Вирусология наука о вирусах микроскопических на..

наука о вирусах микроскопических надмолекулярных созданиях природы, которые являются своеобразной паразитической формой жизни.
Общая вирусология изучает природу вирусов, их строение, размножение, биохимию, генетику. Медицинская, ветеринарная и сельскохозяйственная вирусология исследует патогенные вирусы, их инфекционные свойства, разрабатывает меры предупреждения, диагностики и лечения вызываемых ими заболеваний.
Вирусология решает фундаментальные и прикладные задачи и тесно связана с другими науками. Открытие и изучение вирусов, в частности бактериофагов, внесло огромный вклад в становление и развитие молекулярной биологии. Раздел вирусологии, изучающий наследственные свойства вирусов, тесно связан с молекулярной генетикой. Вирусы не только предмет изучения, но и инструмент молекулярно-генетических исследований, что связывает вирусологию с генетической инженерией. Вирусы возбудители большого количества инфекционных заболеваний человека, животных, растений, насекомых. С этой точки зрения вирусология тесно связана с медициной, ветеринарией, фитопатологией и другими науками.
Возникнув в конце XIX века как ветвь патологии человека и животных, с одной стороны, и фитопатологии с другой, вирусология стала самостоятельной наукой, по праву занимающей одно из основных мест среди биологических наук.

