорости коонформационных движений система является адиабатической.
5. Элементарный акт ферментативной реакции в работах Блюменфельда и Чернавского.
Формулируется постулат, согласно которому конформационное изменение ФСК, следующее за присоединением S к активному центру Е, включает в себя кроме разрыва старых и образования новых вторичных связей в макромолекуле белка также химические изменения S, превращающие S в Р. Т.о., элементарный акт ферментативной реакции заключается в конформационном изменении макромолекулы (ФСК), и скорость превращения S в Р определяется скоростью этого конформационнного изменения.






Рис.13. Схема энергетических изменений на разных стадиях каталитического разрыва связи А-В субстрата: 13EMBED Equation.31415
В быстрой стадии (а) присоединения S к E происходит с выделением энергии
·G1. Конформация белка не успевает измениться и остаётся напряжённой. На стадии (b) происходит медленная релаксация комплекса к новому равновесию и превращение S в P (13EMBED Equation.31415 новая конформация фермента). Свободная энергия понижается на величину
·G2. Далее, в стадии (c) комплекс распадается на фермент и продукт, но фермент остаётся в напряжённой конформации 13EMBED Equation.31415, медленно релаксирующей к стадии (d).Общее понижение свободной энергии
·G=
·G1+
·G2+
·G3+
·G4. Это термодинамическая модель, в рамках которой кинетика процесса не рассматривалась. Блюменфельд считает уравнение Аррениуса или Эйринга неприменимым к ферментативным реакциям, утверждая, что система не характеризуется энергией активации в обычном смысле слова. Блюменфельд настаивает на том, что все молекулы субстрата, образовавшие ФСК с Е, релаксирующим к новому конформационному состоянию, претерпевают химическое превращение. Влияние Т на скорость реакции определяется не изменением числа молекул, способных преодолеть активационный барьер, а изменением исходной конформации и, следовательно, изменением пути и скорости последующей релаксации.
6. Для построения кинетической теории необходимо исследовать относительную роль двух механизмов переноса электрона: 1) надбарьерный переход по Эйрингу; 2) туннельный эффект. Туннельный эффект при переносе электрона в биологической системе был впервые рассмотрен Чансом.
Константа скорости активационного перехода равна:
13EMBED Equation.31415
13EMBED Equation.31415 свободная энергия активации.
Число актов перехода в единицу времени равно:
13EMBED Equation.31415
13EMBED Equation.31415 частота колебаний электрона в молекуле, участвующей в цепи переноса (для цитохрома с 13EMBED Equation.31415 ~ 1017 c-1), L ширина барьера, U его высота, Е уровень энергии электрона, m масса электрона. Член 13EMBED Equation.31415 определяет прозрачность барьера.

Рис.14. Схема потенциальных ям двух соседних переносчиков: две потенциальные ямы, разделённые барьером.

13EMBED Equation.31415 условие резонанса. 13EMBED Equation.31415 энергия i-го уровня.
Полная скорость переноса определяется суммой k1+k2. при высоких Т преобладает k1, а при низких Т k2. Можно предположить, что Fа и U совпадают. Молекулярная система ЦПЭ (цепи переноса электрона) содержит "проводящие группы", в которых р-электроны делокализованы (ароматические группы белков, простетические группы, коферменты, к ним относят и атомы переходных металлов). Размеры таких групп ~ нескольких Е. Проводящие группы отделены друг от друга диэлектрическими молекулами белков и липидов; соответствующие значения ширины барьера L ~ размеров этих молекул. Согласно имеющимся оценкам L ~ 10-20Е, U ~ 1-2 eV. При этих значениях k2>> k1. Отсюда следует, что реальные процессы должны быть практически независимыми от Т, но это противоречит опыту. Контрвозражение: туннельный переход электрона должен сопровождаться излучением фононов, возбуждением колебаний молекул, конформационными переходами, что приводит к сильной температурной зависимости.
Поведение электрона при его туннелировании зависит от соотношения между разностью электронных уровней
·Е и величиной резонансного расщепления
·Еr (учитывающего влияние среды, движение ядер, электронно-колебательные взаимодействия).
13EMBED Equation.31415
Таким образом, туннельный эффект связан с условиями резонанса электронных уровней энергии.
Если
·Е >>
·Еr, то туннельного перехода не будет. При
·Е
·
·Еr переход произойдёт за время 13EMBED Equation.31415. При L
· 20Е, (U-E)
· 2eV,
·Еr
· 10-6 eV. Реальные значения в ЦПЭ должны быть много больше, и такой идеальный переход невозможен. Туннелирование становится возможным вследствие диссипации энергии, обеспечивающей сближение электронных уровней. Именно ЭКВ создают возможность такой диссипации.
В квантовой механике движение электрона описывается волновой функцией
·(x,t), которая при х = х0, попадая на барьер U0, частично отражается, а частично проходит сквозь барьер. Стационарные уравнения Шрёдингера в области 1 и 2 имеют вид:
13EMBED Equation.31415
Стационарные состояния с энергией Е описываются волновыми векторами k1 и k2:
13EMBED Equation.31415
Тогда 13EMBED Equation.31415 13EMBED Equation.31415. Вероятность найти частицу в области 2 при E-U0 < 0, k2=ik; где 13EMBED Equation.31415 равна:
13EMBED Equation.31415


4.8. Ферментативная активность лизоцима
Лизоцим это фермент, разрушающий определённые бактериальные клетки (расщепляет полисахаридные цепи клеточной стенки, после чего клетка разрывается под действием осмотического шока входа воды внутрь клетки).
Полисахарид клеточной стенки полимер, в котором чередуются остатки сахаров двух типов N-ацетилглюкозамин (NAG) и N-ацетилмурамовая кислота (NAM). Сахара, имеющие
·-конфигурацию относительно С1-атома, образуют полимерную цепь с помощью гликозидных связей между С1- одного сахарного кольца и С4-атомом следующего.
Структура лизоцима. Лизоцим (из белка куриного яйца) состоит из одной полипептидной цепи, насчитывающей 129 остатков и имеющей 4 дисульфидных мостика. Фермент может связываться с ингибиторами, химически сходными с полисахаридом клеточной стенки. С помощью рентгеноструктурного анализа Филипсом и др. была определена пространственная структура белка как такового и белка, закристаллизованного вместе с ингибитором. Оказалось, что лизоцим состоит из двух доменов (
· и
·-типов), образующих щель, в которой находится активный центр, способный связать гексосахарид, причём, для связывания каждого из шести сахарных колец на ферменте имеется свой участок (это участки A, B, C, D, E, F).
Расщепление полисахарида осуществляется путём гидролиза гликозидной связи между сахарными кольцами, располагающимися в участках D и E. Анализ кристаллографических данных позволил предположить, что непосредственно перед и после гидролиза сахарное кольцо в участке D имеет не обычную конформацию кресла, а конформацию полукресла, характеризующуюся тем, что 5 из 6 атомов, образующих сахарное кольцо, лежат практически в одной плоскости. Центральную роль в функционировании лизоцима играют остатки глутаминовой кислоты Glu35 и аспарагиновой кислоты Asp 52. Боковые цепи этих остатков располагаются близко к гликозидной связи (~ 0.3 нм) между сахарными кольцами, локализованными в участках D и E. Glu 35 находится в неполярном окружении, и поэтому его карбоксильная группа остаётся протонированной (т.е. в форме СООН). Окружение Asp 52, наоборот, полярно и эта группа депротонирована (–СОО- ).
Реакцию гидролиза можно подразделить на несколько этапов:
–СООН-группа Glu 35 предоставляет свой протон гликозидному кислороду, что приводит к разрыву связи между этим атомом кислорода и С1-атомом сахарного кольца, располагающегося в участке D. Получившийся в результате фрагмент исходного полисахарида, включающий в себя сахарные кольца, которые находятся в участках E и F, является продуктом и может освободиться из комплекса с ферментом.
Сахарное кольцо, располагающееся в D–участке, имеет искажённую конформацию, соответствующую конформации переходного состояния. При этом С1-атом оказывается положительно заряженным. Такое состояние углеродного атома называется карбоний-ионом. Оно стабилизируется с помощью отрицательного заряда близко расположенного остатка Asp 52.

Рис.15.Связывание сахаров с лизоцимом стабилизируется при помощи гидрофобных взаимодействий и водородных связей.

Гидроксильный ион ОН-, донором которого является Н2О из окружающей среды, присоединяется к карбоний-иону, после чего второй фрагмент расщепленного полисахарида становится продуктом реакции. Одновременно из-за связывания иона водорода (Н+) протонируется карбоксильная группа Glu 35, переходя в форму –СООН.
Теперь фермент находится в первоначальном состоянии и готов осуществить следующую реакцию расщепления полисахарида.
Этот пример позволяет проследить некоторые общие принципы ферментативного катализа.
Увеличение энергии субстрата за счёт искажения структуры сахарного кольца NAM, находящегося в D-участке.
Наличие необычного окружения Glu 35, обусловливающее появление реакционноспособного протона.
Правильная ориентация протона в Glu 35, необходимая для атаки гликозидной связи.
Уменьшение свободной энергии переходного состояния за счёт стабилизации карбоний-иона карбоксильной группой остатка Asp52.
Глава 5. Физика нуклеиновых кислот.

5.1. Основная характеристика
Нуклеиновые кислоты - это биополимеры, макромолекулы которых состоят из многократно повторяющихся звеньев - нуклеотидов. Поэтому их называют также полинуклеотидами. Важнейшей характеристикой нуклеиновых кислот является их нуклеотидный состав. В состав нуклеотида - структурного звена нуклеиновых кислот - входят три составные части:

азотистое основание - пиримидиновое или пуриновое. В нуклеиновых кислотах содержатся основания 4-х разных видов: два из них относятся к классу пуринов и два – к классу пиримидинов. Азот, содержащийся в кольцах, придает молекулам основные свойства.

Строение пуриновых оснований:
[ Cкачайте файл, чтобы посмотреть картинку ]

Строение пиримидиновых оснований:
[ Cкачайте файл, чтобы посмотреть картинку ]

моносахарид - рибоза или 2-дезоксирибоза. Сахар, входящий в состав нуклеотида, содержит пять углеродных атомов, т.е. представляет собой пентозу. В зависимости от вида пентозы, присутствующей в нуклеотиде, различают два вида нуклеиновых кислот – рибонуклеиновые кислоты (РНК), которые содержат рибозу, и дезоксирибонуклеиновые кислоты (ДНК), содержащие дезоксирибозу.

Строение моносахаридов:
[ Cкачайте файл, чтобы посмотреть картинку ]


остаток фосфорной кислоты. Нуклеиновые кислоты являются кислотами потому, что в их молекулах содержится фосфорная кислота.

В конце 40-х начале 50-х годов, когда появились такие методы исследования, как хроматография на бумаге и УФ-спектроскопия, были проведены многочисленные исследования нуклеотидного состава НК (Чаргафф, А. Н. Белозерский). Полученные данные позволили решительно отбросить старые представления о нуклеиновых кислотах, как о полимерах, содержащих повторяющиеся тетрануклеотидные последовательности (так называемая тетрануклеотидная теория строения ПК, господствовавшая в 3040-е годы), и подготовили почву для создания современных представлений не только о первичной структуре ДНК и РНК, но и об их макромолекулярной структуре и функциях.
Метод определения состава НК основан на анализе гидролизатов, образующихся при их ферментативном или химическом расщеплении. Обычно используются три способа химического расщепления НК. Кислотный гидролиз в жестких условиях (70%-ная хлорная кислота, 100°С, 1 ч или 100%-ная муравьиная кислота, 175°C, 2 ч), применяемый для анализа как ДНК, так и РНК, приводит к разрыву всех N-гликозидных связей и образованию смеси пуриновых и пиримидиновых оснований. При исследовании РНК могут использоваться как мягкий кислотный гидролиз (1 н соляная кислота, 100°C, 1 ч), в результате которого образуются пуриновые основания и пиримидиновые нуклеозид-2'(3')-фосфаты, так и щелочной гидролиз (0,3 н. едкое кали, 37°С, 20 ч), дающий смесь нуклеозид -2' (3') -фосфатов.
Поскольку в НК число нуклеотидов каждого вида равно числу соответствующих оснований, для установления нуклеотидного состава данной НК достаточно определить количественное соотношение оснований. Для этой цели из гидролизатов с помощью хроматографии на бумаге или электрофореза (когда в результате гидролиза получают нуклеотиды) выделяют индивидуальные соединения. Каждое основание независимо от того, связано оно с углеводным фрагментом или нет, обладает характерным максимумом поглощения в УФ, интенсивность которого зависит от концентрации. По этой причине, исходя из УФ-спектров выделенных соединений, можно определить количественное соотношение оснований, а следовательно, и нуклеотидный состав исходной НК.
При количественном определении минорных нуклеотидов, особенно таких неустойчивых, как дигидроуридиловая кислота, пользуются ферментативными методами гидролиза (ФДЭ змеиного яда и селезенки).
Использование описанных выше аналитических приемов показало, что НК различного происхождения состоят за редким исключением из четырех основных нуклеотидов и что содержание минорных нуклеотидов может меняться в значительных пределах.
Как будет показано далее, при изучении нуклеотидного состава ДНК были получены данные, которые помогли установить ее пространственную структуру.
Нуклеиновые кислоты, полинуклеотиды, важнейшие биологически активные биополимеры, имеющие универсальное распространение в живой природе. Содержатся в каждой клетке всех организмов. НК были открыты в 1868 швейцарским учёным Ф. Мишером в клеточных ядрах (отсюда название: лат. nucleus - ядро), выделенных из гноя, а также из спермы лосося. Позднее нуклеиновые кислоты были обнаружены не только в ядре, но и в цитоплазме. Различают два главных типа нуклеиновых кислот - дезоксирибонуклеиновые кислоты, или ДНК, содержащиеся преимущественно в ядрах клеток, и рибонуклеиновые кислоты, или РНК, находящиеся главным образом в цитоплазме.
Молекулы нуклеиновых кислот - длинные полимерные цепочки с молекулярной массой 2,5 104 – 4 109, построенные из мономерных молекул - нуклеотидов так, что гидроксильные группы у 3' и 5' углеродных атомов углевода соседних нуклеотидов связаны остатком фосфорной кислоты. В состав РНК в качестве углевода входит рибоза, а азотистые компоненты представлены аденином, гуанином (пуриновые основания), урацилом и цитозином (пиримидиновые основания). В ДНК углеводным компонентом является дезоксирибоза, а урацил заменен тимином (5-метилурацилом). Фосфат и сахар составляют неспецифическую часть в молекуле нуклеотида, а пуриновое или пиримидиновое основание - специфическую. В составе большинства нуклеиновых кислот обнаружены в небольших количествах также некоторые другие (главным образом метилированные) производные пуринов и пиримидинов - т. н. минорные основания.
Нуклеиновые кислоты имеют различающийся состав. В частности, дезоксирибонуклеиновые кислоты (ДНК) содержат дезоксирибозу, а рибонуклеиновые кислоты (РНК) - рибозу. Эти и другие отличия в составе нуклеиновых кислот приведены в таблице:
Одинаковые компоненты
Отличающиеся компоненты


ДНК
РНК

АДЕНИН
ГУАНИН
ЦИТОЗИН
ДЕЗОКСИРИБОЗА
ТИМИН
РИБОЗА
УРАЦИЛ


Цепи нуклеиновых кислот содержат от нескольких десятков до многих тысяч нуклеотидных остатков, расположенных линейно в определённой последовательности, уникальной для данной нуклеиновой кислоты. Т.е., как РНК, так и ДНК представлены огромным множеством индивидуальных соединений. Линейная последовательность нуклеотидов определяет первичную структуру нуклеиновых кислот. Вторичная структура нуклеиновых кислот возникает в результате сближения определённых пар оснований, а именно: гуанина с цитозином и аденина с урацилом (или тимином) по принципу комплементарности за счёт водородных связей, а также гидрофобных взаимодействий между ними.
Биологическая роль нуклеиновых кислот заключается в хранении, реализации и передаче наследственной информации, "записанной" в молекулах нуклеиновых кислот в виде последовательности нуклеотидов - т. н. генетического кода. При делении клеток - митозе - происходит самокопирование ДНК - её репликация, в результате чего каждая дочерняя клетка получает равное количество ДНК, заключающей программу развития всех признаков материнской клетки. Реализация этой генетической информации в определённые признаки осуществляется путём биосинтеза молекул РНК на молекуле ДНК (транскрипция) и последующего биосинтеза белков с участием разных типов РНК (трансляция).
Исследование строения и функций нуклеиновых кислот в 50-70-х гг. 20 в. обусловило огромные успехи молекулярной генетики и молекулярной биологии. Важнейшим этапом в изучении химии и биологии НК было создание в 1953 Дж. Уотсоном и Ф. Криком модели ДНК (двойная спираль), что позволило объяснить многие её свойства и биологические функции. Нуклеиновые кислоты обнаружены также в клеточных органеллах (хлоропластах, митохондриях и др.), где функции их изучаются. Сравнительный анализ нуклеиновых кислот в разных группах организмов играет важную роль при решении вопросов систематики и эволюции. Каждый вид организмов содержит специфичные нуклеиновые кислоты (как РНК, так и ДНК). Степень сходства в строении нуклеиновых кислот указывает на уровень филогенетической близости организмов.
Нуклеозиды - соединения азотистого основания и углеводов (рибозы и дезоксирибозы). Нуклеозиды образуются за счет N-гликозидной связи между девятым атомом азота у пуриновых (первым атомом азота - у пиримидиновых) оснований и гидроксилом первого атома углерода рибозы или дезоксирибозы. Во избежание путаницы, нумерация атомов азотистых оснований осуществляется арабскими цифрами, а у атомов углерода рибоз - арабскими цифрами со “штрихом”.
пуриновые
[ Cкачайте файл, чтобы посмотреть картинку ]

пиримидиновые
13 EMBED PBrush 1415


[ Cкачайте файл, чтобы посмотреть картинку ]

Нуклеотиды отличаются от нуклеозидов наличием остатков фосфорной кислоты (от одного до трех), связанных простой эфирной связью с гидроксилом 5' атома углерода рибоз. Остатки фосфорных кислот между собой также связаны простой эфирной связью. В зависимости от числа остатков фосфорной кислоты в нуклеотидах различают моно-, ди- и трифосфонуклеотиды. Их номенклатура приведена в таблице:


азотистые
основания
нуклеозиды
нуклеотиды



полное название
Сокращенное

аденин
аденозин
Аденозинмонофосфат
АМФ

гуанин
гуанозин
Гуанозинмонофосфат
ГМФ

цитозин
цитидин
Цитидинмонофосфат
ЦМФ

урацил
уридин
Уридинмонофосфат
УМФ

тимин
тимидин
тимидинмонофосфат
ТМФ

Собственно нуклеиновые кислоты представляют собой полинуклеотидмоно-фосфаты. Полимерная цепь образуется за счет фосфодиэфирной связи между 3'- гидроксилом одного нуклеотида и 5'- гидроксилом другого. Таким образом, первичная структура нуклеиновых кислот представляет собой порядок чередования нуклеотидов в полинуклеотидной цепи. Один из концов этой цепи (изображаемый слева) имеет свободный гидроксил при 5' - атоме С, а другой (изображаемый справа) - свободный гидроксил при 3'- атоме углерода рибоз. Поскольку основой нуклеиновых кислот является сахарофосфатный остов, в сокращенных написаниях участков цепи используют лишь однобуквенные символы, соответствующего азотистого основания. Полное и схематичное обозначения участка полинуклеотидной цепи приведены ниже:
5'-НО-G-A-A-T-C-T-A-C-A-3'
Вследствие наличия сильно диссоциирующих фосфатных групп, нуклеиновые кислоты легко образуют связи с основными белками с образованием нуклеопротеинов. Протеины отделяются от НК детергентами или после расщепления белков протеиназами НК осаждаются спиртом.
Подобно белкам, ДНК имеют первичную, вторичную и третичную структуру.