Глава 1. История вирусологии

1.1. Открытие вирусов
Вирусология молодая наука, ее история насчитывает немногим более 100 лет. Начав свой путь как наука о вирусах, вызывающих болезни человека, животных и растений, в настоящее время вирусология развивается в направлениях изучения основных законов современной биологии на молекулярном уровне, основываясь на том, что вирусы являются частью биосферы и важным фактором эволюции органического мира.
История вирусологии необычна тем, что один из ее предметов вирусные болезни стал изучаться задолго до того, как были открыты собственно вирусы. Начало истории вирусологии это борьба с инфекционными заболеваниями и только впоследствии постепенное раскрытие источников этих болезней. Подтверждением тому служат работы Эдуарда Дженнера (1749-1823 гг.) по предупреждению оспы и работы Луи Пастера (1822-1895 гг.) с возбудителем бешенства.
С незапамятных времен оспа была бичом человечества, унося тысячи жизней. Описания оспенной заразы встречаются в рукописях древнейших китайских и индийских текстов. Первые упоминания об эпидемиях оспы на европейском континенте датируются VI столетием нашей эры (эпидемия среди солдат эфиопской армии, осаждавшей Мекку), после чего наблюдался необъяснимый период времени, когда упоминания об эпидемиях оспы отсутствовали. Оспа снова начала гулять по континентам в XVII веке. Например, в Северной Америке (1617-1619 гг.) в штате Массачусетс погибло 9/10 населения, в Исландии (1707 г.) после эпидемии оспы от 57 тыс. человек осталось только 17 тыс., в г. Истхем (1763 г.) от 1331 жителя осталось 4 человека. В связи с этим, проблема борьбы с оспой стояла очень остро.
Методика предупреждения оспы через прививку, называемая вариоляцией, была известна с давних времен. Упоминания о применении вариоляции в Европе датируются серединой 17-го века со ссылками на более ранний опыт применения в Китае, на Дальнем Востоке, в Турции. Суть вариоляции заключалась в том, что содержимое пустул от пациентов, болевших легкой формой оспы, вносили в маленькую ранку на коже человека, что вызывало легкое заболевание и предупреждало острую форму. Однако при этом сохранялась большая опасность заболевания тяжелой формой оспы и смертность среди привитых достигала 10%. Дженнер совершил переворот в методике предупреждения оспы. Он первый обратил внимание на то, что люди, переболевшие коровьей оспой, которая протекала легко, впоследствии никогда не болели оспой. 14 мая 1796 г. Дженнер внес в ранку Джеймса Фипса, никогда не болевшего оспой, жидкость из пустул больной коровьей оспой доярки Сары Селмес. На месте искусственной инфекции у мальчика появились типичные пустулы, которые через 14 дней исчезли. Тогда Дженнер внес в ранку мальчика высокоинфекционный материал из пустул больного оспой. Мальчик не заболел. Так зародилась и подтвердилась идея вакцинации (от латинского слова vacca корова). Во времена Дженнера вакцинация понималась как внесение инфекционного материала коровьей оспы в организм человека с целью предотвращения заболевания натуральной оспой. Термин вакцина применяли к веществу, предохранявшему от оспы. С 1840 г. противооспенную вакцину стали получать заражением телят. Вирус оспы человека был открыт только в 1904 г. Таким образом, оспа это первая инфекция, против которой была применена вакцина, т. е. первая управляемая инфекция. Успехи в вакцинопрофилактике черной оспы привели к ее искоренению в мировом масштабе.
В наше время вакцинация и вакцина употребляются как общие термины, обозначающие прививку и прививочный материал.
Пастер, по существу не знавший ничего конкретного о причинах бешенства, кроме неоспоримого факта его инфекционной природы, использовал принцип ослабления (аттенуации) возбудителя. В целях ослабления болезнетворных свойств возбудителя бешенства был использован кролик, в мозг которого ввели мозговую ткань умершей от бешенства собаки. После смерти кролика мозговая ткань его была введена следующему кролику и т. д. Было проведено около 100 пассажей, прежде чем возбудитель адаптировался к ткани мозга кролика. Будучи введен подкожно в организм собаки, он проявлял лишь умеренные свойства патогенности. Такой «перевоспитанный» возбудитель Пастер назвал «фиксированным», в отличие от «дикого», которому свойственна высокая патогенность. Позднее Пастер разработал метод создания иммунитета, состоящий из серии инъекций с постепенно увеличивающимся содержанием фиксированного возбудителя. Собака, прошедшая полный курс инъекций, оказалась в полной мере устойчивой к инфекции. Пастер пришел к выводу, что процесс развития инфекционной болезни, по существу, является борьбой микробов с защитными силами организма. «Каждая болезнь должна иметь своего возбудителя, а мы должны способствовать развитию иммунитета к этой болезни в организме пациента», говорил Пастер. Еще не понимая, каким образом организм вырабатывает иммунитет, Пастер сумел использовать его принципы и направить механизмы этого процесса на пользу человека. В июле 1885 г. Пастеру представился случай испытать свойства «фиксированного» возбудителя бешенства на ребенке, укушенном бешеной собакой. Мальчику была проведена серия инъекций все более ядовитого вещества, причем последняя инъекция содержала уже полностью патогенную форму возбудителя. Мальчик остался здоров. Вирус бешенства был открыт Ремленже в 1903 г.
Следует отметить, что ни вирус оспы, ни вирус бешенства не были первыми открытыми вирусами, поражающими животных и человека. Первое место по праву принадлежит вирусу ящура, открытому Леффлером и Фрошем в 1898 г. Эти исследователи, используя многократные разведения фильтрующегося агента, показали его ядовитость и сделали заключение о его корпускулярной природе.
К концу XIX-го столетия выяснилось, что целый ряд заболеваний человека, таких как бешенство, оспа, грипп, желтая лихорадка являются инфекционными, однако их возбудители не обнаруживались бактериологическими методами. Благодаря работам Роберта Коха (1843-1910 гг.), который впервые использовал технику чистых бактериальных культур, появилась возможность различать бактериальные и небактериальные заболевания. В 1890 г. на X конгрессе гигиенистов Кох вынужден был заявить, что «при перечисленных болезнях мы имеем дело не с бактериями, а с организованными возбудителями, которые принадлежат к совсем другой группе микроорганизмов». Это высказывание Коха свидетельствует, что открытие вирусов не было случайным событием. Не только опыт работы с непонятными по своей природе возбудителями, но и понимание сущности происходящего способствовали тому, что была сформулирована мысль о существовании оригинальной группы возбудителей инфекционных заболеваний небактериальной природы. Оставалось экспериментально доказать ее существование.
Первое экспериментальное доказательство существования новой группы возбудителей инфекционных заболеваний было получено нашим соотечественником физиологом растений Дмитрием Иосифовичем Ивановским (1864-1920 гг.) при изучении мозаичных заболеваний табака. Это неудивительно, так как инфекционные заболевания эпидемического характера часто наблюдались и у растений. Еще в 1883-84 гг. голландский ботаник и генетик де Фриз наблюдал эпидемию позеленения цветов и предположил инфекционную природу заболевания. В 1886 г. немецкий ученый Майер, работавший в Голландии, показал, что сок растений, больных мозаичной болезнью, при инокуляции вызывает у растений такое же заболевание. Майер был уверен, что виновником болезни является микроорганизм, и безуспешно искал его. В 19 веке заболевания табака наносили огромный вред сельскому хозяйству и в нашей стране. В связи с этим, для изучения заболеваний табака на Украину была направлена группа исследователей, в которую, будучи студентом Петербургского университета, входил Д.И. Ивановский. В результате изучения заболевания, описанного в 1886 г. Майером как мозаичная болезнь табака, Д.И. Ивановский и В.В. Половцев пришли к выводу, что оно представляет собой два различных заболевания. Одно из них «рябуха» вызывается грибком, а другое неизвестного происхождения. Изучение мозаичной болезни табака было продолжено Ивановским в Никитском ботаническом саду под руководством академика А.С. Фамицина. Используя сок пораженного болезнью листа табака, профильтрованный через свечу Шамберлана, задерживающую самые мелкие бактерии, Ивановский вызвал заболевание листьев табака. Культивирование зараженного сока на искусственных питательных средах не дало результатов и Ивановский приходит к выводу, что возбудитель болезни имеет необычную природу он фильтруется через бактериальные фильтры и не способен расти на искусственных питательных средах. Прогревание сока при 60-70 °C лишало его инфекционности, что свидетельствовало о живой природе возбудителя. Ивановский сначала назвал новый тип возбудителя «фильтрующиеся бактерии». Результаты работы Д.И. Ивановского были положены в основу его диссертации, представленной в 1888 г., и опубликованы в книге «О двух болезнях табака» в 1892 году. Этот год и считается годом открытия вирусов.
Определенный период времени в зарубежных публикациях открытие вирусов связывали с именем голландского ученого Бейеринка (1851-1931 гг.), который также занимался изучением мозаичной болезни табака и опубликовал свои опыты в 1898 г. Профильтрованный сок зараженного растения Бейеринк поместил на поверхность агара, проинкубировал и получил на его поверхности бактериальные колонии. После этого верхний слой агара с колониями бактерий был удален, а внутренний слой был использован для заражения здорового растения. Растение заболело. Из этого Бейеринк сделал вывод, что причиной заболевания являются не бактерии, а некая жидкая субстанция, которая могла проникнуть внутрь агара, и назвал возбудителя «жидкий живой контагий». В связи с тем, что Ивановский только подробно описал свои опыты, но не уделил должного внимания небактериальной природе возбудителя, возникло недопонимание ситуации. Известность работы Ивановского приобрели только после того, как Бейеринк повторил и расширил его опыты и подчеркнул, что Ивановский впервые доказал именно небактериальный характер возбудителя самой типичной вирусной болезни табака. Сам Бейеринк признал первенство Ивановского и в настоящее время приоритет открытия вирусов Д.И. Ивановским признан во всем мире.
Слово ВИРУС означает яд. Этот термин применял еще Пастер для обозначения заразного начала. Следует отметить, что в начале 19 века все болезнетворные агенты назывались словом вирус. Только после того, как стала понятна природа бактерий, ядов и токсинов терминами «ультравирус», а затем просто «вирус» стали обозначать «новый тип фильтрующегося возбудителя». Широко термин «вирус» укоренился в 30-е годы нашего столетия.
В настоящее время ясно, что вирусы характеризуются убиквитарностью, то есть повсеместностью распространения. Вирусы поражают представителей всех царств живого: человека, позвоночных и беспозвоночных животных, растения, грибы, бактерии.
Первое сообщение, имеющее отношение к вирусам бактерий было сделано Ханкин в 1896 г. В Летописи Института Пастера он заявил, что «... вода некоторых рек Индии обладает бактерицидным действием...», что без сомнения связано с вирусами бактерий. В 1915 г. Туорт в Лондоне, изучая причины лизиса бактериальных колоний, описал принцип передачи «лизиса» новым культурам в ряду поколений. Его работы, как это часто бывает, фактически оказались не замеченными, и два года спустя, в 1917 г., канадец де Эрелль повторно обнаружил явление лизиса бактерий, связанного с фильтрующимся агентом. Он назвал этот агент бактериофагом. Де Эрелль предполагал, что бактериофаг один. Однако исследования Барнета, работавшего в Мельбурне в 1924-34 гг., показали широкое разнообразие бактериальных вирусов по физическим и биологическим свойствам. Открытие многообразия бактериофагов вызвало большой научный интерес. В конце 30-х годов трое исследователей физик Дельбрюк, бактериологи Лурия и Херши, работавшие в США, создали так называемую «Фаговую группу», исследования которой в области генетики бактериофагов в конечном итоге привели к рождению новой науки молекулярной биологии.
Изучение вирусов насекомых существенно отстало от вирусологии позвоночных животных и человека. В настоящее время ясно, что вирусы, поражающие насекомых, условно можно разделить на 3 группы: собственно вирусы насекомых, вирусы животных и человека, для которых насекомые являются промежуточными хозяевами, и вирусы растений, которые также поражают насекомых.
Первый вирус насекомых, который был идентифицирован вирус желтухи шелковичного червя (вирус полиэдроза тутового шелкопряда, названный Bollea stilpotiae). Еще в 1907 г. Провачек показал, что фильтрованный гомогенат больных личинок является инфекционным для здоровых личинок тутового шелкопряда, но только в 1947 г. немецкий ученый Бергольд обнаружил палочковидные вирусные частицы.
Одним из наиболее плодотворных исследований в области вирусологии является изучение Ридом природы желтой лихорадки на волонтерах армии США в 1900-1901 гг. Убедительно было продемонстрировано, что желтая лихорадка вызывается фильтрующимся вирусом, который передавался комарами и москитами. Было также установлено, что москиты после впитывания инфекционной крови в течение двух недель остаются неинфекционными. Таким образом, был определен внешний инкубационный период заболевания (время, необходимое для репродукции вируса в насекомом) и установлены основные принципы эпидемиологии арбовирусных инфекций (вирусных инфекций, передаваемых кровососущими членистоногими).
Способность размножения вирусов растений в своем переносчике насекомом была показана в 1952 г. Мараморошу. Исследователь, используя технику инъекций насекомым, убедительно показал способность вируса желтухи астр размножаться в своем переносчике шеститочечной цикаде.
1.2. Этапы развития вирусологии
История достижений вирусологии напрямую связана с успехами развития методической базы исследований.
Конец XIX начало XX-го века. Основным методом идентификации вирусов в этот период был метод фильтрации через бактериологические фильтры (свечи Шамберлана), которые использовались как средство разделения возбудителей на бактерии и небактерии. С использованием фильтруемости через бактериологические фильтры были открыты следующие вирусы:
1892 г. вирус табачной мозаики;
1898 г. вирус ящура;
1899 г. вирус чумы рогатого скота;
1900 г. вирус желтой лихорадки;
1902 г. вирус оспы птиц и овец;
1903 г. вирус бешенства и вирус чумы свиней;
1904 г. вирус оспы человека;
1905 г. вирус чумы собак и вирус вакцины;
1907 г. вирус денге;
1908 г. вирус оспы и трахомы;
1909 г. вирус полиомиелита;
1911 г. вирус саркомы Рауса;
1915 г. бактериофаги;
1916 г. вирус кори;
1917 г. вирус герпеса;
1926 г. вирус везикулярного стоматита.
30-е годы основным вирусологическим методом, используемым для выделения вирусов и их дальнейшей идентификации, являются лабораторные животные (белые мыши для вирусов гриппа, новорожденные мыши для вирусов Коксаки, шимпанзе для вируса гепатита B, куры, голуби для онкогенных вирусов, поросята-гнотобионты для кишечных вирусов и т. д.). Первым, кто начал систематически использовать лабораторных животных при изучении вирусов, был Пастер, который еще в 1881 г. проводил исследования по инокуляции материала от больных бешенством в мозг кролика. Другая веха работы по изучению желтой лихорадки, следствием которых явилось использование в вирусологической практике новорожденных мышей. Кульминацией этого цикла работ стало выделение Сайклзом в 1948 г. на мышах-сосунках группы вирусов эпидемической миалгии.
1931 г. в качестве экспериментальной модели для выделения вирусов стали использоваться куриные эмбрионы, которые обладают высокой чувствительностью к вирусам гриппа, оспы, лейкоза, саркомы кур и некоторым другим вирусам. И в настоящее время куриные эмбрионы широко используются для выделения вирусов гриппа.
1932 г. английский химик Элфорд создает искусственные мелкопористые коллоидные мембраны основу для метода ультрафильтрации, с помощью которого стало возможным проводить определение размера вирусных частиц и дифференцировать вирусы по этому признаку.
1935 г. применение метода центрифугирования дало возможность кристаллизации вируса табачной мозаики. В настоящее время методы центрифугирования и ультрацентрифугирования (ускорение на дне пробирки превышает 200000 g) широко используются для выделения и очистки вирусов.
В 1939 г. для изучения вирусов впервые был применен электронный микроскоп, обладающий разрешающей способностью 0,2-0,3 нм. Использование ультратонких срезов тканей и метода негативного контрастирования водных суспензий позволило проводить изучение взаимодействия вирусов с клеткой и исследовать структуру (архитектуру) вирионов. Сведения, полученные с помощью электронного микроскопа, были значительно расширены с помощью рентгеноструктурного анализа кристаллов и псевдокристаллов вирусов. Совершенствование электронных микроскопов завершилось созданием сканирующих микроскопов, позволяющих получать объемные изображения. С использованием метода электронной микроскопии изучена архитектура вирионов, особенности их проникновения в клетку хозяина.
В этот период была открыта основная масса вирусов. В качестве примера могут быть приведены следующие:
1931 г. вирус гриппа свиней и вирус западного энцефаломиелита лошадей;
1933 г. вирус гриппа человека и вирус восточного энцефаломиелита лошадей;
1934 г. вирус паротита;
1936г. вирус рака молочной железы мышей;
1937г. вирус клещевого энцефалита.
40-е годы. В 1940 г. Хогланд с коллегами установили, что вирус осповакцины содержит ДНК, но не РНК. Стало очевидным, что вирусы отличаются от бактерий не только размерами и неспособностью расти без клеток, но и тем, что они содержат только один вид нуклеиновой кислоты ДНК или РНК.
1941 г. американский ученый Херст на модели вируса гриппа открыл феномен гемагглютинации (склеивания эритроцитов). Это открытие легло в основу разработки методов выявления и идентификации вирусов и способствовало изучению взаимодействия вируса с клеткой. Принцип гемагглютинации положен в основу ряда методов:
РГА реакция гемагглютинации применяется для обнаружения и титрования вирусов;
РТГА реакция торможения гемагглютинации применяется для идентификации и титрования вирусов.
1942 г. Херст устанавливает наличие у вируса гриппа фермента, который позднее идентифицирован как нейраминидаза.
1949 г. открытие возможности культивирования клеток животных тканей в искусственных условиях. В 1952 г. Эндерс, Уэллер и Роббинс получили Нобелевскую премию за разработку метода культуры клеток.
Введение в вирусологию метода культуры клеток явилось важным событием, давшим возможность получения культуральных вакцин. Из широко применяемых в настоящее время культуральных живых и убитых вакцин, созданных на основе аттенуированных штаммов вирусов, следует отметить вакцины против полиомиелита, паротита, кори и краснухи.
Создателями вакцин против полиомиелита являются американские вирусологи Сэбин (трехвалентная живая вакцина на основе аттенуированных штаммов полиовирусов трех серотипов) и Солк (убитая трехвалентная вакцина). В нашей стране советскими вирусологами М.П. Чумаковым и А.А. Смородинцевым разработана технология производства живой и убитой вакцин против полиомиелита. В 1988 г. Всемирная ассамблея здравоохранения поставила перед ВОЗ задачу ликвидации полиомиелита во всем мире с полным прекращением циркуляции дикого полиовируса. К настоящему времени достигнут огромный прогресс в этом направлении. Применение глобальной вакцинации против полиомиелита с применением «туровых» схем вакцинации позволило не только кардинально снизить заболеваемость, но и создать территории, свободные от циркуляции дикого полиовируса.
Открыты вирусы:
1945 г. вирус Крымской геморрагической лихорадки;
1948 г. вирусы Коксаки.
50-е годы. В 1952 г. Дульбекко разрабатывает метод титрования бляшек в монослое клеток эмбриона цыпленка, что позволило ввести в вирусологию количественный аспект. 1956-62 гг. Уотсон, Каспар (США) и Клуг (Великобритания) разрабатывают общую теорию симметрии вирусных частиц. Структура вирусной частицы стала одним из критериев в системе классификации вирусов.
Этот период характеризовался значительными достижениями в области бактериофагов:
установлена индукция профага лизогенизирующих фагов (Львов и др., 1950г.);
доказано, что инфекционность присуща фаговой ДНК, а не белковой оболочке (Херши, Чейз, 1952 г.);
открыто явление общей трансдукции (Циндер, Ледерберг, 1952 г.).
Реконструирован инфекционный вирус табачной мозаики (Френкель-Конрад, Вильяме, Сингер, 1955-57 гг.), в 1955 г. получен в кристаллическом виде вирус полиомиелита (Шаффер, Шверд, 1955 г.).
Открыты вирусы:
1951 г. вирусы лейкоза мышей и ECHO;
1953 г. аденовирусы;
1954 г. вирус краснухи;
1956 г. вирусы парагриппа, цитомегаловирус, респираторно-синцитиальный вирус;
1957 г. вирус полиомы;
1959 г. вирус аргентинской геморрагической лихорадки.
60-е и последующие годы характеризуются расцветом молекулярно-биологических методов исследования. Достижения в области химии, физики, молекулярной биологии и генетики легли в основу методической базы научных исследований, которые стали применяться не только на уровне методик, но и целых технологий, где вирусы выступают не только как объект исследований, но и как инструмент. Ни одно открытие молекулярной биологии не обходится без вирусной модели.
1967 г. Катес и МакАуслан демонстрируют присутствие в вирионе осповакцины ДНК-зависимой РНК-полимеразы. В следующем году обнаруживается РНК-зависимая РНК-полимераза у реовирусов, а затем у парамиксо- и рабдовирусов. В 1968 г. Якобсон и Балтимор устанавливают наличие у полиовирусов геномного белка, соединенного с РНК, Балтимор и Бостон устанавливают, что геномная РНК полиовируса транслируется в полипротеин.
Открыты вирусы:
1960 г. риновирусы;
1963 г. австралийский антиген (HBsAg).
70-е годы. Балтимор одновременно с Темином и Мизутани сообщают об открытии в составе РНК-содержащих онкогенных вирусов фермента обратной транскриптазы (ревертазы). Становится реальным изучение генома РНК содержащих вирусов.
Изучение экспрессии генов у вирусов эукариот дало фундаментальную информацию о молекулярной биологии самих эукариот существование кэп-структуры мРНК и ее роль в трансляции РНК, наличие полиадениловой последовательности на 3'-конце мРНК, сплайсинг и роль энхансеров в транскрипции впервые выявлены при изучении вирусов животных.
1972 г. Берг публикует сообщение о создании рекомбинантной молекулы ДНК. Возникает новый раздел молекулярной биологии генная инженерия. Применение технологии рекомбинантных ДНК позволяет получать белки, имеющие важное значение в медицине (инсулин, интерферон, вакцины). 1975 г. Келер и Мильштейн получают первые линии гибридов, продуцирующих моноклональные антитела (МКА). На основе МКА разрабатываются самые специфичные тест-системы для диагностики вирусных инфекций. 1976 г. Бламберг за открытие HBsAg получает Нобелевскую премию. Установлено, что гепатит A и гепатит B вызываются разными вирусами.
Открыты вирусы:
1970 г. вирус гепатита B;
1973 г. ротавирусы, вирус гепатита A;
1977 г. вирус гепатита дельта.
80-е годы. Развитие заложенных отечественным ученым Л.А. Зильбером представлений о том, что возникновение опухолей может быть связано с вирусами. Компоненты вирусов, ответственные за развитие опухолей, назвали онкогенами. Вирусные онкогены оказались в числе лучших модельных систем, помогающих изучению механизмов онкогенетической трансформации клеток млекопитающих.
1985 г. Мюллис получает Нобелевскую премию за открытие полимеразной цепной реакции (ПЦР). Это молекулярно-генетический метод диагностики, позволивший, кроме того, усовершенствовать технологию получения рекомбинантных ДНК и открыть новые вирусы.
Открыты вирусы:
1983 г. вирус иммунодефицита человека;
1989 г. вирус гепатита C;
1995 г. с использованием ПЦР открыт вирус гепатита G.
1.3. Развитие концепции о природе вирусов
Ответы на вопросы «Что такое вирусы?» и «Какова их природа?» составляли предмет дискуссии многие годы со времени их открытия. В 20-30 гг. никто не сомневался, что вирусы являются живой материей. В 30-40 гг. считалось, что вирусы это микроорганизмы, так как способны размножаться, обладают наследственностью, изменчивостью и приспособляемостью к меняющимся условиям среды обитания, и, наконец, подвержены биологической эволюции, которая обеспечивается естественным и искусственным отбором. В 60-е годы первые успехи молекулярной биологии определили закат концепции о вирусах как организмах. В онтогенетическом цикле вируса выделены две формы внеклеточная и внутриклеточная. Для обозначения внеклеточной формы вируса введен термин ВИРИОН. Установлены отличия его организации от строения клеток. Обобщены факты, указывающие на совершенно отличный от клеток тип размножения, названный дисъюнктивная репродукция. Дисъюнктивная репродукция это временная и территориальная разобщенность синтеза вирусных компонентов генетического материала и белков от последующей сборки и формирования вирионов. Показано, что генетический материал вирусов представлен одним из двух типов нуклеиновой кислоты (РНК или ДНК). Сформулировано, что основным и абсолютным критерием отличия вирусов от всех других форм жизни является отсутствие у них собственных белоксинтезирующих систем.
Накопившиеся данные позволили прийти к выводу, что вирусы не являются организмами, пусть даже мельчайшими, так как любые, даже минимальные организмы типа микоплазм, риккетсий и хламидий имеют собственные белоксинтезирующие системы. Согласно определению, сформулированному академиком В.М. Ждановым, вирусы являются автономными генетическими структурами, способными функционировать только в клетках с разной степенью зависимости от клеточных систем синтеза нуклеиновых кислот и полной зависимостью от клеточных белоксинтезирующих и энергетических систем, и подвергающимися самостоятельной эволюции.
С точки зрения паразитологии, вирусы облигатные внутриклеточные паразиты. Паразитизм (от греческого parasitos нахлебник) состояние симбиоза, при котором один организм (паразит) живет за счет другого, нанося ему вред. При этом паразит физически и физиологически зависит от хозяина. Внутриклеточный паразитизм это высшая стадия облигатного паразитизма, суть которого заключается в абсолютной зависимости метаболизма паразита от организма хозяина и характеризуется полной невозможностью размножения паразита за пределами клетки. Однако уровень паразитизма вирусов качественно иной, чем у внутриклеточных паразитов-микроорганизмов. Вирусы это генетические паразиты. Крайним проявлением генетического паразитизма является способность ряда вирусов интегрировать в геном клетки хозяина. С этой точки зрения вирусы могут быть определены как особая неклеточная форма жизни, которой присущ строгий внутриклеточный паразитизм на молекулярном и молекулярно-генетическом уровнях,
Таким образом, вирусы представляют собой многообразную и многочисленную группу неклеточных форм жизни, не являющихся микроорганизмами, и объединенных в царство Vira, Вирусы изучаются в рамках вирусологии, которая представляет собой самостоятельную научную дисциплину, имеющую свой объект и методы исследования.
Вирусологию разделяют на общую и частную, а вирусологические исследования на фундаментальные и прикладные. Предметом фундаментальных исследований в вирусологии является архитектура вирионов, их состав, особенности взаимодействия вирусов с клеткой, способы переноса наследственной информации, молекулярные механизмы синтеза элементов и процесс их объединения в целое, молекулярные механизмы изменчивости вирусов и их эволюция. Прикладные исследования в вирусологии связаны с решением проблем медицины, ветеринарии и фитопатологии.

ГЛАВА 2
СТРУКТУРНАЯ И МОЛЕКУЛЯРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ВИРУСОВ
В онтогенетическом цикле вируса выделены две стадии внеклеточная и внутриклеточная и, соответственно, две формы его существования вирион и вегетативная форма. Вирион это целая вирусная частица, в основном состоящая из белка и нуклеиновой кислоты, часто устойчивая к воздействию факторов внешней среды и приспособленная для переноса генетической информации из клетки в клетку. Вегетативная форма вируса существует в едином комплексе вирус-клетка и только в их тесном взаимодействии.
2.1. Архитектура вирионов
Внеклеточная форма вируса вирион, предназначенная для сохранения и переноса нуклеиновой кислоты вируса, характеризуется собственной архитектурой, биохимическими и молекулярно-генетическими особенностями. Под архитектурой вирионов понимают ультратонкую структурную организацию этих надмолекулярных образований, различающихся размерами, формой и сложностью строения. Для описания архитектуры вирусных структур разработана номенклатура терминов:
Белковая субъединица единая, уложенная определенным образом полипептидная цепь.
Структурная единица (структурный элемент) белковый ансамбль более высокого порядка, образованный несколькими химически связанными идентичными или неидентичными субъединицами.
Морфологическая единица группа выступов (кластер) на поверхности капсида, видимая в электронном микроскопе. Часто наблюдаются кластеры, состоящие из пяти (пентамер) и шести (гексамер) выступов. Это явление получило название пентамерно-гексамерной кластеризации. Если морфологическая единица соответствует химически значимому образованию (сохраняет свою организацию в условиях мягкой дезинтеграции), то применяют термин капсомер.