5.2. Первичная структура
Первичная структура есть последовательность чередования нуклеотидов в цепи ДНК и РНК. Сложность расшифровки структуры связана с наличием всего 4-х видов нуклеотидов при их огромном числе в молекуле.



5.3. Состав ДНК
Исследуя нуклеотидный состав нативных ДНК различного происхождения, Чаргафф обнаружил следующие закономерности.
Все ДНК независимо от их происхождения содержат одинаковое число пуриновых и пиримидиновых оснований. Следовательно, в любой ДНК на каждый пуриновый нуклеотид приходится один пиримидиновый.
Любая ДНК всегда содержит в равных количествах попарно аденин и тимин, гуанин и цитозин, что обычно обозначают как А=Т и G=C. Из этих закономерностей вытекает третья.
Количество оснований, содержащих аминогруппы в положении 4 пиримидинового ядра и 6 пуринового (цитозин и аденин), равно количеству оснований, содержащих оксо-группу в тех же положениях (гуанин и тимин), т. е. A+C=G+T. Эти закономерности получили название правил Чаргаффа. Наряду с этим было установлено, что для каждого типа ДНК суммарное содержание гуанина и цитозина не равно суммарному содержанию аденина и тимина, т. е. что (G+C)/(A+T), как правило, отличается от единицы (может быть как больше, так и меньше ее). По этому признаку различают два основных типа ДНК: А-Т-тип с преимущественным содержанием аденина и тимина и G-C-тип с преимущественным содержанием гуанина и цитозина.
Величину отношения содержания суммы гуанина и цитозина к сумме содержания аденина и тимина, характеризующую нуклеотидный состав данного вида ДНК, принято называть коэффициентом специфичности. Каждая ДНК имеет характерный коэффициент специфичности, который может изменяться в пределах от 0,3 до 2,8. При подсчете коэффициента специфичности учитывается содержание минорных оснований, а также замены основных оснований их производными, например, при подсчете коэффициента специфичности для ДНК зародышей пшеницы, в которой содержится 6% 5-метилцитозина. Последний входит в сумму содержания гуанина (22,7%) и цитозина (16,8%). Смысл правил Чаргаффа для ДНК стал понятным после установления ее пространственной структуры.


5.4. Состав РНК
Первые сведения о нуклеотидном составе РНК относились к препаратам, представляющим собой смеси клеточных РНК (рибосомных, информационных и транспортных) и называемым обычно суммарной фракцией РНК. Правила Чаргаффа в этом случае не соблюдаются, хотя определенное соответствие между содержанием гуанина и цитозина, а также аденина и урацила все же имеет, место.
Данные, полученные в последние годы при анализе индивидуальных РНК, показывают, что и на них правила Чаргаффа не распространяются. Однако различия в содержании аденина и урацила, а также гуанина и цитозина для большинства РНК невелики и что, следовательно, тенденция к выполнению указанных правил все же наблюдается. Этот факт объясняется особенностями макроструктуры РНК.
Характерными структурными элементами некоторых РНК являются минорные основания. Соответствующие им нуклеотидные остатки обычно входят в состав транспортных и некоторых других РНК в очень небольших количествах, поэтому определение полного нуклеотидного состава таких РНК представляет собой иногда весьма сложную задачу.
ФРАГМЕНТ МОЛЕКУЛЫ РНК. Основное отличие от ДНК – наличие группировок ОН в рибозе (красный цвет) и фрагмента урацила (синий цвет).
5.5. Вторичная структура нуклеиновых кислот
В 1953 г. Уотсон и Крик, опираясь на известные данные о конформаци нуклеозидных остатков, о характере межнуклеотидной связи в ДНК и закономерности нуклеотидного состава ДНК (правила Чаргаффа), расшифровали рентгенограммы паракристаллической формы ДНК (так называемой В-формы, образующейся при влажности выше 80% и при высокой концентрации противоионов (Li+) в образце). Согласно их модели, молекула ДНК представляет собой правильную спираль, образованную двумя полидезоксирибонуклеотидными цепями, закрученными относительно друг друга и вокруг общей оси. Диаметр спирали практически постоянен вдоль всей ее длины и равен 1,8 нм (18 Е).

13 EMBED Photoshop.Image.8 \s 1415
Макромолекулярная структура ДНК.
(а) Модель Уотсона Крика;
(б) параметры спиралей В-, С- и Т-форм ДНК (проекции перпендикулярно оси спирали);
(в) поперечный разрез спирали ДНК в В-форме (заштрихованные прямоугольники изображают пары оснований);
(г) параметры спирали ДНК в А-форме;
(д) поперечный разрез спирали ДНК в А-форме.
Длина витка спирали, который соответствует ее периоду идентичности, составляет 3,37 нм (33,7 Е). На один виток спирали приходится 10 остатков оснований в одной цепи. Расстояние между плоскостями оснований равно, таким образом, примерно 0,34 нм (3,4 Е). Плоскости остатков оснований перпендикулярны длинной оси спирали. Плоскости углеводных остатков несколько отклоняются от этой оси (первоначально Уотсон и Крик предположили, что они параллельны ей).
Из рисунка видно, что углеводофосфатный остов молекулы обращен наружу. Спираль закручена таким образом, что на ее поверхности можно выделить две различные по размерам бороздки (их часто называют также желобками) большую, шириной примерно 2,2 нм (22 Е), и малую шириной около 1,2 нм (12 Е). Спираль правовращающая. Полидезоксирибонуклеотидные цепи в ней антипараллельны: это означает, что если мы будем двигаться вдоль длинной оси спирали от одного ее конца к другому, то в одной цепи мы будем проходить фосфодиэфирные связи в направлении 3' - 5', а в другой в направлении 5' - 3'. Иными словами, на каждом из концов линейной молекулы ДНК расположены 5'-конец одной и 3'-конец другой цепи.
Регулярность спирали требует, чтобы против остатка пуринового основания в одной цепи находился остаток пиримидинового основания в другой цепи. Как уже подчеркивалось, это требование реализуется в виде принципа образования комплементарных пар оснований, т. е. остаткам аденина и гуанина в одной цепи соответствуют остатки тимина и цитозина в другой цепи (и наоборот).
Таким образом, последовательность нуклеотидов в одной цепи молекулы ДНК предопределяет нуклеотидную последовательность другой цепи.
Этот принцип является главным следствием модели Уотсона и Крика, поскольку он в удивительно простых химических терминах объясняет основное функциональное назначение ДНК быть хранителем генетической информации.
Образование вторичной структуры НК возможно вследствие проявления эффектов комплементарности и стэкинг-взаимодействий Очень часто наблюдаются двунитевые спирализованные молекулы ДНК, замкнутые в кольцо с ковалентно связанными концами. Они не имеют разрывов у каждой в отдельности полинуклеотидной цепи. Подобные кольцевые ДНК, как правило, суперспирализованы, то есть кольцо дополнительно закручено в спираль. Суперспирализация - правило, а не исключение, при условии отсутствия разрывов в фосфодиэфирных связях полинуклеотидной цепи.
Комплементарность - последовательность нуклеотидов в одной цепи автоматически определяет строго соответствующую ей последовательность нуклеотидов в комплементарной ей цепи. Так, азотистое основание аденин (А) всегда взаимодействует только с комплементарным ему азотистым основанием тимин (Т) в молекулах ДНК. Одновременно азотистые основания гуанин (Г) одной цепи взаимодействует только с комплементарними им азотистыми основаниями цитозин (Ц) другой цепи (как в ДНК, так и в РНК). Комплементарность оснований обеспечивается системой водородных связей. В молекулах РНК, имеющих, в основном, однонитевую структуру, на отдельных участках, азотистые основания А взаимодействуют с комплементарными им азотистыми основаниями У.
[ Cкачайте файл, чтобы посмотреть картинку ]
Аналогично происходит взаимодействие в процессах транскрипции, когда на матрице ДНК синтезируется молекула РНК (матричная, транспортная и т.д.), и наоборот, когда при участии реверс-транскриптазы происходит синтез кДНК на матрице РНК.
Стэкинг-взаимодействия – особого рода (Ван-дер-Ваальсовы) взаимодействия между сложенными в стопку (как монеты) друг над другом азотистых оснований.
Имеются А, В, С и Z-формы двунитевых участков ДНК, отличающиеся наклонами плоскостей азотистых оснований друг относительно друга ( у А- 20є, В- 0є, С- 5є, Z- особая ломанная форма).
[ Cкачайте файл, чтобы посмотреть картинку ]
SBS (side-by-side) – форма (бок о бок). Две цепи расположены прямо и незакручены.
5.6. Природа межнуклеотидных связей
Работы по определению способа соединения нуклеотидов в полимерных молекулах НК были успешно завершены в начале 50-х годов сразу после того, как была установлена структура нуклеотидов и изучены некоторые свойства их производных (главным образом эфиров). К этому же времени были разработаны методы выделения и очистки ДНК и РНК, так что исследование природы межмономерных связей проводилось с использованием чистых, хотя и сильно деградированных препаратов НК.
Первые сведения о типе межмономерной, или, как ее принято называть, межнуклеотидной связи были получены с помощью потенциометрического титрования. Эти сведения свидетельствовали о наличии, как в РНК, так и в ДНК только одной гпдроксильной группы у каждой фосфатной группы (рКа~1). На основании этого было сделано заключение, что НК содержит структурную единицу дизамещенной фосфорной кислоты.
Естественно было предположить, что фосфатные остатки «сшивают» нуклеозиды за счет двух своих гидроксилов, а один остается свободным. Оставалось выяснить, какие части нуклеозидных фрагментов участвуют в образовании связи с фосфатными группами.
Поскольку НК могут быть дезаминированы действием азотистой кислоты, очевидно, что аминогруппы пиримидиновых и пуриновых оснований не принимают участия в образовании межнуклеотидной связи. Помимо этого потенциометрическое титрование указывало, что и оксо (окси)-группы остатков гуанина и урацила, входящих в состав НК, свободны. На основании этих данных было сделано заключение о том, что межнуклеотидные связи образованы фосфатной группой и гидроксильными группами углеводных остатков (т. е. что они являются фосфодиэфирными), которые, следовательно, и являются ответственными за образование полимерной цепи (НК). Таким образом, то, что принято обычно называть межнуклеотидной связью, представляет собой по существу узел, включающий систему связей:
[ Cкачайте файл, чтобы посмотреть картинку ]
(где С первичный или вторичный атомы углерода остатка углевода). При гидролизе ДНК и РНК в зависимости от условий реакции, образуются нуклеотиды с разным положением фосфатного остатка:
[ Cкачайте файл, чтобы посмотреть картинку ]
Если предположить, что в НК все межнуклеотидные связи идентичны, то, очевидно, что они могут включать помимо фосфатного остатка только 3'-гидроксильную группу одного нуклеозидного звена и 5'-гидроксильную группу другого нуклеозидного звена. В случае же их неравноценности в полимерной цепи ДНК могли бы одновременно существовать три типа связей: 3'5', 3'3' и 5'5'. Для РНК за счет участия 2'-гидpoкcильнoй группы число типов связи должно было быть еще больше.
Установить истинную природу межнуклеотидных связей в нативных ДНК и РНК удалось в результате направленного расщепления биополимеров с помощью химического и ферментативного гидролиза и последующего выделения и идентификации полученных при этом фрагментов.


5.7. Межнуклеотидная связь в ДНК
Химический гидролиз ДНК как метод деградации полимера с целью установления природы межнуклеотидной связи оказался практически непригодным. ДНК не расщепляется при щелочных значениях рН, что хорошо согласуется с предположением о фосфодиэфирной природе межнуклеотидной связи (устойчивость диалкилфосфатов в щелочной среде обсуждалась в разделе). При обработке кислотой даже в мягких условиях ДНК расщепляется как по фосфодиэфирным, так и по N-гликозидным связям, образованным пуриновыми основаниями. Вследствие этого расщепление полимера протекает неоднозначно, но из продуктов кислотного гидролиза ДНК все же удалось выделить дифосфаты пиримидиновых дезоксинуклеозидов, которые оказались идентичными синтетическим 3',5'-дифосфатам дезоксицитидина и дезокситимидина:
[ Cкачайте файл, чтобы посмотреть картинку ]
Здесь же важно отметить, что наличие этих соединений в продуктах деградации ДНК указывает на участие обеих гидроксильных групп, по крайней мере, пиримидиновых мономерных компонентов, в образовании межнуклеотидной связи.
Более специфическим оказалось ферментативное расщепление ДНК. При обработке препаратов ДНК фосфодиэстеразой (ФДЭ) змеиного яда полимер практически полностью гидролизуется до дезоксннуклеозид-5'-фосфатов, структура которых была Остановлена сравнением с соответствующими нуклеотидами, полученными встречным синтезом.
[ Cкачайте файл, чтобы посмотреть картинку ]
Эти данные свидетельствуют об участии 5'-гидроксильных групп всех четырех дезоксинуклеозидов, входящих в состав ДНК, в образовании межнуклеотидной связи. Аналогично, но до 3'-фосфатов дезоксинуклеозидов расщепляется ДНК в присутствии ФДЭ, выделенной из микрококков или из селезенки.
[ Cкачайте файл, чтобы посмотреть картинку ]
Из данных гидролиза ДНК фосфодиэстеразами различной специфичности становится очевидным, что связь нуклеозидных остатков в ДНК осуществляется фосфатной группой, которая одновременно этерифицирует гидроксильную группу у вторичного атома углерода (положение 3') одного нуклеозидного звена и гидроксильную группу у первичного атома углерода (положение 5') другого нуклеотидного звена.
Таким образом, было убедительно доказано, что в ДНК межнуклеотидная связь осуществляется за счет фосфатной группы, а также 3'- и 5'-гидроксильных групп нуклеозидных остатков [(а) и (б) направления расщепления полинуклеотидной цепи ДНК фосфодиэстеразами соответственно змеиного яда и селезенки или микрококков]:
[ Cкачайте файл, чтобы посмотреть картинку ]

Предположение о возможности иного строения полимера с регулярно перемежающимися связями нуклеозидных остатков по типу 3'3' и 5'5' было отвергнуто, так как оно не удовлетворяло всем экспериментальным данным. Так, полимер такого типа не должен был бы полностью гидролизоваться (до мономеров) в присутствии ФДЭ змеиного яда, избирательно расщепляющей только алкиловые эфиры нуклеозид-5'–фосфатов. То же можно сказать о ФДЭ селезенки, селективно гидролизирующей алкиловые эфиры нуклеозид-3'-фосфатов.


5.8. Конформационный анализ ДНК
Молекула ДНК обычно находится в форме двойной спирали, образуемой двумя полинуклеотидными цепями, обвивающимися одна вокруг другой. Два дезоксирибозных остова, расположенные по периферии молекулы, имеют антипараллельную ориентацию. Наиболее часто встречается В-форма.




Сравнение типов спиралей

Тип спирали
A
B
C
D

Конформация сахара
C3-эндо
С2-эндо

Число пар на виток
11
10
9.33
8

Смещение пары от оси спирали, Е
4.7
0.2
-1.0
-1.8

Угол спирального вращения, °
32.7
36
38.6
45

Расстояние между нуклеотидами
вдоль оси спирали, Е
2.56
3.3-3.4
3.31
3.03

Уголь наклона пары, °
20
-6
-8
-16

Ширина желобков
Минорного
11.0
5.7
4.8



Главного
2.7
11.7
11.7


Глубина желобков
Минорного
2.8
7.5
7.5



Главного
13.5
8.5
8.5



Рис.1. Четыре наиболее устойчивые конформаций сахарного кольца в нуклеотиде.
Основная причина различия конформаций связана с геометрией сахарного кольца у форм В- и А-семейств. Фуранозное кольцо рибозы и дезоксирибозы неплоское. Обычно атом С2, либо атом СЗ выходят из плоскости других четырех атомов кольца. Если данный атом выдвинут в сторону 5'-углерода и расположен выше кольца, т.е. находится от него со стороны основания, то кольцо обладает эндоконформацией (рис.1). Если атом лежит ниже кольца, то получается экзоконформация. При изменения геометрии сахара с С2'-эндо (СЗ'-экзо) к СЗ'-эндо резко меняется расположение в пространстве выходящих из связей, что и соответствует перех переходу от В- к А-формам.
Главное структурное отличие А-формы от В-формы - это большое отверстие в центре спирали у А-формы, которое занимает почти половину диаметра всей спирали (d~20Е, у В-формы d~9Е). Молекулярным «переключателем» для перехода двойной спирали ДНК между семействами форм В- и А- служит сахарное кольцо пентозы.