Капсид внешний белковый чехол или футляр, образующий замкнутую сферу вокруг геномной нуклеиновой кислоты.
Кор (core) внутренняя белковая оболочка, непосредственно примыкающая к нуклеиновой кислоте.
Нуклеокапсид комплекс белка с нуклеиновой кислотой, представляющий собой упакованную форму генома.
Суперкапсид или пеплос оболочка вириона, образованная липидной мембраной клеточного происхождения и вирусными белками.
Матрикс белковый компонент, локализованный между суперкапсидом и капсидом.
Пепломеры и шипы поверхностные выступы суперкапсида.

Как уже отмечалось, вирусы могут проходить через самые микроскопические поры, задерживающие бактерии, за что и были названы фильтрующимися агентами. Свойство фильтруемости вирусов обусловлено размерами, исчисляемыми нанометрами (нм), что на несколько порядков меньше, чем размеры самых мелких микроорганизмов. Размеры вирусных частиц, в свою очередь, колеблются в относительно широких пределах. Самые мелкие просто устроенные вирусы имеют диаметр чуть больше 20 нм (парвовирусы, пикорнавирусы, фаг Q
·), вирусы средних размеров 100-150 нм (аденовирусы, коронавирусы). Наиболее крупными признаны вирусные частицы осповакцины, размеры которых достигают 170x450 нм. Длина нитевидных вирусов растений может составлять 2000 нм.
Представители царства Vira характеризуются разнообразием форм. По своей структуре вирусные частицы могут быть простыми образованиями, а могут представлять собой достаточно сложные ансамбли, включающие несколько структурных элементов. Условная модель гипотетического вириона, включающего все возможные структурные образования, представлена на рисунке 1.
Существует два типа вирусных частиц (ВЧ), принципиально отличающихся друг от друга:
1) ВЧ, лишенные оболочки (безоболочечные или непокрытые вирионы);
2) ВЧ, имеющие оболочку (оболочечные или покрытые вирионы).