5.9. Необычные структуры ДНК
К ним относятся крестообразные структуры, левозакрученная Z-форма (для нее характерно чередование пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов), различного рода тройные и четвертные спирали, структура со сдвинутыми петлями SLS [7].
Важное значение имеет проблема функционирования в клетке сверх скрученных кольцевых замкнутых ДНК. Для закрученного нормального двуспирального комплекса общее число оборотов
· одной нити относительно другой равно числу витков
· в ненапряженной двойной спирали плюс число супервитков
·, т.е.
·=
·+
·
Величина
· всегда положительна,
· может быть и отрицательным - это лево спиральные супервитки, противоположные по знаку двойные правые спирали.
Различные характеристики ДНК зависят от плотности супервитков (степени суперспиральности)
·, равной числу этих супервитков
· на 10 пар оснований в состоянии, когда все пары в двойной спирали закрыты. Для природных кольцевых молекул ДНК вирусов
·, чаще всего отрицательна. Наиболее типичное значение -
·=0,05 (-5 супервитков на 1000 пар оснований). С ростом плотности сверхспиральности
· вероятность раскрытия пары возрастает, причем наиболее резко в области изменения плотности от 0,06 до 0,12. Здесь начинают раскрываться не только отдельные пары, но и более протяженные области, что приводит к появлению крестообразных структур. Плотность сверхспирализации не может превысить некоторого предельного значения (
·=0,085), поскольку дальнейшее увеличение -
· будет компенсироваться соответствующим раскрытием пар оснований в двойной спирали [7].
Состояние сверхспирализации наблюдается не только у кольцевых ДНК, но также на отдельных участках линейной ДНК. Сверхспирализация отдельных доменов происходит под влиянием специальных белков, активирующих фермент ДНК-гиразу, который превращает «расслабленную» не сверхспирализованную ДНК в сверхспираль. Имеются данные о том, что транскрипция в клетке идет на ДНК, находящейся в напряженном сверхспирализованном состоянии.
Н-форма связана с существованием тройного комплекса, состоящего из двух полипиримидиновых (С-Т) цепей и только одной полипуриновой (A-G) цепи.
Структура со сдвинутыми петлями была обнаружена для ДНК и РНК. SLS-форма образуется, если в цепях ДНК содержатся короткие прямые повторы. Она получается при проскальзывании относительно друг друга комплементарных нуклеотидных цепей. При этом возникают две однонитевые петли, выступающие из каждой полинуклеотидной цепи и разделенные длиной повтора [7].
В растворе двухнитчатая ДНК имеет специфическую третичную структуру. В присутствии полиэтиленгликоля ДНК приобретает компактную форму тора. При этом наблюдается изменение КД (кругового дихроизма). По-видимому, одновременно происходит агрегация молекул ДНК. Диаметры торов варьируют от 80 до 140 нм. Образование тора есть обратимый конформационный переход [4].


5.10. Физические модели ДНК
Существуют две физические модели ДНК: модель гибкого стержня и модель спираль-клубок.
В обычных полимерных цепях гибкость определяется поворотной изомерией. Однако в модели, где ДНК представляется в виде упругого стержня, ее жесткость характеризуется двумя параметрами: жесткостью на изгиб оси и жесткостью кручения. Жесткость на изгиб оси двойной спирали определяет способность ДНК укладываться в вирусных частицах, хромосомах и т.д. Энергия изгиба цепочки, состоящей из N+1 звеньев или N+1 пар оснований, с углами 13EMBED Equation.31415между звеньями цепи имеет вид
13 EMBED Equation.3 1415
где 13EMBED Equation.31415 константа жесткости на изгиб двойной оси.
13EMBED Equation.31415
где l - длина звена, а - персистентная длина, kT - средняя энергия колебаний.
Отсюда, зная персистентную длину a=50,0 нм, можно найти 13EMBED Equation.31415Дж.13EMBED Equation.314156эВ. Жесткость на кручение или торсионная жесткость ДНК, определяется как изменение энергии при отклонении угла между соседними парами оснований от его равновесного значения. Согласно расчетам, числовое значение торсионной жесткости 13EMBED Equation.31415 для кольцевой полимерной цепи составляет 13EMBED Equation.31415=0,036 kT. При такой жесткости особое значение торсионная гибкость приобретает в случае замкнутых кольцевых молекул ДНК, состоящих из двух взаимно зацепленных одно нитевых колец. В обычных условиях угол (36°) между осями пар оснований, соседних по длине двойной спирали ДНК, испытывает отклонение ±5° вследствие тепловых колебаний. В то же время для перехода между разными формами ДНК (В- и С-формы) достаточно изменения этого угла всего на 2,5° . Отсюда следует, что в пределах семейства одного типа форм (В-формы) происходят непрерывные переходы из одной конформации в другую. По существу, разные участки одной и той же молекулы ДНК могут находиться одновременно в разных конформациях.
В модели гибкого стержня изменения конформации ДНК связываются с небольшим изгибом и кручением двойной спирали в каждой паре оснований, которые накапливаются на большой длине. В результате происходит непрерывное изгибание молекулы ДНК с образованием кольца диаметром около 10,0 нм. Согласно другой точке зрения, укладка двойной спирали при компактизации ДНК может происходить за счет редких изломов на большой угол вследствие нарушения межплоскостных (стекинг) взаимодействий между парами оснований. Наряду с флуктуационными изгибами оси спирали и поворотами соседних пар оснований в ДНК может происходить и раскрытие отдельных пар оснований. Хотя этот процесс идет с очень малой вероятностью, тем не менее, он приводит к сильным изменениям конформации и играет определяющую роль в реакциях ДНК с химическими агентами (например, с формальдегидом), которые могут реагировать лишь с раскрытыми нуклеотидами. Эти маловероятные, но значительные изменения структуры учитываются в моделях спираль-клубок. При обычных физиологических температурах в ДНК происходят в основном флуктуационные раскрытия отдельных пар оснований с вероятностями не более 10-5. Вероятности одновременного раскрытия двух и большего числа пар оснований соответственно на один и два порядка меньше.


5.11. Третичная структура ДНК
ДНК имеют линейную, кольцевую, 2-х и 1-о цепочечную формы.
Двухцепочечные ДНК с "липкими" концами могут образовывать кольцо, которое далее ковалентно сшивается по сахарофосфатной цепи при помощи ДНК-лигазы.
Третичная структура ДНК у эукариотических клеток отличается тем, что многократная спирализация ДНК сопровождается образованием комплексов с белками.
46 хромосом (хроматид) человека организованы в 23 пары. Средняя длина хромосомы составляет 130 млн. пар оснований и имеет длину 5 см. Хромосома №1- 263 млн. п.о., хромосома № 46 –меньше 50 млн. п.о. Если проложить все ДНК в В-конформации в линию, то их общая длина превысит 2 метра. Человеческая хромосома 16 имеет 2,5 мкм в длину, а длина самой ДНК- 3,7 см.
Понятно, что уместить такой длины ДНК в ядре возможно только путем ее определенной упаковки. При образовании третичной структуры ДНК человека происходит в среднем уменьшение ее размеров в 100 тысяч раз.

При образовании третичной структуры нуклеиновых кислот возможно образование трех и четырех нитевых участков. Образование трех нитевых участков благодаря так называемым Хугстэновским взаимодействиям (Hoogsteen base pairs), когда одновременно взаимодействуют три основания: А-А-Т, Т-А-Т, Г-Г-Ц, Ц-Г-Ц.
Аналогичным образом происходит образование тетрамерных участков ДНК. Точный биологический смысл появления трех и четырех нитевых участков ДНК пока не выяснен. Имеются только лишь предположения о том, что такие участки возникают в местах, наиболее ответственных за процессы репликации и транскрипции.
Материал хромосом – хроматин – содержит кроме самой ДНК также гистоны, негистоновые белки, небольшое количество РНК. Нуклеосомный кор содержит октамер гистонов (2 х (Н2а+Н2b+H3+H4)).
Гистон – простой белок (примерно 50% хроматина). Нуклеосомный корпус образуется при оборачивании октамера гистонов двунитевой спирализованной ДНК на 1,5 оборота, отдельно включается дополни-тельный белок – гистон Н1. Все вместе называется хроматосомом.
Н1 – очень богат ЛИЗ; Н2а, Н2b – умеренное количество ЛИЗ; Н3 – есть ЦИС, умеренно - АРГ; Н4 – богат АРГ и ГЛИ.
Хроматосомы образуются на двунитевой спирали ДНК на дистанциях от 20 до 90 пар нуклеотидов и напоминают нанизанные на нитку бусины. Следующий этап- сворачивание в спираль очень длинной последовательности “бус”. Эта спираль, в свою очередь, претерпевает сворачивание в двужильные канаты, из которых образуются гроздья, являющиеся небольшой частью хромосомы:
[ Cкачайте файл, чтобы посмотреть картинку ]


5.12. Межнуклеотидная связь в РНК
Уже на первых этапах изучения строения РНК был установлен факт чрезвычайной неустойчивости се при щелочном гидролизе. Основными продуктами щелочного гидролиза РНК являются рибонуклсозид-2'- и рибонуклеозид-3'-фосфаты, образующиеся практически в равных количествах.
[ Cкачайте файл, чтобы посмотреть картинку ]
Рибонуклеозид-5'-фосфаты при этом не образуются. Эти данные не укладывались в представления о фосфодиэфирной природе межнуклеотидной связи в РНК и требовали всестороннего изучения. Очень важную роль в таком исследовании, которое выполнили в начале 50-х гг. Тодд с сотрудниками, сыграли синтетические алкиловые эфиры рибонуклеотидов, которые были получены специально, чтобы промоделировать тот или иной тип фосфодиэфирной связи.
Полученные школой Тодда данные о механизмах превращения алкиловых эфиров рибонуклеотидов в щелочной среде позволили предположить, что в РНК, так же как и в ДНК, межнуклеотидная связь осуществляется фосфатной группой и 3'- и 5'-гидроксильными группами углеводных остатков. Подобная связь в РНК должна очень легко расщепляться в щелочной среде, так как соседняя 2'-гидроксильная группа должна катализировать этот процесс при рН>10, когда начинается ионизация гидроксильных групп рибозы. Очень важно подчеркнуть, что промежуточными соединениями при щелочном расщеплении должны быть все четыре рибонуклеозид-2',3'-циклофосфата, а конечными образующиеся при их гидролизе рибонуклеозид-3'-фосфаты и рибонуклеозид-2'-фосфаты (четыре пары изомеров).
Данные щелочного гидролиза ограничили количество возможных для РНК типов межнуклеотидных связей, но не прояснили вопроса о том, как построен этот полимер.
Более точные сведения о типе межнуклеотидной связи в РНК, как и в случае ДНК, были получены с помощью ферментативного гидролиза.
Гидролиз РНК с использованием ФДЭ змеиного яда, протекающий до рибонуклеозид-5'-фосфатов, подтвердил уже прямым путем предположение об участии 5'-гидроксильных групп в образовании фосфодиэфирной связи между мономерными звеньями. Позднее это было окончательно установлено в результате открытия фосфоролиза РНК в присутствии фермента полинуклеотидфосфорилазы (ПНФаза), приводящего к образованию рибонуклеозид-5'-пирофосфатов:

Таким образом, оставалось выяснить природу второй гидроксильной группы, участвующей в образовании межнуклеотидной связи. Частично решить эту задачу помог еще один фермент, который использовался для направленного расщепления РНК, пиримидиловая рибонуклеаза (РНаза).
Ранее было показано, что этот фермент расщепляет только алкиловые эфиры пиримидиновых рибонуклеозид-3'-фосфатов до рибонук-леозид-3'-фосфатов (через промежуточный рибонуклеозид-2',3'-циклофосфат). Оказалось, что аналогичным образом этот фермент действует и на РНК. В экспериментах с любыми образцами очищенной РНК было обнаружено, что количество фосфорной кислоты, которая образуется при обработке полимера последовательно пиримидиловой РНазой и фосфомоноэстеразой (ФМЭ), а также количество иодной кислоты, затрачиваемой на последующее окисление, эквивалентно количеству остатков пиримидинов в данном образце РНК. Это говорило в пользу того, что, по крайней мере, пиримидиновые нуклеотиды в РНК связаны с соседними нуклеотидами только посредством 3'5'-межнук-леотидной связи. Этот вывод подтверждают данные щелочной обработки ферментативных гидролизатов РНК, полученных после действия на нее РНК-азы: в щелочной среде миграция фосфатного остатка в рибонуклеозид-3'- и -2'-фосфатах невозможна, и наличие в соответствующих гидролизатах только пиримидиновых рибонуклеозид-З'-фосфатов делает очевидным 3'5'-тип межнуклеотидной связи для пиримидиновых нуклеотидов.


5.13. Макромолекулярная структура тРНК
РНК состоит из одной полинуклеотидной цепи, закрученной на себя, образует короткие двуспиральные шпильки в палиндромных участках (Г с Ц, А с У). Различают три вида РНК: рибосомная (рРНК) – 80%, транспортная (тРНК) -15%, и информационная или матричная (мРНК) – 5%. тРНК - самые мелкие молекулы (ММ=23-30 тыс.). Они являются переносчиками аминокислот. Каждая тРНК переносит только одну аминокислоту, но на одну аминокислоту имеется более одной тРНК. Всего известно 61 тРНК.
[ Cкачайте файл, чтобы посмотреть картинку ]
Строение тРНК. Имеет акцептирующий участок (присоединяет АК, при участии АТФ), общий участок (петля дигидроуридина) обеспечивает связь со специфическим ферментом, характерный участок (петля псевдо урацила) всегда содержит последовательность 5'-TЦГ-3', этой петлей взаимодействует с рибосомой. Антикодонавая петля – содержит 3 нуклеотида, комплементарных кодону данной аминокислоты в мРНК, например, кодону 5'-ГЦЦ-3' в мРНК соответствует антикодон 3'-ЦГГ-5' в тРНК. Этим обеспечивается специфичность взаимодействия с матричной РНК.


5.14. Физико-химические свойства ДНК
Молекулярная масса ДНК определяется рядом методов, в том числе: а) ультрацентрифугированием в градиенте CsCl (ММ от 200000 до 109);
б) по вязкости растворов (М > 109, поскольку при центрифугировании такие длинные молекулы разрываются под действием собственного веса).

Вязкость
Растворы нативной ДНК очень вязкие. Однако это не означает, что вся макромолекула ДНК является жестким стержнем. Данные, полученные методами рассеяния света, седиментации, вискозиметрии показывают, что двойная спираль нативной ДНК свернута в рыхлый клубок [3].
Константа седиментации
Характерестическая вязкость

Мол. вес 3
·105- 4
·106
S=0,116 M0,325
Мол. вес 3
·105- 2
·106
[
·]=1,05
·10-7 M1,32

Мол. вес 4
·106- 1,3
·108
S=0,034 M0,405
Мол. вес 2
·106- 1,3
·108
[
·]=6,9
·10-4 M0,7


Уравнение Флори - Манделькерна:
13EMBED Equation.31415
где М
· -средневесовая молекулярная масса полимера, S – константа седиментации, [
·] - характеристическая вязкость,
·0- вязкость растворителя, NA - число Авогадро,
· - плотность растворителя,
· - эмпирический коэффициент.
Для ДНК
·=2,5
·106 и
·=2,2
·106 для денатурированной [3].
Формулы Зимма и Крозера:
13EMBED Equation.31415
13EMBED Equation.31415

Оптические свойства
Поглощение света хромофорными группами зависит от дипольных моментов перехода, в частности от их взаимодействия, если они находятся близко друг от друга, как это имеет место в двойной спирали ДНК. В случае, когда дипольные моменты перехода расположены хаотически, взаимодействия их взаимно нейтрализуются. При переходе спиральклубок будет наблюдаться увеличение оптической плотности - гиперхромный эффект, а при переходе клубок-спираль - уменьшение оптической плотности, т.е. гипохромный эффект.
Если нанести тонкую пленку полинуклеотида из раствора на кварц, подсушить и осторожно ориентировать растяжением, то макромолекулы ЦНК оказываются ориентированными преимущественно вдоль оси растяжения. Такой образец обладает большим дихроизмом, т.е. по-разному поглощает свет, поляризованный вдоль направления ориентации пленки и перпендикулярно ей. На рис. представлены кривые дихроизма в ориентированных пленках полицитидиловой кислоты.

Кривые дихроизма в ориентированных пленках попицитидиловой кислоты Электрический вектор: 1-
·. оси спирали
2-| | оси спирали
Максимум поглощения приходится на 270 нм. Поглощается главным образом свет, поляризованный перпендикулярно оси макромолекулы. Это означает, что дипольные моменты перехода ориентированы перпендикулярно оси спирали, т.е. лежат в плоскости гетероциклических оснований. В случае полинуклеотидов свет поглощается электронами гетероциклических ядер.
Эти электроны образуют делокализованные
·-орбиты, и поглощение означает переход электрона с
·-орбиты на возбужденный уровень
·
·* [3].
Более слабый максимум поглощения наблюдается при 280 нм. К гетероциклическому кольцу присоединены такие группы (например, С=О), в которых электроны локализованы и не входят в сопряженную систему
·-связей. Электрон, локализованный в связи С=О - n-состояние, может быть возбужден на
·*-уровень, т. е. переходит в кольцо. Дипольные моменты перехода расположены перпендикулярно плоскости кольца. Сильнее поглощается свет, поляризованный параллельно оси макромолекулы [3].

Молекулы, которые не могут быть совмещены со своим зеркальным изображением, называются хиральными. Один из источников хиральности -образование спиральных конформаций. Спираль может быть правой и левой. В растворе хиральных молекул электромагнитное излучение, поляризованное по кругу вправо или влево, имеет различные показатели преломления и различные молярные коэффициенты экстинкции (коэффициенты пропорциональности между оптической плотностью с одной стороны, и толщиной поглощающего слоя и концентрацией вещества с другой). Различие молярных коэффициентов экстинкции для излучения, поляризованного по кругу вправо
·R и влево
·L, называется круговым дихроизмом. Коэффициент дихроичного поглощения: 13EMBED Equation.31415
·
·=
·L -
·R является функцией длины волны.
КД ДНК имеет положительный максимум при 273 нм и отрицательный - при 243 нм. При нагревании раствора КД начинает увеличиваться, проходит через максимум при 45° и затем падает до величины меньше первоначальной при 80 (рис.1). Это превращение при охлаждении обратимо [45].
КД спектры очень чувствительны к изменению конформации биополимеров. На рис.2 приведены КД-спектры ДНК в А-, В- и С-форме [46].

Биополимеры обладают естественной оптической активностью, т. е вращают плоскость поляризации света.
Оптическая активность [
·] сильно зависит от длины волны света (уменьшается с ростом длины волны).
В полосе поглощения света вращение становится особенно большим аномальная дисперсия оптической активности [3].

Рис 3. Аномальная дисперсия оптической активности ДНК фага - 2
1-нативная ДНК
2-ДНК, подвергавшаяся нагреванию до 100 0С







5.15. Денатурация и ренатурация
Денатурация ДНК сводится к разрушению двойной спирали. Нагревание раствора нативной ДНК вызывает разделение двойной спирали на две цепи, сворачивающиеся в статистические клубки. При этом значительно уменьшаются вязкость и оптическая активность.
При денатурации гипохромизм исчезает, т.е. на 30-40% возрастает интенсивность поглощения в области 260 нм [13].
Для определения средней степени перехода
· т.е. доли звеньев, находящихся в клубкообразном состоянии, можно использовать соотношение:
13EMBED Equation.31415,
где через 13EMBED Equation.31415и 13EMBED Equation.31415обозначено поглощение ДНК в полностью спиральном и полностью клубкообразном состоянии соответственно.

Денатурация происходит также при увеличении рН раствора до уровня, при котором разрушаются водородные связи между основаниями.
Поскольку для разрушения двух водородных связей АТ-пар требуется меньше энергии, чем для разрыва трех водородных связей GC-nap, значения температуры и рН, при которых происходит денатурация, зависят от нуклеотидного состава ДНК.
Рис.4.
- изменение оптической плотности
- изменение оптической активности
Падение характеристической вязкости
В качестве простейшей характеристики плавления данной ДНК обычно используют температуру плавления Tm, которая определяется как температура, при которой половина звеньев молекулы находится в клубкообразном состоянии. Линейная зависимость температуры плавления ДНК от содержания GC- пар дает при экстраполяции предельные значения Tm=69 С для поли-AT и 110°С для поли-GC, хорошо согласующиеся с экспериментальными значениями для соответствующих синтетических полинуклеотидов (65 и 104°С) [4].
При заданном составе растворителя температура плавления:
13EMBED Equation.31415
где через ТAT и TGC обозначены температуры плавления молекул ДНК, состоящих только из AT- и только из GC-nap, соответственно; xGC доля GC-пар.
Температура плавления ДНК растет с увеличением ионной силы раствора приблизительно пропорционально логарифму концентрации катионов. При физиологических условиях в растворе Tm=85-95°С.
Tm возрастает на 16,6°C при каждом десятикратном увеличении концентрации моновалентных ионов [13].
Кривая плавления ДНК, т.е. зависимость
· от T, обладает тонкой структурой, если длина ДНК не превышает несколько десятков тысяч пар оснований. Особенно ярко эта тонкая структура проявляется на дифференциальной кривой плавления, т.е. зависимости 13EMBED Equation.31415. Пример такой дифференциальной кривой приведен на рис.5. Конкретный профиль плавления, который отражают такие кривые, определяется последовательностью оснований в исследуемой ДНК.

Рис. 5 Экспериментальная (1) и теоретическая (2) дифференциальные кривые плавления ДНК фага fd, содержащего 2528 пар оснований.
Теоретический и экспериментальный анализы показали, что пики на дифференциальных кривых плавления связаны с выплавлением в интервале в несколько десятых градуса отдельных участков молекулы с характерным размером в несколько сотен пар оснований.
Кольцевые замкнутые ДНК, фигурирующие в фагах и бактериях, вследствие топологической невозможности свободного раскручивания с образованием петель, должны плавиться при более высокой температуре, чем те же ДНК в линейной форме.
Денатурация - процесс обратимый, последующее восстановление двухцепочечной структуры ДНК может происходить даже при полном расхождении цепей. Процесс воссоединения, называемый ренатурацией или отжигом, происходит при понижении температуры или рН. Если температура или рН понижаются постепенно, то цепи соединяются правильно, с восстановлением всех исходных пар оснований. При резком понижении температуры или рН правильное воссоединение затрудняется из-за спаривания оснований локально комплементарных участков в пределах одной или разных цепей.
Как и в случае ДНК, двухцепочечные участки в РНК разрушаются при повышении температуры или рН, но, в отличие от ДНК, при высоких значениях рН в РНК разрушаются и фосфодиэфирные связи. Поскольку протяженность спирализованных участков в одноцепочечной РНК невелика, а сами спирали несовершенны, разрушаются они довольно легко. Однако полностью комплементарная двухцепочечная РНК плавится в довольно узком температурном интервале, как и двухцепочечная ДНК.


5.16. Кинетика расплетания двойной спирали
Расплетание возникает после разрыва связей между цепями. Если допустить, что оно происходит в результате вращательного броуновского движения, то этот процесс потребует времени
· гораздо большего, чем наблюдаемое. Кун рассмотрел разделение цепей, происходящее при сочетании вращательного теплового движения с поступательным, и получил для ДНК с молек. массой 13 EMBED Equation.3 1415
· порядка 1 мин, что слишком много.
Время расплетания существенно уменьшается, если учесть вращательный момент, возникающий вследствие разделения цепей (Лонгет-Хиггинс и Зимм, 1960). Момент этот равен
13EMBED Equation.31415,

·=36/57,3 - выраженный в радианах угол, на который нужно повернуть конец цепи для освобождения одной пары оснований. Скорость раскручивания, т. е. относительная угловая скорость двух половин спирали, есть13EMBED Equation.31415, где
·- коэффициент трения. Для спиралей с молек. массой порядка 106
· оказывается порядка секунд. Эта оценка не учитывает необратимости расплетания и перепутывания освободившихся цепей.
Мэсси и Зимм (1969) исследовали денатурацию ДНК релаксационными методами и установили зависимость
· от ряда факторов.
13EMBED Equation.31415
где 0<
·<1- фактор, характеризующий стадию перехода, с - концентрация
ДНК, [
·] – ее характеристическая вязкость,
·0 вязкость растворителя, b - константа, зависящая от ионной силы. При малых с значение
·~M, повышение
· от начала перехода к концу показывает, что сопротивление среды возрастает по мере развертывания молекулы [4].
Варшавский и Евдокимов изучали расплетание ДНК методом теплового удара. Раствор ДНК нагревался от 5 до 20°С в течение 0,5 с. Кинетические кривые свидетельствуют о наличии не менее двух стадий структурного перехода. В первой, быстрой, стадии исчезает почти весь гипохромный эффект. По-видимому, на этой стадии образуются неподвижные петли, полное расплетание которых происходит на второй стадии. Скорость расплетания следует уравнению Аррениуса, энергия активации процесса сильно зависит от рН, имея максимальное значение при промежуточных рН [4].


5.17. Термодинамика плавления двойной спирали (переходов спираль - клубок)
Рассмотрим простую двойную спираль, построенную из двух комплементарных гомополинуклеотидных цепей. В области перехода спираль-клубок такая молекула состоит из чередующихся спиральных и неупорядоченных участков петель. Если обозначить число разорванных пар N1, число связанных пар N2 и число двуспиральных участков, равное числу петель, n, то свободная энергия системы запишется в виде:
13EMBED Equation.31415
где G1 и G2 - свободные энергии полностью разделенных и полностью двуспиральных молекул, отнесенные к одной паре оснований, GS - свободная энергия, необходимая для возникновения петли, т. е. расплавленной области между двумя спиральными. S0 энтропия смешения спиральных и не спиральных участков, т. е. (в расчете на моль)
13EMBED Equation.31415
Минимум G при данной температуре соответствует условию
13EMBED Equation.31415
где 13EMBED Equation.31415есть фактор кооперативности. Чем меньше
·, тем больше кооперативность. Равновесные значения N1 ,N2 и n находятся путем дифференцирования G по N1 , причем N2 =N-N1 , где N константа. Приравняв
·G/
·N1 нулю, получаем:
13EMBED Equation.31415
Таким образом, гомополимер в области перехода является последовательностью спиральных и не спиральных участков, размеры которых определяются
·. Это связано с одномерностью системы, которая, согласно теореме Ландау и Лившица, не может разделиться на фазы.
Кривая плавления, т. е. зависимость доли неупорядоченных пар 13EMBED Equation.31415 (
·- степень спиральности) от T, идет тем круче, чем меньше
·.
При
·=1 кооперативность отсутствует;
при
· =0 кооперативность полная. В середине интервала плавления модуль производной 13EMBED Equation.31415 максимален и интервал определяется условием
13EMBED Equation.31415.
Расчет, основанный на модели Изинга, дает:
13EMBED Equation.31415,
где
·H - разность энтальпий спиральной и не спиральной молекул в расчете на пару оснований. Из экспериментальных значений
·T для синтетических гомополинуклеотидов получается
·~10-4-10-5, т.е. GS
·30 кДж/моль. Степень кооперативности очень высока [4].
Рассмотрение гетерогенности требует учета двух факторов - различий стабильности пар AT и GC и добавочного укрепления или ослабления двойной спирали лигандами. Эти факторы влияют по-разному, т.к. лиганды могут перераспределяться по цепи в процессе плавления, а первичная структура неизменна. Допустим, что m1 молекул лиганда связано не спиральными и m2 спиральными участками полимера. Тогда
где g1 и g2 - свободные энергии лигандов соответственно в не спиральных и спиральных участках. Последний член содержит энтропию смешения полимера с лигандами. Условие минимума
·G/
·n=0 такое же, как и в предыдущем случае, т.е. средняя длина спиральных участков при данном
· не зависит от присутствия лигандов. С другой стороны, из условия
·G/
·N1=0 получается:
13EMBED Equation.31415,
где c1=m1/N1, c2=m2/N2. Эти концентрации лигандов выражаются через концентрацию лиганда в растворе c0 и константы связывания K1 и K2
13EMBED Equation.31415,13EMBED Equation.31415.
Кривая плавления гомополиера без лигандов описывается функцией
·=f(s), причем
·=0,5 при sпл=1, т.е. G1=G2. При наличии лигандов
·=f(s*) и
·=0,5 при s*, т.е. при
13EMBED Equation.31415.
Сдвиг температуры плавления по сравнению с таковой для чистого полимера T0 определяется как
13EMBED Equation.31415.
Изменение интервала температур плавления есть
13EMBED Equation.31415
Полная концентрация лигандов в растворе и на полинуклеотиде равна
13EMBED Equation.31415,
где р - концентрация связывающих лиганды фосфатных групп полинуклеотида. Если с » р, то
13EMBED Equation.31415, 13EMBED Equation.31415.
При прочном связывании лигандов полимером во всей области перехода, т. е. при K1p »1 или K2p »1 и c
· p
13EMBED Equation.31415,
13EMBED Equation.31415
где q=K2/K1.
Таким образом, лиганды действуют в качестве «скрепок», стабилизирующих двойную спираль [4].
Особенность гетерополимера состоит в относительно малом числе микросостояний, отвечающих данной энергии. Поэтому энтропия смешения не может существенно влиять на плавление. Вместе с тем появляется новый энергетический фактор, определяемый тем, что при уменьшении средней длины расплавленных участков содержание в них более стабильных пар GC должно уменьшаться. Конкуренция этого фактора и фактора, обусловленного невыгодностью «стыков» спиральных и не спиральных участков, должна приводить к чередованию спиральных и не спиральных участков определенной длины при данном значении
· [4].
Приближенное решение задачи о плавлении гетерополимера с беспорядочной последовательностью пар получено Лазуркиным и Франк-Каменецким. Они разделили молекулу на одинаковые отрезки, каждый из которых содержит
· пар. Если
· достаточно велико, то распределение концентрации пар GC по этим отрезкам будет гауссовым, т. е.:
13EMBED Equation.31415,
где 13EMBED Equation.31415, x- содержание пар GC, x0- значение х, отвечающее максимуму распределения.
Общее число пар GC в расплавленных участках минимально, если все отрезки с содержанием этих пар, меньшим некоторого предельного значения x
· расплавлены и все отрезки с x >x
· спиральны. Значение x
· определяется условием:
13EMBED Equation.31415
Средняя концентрация GC в расплавленных участках равна
13EMBED Equation.31415
Так как состав каждого отрезка не зависит от состава других, вероятность того, что расплавленная область состоит из r отрезков, следующих друг за другом, равна
13EMBED Equation.31415
и среднее число отрезков расплавленной области
13EMBED Equation.31415.
Среднее число пар оснований в расплавленной области
13EMBED Equation.31415
и число расплавленных областей во всей молекуле
13EMBED Equation.31415
Свободная энергия полимера
13EMBED Equation.31415
где GS - энтропийный вклад, определяемый смешением областей. Вводя условия N1+N2 =N, N1+N2=x0N, выражая n через
·, обозначая
·GGC=G1GC-G2GC,
·GAT=G1AT-G2AT и отбрасывая постоянные члены, получим
13EMBED Equation.31415
Равновесные значения N1 и
· находятся из условия минимума выражения G(N1,
·).

Интервал плавления гетерополимера
13EMBED Equation.31415
где TGC и TAT - температуры плавления для соответствующих полимеров. Средняя длина спиральной области:
13EMBED Equation.31415.
Определения оптической плотности (и, следовательно,
·) и размеров молекулы ДНК в растворе путем измерения характеристической вязкости в процессе плавления позволили найти средние длины спиральных участков: 1000-2500 пар при
·=0,8-0,9 и 400-500 пар при
·=0,5.
Ширина интервала плавления молекул ДНК со случайной последовательностью нуклеотидов составляет 2,5-3°С. ДНК бактерий - около 5°С, ДНК высших организмов - около 10°С, что свидетельствует об их блочном строении. Молекулярная масса блоков (5-15)
·109 [4].


5.18. Процессинг ДНК и РНК
При жизни организма непрерывно происходят процессы обновления тканей, клеток и т.д., которые неизбежно включают процессы копирования и передачи информации, хранящейся в геноме. Направления передачи наследственной (генетической) информации выделяют в четыре группы:
1.Репликация (от ДНК к ДНК)
2.Транскрипция (от ДНК к РНК)
3. Трансляция (от РНК к белку)
4.Обратная транскрипция (от РНК к кДНК)
Долгое время считалось, что передача информации от РНК к ДНК невозможна, однако, впоследствии выяснилось, что это не так. Некоторые вирусы способны встраивать информацию со своей вирусной РНК в ДНК генома клетки-хозяина. Возможность "обратного" направления информации в настоящее время все шире используется в различных целях, от исследовательских до терапевтических. Так называемые энзимы - реверс-транскриптазы - способны осуществлять синтез ДНК на матрице РНК. О происходящих в клетках млекопитающих (эукариот) процессах передачи информации известно достаточно много, но далеко не все, и изложение хотя бы известных на данный момент времени сведений потребовалось бы слишком много места. Поэтому далее будут изложены лишь самые основы протекающих в клетках простейших организмов (прокариот) этапов передачи наследственной информации.