Рис. 1. Строение гипотетического вириона
2.1.1. Строение вирионов, лишенных оболочки
Выделено три морфологических типа вирионов, лишенных оболочки: палочковидные (нитевидные), изометрические и булавовидные (рис. 2). Существование первых двух типов непокрытых вирионов определяется способом укладки нуклеиновой кислоты и ее взаимодействием с белками.
1. Белковые субъединицы связываются с нуклеиновой кислотой, располагаясь вдоль нее периодическим образом так, что она сворачивается в спираль и образует структуру под названием нуклеокапсид. Такой способ регулярного, периодического взаимодействия белка и нуклеиновой кислоты определяет образование палочковидных и нитевидных вирусных частиц.
2. Нуклеиновая кислота не связана с белковым чехлом (возможные нековалентные связи очень подвижны). Такой принцип взаимодействия определяет образование изометрических (сферических) вирусных частиц. Белковые оболочки вирусов, не связанные с нуклеиновой кислотой, называют капсидом.

3. Булавовидные вирионы обладают дифференцированной структурной организацией и состоят из ряда дискретных структур. Основными структурными элементами вириона являются изометрическая головка и хвостовой отросток. В зависимости от вируса в структуре вириона также могут присутствовать муфта, шейка, воротничок, хвостовой стержень, хвостовой чехол, базальная пластинка и фибриллы. Наиболее сложную дифференцированную структурную организацию имеют бактериофаги T-четной серии, вирион которых состоит из всех перечисленных структурных элементов.
Вирионам или их компонентам могут быть присущи два основных типа симметрии (свойство тел повторять свои части) спиральный и икосаэдрический. В том случае, если компоненты вириона обладают разной симметрией, то говорят о комбинированном типе симметрии ВЧ. (схема 1).
Спиральная укладка макромолекул описывается следующими параметрами: числом субъединиц на виток спирали (u, число необязательно целое); расстоянием между субъединицами вдоль оси спирали (p); шагом спирали (P); P=pu. Классическим примером вируса со спиральным типом симметрии является вирус табачной мозаики (ВТМ). Нуклеокапсид этого палочковидного вируса размером 18x300 нм состоит из 2130 идентичных субъединиц, на виток спирали приходится 16 1/3 субъединиц, шаг спирали составляет 2,3 нм.
Икосаэдрическая симметрия самая эффективная для конструирования замкнутого чехла из отдельных субъединиц. При рассмотрении элементов икосаэдрической симметрии следует различать понятия симметрия и форма. Симметрия в данном случае это набор поворотов, которые переводят объект сам в себя, форма это лишь общий вид кубической поверхности объекта (тетраэдр, октаэдр, додекаэдр и т. д.). Многие объекты, имея икосаэдрическую симметрию, не имеют икосаэдрической формы. Икосаэдр это геометрическая фигура, имеющая 12 вершин, 20 граней, 20 ребер.
Наименьшее число структурных элементов, способных образовать икосаэдр, равно 60, однако капсиды сложноустроенных вирусов могут быть образованы 60n структурными элементами. Для описания икосаэдрической упаковки структурных элементов в капсиде введено так называемое триангуляционное число (T). Это число, равное частному от деления числа субъединиц на 60. Так, у вируса некроза табака и фага
·X174 T=1 (60 субъединиц), многие вирусы растений имеют T=3 (180 субъединиц), вирус Синдбис имеет T=4 (240 субъединиц), ротавирус имеет T=13 (780 субъединиц).
Многие крупные икосаэдрические вирусы для получения плотной упаковки капсида формируют субтриангуляции на основе структур меньших размеров, что предполагает наличие разных типов субъединиц на вершинах икосаэдра и нарушение локальной симметрии в местах их контактов. В этом случае наблюдается расхождение между реально существующей симметрией ВЧ и видом структуры с соответствующим числом Т. Наиболее простую конструкцию капсида, построенного по такому принципу, имеют паповавирусы. Их капсид образован 72 морфологическими единицами, каждая построена из трех белковых субъединиц, организованных в пентамеры, а ВЧ имеет вид структуры с Т=7.

Схема 1. Типы симметрии вирусных частиц

Более сложная структура вириона наблюдается у аденовируса, капсид которого организован по принципу ансамблей, обладает строгой икосаэдрической симметрией и имеет вид структуры с Т=25. На вершинах икосаэдра находятся кластеры пентоны, содержащие в основании так называемые фибры стержень с утолщением на конце. Остальная структура капсида построена из гексонов. Гексоны и пентоны это простейшие подструктуры капсида аденовирусов. Всего в состав аденовириона входит 12 оснований пентонов и 240 гексонов. При диссоциации в мягких условиях образуются надструктуры (капсомеры), состоящие из 9-ти гексонов.
Еще более сложноустроенные вирионы, на пример частицы бактериофагов T-чётной серии, обладают комбинированным типом симметрии. Так, головка бактериофага T4 имеет икосаэдрический тип симметрии, а сокращенный чехол хвостового отростка обладает спиральным типом симметрии. В целом вирион фага T4 обладает комбинированным типом симметрии.
2.1.2. Строение вирионов с оболочкой
Другой тип вирусных частиц это покрытые или оболочечные вирионы. Оболочечные вирионы, также как и непокрытые, могут быть палочковидными, нитевидными и изометрическими разной формы от четко очерченных кирпичеобразных вирионов вируса оспы до плейоморфных частиц вирусов герпеса и коронавирусов, имеющих различные размеры и форму.
Оболочка вириона (пеплос, суперкапсид) состоит из липидсодержащей мембраны клеточного происхождения (цитоплазматической мембраны, мембраны эндоплазматического ретикулюма или аппарата Гольджи, ядерной мембраны) и вирусных гликопротеинов, встроенных в мембрану. Оболочку вирионы приобретают в процессе почкования через ту или иную мембрану.
Вирусные гликопротеины, находящиеся в мембране, как правило, формируют поверхностные выступы, называемые шипами и пепломерами. Эти поверхностные выступы характеризуются разной степенью упорядоченности и могут быть представлены одним белком (вирус кори) или двумя разными белками (вирусы гриппа, ретровирусы), могут быть образованы мономерами белка или его димерами и тримерами.
Таким образом, структурная организация вириона описывается двумя характеристиками наличием/отсутствием оболочки и типом симметрии капсида. Оболочечные вирионы могут обладать икосаэдрической, спиральной и комбинированной симметрией капсида, также как и безоболочечные, что представлено на схеме 2.

Вирионы без оболочки Вирионы с оболочкой
Спиральная Комбинированная Икосаэдрическая
симметрия симметрия симметрия
Схема 2. Характеристика структурной организации вирионов
2.2. Химический состав вирусов
Основными химическими соединениями, которые входят в состав всех вирусов, являются белки и нуклеиновые кислоты. В состав ряда вирусов входят липиды и углеводы.
2.2.1. Белки
Локализация вирусных белков. Белки, связанные с жизненным циклом вируса, разделяют на белки, детерминируемые геномом вируса и белки, имеющие клеточное происхождение. В качестве примера клеточных белков, которые обнаружены в составе некоторых вирионов, могут быть приведены белок цитоскелета актин, и ядерные белки гистоны. Белки клеточного происхождения, участвующие в процессе репликации вируса, будут рассмотрены в разделе взаимодействия вируса с клеткой.
По месту локализации белки, детерминируемые вирусным геномом, разделяют на две группы: 1) структурные белки это белки, входящие в состав ВЧ, их обозначают как VP; 2) неструктурные белки это предшественники структурных белков, регуляторные белки и ферменты, обслуживающие процесс внутриклеточной репродукции вируса и не входящие в состав ВЧ. Их обозначают как NS-белки (схема 3).
Свойства вирусных белков. В состав вирионов входят белки с различной молекулярной массой (от 4 до 100 кД), состоящие из одной или нескольких полипептидных цепей. Количество этих белков также различно у разных вирусов. В состав нуклеокапсида ВТМ входит один белок. У других вирусов в состав вириона может входить несколько десятков белков, имеющих различные физико-химические свойства. Белки, формирующие капсид, нуклеокапсид и коровую оболочку, обладают одним общим свойством способностью к самосборке.
В состав ВЧ могут входить низкомолекулярные белки, не участвующие в формировании капсида. Например, геномные белки пикорнавирусов и аденовирусов. Геномный белок ковалентно связан с нуклеиновой кислотой и участвует в ее репликации.