5.19. Репликация
В процессе копирования информации происходит синтез дочерних молекул ДНК на основе информации, "записанной" в родительской молекуле ДНК. Ясно, что дочерние молекулы должны представлять собой точные копии родительской.
Репликация может осуществляться тремя способами:
а) консервативным;
б) полуконсервативным;
в) дисперсивным.
При консервативной репликации вновь синтезированные цепи ДНК находятся в дочерней молекуле. При полуконсервативной репликации полученные молекулы состоят из родительской и вновь синтезированной цепей. Дисперсивный способ репликации означает наличие перемежающихся родительских и вновь синтезированных участков на каждой из цепей образованных молекул ДНК. Для животных организмов и человека характерен только полуконсервативный путь репликации ДНК.
В процессе репликации участвует целый ряд энзимов (ферментов) с определенными функциями. Только синтезирующих ферментов в клетках прокариот насчитывается три. Их называют ДНК - полимеразами I, II и III. Сведения о функциональных особенностях ДНК-полимераз приведены в таблице.
Проявляемая функция (активность)
Полимераза


Pol I
Pol II
Pol III
Фрагмент Кленова

Полимеразная 5'-3'
есть
есть
есть
есть

Экзонуклеазная 3'-5'
есть
есть
есть
есть

Экзонуклеазная 5'-3'
есть
нет
нет
нет

молекул в клетке
400
нет данных
10-20
нет

производительность (нуклеотидов в мин, 37 С, на 1 молекулу Pol)
600
30
9000
-


Фрагмент Кленова – результат частичного протеолиза ДНК-полимеразы I E. Coli субтилизином. Основная функция полимеразы III – синтез цепи, полимеразы I – синтез и исправление ошибочно вставленных нуклеотидов. Полимераза II осуществляет особые, специализированные функции.
Репликация начинается с расплетания цепей ДНК специальными расплетающими белками, которые называют геликазами (или Rep-протеином). Геликазы используют энергию АТФ в процессе расплетания цепей. Скорость расплетания составляет около 6000 мин-1. Для того чтобы расплетенные цепи не могли вновь соединиться, имеются специальные SSB-белки (single-strand binding proteins), которые присоединяются к комплементарным цепям, удерживая их от ассоциации. По мере продвижения репликационной вилки SSB-протеины передвигаются по цепи, диссоциируя с одного места и присоединяясь на другом. Этот процесс не требует затрат энергии АТФ. После освобождения достаточного места начинается синтез праймера - затравки, необходимой для работы ДНК-полимеразы. Наличие затравки является необходимым условием функционирования ДНК-полимераз (как и наличие комплементарной цепи). В качестве затравки на каждой из разделенных цепей синтезируются маленькие отрезки молекул РНК при помощи фермента примазы.
Синтез новой цепи ДНК осуществляется всегда в направлении 5'-3', поэтому если по одной матричной цепи возможен непрерывный синтез, то по комплементарной ей цепи синтез осуществляется только участками. Эти участки синтеза называют фрагментами Оказаки. Когда синтез на одном из фрагментов Оказаки достигает праймера другого фрагмента, РНК-овый праймер удаляется имеющейся у полимераз 5'-3' полимеразной активностью и достраивается дезоксирибонуклеотидами. После этого сахарофосфатный остов между фрагментами сшивается ковалентной связью при помощи фермента ДНК-лигазы.
[ Cкачайте файл, чтобы посмотреть картинку ]

Частота возникновения ошибок при репликации и транскрипции не превышает 10-8-10-9, то есть, возможна лишь одна ошибка на сотни миллионов нуклеотидов. Такая точность не может быть обеспечена одним только лишь правилом комплементарности нуклеотидов (обеспечивающим точность 1:10000-1:100000). Репликационный аппарат имеет собственные механизмы "поддержания точности" копирования генетической информации. Этими функциями наделена ДНК-полимераза I.
Модель ее структуры и функциональных участков показана на рисунке. Она имеет три зоны активности: полимеризующую в направлении 5'-3', и экозонуклеазные в направлениях 5'-3' и 3'-5'. Области активности разделены пространственно. Вперед (по ходу продвижения полимеразы по матричной цепи ДНК) обращена зона 5'-3' экзонуклеазной активности. Она служит для удаления попадающихся на пути РНК-овых праймеров (затравок). Далее идет собственно синтетическая зона и, наконец, зона с экзонуклеазной активностью в направлении 3'-5'. С этой зоной связана так называемая PROOF-READING активность (способность узнавать неправильно встроенные нуклеотиды) и исправлять их вырезанием ряда уже встроенных нуклеотидов. Для этого молекула ДНК-полимеразы смещается (не отсоединяясь от ДНК-овой матрицы) к месту синтеза и последовательно вырезает нуклеотиды, после чего возобновляется нормальный синтез.
[ Cкачайте файл, чтобы посмотреть картинку ]
В процессе репликации одна из вновь синтезированных цепей (а именно- синтезированная на лидирующей цепи) получается короче на несколько десятков нуклеотидов вследствие того, что содержала РНК-овый праймер (затравку), впоследствии удаленный. Однако получение более коротких копий является совершенно недопустимым в процессе репликации явлением. Положение исправляется при помощи так называемых теломераз. Теломераза, содержащая в себе последовательность нуклеотидов, за несколько приемов удлиняет укороченную цепь, создавая пространство для работы примазы и ДНК-полимеразы, после чего избытки нуклеотидов удаляются:
[ Cкачайте файл, чтобы посмотреть картинку ]

Воздействие на организм неблагоприятных факторов (химические соединения, ультрафиолет и др.) приводит к постоянному накоплению ошибок в геноме, которые, в конечном итоге, вызывают появление патологии, в частности, невыясненный до сих пор механизм раковых заболеваний. Пока лишь существуют только предположения о том, что причиной раковых заболеваний являются дефекты в носителях информации- ДНК.


5.20. Транскрипция
Транскрипция - синтез молекул РНК на основании информации, записанной в ДНК. Осуществляется в ядрах при участии ДНК-зависимых РНК-полимераз, существующих в типах I, II и III (в порядке выхода в гель-хроматографии).
РНК-полимеразы I синтезируют рибосомальные РНК.
РНК-полимеразы II синтезируют матричные и вирусные РНК.
РНК-полимеразы III синтезируют транспортные РНК.
В процессе транскрипции копируется не вся информация с ДНК, а только выборочная, часто отрезками. Сигналом для присоединения полимеразы служат так называемые промотеры, в районе которого (35 нуклеотидных пар до и 10 пар после него) и присоединяется РНК-полимераза. Происходит разделение цепей ДНК и начинается синтез молекулы РНК в направлении 5'-3', только на одной из цепей. При этом по месту тимидиновых нуклеотидов комплементарной цепи встают уридиловые нуклеотиды. Весь комплекс передвигается по молекуле ДНК, пока не будет закончен синтез требуемого участка РНК. ДНК с "отсканированной" информацией репарирует, ассоциируя в двухнитевые молекулы (смотри рисунок ниже).
РНК-полимераза II очень чувствительна к некоторым соединениям, изменяющим ее активность. Так, сродство к альфа-аманитину (компонент грибного яда) составляет KL = 10-8–10-9M. Таким образом, аманитин является сильнейшим ингибитором РНК-полимеразы II, в результате при отравлении белой поганкой (достаточно 0,5 г сырого гриба) вначале развивается расстройство желудочно-кишечного тракта, а через 48 часов наступает смерть в результате тяжелого поражения печени, вследствие прекращения синтеза требуемых белков (нет РНК). Терапия при этой патологии отсутствует, за исключением пересадки печени.
Возбудитель туберкулеза Micobacterium tuberculosis (точнее, его РНК-полимераза) весьма чувствителен к антибиотику рифампицину, в то время как человеческая РНК-полимераза к нему мало чувствительна. На этом свойстве рифампицина основано его использование в терапии туберкулеза.
Молекулы РНК очень часто претерпевают посттранскрипционную модификацию, заключающуюся в удалении участков построенной цепи. Наглядно это можно проследить на примере синтеза молекулы транспортной РНК:
[ Cкачайте файл, чтобы посмотреть картинку ]
[ Cкачайте файл, чтобы посмотреть картинку ]


5.21. Синтез белка
Участие ДНК и РНК в синтезе белков – одна из основных функций нуклеиновых кислот. Белки – важнейшие компоненты каждого живого организма. Мышцы, внутренние органы, костная ткань, кожный и волосяной покров млекопитающих состоят из белков. Это полимерные соединения, которые собираются в живом организме из различных аминокислот. В такой сборке управляющую роль играют нуклеиновые кислоты, процесс проходит в две стадии, причем на каждой из них определяющий фактор – взаимоориентация азотсодержащих гетероциклов ДНК и РНК.
Основная задача ДНК – хранить записанную информацию и предоставлять в тот момент, когда начинается синтез белков. В связи с этим понятна повышенная химическая устойчивость ДНК в сравнении с РНК. Природа позаботилась о том, чтобы сохранить по возможности основную информацию неприкосновенной.
На первой стадии часть двойной спирали раскрывается, освободившиеся ветви расходятся, и на группах А, Т, Г и Ц, оказавшихся доступными, начинается синтез РНК, называемой матричной РНК, поскольку она как копия с матрицы точно воспроизводит информацию, записанную на раскрывшемся участке ДНК. Напротив группы А, принадлежащей молекуле ДНК, располагается фрагмент будущей матричной РНК, содержащий группу У, все остальные группы располагаются друг напротив друга в точном соответствии с тем, как это происходит при образовании двойной спирали ДНК.

По указанной схеме образуются полимерная молекула матричной РНК, содержащая несколько тысяч мономерных звеньев. На втором этапе матричная ДНК перемещается из ядра клетки в околоядерное пространство – цитоплазму. К полученной матричной РНК подходят так называемые транспортные РНК, которые несут с собой (транспортируют) различные аминокислоты. Каждая транспортная РНК, нагруженная определенной аминокислотой, приближается к строго обусловленному участку матричной РНК, нужное место обнаруживается с помощью все того же принципа взаимосоответствия групп А-У, и Г-Ц. В конечном итоге две аминокислоты, оказавшиеся рядом, взаимодействуют между собой, так начинается сборка будущей белковой молекулы.

Важная деталь состоит в том, что временное взаимодействие матричной и транспортной РНК проходит всего по трем группам, например, к триаде Ц-Ц-У матричной кислоты может подойти только соответствующая ей тройка Г-Г-А транспортной РНК, которая непременно несет с собой аминокислоту глицин. Точно также к триаде Г-А-У может приблизиться лишь набор Ц-У-А, транспортирующий только аминокислоту лейцин. Таким образом, последовательность групп в матричной РНК указывает, в каком порядке должны соединяться аминокислоты. Кроме того, система содержит в закодированном виде дополнительные регулирующие правила, некоторые последовательности из трех групп матричной РНК указывает на то, что в этом месте синтез белка должен остановиться, т.е. молекула достигла необходимой длины. Показанный на рис. 10 синтез белка проходит с участием еще одного – третьего вида РНК, они входят в состав рибосом и потому их называют рибосомными. Рибосома, представляющая собой ансамбль определенных белков рибосомных РНК, обеспечивает взаимодействие матричной и транспортной РНК, играя роль конвейерной ленты, которая передвигает матричную РНК на один шаг после того, как произошло соединение двух аминокислот.
Основной смысл двух стадийной схемы состоит в том, что полимерная цепь белковой молекулы собирается из различных аминокислот в намеченном порядке и строго по тому плану, который был записан в закодированном виде на определенном участке ДНК. Таким образом, ДНК представляет собой отправную точку всего этого запрограммированного процесса. В процессе жизнедеятельности белки постоянно расходуются, и потому они регулярно воспроизводятся по описанной схеме, весь синтез белковой молекулы, состоящей из сотен аминокислот, проходит в живом организме приблизительно в течение одной минуты.


Глава 6. Регуляция генной активности.

6.1. Генетический код
Итак, каждая аминокислота в белке опосредованно детерминируется определённым кодоном (группой из 3 оснований) в мРНК и в конечном счёте в ДНК. Поскольку в нуклеиновых кислотах имеется четыре вида оснований, число возможных кодонов составляет 13 EMBED Equation.3 1415. Соответствие между кодонами и аминокислотами, которые они кодируют, называется генетическим или биологическим кодом. Это соответствие было установлено опытным путём: к разрушенным клеткам добавляли синтетические полинуклеотиды известного состава и смотрели, какие аминокислоты включаются в белки. Позднее появилась возможность прямо сравнить последовательности аминокислот в вирусных белках и оснований в вирусных нуклеиновых кислотах. Чрезвычайно интересно, что генетический код, за редкими исключениями, одинаков для всех организмов – от вирусов до человека. Одно из таких исключений составляют изменения в генетическом коде, используемом митохондриями. Митохондрии – это небольшие автономные субклеточные частицы (органеллы), присутствующие во всех клетка, кроме бактерий и зрелых эритроцитов. Предполагают, что когда-то митохондрии были самостоятельными организмами; проникнув в клетки, они со временем стали их неотъемлемой частью, но сохранили некоторое количество собственной ДНК и синтезируют несколько митохондриальных белков.
Аланин
Аргинин
Аспарагин
Аспарагиновая кислота

ГЦУ
ЦГУ
ГАУ
ААУ

ГЦЦ
ЦГЦ
ГАЦ
ААЦ

ГЦА
ЦГА



ГЦГ
ЦГГ




АГА




АГГ



Валин
Гистидин
Глицин
Глутаминовая кислота

ГУУ
ЦАУ
ГГУ
ЦАА

ГУЦ
ЦАЦ
ГГЦ
ЦАГ

ГУА

ГГА


ГУГ

ГГГ


Глутамин
Изолейцин
Лейцин
Лизин

ГАА
АУУ
УУА
ААА

ГАГ
АУЦ
УУГ
ААГ


АУА
ЦУУ




ЦУЦ




ЦУА




ЦУГ


Метионин
Пролин
Серин
Тирозин

АУГ
ЦЦУ
АГУ
УАУ


ЦЦЦ
АГЦ
УАЦ


ЦЦА
УЦА



ЦЦГ
УЦГ




УЦУ




УЦЦ


Треонин
Триптофан
Фенилаланин
Цистеин
Нет



АЦУ
УГГ
УУУ
УГУ
УАА



АЦЦ

УУЦ
УГЦ
УАГ



АЦА



УГА



АЦГ







ГЕНЕТИЧЕСКИЙ СЛОВАРЬ: указаны аминокислоты, встречающиеся в белках, и соответствующие им кодоны в мРНК. «Буквы» в кодонах записаны в направлении 13 EMBED Equation.3 1415 В этом же направлении идут транскрипции нуклеиновых кислот и синтез белка на матрице. «Нет» означает, что кодон не кодирует никаких аминокислот; такие кодоны называются «бессмысленными». Генетический словарь одинаков для всех живых организмов – от вирусов до человека.


Вообще говоря, каждой аминокислоте соответствует более одного кодона. Большинство кодонов, кодирующих одну и ту же аминокислоту, имеют два одинаковых первых основания, но в трёх случаях (для лейцина, серина и аргинина) имеются два альтернативных набора первых дублетов в кодонах, соответствующих одной и той же аминокислоте. Природа основания в третьем положении не столь важна; одна и та же аминокислота – глицин – может кодироваться по-разному: ГГУ, ГГЦ, ГГА и ГГГ. Однако кодоны для двух разных аминокислот могут иметь два одинаковых первых основания, и тогда различие между ними будет определяться природой третьего основания – пурином или пиримидином. Так, гистидин кодируется триплетами ЦАУ и ЦАЦ, а глутамин ЦАА и ЦАГ. Три кодона, УАА, УАГ и УГА, не кодируют никаких аминокислот и называются «бессмысленными».
Одна молекула ДНК кодирует много белковых цепей. Каждый отрезок, кодирующий одну цепь, называют цистроном. Начало и конец цистрона, а также граница раздела между ними помечаются с помощью своего рода знаков химической пунктуации. По крайней мере у бактерий в начале цистрона находится метиониновый кодон АУГ. Логично предположить, что первой аминокислотой в белке всегда должен быть метионин, но часто несколько первых аминокислот отщепляются ферментативно после окончания синтеза белка. Конец белковой цепи помечается одним или несколькими «бессмысленными» кодонами.
У бактерий (прокариот) практически вся ДНК кодирует какие-либо белки или тРНК. Однако у высших форм (эукариот) значительная часть ДНК состоит из простых повторяющихся последовательностей и «молчащих» генов, которые не транскрибируются в РНК и поэтому не транслируются в белки. Кроме того, исходно синтезированная мРНК содержит участки, не детерминирующие никаких белковых последовательностей. Такие участки (интроны), расположенные между кодирующими участками (экзонами), перед началом синтеза белка удаляются специальными ферментами. Почему в ДНК существуют эти казалось бы бесполезные сегменты – неясно; возможно, они выполняют регуляторные функции.
У простейшей Tetrahymena РНК сама удаляет свои интроны и соединяет свободные концы цепей, действуя как фермент по отношению к себе самой. Это единственное известное исключение из правила, согласно которому нуклеиновые кислоты не обладают ферментативной активностью.

6.2. Транспортные РНК и супрессия
Смысл информации, содержащейся в ДНК, если переводить её на язык аминокислот, определяется как самой ДНК, так и считывающим механизмом, т.е. зависит не только от того, какие кодоны есть в ДНК и в какой последовательности они расположены, но также и от того, какие именно аминокислоты (и к каким тРНК) присоединяют аминоацил-тРНК-синтетазы. Конечно, природа синтетаз и тРНК тоже определяется ДНК, и в этом смысле ДНК является первичным детерминантом белковой последовательности. Тем не менее суммарная детерминация представляет собой функцию всей системы, поскольку результат зависит от исходных компонентов. Если бы соответствие между тРНК и аминокислотами было другим, смысл кодонов тоже изменился бы.
Известно, что мутации в ДНК изменяют считывающий механизм и в результате меняют – пусть и незначительно – смысл кодонов. Так, в бактерии Escherichia coli глициновая тРНК обычно узнаёт в мРНК кодон ГГА; мутация в ДНК, с которой транскрибируется эта тРНК, изменяет антикодон глициновой тРНК таким образом, что теперь он узнаёт кодон АГА, соответствующий аргинину, и в белковой молекуле вместо аргинина появляется глицин. Это не обязательно имеет фатальные последствия, поскольку не все аргинины кодируются триплетом АГА и есть аргининовые тРНК, по-прежнему узнающие «свои» АГА. В результате изменёнными оказываются не все белковые молекулы. Иногда такие мутации, изменяющие антикодон, подавляют (супрессируют) мутации в кодоне. Например, если в результате мутации глициновый кодон ГГА превращается в АГА, он всё же может прочитываться как глицин, если антикодон глициновой тРНК, в свою очередь, изменился так, что эта тРНК стала узнавать АГА. В этом случае вторая «ошибка» устраняет первую.
Мутации, приводящие к изменению антикодонов, могут иметь разные последствия, поскольку один и тот же кодон может узнаваться несколькими тРНК. Вообще говоря, узнавание осуществляется благодаря комплементарности оснований кодона и антикодона, однако одно из оснований кодона может модифицироваться таким образом, что антикодон будет узнавать даже неполностью комплементарный кодон. В результате одна и та же тРНК может взаимодействовать с несколькими разными кодонами, кодирующими одну и ту же аминокислоту. Этот феномен неполного соответствия кодона и антикодона был назван Ф. Криком «шатанием».

6.3. Регуляция активности генов
Для организма было бы катастрофой, если бы во всех его клетках одновременно работали все гены и синтезировались все закодированные ими белки. Бактерии, например, должны всё время приспосабливаться к условиям среды, синтезируя нужные ферменты. Все клетки высших организмов имеют один и тот же набор генов, но, к счастью, клетки мозга не продуцируют пищеварительные ферменты, а в хрусталике глаза не синтезируются мышечные белки.
Активность гена характеризуется тем, транскрибируется ли он с образованием соответствующей мРНК. ДНК – длинная молекула, и в определённых её участках имеются последовательности, называемые промоторами, которые распознаются специфическим транскрибирующим ферментом – полимеразой. В этих участках и только в них начинается транскрипция, продолжаясь до тех пор, пока не достигнет последовательности оснований на ДНК, означающей конец считывания.
Существуют особые репрессорные белки, которые связываются с ДНК поблизости от промотора в участке, называемом оператором. Образовавшийся комплекс блокирует транскрипцию, и мРНК не синтезируется. Таким образом, репрессорные белки являются ингибиторами транскрипции. С другой стороны, существуют небольшие молекулы, которые образуют комплекс с репрессорами и снимают их блокирующее действие на транскрипцию. Иными словами, они ингибируют ингибиторы. Так, у бактерий в норме отсутствуют ферменты, катализирующие расщепление некоторых сахаров; однако если один из этих сахаров появляется в среде, он образует комплекс с репрессором, ингибирование снимается и запускается синтез соответствующего фермента. Ферменты, синтез которых индуцируется собственными субстратами, называются индуцибельными. В ряде случаев, наоборот, репрессорный белок не блокирует транскрипцию мРНК, если он не связан с определённой молекулой. У бактерий некоторые ферменты, участвующие в синтезе определённых аминокислот, образуются только в отсутствие этих аминокислот, т.е. бактерии производят данные ферменты лишь по мере надобности. Если добавить в среду соответствующую аминокислоту, она образует комплекс с репрессором и активирует его, а тем самым ингибирует транскрипцию соответствующих генов. Уже образовавшаяся мРНК вскоре расщепляется, и синтез ферментов останавливается. Такие ферменты являются отрицательно индуцибельными.
Поскольку репрессорные белки сами кодируются генами, работа которых, в свою очередь, может регулироваться другими генами, а синтез малых молекул-индукторов и гормонов также в конечном счёте регулируется генами, механизмы регуляции генной активности могут быть очень сложными.
Приложение

ЖИДКОКРИСТАЛЛИЧЕСКИЕ ФОРМЫ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ
К 50-летию открытия структуры ДНК

Ю. М. Евдокимов
Евдокимов Юрий Михайлович - д.х.н., зав. лаб. Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН.

Вопрос о состоянии ДНК в биологических объектах (вирусы, хромосомы простейших и т. д.) был поставлен сразу же после открытия структуры ДНК 50 лет назад. Согласно расчетам, объём, занимаемый молекулой ДНК в растворе, в несколько тысяч раз превышает объём головки простого бактериофага (вирус бактерии), в которой размещается эта ДНК. Следовательно, внутри бактериофага локальная концентрация ДНК может достигать сотен миллиграмм в одном миллилитре, то есть в тысячи раз отличается от концентрации, с которой обычно работают в лабораторных условиях. Аналогичные расчеты свидетельствуют о высокой плотности упаковки молекул ДНК и в хромосомах высших организмов, где молекулы ДНК связаны с различными белками. Характерно, что в биологических объектах молекулы ДНК не только сконцентрированы (конденсированы), но и высокоупорядочены, судя по рефлексам рентгенограммах этих объектов. Таким образом, неотъемлемое свойство биологических объектов - плотная упаковка молекул ДНК, причем такая, которая легко и обратимо меняется в ходе биологических процессов.
Выяснение конкретного механизма (или механизмов) функционирования генома в клетке – трудная экспериментальная задача, для однозначного решения которой методы анализа еще не разработаны, поэтому большое значение приобрело моделирование процесса конденсации молекул ДНК в лабораторных условиях.
Рассмотрим некоторые результаты, полученные главным образом в Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН. Основной вывод из проведенных работ состоит в том, что при всех условиях, вызывающих фазовое исключение молекул двухцепочечных нуклеиновых кислот из водно-полимерных или водно-солевых растворов, эти молекулы находятся преимущественно в жидкокристаллическом состоянии. Интерес к жидким кристаллам нуклеиновых кислот обусловлен не только их большой биологической значимостью, но и обнаруженной сравнительно недавно возможностью их применения в практических целях, например, в качестве чувствительных элементов сенсорных устройств и "носителей" генетического материала, а также в составе соединений, используемых в медицине либо биотехнологии.

Конденсированное состояние высокомолекулярных двухцепочечных ДНК

В исследованиях жидкокристаллического состояния молекул нуклеиновых кислот существуют два взаимодополняющих направления: внутримолекулярная конденсация единичных молекул высокой молекулярной массы и межмолекулярная конденсация молекул низкой молекулярной массы. Эксперименты однозначно доказали, что в результате внутримолекулярной конденсации, происходящей при фазовом исключении высокомолекулярных двухцепочечных ДНК (молекулярная масса более 13 EMBED Equation.3 1415Дальтон) из водно-полимерных или водно-солевых растворов, образуются единичные частицы, имеющие форму торов (бубликов) диаметром около 1000 Е, а иногда и другие пространственные структуры. Получены также доказательства, что в составе торов соседние участки единичной молекулы ДНК уложены упорядочение, однако вопрос о том, какому "состоянию соответствует эта упорядоченная упаковка, остается дискуссионным.
Экспериментальное изучение процесса конденсации единичных молекул ДНК затруднительно, поскольку наблюдать его можно только при помощи электронного или атомно-силового микроскопов, причем опыты необходимо проводить с растворами, в которых концентрация нуклеиновых кислот не превышает 0.1 мкг/мл, и в условиях, исключающих повреждение вторичной структуры этих молекул. Неудивительно, что опубликовано сравнительно немного работ, содержащих убедительные доказательства образования торообразных частиц ДНК.

Жидкокристаллическое состояние низкомолекулярных двухцепочечных ДНК

Параллельно и практически независимо развивалось исследование конденсации двухцепочечных молекул ДНК, молекулярная масса которых не превышала 106 Да. Очевидно, что при использовании линейных, жестких молекул ДНК конденсация – это межмолекулярный процесс, в результате которого можно получить фазу (осадок) или изолированные частицы фазы (дисперсию) ДНК (рис. 1). Изучение свойств фазы, или дисперсии, существенно облегчается, поскольку имеются не только экспериментальные методы наблюдения за их образованием, но и параметры, позволяющие классифицировать фазы (дисперсии).

Рис. 1. Схематическое изображение линейных молекул ДНК (а), схема фазового исключения из водно-солевого раствора и частица холестерической жидкокристаллической дисперсии ДНК (б), расположение двухцепочечных молекул ДНК в слое холестерика (в) Б - диаметр холестерика, около 103 А, Р - шаг спиральной закрутки холестерика (данные С.Г. Скуридина)

В 1961 г. физикохимик К. Робинсон, исследуя при помощи поляризационного микроскопа свойства тонкого слоя концентрированного раствора ДНК, наблюдал характерную картину, известную под названием "текстура отпечатков пальцев", которая аналогична текстуре тонких слоев растворов поли-
·-бензил-L-глютамата в органических растворителях. Опасаясь присутствия белковых примесей в растворе, Робинсон осторожно сформулировал предположение о том, что молекулы ДНК в концентрированных растворах могут находиться в жидкокристаллическом (мезофазном) состоянии. Позднее были проведены микроскопические и рентгенографические исследования, которые не только подтвердили это предположение, но и доказали множественность фаз молекул ДНК длиной около 500 Е, возникающих при фазовом исключении в разных условиях.
Фрагменты двухцепочечной ДНК длиной около 500 Е ведут себя в водно-солевых растворах как жесткие стержни. Поскольку в водно-солевых растворах умеренной ионной силы (~ 0.1 М NаСl) среднее значение эффективного диаметра (Б) ДНК близко к 50 Е, у молекулы длиной L ~ 500 Е аксиальное отношение (L/D) составляет примерно 10. Согласно расчетам, жесткие молекулы, обладающие такими параметрами, стремятся к образованию упорядоченной фазы при концентрировании. Фазовый переход ДНК удовлетворительно описывается в рамках теории П. Флори для жесткоцепных полимеров.
Обобщив результаты, полученные многими исследователями, выделим основные фазы, наблюдаемые при концентрировании двухцепочечных молекул ДНК (таблица). При некоторой, так называемой критической, концентрации молекулы ДНК спонтанно конденсируются, формируя фазу с характерным расстоянием между молекулами от 51 до 30 Е. Две особенности присущи этой фазе. Как следует из рентгенограмм, молекулы ДНК в образующейся фазе упорядочены, однако трехмерный порядок в их расположении отсутствует, то есть для фазы характерны свойства одномерного кристалла. В то же время фаза обладает текучестью, и соседние молекулы ДНК сохраняют присущие им некоторые диффузионные степени свободы, то есть для фазы характерны свойства жидкости. Именно сочетание этих двух разных особенностей позволяет использовать термин лиотропная "жидкокристаллическая" для обозначения фазы, возникающей в результате концентрирования ДНК.
Величина критической концентрации обратно пропорциональна длине молекул ДНК. Например, для фрагмента ДНК в 147 пар нуклеотидов она составляет около 170 мг/мл, а при размере 437 пар нуклеотидов - 90 мг/мл. Величина критической концентрации прямо пропорциональна ионной силе раствора и практически не зависит от его температуры в пределах от 20 до 60°С.













Рис. 2. Текстура тонкого слоя холестерической фазы, образованной двухцепочечными молекулами ДНК Изображение в поляризованном свете (данные С.Г. Скуридина)

Молекулы ДНК в образующейся фазе упаковываются таким способом, что в ее структуре можно выделить "слои" из соседних молекул, причем вследствие присущей молекулам ДНК анизотропии (геометрической и оптической) соседние слои повернуты относительно друг друга на небольшой угол. В результате для возникающей жидкокристаллической фазы характерна спиральная закрутка пространственной структуры; такая фаза носит название "холестерической" . Именно в силу спиральной закрутки слоев холестерическая фаза обладает текстурой "отпечатков пальцев" (рис. 2).
В данном случае термин "холестерическая" имеет лишь исторический смысл; этот термин был введен в 1922 г. Г. Фриделем для обозначения одного из классов жидких кристаллов, к которому относились, главным образом, производные холестерина. Особенность этого класса жидких кристаллов состоит в том, что в каждом последуем слое длинные оси молекул повернуты на небольшой угол по отношению к предыдущему, что приводит к образованию макроскопической спиральной структуры.
Интересен вопрос о направлении закрутки пространственной структуры холестерической фазы двухцепочечных молекул ДНК. Прямые измерения оптических свойств концентрированных растворов ДНК при помощи так называемого клина Гранжана-Кано показали, что при концентрации около 200 мг/мл правоспиральные двухцепочечные молекулы ДНК формируют холестерик, в котором соседние слои закручены влево. Обычно говорят, что правые молекулы ДНК образуют холестерик с левой закруткой пространственной структуры. Отметим, что параметры вторичной структуры спиральной молекулы ДНК (расстояние между парами оснований и их ориентация относительно осей молекулы ДНК) практически не меняются при возникновении жидкокристаллической фазы. Величина шага спиральной закрутки холестерика из молекул ДНК увеличивается по мере роста концентрации ДНК, то есть при переходе от холестерической к гексагональной фазе происходит раскрутка пространственной структуры холестерической фазы ДНК, но не спирали ДНК.
Таким образом, доказано, что жесткие двухцепочечные молекулы ДНК в процессе межмолекулярной конденсации образуют упорядоченные жидкокристаллические и кристаллические фазы. Следует обратить внимание на то, что приготовление концентрированных растворов ДНК с фиксированными свойствами - трудная экспериментальная задача, а сам процесс формирования жидкокристаллических фаз в такой системе может длиться недели и даже месяцы.
Сколько-нибудь последовательная и полная теории фаз, образуемых жесткими молекулами типа двухцепочечной ДНК, еще не создана, что объясняется сложностью как структуры самих молекул, так и характера их взаимодействия друг с другом и с растворителем. Если в процессе формирования жидких кристаллов низкомолекулярных соединений растворитель играет довольно пассивную роль, выступая только как переносчик электростатических или дисперсионных взаимодействий, то в случае ДНК, образующих жидкокристаллические фазы, ситуация другая. Взаимодействия молекул ДНК и растворителя, ответственные за образование жидкого кристалла, по определению не локальны, поскольку физически всегда связаны с пространственной дисперсией диэлектрических свойств. Однако эта нелокальность становится существенной лишь для сегментов ДНК длиной порядка 100 пар нуклеотидов, сильно взаимодействующих с молекулами воды. Высказано предположение, согласно которому упаковка молекул ДНК связана не только с анизотропными свойствами молекул ДНК, сближающимися в процессе фазового исключения, но и со свойствами находящихся между ними молекул воды. Роль воды в стабилизации и "отражении" вторичной структуры ДНК долгое время остается предметом теоретических и экспериментальных исследований.
Что касается применения жидкокристаллических фаз ДНК для решения практических задач, то нужно отметить следующее. Несмотря на простоту самого процесса концентрирования, длительность достижения равновесного состояния, а также зависимость образования фазы от множества трудно учитываемых факторов резко ограничивают возможность практического использования этих фаз.

Жидкокристаллические дисперсии двухцепочечных ДНК

С физико-химической точки зрения, интерес к жидкокристаллическим дисперсиям обусловлен тем, что свойства частиц дисперсий размером 100-1000 Е могут значительно отличаться от свойств, характерных для непрерывных фаз. Дело в том, что расположение молекул ДНК в слое задается осмотическим давлением растворителя, возможны и дефекты упаковки молекул ДНК в частицах. В результате упаковка молекул в частицах дисперсий, в принципе, может отличаться от упаковки молекул в жидкокристаллических фазах. С биологической точки зрения, свойства частиц жидкокристаллических дисперсий интересны потому, что такие частицы позволяют более точно описать свойства ДНК-содержащих вирусов или хромосом простейших. Для этих дисперсных систем микроскопического размера характерна не только упорядоченная, но и подвижная упаковка ДНК. С практической точки зрения, жидкокристаллические дисперсии привлекают внимание уникальным сочетанием физико-химических свойств молекул ДНК.
Рассмотрим свойства частиц дисперсной фазы, формируемой при смешении водно-солевых растворов ДНК с водно-солевыми растворами некоторых полимеров, в частности полиэтиленгликоля. При достижении критической концентрации полиэтиленгликоля происходит фазовое исключение молекул ДНК, приводящее к образованию дисперсии, частицы которой имеют микроскопический размер (диаметр порядка 103 Е). Вторичная структура ДНК и химическая реакционная способность азотистых оснований ДНК при фазовом исключении практически не меняются.
Рентгенографический анализ свидетельствует не только об упорядоченности молекул ДНК в частицах дисперсии, но и о том, что концентрация ДНК составляет около 200 мг/мл, то есть возможно образование холестерической фазы ДНК. Доказательство существования именно холестерической жидкокристаллической упаковки молекул ДНК в частицах дисперсии основано на появлении аномальной оптической активности в полосе поглощения так называемого внешнего хромофора. (Это растворенные в расплавах термотропных холестериков молекулы окрашенного соединения, которые определенным образом ориентируются в слоях холестерической структуры).
В структуре двухцепочечных молекул ДНК имеются хромофоры (азотистые основания, поглощающие в ультрафиолетовой области спектра), которые достаточно жестко фиксированы: угол наклона оснований по отношению к длинной оси молекул ДНК - около 90°. Если при фазовом исключении образуются частицы со слоевой упаковкой молекул ДНК (см. рис. 1), то это означает, что азотистые основания также определенным образом ориентированы в слое из соседних молекул ДНК. Поэтому можно ожидать появления в спектре кругового дихроизма аномальной полосы в области поглощения азотистых оснований только при холестерической упаковке соседних молекул ДНК в образующихся при фазовом исключении частицах жидкокристаллической дисперсии.
Расчеты позволили уточнить условия (шаг спиральной структуры холестерика, размер частиц дисперсии и т. д.), при которых аномальная полоса может быть зарегистрирована экспериментально. Проведенные опыты обнаружили ее в спектрах кругового дихроизма жидкокристаллических дисперсий ДНК (рис. 3). Этот результат свидетельствует, что в частицах дисперсии жесткие анизотропные молекулы ДНК реализуют свое потенциальное стремление к холестерическому способу упаковки. Очевидно, что формирование дисперсий из одноцепочечных молекул нуклеиновых кислот, для которых характерна нежесткая ориентация азотистых оснований, не может привести к появлению аномальной полосы в спектрах кругового дихроизма.



















Рис. 3. Спектры кругового дихроизма линейной В-формы ДНК (1), жидкокристаллической дисперсии ДНК (2) и жидкого кристалла ДНК (3)

Частицы холестерической дисперсии существуют только в определенном интервале осмотического давления растворителя, задаваемого, например, концентрацией полиэтиленгликоля в растворе. Выход за нижний предел приводит к изотропному состоянию, выход за верхний предел – к гексагональной упаковке молекул ДНК в частицах дисперсии. В ходе обоих процессов исчезает аномальная оптическая активность, что свидетельствует о весьма подвижной пространственной организации холестерика ДНК. Поскольку холестерические жидкокристаллические дисперсии ДНК формируются в водно-полимерных растворах, имеющих определенное осмотическое давление и диэлектрическую постоянную, направление закрутки пространственной холестерической спирали зависит от свойств растворителя.
Взаимодействие биологически активных соединений с молекулами ДНК, входящими в состав частиц холестерической дисперсии, может менять свойства ДНК. Это, в свою очередь, означает, что при определенной структуре биологически активных молекул, взаимодействующих с ДНК, формирование дисперсий из комплексов "ДНК-биологически активное соединение" может сопровождаться изменением как величины амплитуды аномальной полосы в спектре кругового дихроизма, так и ее знака.
Модификация поверхности молекулы ДНК в результате действия физических или химических факторов, нарушающих однородность поверхности, влияет на способность молекул ДНК к образованию холестерических жидкокристаллических дисперсий. Таким образом, не только направление закрутки спирали исходной молекулы, но и свойства поверхности молекул нуклеиновых кислот имеют важное значение при определении характера их пространственной упаковки в жидкокристаллической дисперсии.
Если происходит встраивание (интеркаляция) окрашенных биологически активных соединений между парами оснований ДНК в составе частиц холестерической дисперсии, то в спектре кругового дихроизма следует ожидать появления двух аномальных полос. Одна из них будет по-прежнему расположена в области поглощения азотистых оснований ДНК (длина волны около 270 нм), другая - в области поглощения хромофоров биологически активного соединения (например, на длине волны 500 нм). Появление двух аномальных полос в спектре кругового дихроизма может быть объяснено только в том случае, если из молекул ДНК образуется жидкокристаллическая дисперсия, для частиц которой характерна холестерическая пространственная структура. В определенных условиях амплитуда полосы на длине волны 500 нм прямо пропорциональна концентрации молекул биологически активного соединения, связанных с ДНК, тогда как полоса на длине волны 270 нм остается практически неизменной; она может служить внутренним стандартом, характеризующим качество полученного холестерика.
Таким образом, свойства молекул ДНК и водно-полимерного раствора управляют свойствами частиц жидкокристаллических дисперсий. Как и в случае жидкокристаллических фаз, могут формироваться дисперсии с различной упаковкой. Однако упаковка молекул ДНК в частицах жидкокристаллических дисперсий легко регулируется, что сближает их поведение с поведением биологических объектов.