БЕЛКИ ВИРУСОВ
Детерминированы геномом вируса

Имеют клеточное происхождение
Белки суперкапсида, ферменты, гистоны
Неструктурные:
Предшественники архитектурных
белков
Ферменты
Регуляторные белки
Структурные:
Архитектурные (суперкапсидные, капсидные, матриксные, коровые) Ферменты Геномные
Схема 3. Локализация вирусных белков
Сложные белки представлены гликопротеинами (обозначают как gp) и липопротеинами. Наличие гликопротеина определяет присутствие в вирионе углеводного компонента, который может быть представлен олигосахаридами маннозного типа, галактозой, N-ацетилглюкозамином или нейраминовой кислотой. Вирусные гликопротеины, как правило, экспонированы на наружной поверхности ВЧ и выполняют три основные функции: обеспечивают связывание вириона с клеточным рецептором (функция прикрепительного белка), обладают фузионной активностью (обеспечивают слияние мембран) и определяют антигенные свойства вирусов. В то же время, вирусные гликопротеины могут быть и неструктурными белками и, оставаясь в интегральной форме в мембране шероховатого эндоплазматического ретикулюма (ШЭР), выполнять функции транслоказ, обеспечивая транспорт вирусных компонентов в его просвет.
Вирусные липопротеины представлены белками, ацилированными, как правило, миристиновой (C14) кислотой. Остатки жирных кислот, соединенные с молекулой белка, выполняют функцию липофильного якоря.
Вирусные белки-ферменты могут входить в состав вирусной частицы или являться неструктурными белками и появляться в клетке после экспрессии вирусного генома. Наиболее оснащенным ферментами является вирион вируса оспы, который имеет практически полный набор энзимов, необходимых для независимой внутриклеточной репликации вируса. В то же время, мелкие просто организованные изометрические вирусы с позитивным РНК-геномом могут не иметь никаких ферментов в составе вириона.
Функционально активные белки вирусов представлены, в первую очередь, ферментами нуклеинового обмена, обеспечивающими сложные механизмы репликации/транскрипции вирусного генома; ферментами, осуществляющими посттрансляционный процессинг и модификацию белков, и ферментами, участвующими в проникновении вирионов в клетку хозяина.
Первая группа ферментов наиболее многочисленна и включает как аналоги клеточных ферментов, так и вирус-специфические ферменты.
ДНК-зависимая ДНК-полимераза осуществляет синтез ДНК на матрице ДНК (вирус оспы).
ДНК-зависимая РНК-полимераза осуществляет синтез мРНК на матрице ДНК (вирус оспы).
РНК-зависимая РНК-полимераза осуществляет синтез РНК на матрице РНК. Выполняет функции транскриптазы и репликазы. Впервые обнаружена в 1970 г. Балтимором у вируса везикулярного стоматита. Входит в состав вирионов или является NS-белком РНК-содержащих вирусов.
Обратная транскриптаза или ревертаза или РНК-зависимая ДНК-полимераза осуществляет синтез ДНК на матрице РНК. Впервые открыта в 1970 г. у ретровирусов Темином и Мизутани.
Хеликаза осуществляет расплетете двухнитевой структуры ДНК. Кроме этого хеликазы обладают нуклеотидтрифосфат-зависимой РНК-хеликазной активностью, которая включает три процесса: связывание дезоксинуклеотидтрифосфата, его гидролиз и за счет этой энергии расплетение двухнитевой РНК.
мРНК-модифицирующие ферменты: поли-А-полимераза аденилирует 3'-конец РНК за счет энергии АТФ; Кэп-энзим и метилтрансферазный комплекс катализирует образование на 5'-конце кэп-структуры.
АТФ-аза, ГТФ-аза осуществляют гидролиз соответствующих энергетических субстратов.
Рибонуклеаза Н разрушает РНК, находящуюся в дуплексе с ДНК. Вторая группа вирусных ферментов ферменты белкового обмена.
Здесь мы приведем лишь некоторые из них:
Протеиназы ферменты, участвующие в посттрансляционном процессинге полипротеинов. Являются NS-белками РНК-содержащих вирусов;
Протеинкиназы ферменты, фосфорилирующие структурные белки вирионов. Обнаружены в составе вируса везикулярного стоматита, вируса бешенства, альфавирусов и ретровирусов. Примерами ферментов, участвующих в проникновении вирусов в клетку, являются лизоцим бактериофагов и нейраминидаза вируса гриппа.
2.2.2. Липиды
Все оболочечные РНК-содержащие почкующиеся вирусы имеют липиды клеточного происхождения, входящие в состав суперкапсида (15-30% от сухого веса). 50-60% липидов представлены фосфолипидами, 20-30% составляет холестерин.
У ДНК-геномных вирусов липиды содержат вирусы оспы, герпеса, гепатита B. Это непочкующиеся вирусы. У вируса оспы липиды не образуют дифференцированной оболочки, которая формируется в цитоплазме в процессе морфогенеза поксвириона. Липиды вируса гепатита B образуются путем инвагинации мембран эндоплазматического ретикулюма (ЭПР). Липидсодержащая оболочка вируса герпеса формируется при прохождении внутреннего компонента вириона через ядерную мембрану. Следовательно, в состав вирусной оболочки герпесвирусов входят липиды ядерной мембраны.
2.2.3. Нуклеиновые кислоты
Клетки всех живых организмов содержат два вида нуклеиновой кислоты ДНК (двухнитевая ДНК клеточного генома) и РНК (мРНК, тРНК, рРНК). В отличие от клеток, вирионы содержат только один вид нуклеиновой кислоты ДНК или РНК. И та и другая являются хранителями наследственной информации и выполняют функции генома. Однако следует учитывать, что наличие одного вида нуклеиновой кислоты является характеристикой вириона, но не вируса. В жизненном цикле вируса его геномная нуклеиновая кислота транскрибируется, то есть ДНК-содержащие вирусы образуют РНК. Ряд РНК-содержащих вирусов имеют в цикле репродукции стадию обратной транскрипции и синтезируют ДНК на матрице РНК. Примерно 20% всех вирусов имеют ДНК-геном, 80% РНК-геном. Способность РНК хранить наследственную информацию уникальное свойство вирусов. Размеры вирусных геномов (длина нуклеотидных последовательностей, выраженная в нуклеотидах) варьируют в широких пределах от 1,7 тысяч нуклеотидов (т.н.) у цирковируса свиней до 300 т.н. у фикоднавирусов архибактерий.
Кроме того, что геном вирусов может быть представлен или ДНК или РНК, он может находиться в разных видах в виде двухнитевой (дн) или однонитевой (он) формы, в виде линейной или кольцевой, в виде непрерывной или сегментированной формы (схема 4).

РЯК
двухнитевая однонитевая
ДНК двухнитевая однонитевяя
I
I
линейная кольцевая линейная кольцевая
линейная / кольцевая сегментирован- /сегментирован-
сегментированная
непрерывная
частично двухнитевая
линейная
(+)РНК (-)РНК
непрерывная сегментированная
Схема 4. Виды нуклеиновых кислот вирусов
Особенностями ДНК-геномов является то, что линейные молекулы никогда не имеют бессмысленных концов. Концы молекул могут содержать прямые (
·
·) или инвертированные концевые повторы (
·
·), выступающие комплементарные (липкие) концы, самокомплементарные концевые последовательности, терминальные геномные белки (
·) (рис. 3).


~^-*> *
· дн, линейная с прямыми концевыми повторами Герпесвирусы Фаги Т7, Т2






пм дн, линейная с инвертированными повторами и терминальными белками Аденовирусы
г»




дн, линейная с липкими концами

Фаг X


дн, с ковалентно замкнутыми концами (терминальные петли)
1 J
Поксвирусы Иридовирусы
дн, с разрывами одной цепи

ФагТ5


& частично дн, кольцевая Гепаднавирусы
@ дн, кольцевая Папиломавирусы Фаг RM2
<*> дн, кольцевая, сегментированная Полиднавирусы
о он, кольцевая Фаги фХ 174, Ml3
он, линейная с самокомплементарной 3'-последовательностью
>
Парвовирусы

Рис. 3. Виды ДНК-геномов вирусов

+Кэ AAA 5'-кэп, 3'-поли-А последовательность Флавирусы

1

Коронавирусы
+Кэп -tf 5'-кэп, 3'-тРНК-подобная структура ВТМ
+VPg п - AAA 5'-терминальный геномный белок Калицивирусы



Пикорнавирусы Потивирусы
+Кэп +Кэп AAA AAA диплоидный набор



Ретровирусы
- он,линейная Парамиксовирусы

Рабдовирусы
1 1 он, линейная, сегментированная Ортомиксовирусы (7-8 сегментов)
L
О М
О S
О он, кольцевая, сегментированная Буньявирусы Аренавирусы
дн, линейная, сегментированная


Реовирусы (10-11 сегментов)
II



+ 1 обоюдозначащая (амбисенс) РНК S-сегмент аренавиру-
сов
Тосповирусы

Рис. 4. Виды РНК-геномов вирусов


Многообразие видов РНК геномов расширяется за счет существования последовательностей, отличающихся направлением связей сахаро-фосфатного остова (рис. 4).
Однонитевые РНК могут иметь позитивную полярность (+)РНК, негативную полярность (-)РНК или могут быть представлены обоюдозначащей цепью (+,-)РНК (амбисенс стратегия кодирования). В свою очередь, РНК позитивной полярности могут иметь разную структурную организацию: могут, являясь матричной РНК, иметь на 5'-конце кэп (7-метилгуанозин, Сар), а на 3'-конце поли-А (poly-A) последовательность; могут не иметь кэпа или поли-А; могут иметь на 5'-конце геномный белок; могут иметь на 3'-конце тРНК-подобную или шпильковую структуру.
Виды геномов вирусов легли в основу их классификации. Однако следует учитывать, что вид генома в настоящее время не является формальным таксоном и используется для удобства ориентации в многообразии вирусов.


ГЛАВА 3
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ВИРУСОВ С ОРГАНИЗМОМ ХОЗЯИНА
3.1. Пути распространения вирусов в биосфере
Экологическая ниша вирусов это многокомпонентная система взаимосвязанных элементов, включающая клетку, организм, популяцию хозяина, переносчиков, другие вирусы и внешнюю среду. Для сохранения вируса как биологического вида необходима его последовательная передача от хозяина к хозяину. Передача происходит по горизонтальному и вертикальному направлениям, что имеет место не только в популяциях человека и животных, но и среди бактерий, насекомых, растений, грибов.
Горизонтальная передача рассеивание возбудителей среди восприимчивых хозяев с использованием различных механизмов и путей, во многом определяемых средой обитания и особенностями жизнедеятельности организма-хозяина.
Вертикальная передача это передача возбудителя от родителей потомству, которая также может осуществляться различными путями, и предполагает сохранение вируса в ряду поколений.
Бактериофаги в природных условиях встречаются в тех местах, где есть чувствительные бактерии (в воде, почве, выделениях человека и животных), которые инфицируются вирусом при случайных контактах и распространяются водными потоками или путями, используемыми хозяином. Применение бактериофагов в качестве лечебных препаратов значительно увеличило интенсивность циркуляции вирусов бактерий в биосфере. Возможно распространение бактериофагов воздушным путем, что создает определенные трудности при работе с бактериальными культурами в научно-исследовательских лабораториях.
Вирусы растений могут распространяться в процессе размножения хозяев (с пыльцой, семенами), где важную роль играют природные факторы (дождь, ветер, птицы). Человек распространяет вирусы растений при использовании зараженного посадочного материала (вегетативные побеги, семена), а также при использовании зараженной земли. Однако основными переносчиками фитопатогенных вирусов являются их промежуточные хозяева (насекомые, клещики, нематоды, фитопатогенные грибы).
Вирусы насекомых инфицируют хозяина в процессе его питания и размножения. Различают трасспермальную, трансовариальную и трансстадийную (в процессе метаморфоза) передачи вируса. Распространяются вирусы в процессе миграций насекомых.
Распространение вирусов позвоночных осуществляется с использованием механизмов, которые реализуются различными путями, и часто включают внешнюю среду и промежуточных хозяев вируса. Важную роль в распространении вирусов играют миграционные процессы, наблюдаемые среди людей и животных.
Распространение вирусов в человеческой популяции имеет свои особенности. В соответствии с четырьмя основными типами локализации возбудителя в организме (дыхательные пути, желудочно-кишечный тракт, кровь, наружные покровы) выделены несколько механизмов передачи вирусов.
Трансмиссивный механизм передача с помощью биологических переносчиков. При любом варианте такой передачи вирус черпается переносчиком из внутренних сред донора и внедряется во внутреннюю среду реципиента.
Парентеральный механизм передача вирусов через кровь. Вирусы, циркулирующие в крови, могут передаваться в процессе переливаний крови, при использовании загрязненных шприцев и других медицинских инструментов (искусственный путь), в процессе сексуальных контактов (половой путь) и другими путями.
Алиментарный (энтеральный) механизм вирус проникает через слизистые оболочки органов пищеварения. Разновидностью алиментарного механизма является фекально-оральный механизм передачи вируса.
Аэрогенный механизм входными воротами инфекции являются слизистые органов дыхания. Реализуется воздушно-капельным или пылевым путем.
Контактный механизм реализуется через кожные покровы. Такой механизм передачи могут использовать очень немногие вирусы. Так, например, вирус бешенства может проникать в организм животного и человека при ослюнении кожных покровов. Слюна собак содержит гиалуронидазу, которая облегчает проникновение вируса в кровь через кожу.
Вертикальный механизм передача вирусов от матери плоду во время вынашивания и родов. Возбудитель может передаваться через плаценту, через околоплодные воды и оболочки, при прохождении плода через родовые пути матери.
Таблица 1 Механизмы и пути распространения вирусов человека
Механизм
Путь
Примеры

Аэрогенный
Воздушно-капельный, пылевой
Вирусы гриппа, ротавирусы

Алиментарный
Пищевой, водный, бытовой
Энтеровирусы, ротавирусы, калицивирусы

Трансмиссивный
Через биологического переносчика
Вирус лихорадки Западного Нила

Парентеральный
Искусственный, половой
Вирусы гепатита B, C, D, BИЧ

Контактный
Через кожные покровы
Вирус натуральной оспы, вирус бешенства

Вертикальный
От матери плоду во время вынашивания и родов
Вирус простого герпеса, ЦМВ, ВИЧ