Жидкокристаллическое состояние ДНК в биологических системах

Тот факт, что оптически активные молекулы ДНК при высокой концентрации должны находиться в жидкокристаллическом состоянии, позволяет высказать предположение о реальности существования такого состояния in vivo. Действительно, при исследовании сборки бактериофага Т4 в клетках Е.coli было показано, что на определенной стадии происходит расщепление белка р22 на два низкомолекулярных белка II и VII, в составе которых содержание остатков глутаминовой и аспарагиновой кислот достигает 80 и 48% соответственно. Эти белки в клетке несут суммарный отрицательный заряд, поэтому не могут образовать комплексов с ДНК. Концентрация низкомолекулярных белков в месте сборки фаговой частицы составляет примерно 500 мг/мл, то есть в клетках Е.coli создаются те же условия, что и в водно-солевых растворах полиэтиленгликоля (ПЭГ) при фазовом исключении. Такая ситуация названа ПЭГ-подобной. Прямыми опытами было доказано, что в этих условиях водорастворимые биополимеры вызывают фазовое исключение молекул ДНК.
Электронно-микроскопическое исследование ультратонких срезов хромосом жгутиконосцев (Dinoflagellata) под разными углами их сечения выявило молекулярные узоры, математическая реконструкция которых однозначно отражает холестерическую упаковку молекул ДНК в этом биологическом объекте (рис. 4). Аналогичные молекулярные узоры наблюдались также на срезах хромосом бактерий (Escherichia coli, Bacillus subtilis, Rhizobium, etc.), однако их редко интерпретировали как указание на холестерическую упаковку ДНК.



















Рис. 4. Схематическое изображение холестерической структуры хромосом простейших (Dinoflagellata), полученное при помощи электронного микроскопа а – схема хромосомы, Р/2 – расстояние между двумя светлыми (или темными) полосами на текстуре; б -направление срезов ультратонких слоев хромосомы; в - схема сечения под произвольным углом к длинной оси хромосомы (1), перпендикулярно к ней (2) и вдоль длинной оси (3)

Интересны данные о состоянии ДНК в половых клетках. В головках спермиев многих млекопитающих (крысы, кролика, жеребца, быка) молекулы ДНК имеют холестерическую упаковку, несмотря на наличие протаминоподобных белков в их составе. В частности, в спектре кругового дихроизма хроматина спермиев быка содержится интенсивная отрицательная полоса, соответствующая холестерической упаковке молекул ДНК. Аналогичная упаковка характерна для спермиев скорпиона, осьминога (Eledone cirrhosa), древесной лягушки (Rhacophoris) и рыб (Scyliorhinus caniculis).
Если учесть высокую плотность упаковки генетического материала, то следует признать, что в некоторых биологических объектах преобладает холестерическое жидкокристаллическое состояние молекул ДНК. Конечно, в вирусах и хромосомах упаковка двухцепочечных молекул ДНК или их сегментов может быть разной. В тех случаях, когда молекулы ДНК практически не связаны с белками (бактериальные нуклеоиды, хромосомы простейших, вирусы и т.д.), реализуется упорядоченная упаковка жидкокристаллического или кристаллического типа. При этом анизотропные свойства молекул ДНК обеспечивают формирование холестерической упаковки, наблюдаемой экспериментально.
В клетках высших организмов, где молекулы ДНК связаны с гистонами и другими белками, реализуется другой способ упаковки ДНК. По аналогии с жидкокристаллической дисперсией ДНК, можно предположить, что белки, входящие в состав хроматина, играют роль диэлектрической среды, влияющей на способ упаковки молекул ДНК. Кроме того, взаимодействие ДНК с гистоновыми и другими белками приводит к возникновению структур, называемых нуклеосомами. В фибриллах, образуемых нуклеосомами, молекулы ДНК упаковываются в более сложную спиральную структуру, свойства которой заметно отличаются от свойств структуры, наблюдаемой в концентрированном растворе. Такая структура может включать упорядоченные и неупорядоченные элементы, а также "петли". Таким образом, в клетках высших организмов может существовать иерархия структур, определяемая не только содержанием и свойствами белков, но и пространственными особенностями нуклеосом. С переходом между этими иерархическими структурами связана реализация генетической информации в организмах. Тем не менее внутреннее (фазовое) поведение ДНК и в этом случае аналогично поведению жидкокристаллической фазы, поскольку определяется стремлением молекул ДНК к упорядоченной упаковке.


Практическое применение частиц жидкокристаллических дисперсий ДНК

Как известно, частицы жидкокристаллических дисперсий используются в качестве чувствительных элементов (биодатчиков) биосенсорных устройств и как "депо" генетического материала или биологически значимых соединений, способных к образованию комплексов с ДНК.
Последнее десятилетие характеризуется интенсивным развитием технологий, которые ориентированы на создание устройств, позволяющих получать информацию о свойствах различных сред (объектов) в форме электрического сигнала. В сенсорных технологиях чувствительный элемент способен "узнать" исследуемое вещество среди множества родственных и преобразовать полученную информацию о его присутствии в ответ, фиксируемый в цифровой или аналоговой форме. Наибольшее развитие имеют аналитические устройства, использующие в качестве узнающего элемента биомакромолекулы – биосенсоры. В простейшем случае биосенсор состоит из биодатчика, который содержит молекулы, способные к узнаванию, и преобразователя, трансформирующего любой сигнал (о массе, цвете, концентрации ионов и т. д.), который генерируется при взаимодействии биодатчика с анализируемым веществом, в электрический.
Создание биосенсоров – задача биоинженерии, решаемая на основе достижений современной молекулярной биологии, физической химии биополимеров и микроэлектроники. Теоретически любая биологическая молекула (или биохимическая реакция) может быть использована при конструировании биодатчиков. Однако анализ данных литературы показывает, что в большинстве разработанных к настоящему времени биосенсоров чувствительными элементами служат ферменты (белки). Менее распространены биодатчики на основе одноцепочечных нуклеиновых кислот и полинуклеотидов. Мы уделим внимание только биодатчикам, использующим жидкокристаллические дисперсии ДНК. Они разработаны в нашей лаборатории, нами получены патенты России, США, Германии и других стран.
Принцип действия биодатчика на молекулах двухцепочечных ДНК основан на высокой лабильности холестерической структуры жидкокристаллических дисперсий ДНК. Уже отмечалось, что нарушение регулярного характера расположения азотистых оснований или модификация поверхности молекул ДНК под действием разных факторов влияют как на способность молекул ДНК к формированию холестерических жидкокристаллических дисперсий, так и на оптические свойства самих дисперсий.
Действительно, образование "сшивок" между парами азотистых оснований, например, при действии противоопухолевых соединений группы платины (П), сопровождается нарушением взаимной ориентации соседних оснований. В результате амплитуда аномальной отрицательной полосы в спектре кругового дихроизма, характерная для холестериков из молекул ДНК (см. рис. 3), резко уменьшается. Появление одной "сшивки", содержащей один атом платины и приходящейся приблизительно на 100 пар оснований, оказывается достаточным, чтобы заметно подавить аномальные оптические свойства холестерической дисперсии ДНК.
Тот же эффект вызывают фотохимическая модификация ДНК под действием ультрафиолетового облучения (образование тиминовых димеров), а также создание на поверхности молекул ДНК "выступов" (протуберанцев) в результате взаимодействия азотистых оснований с комплексными соединениями металлов и последующего формирования холестерической дисперсии. Последний способ позволяет обнаружить эффект воздействия на ДНК приблизительно одного атома меди на 100 пар азотистых оснований или одного атома палладия на 500 пар.
Принцип действия биодатчиков, использующих частицы жидкокристаллической дисперсии, состоит в следующем: азотистые основания в молекулах ДНК, фиксированных в структуре холестерической жидкокристаллической дисперсии, тем или иным способом "узнают" молекулы биологически активного соединения (БАС) и "адресуют" их в определенные места на поверхности ДНК. Образование комплекса "ДНК-БАС" приводит к появлению первичного (в частности, оптического) сигнала. Пространственная структура холестерика многократно усиливает генерируемый в системе первичный сигнал (пространственная амплификация сигнала) и делает видимыми результаты действия биологически активного соединения на ДНК: в спектре кругового дихроизма появляется аномальная полоса (полосы) в области поглощения биологически активного соединения. Амплитуда этой полосы пропорциональна концентрации биологически активного соединения, а знак полосы несет информацию о способе ориентации его молекул по отношению к парам оснований ДНК.
На рис. 5, а приведены спектры кругового дихроизма жидкокристаллических дисперсий ДНК, обработанных дауномицином - окрашенным противоопухолевым антибиотиком антрациклиновой группы. В этих спектрах, кроме отрицательной полосы в области поглощения азотистых оснований ДНК (длина волны около 270 нм), наблюдается дополнительная отрицательная полоса в диапазоне поглощения дауномицина (длина волны около 500 нм). Отрицательный знак однозначно свидетельствует о том, что молекулы дауномицина интеркалируют между парами оснований ДНК. Интересно, что амплитуда полосы на длине волны 270 нм практически не меняется при увеличении концентрации дауномицина в растворе, в то время как амплитуда полосы на длине волны 500 нм прямо пропорциональна концентрации молекул дауномицина, связанных с ДНК. Пользуясь калибровочной зависимостью (рис. 5б), можно определять концентрацию дауномицина в растворе.


Рис. 5. Спектр кругового дихроизма в ультрафиолетовой (длина волны 270 нм) и видимой (длина волны 500 нм) областях спектра для жидкокристаллической дисперсии ДНК, обработанной дауномицином (а), и зависимость амплитуды отрицательной полосы в видимой области спектра от концентрации дауномицина (б). Светлые и темные точки на кривой (б) – результаты, полученные сразу и через 12 часов после добавления дауномицина (данные В.И. Салянова)

Таким же способом можно обнаруживать (даже в плазме крови) другие противоопухолевые соединения - синтетические и полусинтетические антибиотики антрациклинового ряда (карминомицин, аклациномицин, виоламицин и т. д.), антраценового (бисантрен) или антрахинонового рядов (митоксантрон). Минимальные концентрации этих соединений, определяемые биодатчиками на жидкокристаллических дисперсиях ДНК (около 10-7 М), соответствуют реальным концентрациям, которые применяются при терапии опухолевых заболеваний. Следовательно, при помощи жидкокристаллических дисперсий можно не только выявить биологически активное соединение и определить его концентрацию, но и установить способ расположения его молекул на ДНК, что представляет интерес при синтезе новых производных биологически активного соединения.
Новейшее направление биоинженерии - создание сложных трехмерных конструкций с регулируемыми свойствами, "строительными блоками" которых являются молекулы ДНК. Предложенный сотрудниками нашей лаборатории совместно с коллегами из Германии и Италии подход к построению молекулярных конструкций на основе жидкокристаллических дисперсий ДНК основан на пространственной фиксации молекул ДНК при помощи "сшивок", содержащих в своем составе "чувствительные элементы" с регулируемыми свойствами.
"Сшивание" независимо диффундирующих соседних молекул ДНК, расположенных в частицах жидкокристаллических дисперсий на расстоянии 30-50 Е друг от друга, представляет определенную трудность, поскольку необходимо сохранить целостность пространственной структуры частицы холестерической дисперсии и не нарушить ее аномальную оптическую активность. Молекулярное конструирование базируется на нескольких положениях, прямо вытекающих из свойств жидкокристаллических дисперсий.
Во-первых, химическая реакционная способность молекул ДНК не нарушается, что открывает возможность для направленного изменения их свойств. В частности, на поверхности молекул ДНК можно регулярным образом фиксировать различные соединения (молекулы "гостей").
Во-вторых, скорость химических реакций, как правило, выше скорости диффузионного перемещения соседних молекул ДНК.
И, в-третьих, многие соединения могут образовывать структуры достаточно протяженного размера (полимерные хелатные комплексы, жесткие или полужесткие линейные структуры и т. д.). Для создания "сшивок" использовались антрациклиновые антибиотики, например дауномицин и его аналоги.
Наиболее просто построить молекулярную конструкцию на основе двухцепочечных полирибонуклеотидов, так как интеркаляция антрациклинов между парами азотистых оснований не нарушает структуру этих молекул. Предложенная нами полимерная хелатная "сшивка" между молекулами поли (И) х поли (Ц), фиксированными в частице жидкокристаллической дисперсии, показана на рис. 6а. Возникновение полимерных хелатных "сшивок" [ДАУ-Сu2+-ДАУ-Сu2+....ДАУ-Сu2+-ДАУ] между соседними молекулами поли (И) х поли (Ц) приводит к образованию трехмерной молекулярной конструкции (рис. 6б).



Рис. 6. Полимерный хелатный мостик между соседними молекулами поли (И) х поли (Ц), фиксированными в структуре частицы холестерической жидкокристаллической дисперсии (а – вид вдоль длинной оси соседних молекул), и трехмерная молекулярная конструкция на основе двухцепочечных молекул нуклеиновых кислот, фиксированных в структуре частицы жидкокристаллической дисперсии и сшитых полимерными хелатными мостиками (б) D – расстояние между слоями молекул ДНК, n - направление закрутки слоя (данные М.А. Захарова).

Если энергия "сшивок" достаточна для фиксации соседних молекул нуклеиновых кислот, то осмотическое давление водно-полимерного раствора уже не столь существенно для стабилизации структуры частиц, то есть создаются условия, в которых частицы жидкокристаллических дисперсий могут существовать без нарушения их исходной холестерической структуры даже в обычном водно-солевом растворе. Появляется возможность для прямого определения формы и размера микроскопических частиц жидкокристаллических дисперсий после их превращения в пространственно зафиксированную молекулярную конструкцию. Согласно данным атомной силовой микроскопии, в молекулярных конструкциях, сформированных на основе молекул поли И) х поли (Ц), средний размер частиц, имеющих форму, близкую к сферической, – около 0.4 мкм. Размер частиц молекулярной конструкции ДНК меняется в пределах от 0.3 до 0.7 мкм, однако их средний размер (около 0.5 мкм) вполне согласуется с результатами определения размера частиц жидкокристаллических дисперсий ДНК, полученными другими физико-химическими методами.
Созданная нами молекулярная конструкция уникальна, поскольку любой из компонентов полимерных хелатных "сшивок" может служить "чувствительным элементом". Нарушение целостности структуры в одном месте или изменение конфигурации полимерных хелатных "сшивок" между молекулами нуклеиновых кислот приведет в конечном счете к разрушению всей молекулярной конструкции. Этот процесс должен сопровождаться уменьшением аномальной оптической активности. В определенных условиях величина амплитуды аномальной полосы в спектре кругового дихроизма молекулярной конструкций прямо связана с концентрацией химического или биологически активного соединения, разрушающего полимерную хелатную "сшивку". Таким образом, молекулярная конструкция на основе жидкокристаллических дисперсий нуклеиновых кислот представляет собой биодатчик микроскопического размера для определения любого фактора, влияющего на стабильность полимерной хелатной "сшивки". Этот биодатчик, в принципе, можно назвать интегральным микрочипом.
Молекулярная конструкция может разрушаться в результате восстановления ионов Си2+ до Си1+ или при действии на молекулярную конструкцию "суммарного" белка или индивидуальных белков (инсулин, пепсин, бычий сывороточный альбумин. РНКаза,

·-глобулин, лизоцим), а также полиаминокислота (полигистидин, полилизин, полиглютаминовая кислота или полиаспарагиновая кислота). Разрушение обусловлено образованием более прочных комплексов между белками (аминокислотами) и ионами Си2+ и, следовательно, уходом ионов Сu2+ из состава полимерной хелатной "сшивки". Наличие прямо пропорциональной зависимости между изменением амплитуды полосы в спектре кругового дихроизма молекулярной конструкции и, в частности, концентрацией биологически активного соединения в растворе в интервале от 0 до 12 мкг/мл позволяет использовать эту зависимость для определения содержания биологически активного соединения.
Существует принципиальная возможность повышения эффективности процесса "сшивания" соседних молекул нуклеиновых кислот за счет создания на их поверхности дополнительных реакционных мест, способных к хелатообразованию. Действительно, можно нейтрализовать отрицательные заряды фосфатных групп на поверхности нуклеиновых кислот, сформировав электростатический комплекс между нуклеиновыми кислотами и спиральными полимерами, несущими, например, такие реакционные группы, как гидроксильная или аминогруппа. В силу спиральной структуры молекул нуклеиновых кислот не все аминогруппы полимера будут принимать участие в нейтрализации зарядов фосфатных групп. Часть аминогрупп будет "экспонирована" в растворитель. Сочетание гидроксильной и аминогруппы в составе полимера позволит формировать хелатные комплексы с ионами двухвалентных металлов. Эти хелатные комплексы могут служить местом "начала" или "окончания" полимерных мостиков, сшивающих в данном случае не молекулы нуклеиновых кислот, а молекулы "чужеродных" полимеров. Открывается возможность для создания нового типа биодатчиков.
Поскольку локальная концентрация ДНК в частицах жидкокристаллических дисперсий может достигать сотен миллиграммов в одном миллилитре, эти частицы могут использоваться для введения генетического материала в клетки, а значит, и трансформации клеток. Кроме того, локальная концентрация противоопухолевых соединений, антибиотиков и т.д., способных связываться с ДНК в составе частиц дисперсий, всего в несколько раз меньше локальной концентрации ДНК, что открывает возможность для введения весьма высоких концентраций антибиотиков в клетки животных.
Таким образом, исследование особенностей жидкокристаллического состояния двухцепочечных молекул ДНК позволяет не только расширить спектр свойств этих молекул, важных с теоретической и практической точек зрения, но и осознать существование разрыва при переносе знаний, полученных в процессе изучения свойств изолированных молекул ДНК, на свойства конденсированных молекул ДНК в составе биологических объектов.


ПЕРВЫЕ МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МОТОРЫ НА ОСНОВЕ ДНК


Ученые из Bell Labs и Оксфордского университета создали первые молекулярные моторы на основе ДНК. Устройства, напоминающие моторизованные щипчики в 100000 раз меньше булавочной головки.
Разработка двигателя на базе ДНК это часть активно развивающегося направления. Ученые верят, что нанотехнологии позволят создать процессоры с миллиардами транзисторов (чем больше транзисторов в процессоре, тем он мощнее), вместо миллионов, что является сегодняшним порядком сложности в полупроводниковых технологиях. «Эта технология в потенциале может заменить сегодняшние методы производства интегральных схем, которые могут достичь своего действительного предела в течение ближайших десяти дет, когда закон Мура упрется в тупик» говорит физик Бернард Юрке из Bell Labs. ДНК, обеспечивающая молекулярные чертежи для всех живых клеток, является идеальным инструментом для создания наноустройств. «Мы пользуемся тем свойством ДНК, что ее части с миллиардами возможных комбинаций соединяются только одним-единственным способом, как части головоломки», говорит Юрке. Разработчики спроектировали части синтетической ДНК так, чтобы они опознавали друг друга на каждом шаге изготовления моторов. В результате, единственным необходимым ингредиентом в тестовой пробирке были сами ДНК.
«Поскольку ДНК являются и «топливом» для этих моторов, они полностью самодостаточны и не нуждаются в других химикатах», говорит Юрке. Самосборка моторов на основе ДНК, также критически важна для производства наноустройств. «При данных масштабах никакой другой подход не представляется практически применимым», говорит Юрке «Это может привести к созданию пробирочных нанопроизводств, которые собирают сложные структуры, такие как электронные схемы, путем соответствующей подачи молекул».


Поскольку обычно ДНК имеет вид двойной юпирали этакой перекрученной лесенки исследователи начали с трех одиночных спиралей, каждая из которых напоминала половинку лестницы, разрезанную вдоль.
Спираль А имеет правильную структуру, совпадающую с половинами спиралей В и С и соответственно соединяется с ними. Спираль А имеет также свободную секцию между частями, соединяющимися со спиралями В и С, так, что обе «руки» АВ и АС могут двигаться свободно.
В свободном состоянии структура ДНК плавает с расставленными руками. Руки сцепляются при добавлении «топливной» спирали, которая спроектирована так, чтобы совпадать со свободными секциями спиралей В и С. Снова открыть щипчики можно, добавив другую спираль, совпадающую с «топливной» и удаляющую ее.
«Вся находящаяся в нескольких каплях раствора популяция из 30 триллионов щипчиков ДНК может быть последовательно открыта и закрыта, путем добавления соответствующих спиралей», говорит Эндрю Терблфилж, физик Оксфордского университета, проведший последний календарный год в Bell Labs. Поскольку ДНК-моторы слишком малы, чтобы наблюдать за ними доступными микроскопическими средствами, исследователи воспользовались эффектом флюоресценции для фиксирования фактов открытия и закрытия щипчиков.
Пара молекул красителя была прикреплена к кончикам ДНК-моторов, и когда лазерный свет возбуждал краситель, количество флуоресцентного излучения определяло расстояние между двумя краями.
Юрке сказал, что на создание ДНК-моторов его вдохновило осознание того, что молекулярные белковые моторы в живых организмах отвечают за сокращение мышц и перемещение веществ в клетках.
В настоящее время ученые Bell Labs уже работают над тем, чтобы присоединить к ДНК электропроводящие молекулы, чтобы собрать элементарные молекулярные электрические контуры.


НОВЫЙ МЕТОД ХРАНЕНИЯ ДНК


Ученые Института физико-химических исследований "Рикэн", расположенного в Иокогаме, изобрели новый метод хранения информации ДНК при помощи ее оттиска на листе бумаги. Исследователи назвали новый метод "Книгой ДНК". Теперь вся важная информация, которую содержат гены, может сохраняться в виде книжных страниц в течение нескольких лет.
"До настоящего времени ДНК можно было сохранить только методом замораживая, и ее транспортировку невозможно было производить без сухого льда. Новый метод хранения генетического материала позволяет доставить его в любое место даже при помощи обычной почтовой связи. Он поможет ускорить и усовершенствовать исследования ДНК” - сообщили ученые.
Как рассказывает руководитель проекта Йосихидэ Хаясидзаки, технология нового метода заключается в том, что образец ДНК при помощи игл наносится на лист бумаги, который предварительно опускается в особый водный раствор.
ДНК оставляет на бумаге "оттиск", который затем консервируется. Когда исследователь приступает к работе с данным образцом ДНК, он помещает лист бумаги с хранящейся информацией в аппарат, который размножает весь необходимый генетический материал. После этого в течение двух часов гены доступны для исследования.
Ученые также обнаружили, что ДНК можно хранить при обычной температуре в течение длительного периода времени, если она впитывается в волокна бумаги. Сейчас ученые выясняют, какой тип бумаги является наиболее подходящим для хранения образцов ДНК. Информация ДНК сохраняется на бумаге в течение нескольких лет, если на образцы не попадает прямой солнечный свет.
Если для хранения ДНК можно будет использовать бумагу, на которой обычно печатаются научные журналы, ученые смогут быстро консервировать информацию ДНК в зависимости от потребностей их исследования, сокращая при этом и время, и стоимость работ. Ученые уже создали опытный экземпляр "Книги ДНК", в котором представлены образцы около 60 тысяч генов, извлеченных из ДНК мышей.


ПЕРВЫЙ САМОСОБИРАЕМЫЙ НАНОТРАНЗИСТОР НА ДНК ОСНОВЕ


Как следует из публикации в журнале Science (302, р. 1380), израильские ученые из Технологического института "Технион" (Technion) во главе с физиком Эресом Брауном использовали особенности структуры ДНК и электронных свойств углеродных нанотрубок, впервые создав самособирающийся электронный нанотранзистор.
Открытые недавно нанотрубки обладают удивительными свойствами и позволяют рассчитывать на подлинный прорыв в миниатюризации электронных устройств. Главные трудности в этом направлении пока связаны с большими затратами времени и труда при получении любых устройств на этой основе. Израильским ученым впервые удалось преодолеть эти трудности, применив при сборке технологию, состоящую из нескольких этапов.
При помощи специальных белков, полученных от широко известной бактерии кишечной палочки (Е.соli), исследователи связали углеродные (графитовые) нанотрубки, покрытые антителами, с определенными участками молекулярных цепочек ДНК, после чего оставшуюся часть молекулы ДНК превратили в проводник. При погружении этой "конструкции" в раствор, содержащий ионы серебра, последние осаждались только на тех участках ДНК, которые не были предварительно покрыты указанным белком. На заключительном этапе поверхность еще и "позолотили" для того, чтобы уменьшить сопротивление. В результате ученые получили углеродную нанотрубку, оба конца которой оказались соединенными проводником. Полученное устройство действует как транзистор, реагируя на изменения разности потенциалов, приложенной к субстрату.
В трех сериях экспериментов ученым удалось получить 45 действующих нанотранзисторов, причем примерно треть из них представляла собой самосборки. Устройства могут действовать при комнатной температуре, а единственное ограничение пока связано с тем, что все их компоненты одновременно должны быть пригодны для протекания биохимических реакций и электролитических процессов. Ученые уже сумели соединить между собой два подобных устройства, используя для этой цели чисто биологические методы.
"ДНК прекрасный строительный материал для конструирования в молекулярной биологии, но, к сожалению, он не проводит электричество, объясняет профессор Браун. Нам удалось нанести на нее металлическое покрытие, обеспечив электропроводность".
"Этот результат демонстрирует возможность, используя чисто биологические методы, получать действующие неорганические устройства", подчеркивает эксперт по нанотехнологиям Сиз Дэккер из Университета Дельфта (Нидерланды). Впрочем, по его мнению, понадобится еще много лет упорных исследований прежде, чем ученые научатся получать самособирающиеся макроскопические электронные устройства. Эксперты по нанотехнологии уже назвали эту работу "выдающимся достижением" и "первым практическим шагом на пути к созданию молекулярного компьютера".




ЖИДКАЯ ФОРМА ДНК


Исследователям из Университета Северной Калифорнии Чапль-Хилла, США, удалось создать жидкую форму молекулы ДНК. Если помните, эта молекула имеет спиралевидную структуру и содержит множество отдельных элементов, которые служат своего рода программой для синтеза белка в живых клетках.
Обычно для изучения ДНК молекулы помещают в водный раствор. Теперь группа химиков под руководством Холдена Торпа и Ройса Мюррея предложила разжижать сами молекулы путём химической связи отрицательно заряженных молекул ДНК (в кристаллической форме) с положительно заряженным расплавом ряда солей металлов. Получающаяся в результате густая жидкость проводит электрический ток и, вероятно, может быть применена для реализации давешней идеи генетиков о распознавании последовательностей генов при помощи самой ДНК. Кроме того, жидкая ДНК растворяется в тех растворителях, которым она не поддавалась в твёрдом виде, что может принести новые способы изучения этой таинственной молекулы.
Однако на этом эксперименты не завершились. Во французской Лаборатории физики твёрдых тел Алик Казумов с коллегами показали, что ДНК способна проводить электрический ток и оставаясь в кристаллическом состоянии. Учёные изготовили специальную установку из двух миниатюрных сверхпроводящих электродов, выполненных из рения и углерода, отстоящих друг от друга на расстояние в 0,5 нанометра и соединённых между собой молекулой ДНК. Пропустив по образовавшейся цепи ток, они смогли измерить электрическое сопротивление, которое составило менее 100 кОм на молекулу. Интересно, что физический механизм, ответственный за перенос зарядов, не ясен до сих пор. Но самое интересное, что проводимость ДНК слабо зависит от температуры: вплоть до 1 Кельвина она остаётся почти неизменной, а ещё ниже, по всей вероятности, ДНК обретает свойства сверхпроводника.


СВЕРХПРОВОДИМОСТЬ ДНК


Сегодня физики утверждают, что никакой собственной электропроводности, а тем более сверхпроводимости у ДНК нет - все наблюдаемые на молекуле наследственности электрические эффекты обусловлены связанными с ней молекулами воды.
Со сверхпроводимостью ДНК, демонстрируемой в разных лабораториях мира, связывались многие надежды - от использования этой молекулы в нанотехнологиях до создания ДНК-ового компьютера. Публикация в последнем выпуске специального издания Physical Review Letters по выражению издания New Scientist, "забила в гроб этих представлений последний гвоздь". Ученые из Калифорнийского Университета в Лос-Анджелесе (University of California, Los Angeles) показали, что проводимость в цепях ДНК напрямую зависит от влажности, под которой подразумевается слой молекул поляризованной воды, покрывающий биологическую молекулу. "ДНК имеет водный слой практически в любых условиях. Мы систематически изменяли число водных слоев и показали, что проводимость происходит от молекул воды, а нет от электронов ДНК" –говорит руководитель исследования Георг Грюнер (George Gruner).
До сих пор ДНК считалась проводником переменного, но не постоянного тока. И калифорнийские ученые указывают на то, что именно этого следовало ожидать в том случае, если электропроводность ДНК обусловлена обволакивающей ее водой. Вода – это полярная молекула, перемещаясь по которой электроны производят переменный ток. Они не могут свободно проходить молекулу за молекулой, создавая сплошной поток, называемый постоянным током. Самым естественным объяснением наблюдаемых на ДНК явлений, по мнению соавтора Грюнера Питера Эрмитажа (Peter Armitage), является то, что ДНК вообще не проводит электричество. В другой работе, выполненной в Принстонском Университете в Нью-Джерси (Princeton University in New Jersey) Фуаном Онгом (Phuan Ong) и опубликованной месяц назад и вовсе утверждается, что ДНК – это изолятор. Онг удалил налипшие на ДНК воду и соль, затем привязал эти "очищенные" молекулярные цепочки к золотым электродам. Биологический полимер, коим является ДНК, перестал проводить электричество. В свете новых данных предполагается, что сверхпроводимость ДНК, о которой, в частности, писал журнал Science в 2001 году, могла быть обусловлена покрывающими ее в эксперименте атомами рения. Кое-кто из физиков говорит, что ДНК может служить полупроводником, если к ней подмешать атомы с избытком электронов. Иными словами, для использования молекулы наследственности не по прямому назначению в перспективе еще не все потеряно.

Рекомендуемая литература

Франк-Каменецкий М.Д. Самая главная молекула.- М.: Наука, 1990.
Волькенштейн М.В. Молекулы и жизнь. - М.: Наука, 1965.
Бреслер С.Е. Молекулярная биология. - Л.: Наука, 1973.
Волькенштейн М.В. Биофизика.- М.: Наука, 1988.
Волькенштейн М.В. Общая биофизика. - М.: Наука, 1978.
Рубин А.Б. Биофизика. В 2 т.- М.:ВШ., 1987.
Рубин А.Б. Теоретическая биофизика. - М.: Университет, 1999.
Эткинс П. Молекулы. - М.: Мир, 1991.
Зенгбуш П. Молекулярная и клеточная биология. В 3 т.-М.: Мир, 1982.
Зенгер В. Принципы структурной организации нуклеиновых кислот. - М.: Мир, 1987.
Перевод под редакцией М.В. Волькенштейна “Структура и стабильность биологических макромолекул” М., Мир, 1978 (Сборник статей из II тома серии “Биологические макромолекулы”)
Смосарев А.А. Биология с общей генетикой. - М.: Медицина, 1978.
Льюин Б. Гены. - М.: Мир, 1987.
Тагер А.А. Физическая химия полимеров. - М.: Химия, 1968.
Бартеньев Г.М., Зеленев Ю.В. Физика и механика полимеров. - М.: ВШ, 1983.
Волькенштейн М.В. Молекулярная биофизика. - М.: Наука, 1975.
Шантрен Ю. Биосинтез белков. - М.,1963.
Кушнер В.П. Коформационная изменчивость и денатурация полимеров. – Л.: Наука, 1977.
Перевод под редакцией Б. Хеймса, С. Хиггинса “Транскрипция и трансляция. Методы” М., Мир, 1987
Зотин А. И. ответственный редактор “Термодинамика биологических процессов” - М., Наука, 1976
Гросберг А.Ю., Хохлов А.Р. Статистическая физика макромолекул. - М.: Наука, 1989.
Тюдзе Р., Каван Т. Физическая химия полимеров. - М.: Химия, 1977.
Рубин А.Б. Термодинамика биологических процессов. - М.: Моск. Ун-т, 1984.
Бартеньев Г.М., Зеленев Ю. В. Курс физики полимеров. - Л.: Химия, 1976.
Фершт Э. Структура и механизм действия ферментов. - М.: Мир, 1980.
Шульц Г.Е., Ширмер Р.Х. Принципы структурной организации белков - М.: Мир, 1982.
Степанов М. Молекулярная биология. Структура и функции белков. - М.: ВШ, 1996.
Финкельштейн А.В., Птицын О.Б. Физика белка. - М.: Университет, 2002.
Франк-Каменецкий М.Д Структура ДНК. Эффекты последовательности. - США.: Энциклопедия. Наука жизни, 2002.
Оглезнева Н.Я. Медицинская и биологическая физика. - Омск, 1994.
Кантор И., Шиммел П. Биофизическая химия. В 3 т. - М.: Мир, 1984-1985.
Ленинджер А. Биохимия. т.1. - М.: Мир, 1986.
Рыбин И.А. Лекции по биофизике. – Свердловск: Свердловский ун-т, 1990.
Альбертс Б., Брей Д., Льюис Дж. Молекулярная биология клетки. В 3 т. - М.: Мир, 1994.
Гросберг А.Ю, Хохлов А.Р. Физика в мире полимеров. - М.: Наука, 1989.
Пташке Х. Переключение генов. - М.: Мир, 1988.
Костюк П.Г. Биофизика. - Киев, 1988.
Маррн Э. Биохимия человека. - М.: Мир, 1993.
Пригожин И.И. От возникающего к существующему. - М., 1985.
Рубин А.Б. Лекции по биофизике. - М.: МГУ, 1994.
Кольс О.Р. Биофизика ритмического возбуждения. - М.: МГУ, 1993.
Дюв К. Путешествие в мир живой клетки. - М.: Мир, 1987.
Рис Э., Стенберг М. От клеток к атомам. - М.: Мир, 1988.
Овчинников Ю. А. Биоорганическая химия. - М.: Просвещение, 1987.

Статьи:
Тихонов А.Н. Молекулярные моторы.// Соросовский образовательный журнал. – 1999. - №6.
Шайтан К.В. Конформационная подвижность белка с точки зрения физики.// Соросовский образовательный журнал. – 1999. - №5.
Шайтан К.В., Немухин А.В., Фирсов Д.А., Богдан Т.В., Тополь Н.А. Электронно-конформационные взаимодействия и значение эффективных зарядов на атомах в пептидах.// Молекулярная биология. – 1997. - т.31.










13PAGE 15


13PAGE 14215



13EMBED Equation.31415

G


·

Рис.6. Профиль свободной энергии для химической реакции.
Здесь
· – реакционная координата

Рис.1. Кривые КД ДНК
(в 80% этаноле при различных температурах)

Рис.2. КД-спектры ДНК.

13EMBED Equation.31415



Root EntryEquation NativeEquation NativeEquation NativeEquation NativeEquation NativeEquation NativeEquation NativeEquation NativeEquation NativeEquation NativeEquation NativeEquation NativeEquation NativeEquation NativeEquation NativeEquation NativeEquation NativeEquation NativeEquation NativeEquation NativeEquation NativeEquation NativeEquation NativeEquation NativeEquation NativeEquation NativeEquation NativeEquation NativeEquation NativeEquation NativeEquation NativeEquation NativeEquation NativeEquation NativeEquation NativeEquation Native)ІEquation NativeEquation NativeEquation NativeEquation NativeEquation NativeEquation NativeEquation NativeEquation NativeEquation NativeEquation NativeEquation NativeEquation NativeEquation NativeEquation NativeEquation NativeEquation NativeEquation NativeEquation NativeEquation NativeEquation NativeEquation NativeEquation NativeEquation NativeEquation Native

Приложенные файлы

  • doc 8842843
    Размер файла: 5 MB Загрузок: 0

Добавить комментарий