3.2. Проникновение вирусов в организм хозяина
Циркулируя в биосфере, вирус встречает восприимчивого хозяина, проникает в организм и может вызвать инфекцию.
Инфекция (infectio) заражение. Как биологическое явление представляет собой процесс взаимодействия одного или нескольких видов возбудителей-паразитов с более высокоорганизованным организмом хозяина, который может проявляться болезнью или носительством. Совокупность вызываемых патологических изменений в организме определяется как инфекционный процесс.
Проникновение вируса в организм хозяина у разных биологических видов решается по-разному.
1. Вирусы растений проникают в организм хозяина по типу раневых инфекций, где распространяются по плазмодесмам, ксилеме и флоэме.
2. Вирусы бактерий путем введения нуклеиновой кислоты в тело клетки или путем проникновения вириона.
3. Вирусы насекомых попадают в организм хозяина в процессе питания или размножения.
4. Вирусы животных и человека при инфицировании организма хозяина проходят более сложный путь. Одни вирусы (вирус гриппа, ротавирусы) реплицируются и вызывают заболевание в месте проникновения в организм (входные ворота инфекции). Другие вирусы, попав в организм хозяина с использованием того или иного механизма, проходят стадию распространения. Распространение вируса в организме сопровождается виремией (вирусемией) циркуляцией вируса в крови, что свидетельствует о генерализации инфекции.
Различают несколько путей распространения вирусов в организме:
1. Нейронный путь (вирусы бешенства, герпеса).
2. Лимфатический путь (реовирусы, полиомавирусы).
3. Гематогенный путь, ассоциированный с клеточными компонентами и плазмой крови (вирус краснухи, вирусы гепатита B и C, цитомегаловирус, энтеровирусы).
Сохранение вируса как биологического вида обеспечивает его восприимчивый хозяин, который является основным элементом экологической ниши вируса. Способность клеток или организма хозяина заражаться называется восприимчивостью.
Спектр хозяев разных вирусов значительно варьирует. Одни вирусы имеют широкий круг хозяев, другие заражают лишь определенные клетки одного вида хозяина. Широта круга хозяев может быть ограничена видом (видоспецифические вирусы) или определяться таксономическими категориями более высокого порядка. Вирусы, имеющие широкий круг хозяев, распространены среди вирусов растений. Например, вирус табачной мозаики и вирус желтухи астр инфицируют как растения, так и своего переносчика-насекомого. Примером вирусов животных и человека, имеющих несколько хозяев, являются арбовирусы. Вирус лихорадки Западного Нила инфицирует человека, комаров, водоплавающих птиц; вирус клещевого энцефалита человека, животных, клещей. Однако не найдены вирусы, способные поражать одновременно клетки прокариот и эукариот.
Экологические ниши вирусов, выражающиеся в круге восприимчивых хозяев, сложились в ходе эволюции. Однако они могут меняться, и вирусы способны преодолевать межвидовые барьеры. Так, вирусы гриппа циркулируют среди многих видов животных и птиц, которые являются резервуаром сохранения вируса в межэпидемический период. В Китае среди детей часто наблюдаются вспышки кишечной инфекции, вызванной ротавирусами антигенной группы B, резервуаром которых являются крысы. В качестве примера вируса, преодолевшего межвидовой барьер, можно привести вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), который перешел в человеческую популяцию от обезьян.
Процесс адаптации вируса к новым хозяевам определяется мутациями рецептор-распознающих участков вирионов и собственно изменением вирулентности для данного биологического вида. Однако следует понимать, что не все так однозначно и изучение молекулярных основ преодоления межвидовых барьеров еще впереди.
Для того чтобы размножиться, вирус должен найти восприимчивую клетку. Каждый вирус обладает так называемой тканевой тропностью способностью инфицировать клетки определенного типа. Так, вирусы растений поражают или ткань листа, или ткань прицветника или клетки корневой системы. Вирусы бактерий видоспецифичны вирусы архибактерий не могут инфицировать клетку E. coli, а многие колифаги не проникают в клетку шигеллы. Наиболее выражена тканевая специфичность вирусов животных и человека. Так, вирусы гепатитов поражают гепатоциты, вирус Эпштейна-Барр (вызывает инфекционный мононуклеоз) обладает тропностью к B-лимфоцитам, ВИЧ к T-лимфоцитам, кишечные вирусы к энтероцитам, кардиотропностью обладают вирусы Коксаки B. Целый ряд вирусов обладает тропностью не к одному, а к нескольким типам клеток. Так полиовирусы тропны к клеткам респираторного тракта, желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), центральной нервной системы (ЦНС). Вирус гепатита C (ВГC) лимфотропен и гепатотропен.
Специфическое сродство вирусов к клеткам и тканям определяется двумя механизмами:
Присутствием на клеточной поверхности специфических для вируса рецепторов.
Содержанием в системе активирующих ферментов, необходимых для протеолитического расщепления вирусных поверхностных белков и проявления инфекционной активности вируса.
3.3. Взаимодействие вирусов с клеткой
Основные этапы взаимодействия: адсорбция вируса на клеточной поверхности; проникновение-раздевание вируса; реализация генетической информации; морфогенез вирусных частиц; выход вирусов из клетки.
3.3.1. Адсорбция вируса на клеточной поверхности
Первый этап взаимодействия вируса с клеткой адсорбция вируса на клеточной поверхности, инициирует цепь динамических событий, конечной целью которых является проникновение вируса в клетку.
Специфическое сродство вирусов к клеткам и тканям определяется присутствием на клеточной поверхности мембранных молекул, называемых рецепторами и способных связываться с вирусными поверхностными образованиями, называемыми антирецепторами.
Вирусные антирецепторы это белки и гликопротеины, их также называют прикрепительными белками. Часто (но не всегда) прикрепительные белки образуют выступы на поверхности вириона (шипы, пепломеры), однако собственно антирецептор (функциональная часть молекулы прикрепительного белка), как правило, экранирован от случайных взаимодействий и находится в углублении. В качестве примеров прикрепительных белков вирусов человека и животных, выступающих над поверхностью вириона, могут быть приведены гемагглютинин вируса гриппа, VP4 ротавируса,
·l реовирусов, фимбрии аденовирусов. Специфическими прикрепительными структурами являются фибриллы бактериофагов. У энтеровирусов антирецептор находится на дне так называемых каньонов углублений на поверхности капсида.
Эволюция не создала для вирусов особых мембранных структур, обеспечивающих проникновение вирусов в клетку. Вирусы используют клеточные рецепторы, уже существующие для проникновения в клетку жизненно-важных факторов питательных веществ, факторов роста, гормонов и т. д. Химическая природа клеточных рецепторов многообразна и до конца не изучена. Для разных вирусов это разные мембранные молекулы.
Так, для ряда вирусов рецепторами являются мембранные молекулы интегринового суперсемейства. Для вирусов Коксаки A
·v
·3 интегрин, для вирусов Коксаки B
·2
·3 интегрин, для ротавирусов
·2
·1 интегрин.
Интегрины молекулы адгезии, экспрессируемые на поверхности клеток и связанные с цитоскелетом. Являются гетеродимерами (состоят из двух цепей
· и
·). Идентифицировано около 20 членов этого суперсемейства, которые образуются за счет различных комбинаций
·- и
·-цепей. Во многих случаях интегрины узнают трипептид Arg-Gly-Asp (RGD).
Для других вирусов рецепторами являются молекулы иммуноглобулинового суперсемейства. Так, основным рецептором для ВИЧ является; молекула CD4, для риновирусов молекула адгезии ICAM-1, для полиовирусов CD44 антиген, для вируса гепатита C молекула CD81. Рецепторами для ряда РНК-содержащих вирусов (миксовирусов и рабдовирусов) являются ганглиозиды GTlb, GQlb (гликопротеины, содержащие сиаловую кислоту).
Установлено, что в проникновении вируса в клетку могут принимать участие не одна, а несколько разных мембранных молекул, относящихся к различным суперсемействам. Так, получены данные, что ВГС проникает в клетку также при участии рецептора липопротеинов низкой плотности (ЛНП) то есть в связывании и проникновении вируса в клетке участвуют два рецепторных белка. В проникновении в клетку аденовируса принимают участие белки двух суперсемейств иммуноглобулинового и интегринового. Фибры взаимодействуют с белком суперсемейства иммуноглобулинов, пентон с интегринами. Количество рецепторов, участвующих в проникновении вируса герпеса достигает десяти.
Одни и те же белки могут принимать участие в проникновении разных вирусов. Так, аденовирусы и вирусы Коксаки используют один в тот же мембранный белок иммуноглобулинового суперсемейства. Вирусологи называют его CAR. Полиовирусы и вирусы герпеса имеют один и тот же рецептор на клетках ЦНС, что определяет их нейротропность (CD155 молекула, относящаяся к суперсемейству иммуноглобулинов).
Рецепторы распределены в мембране клетки диффузно. Подвижность (текучесть) белково-липидного слоя мембраны определяет возможность концентрации рецепторов в ограниченном участке. Такая концентрация способствует образованию мультивалентных связей между рецептором и антирецептором, которые необходимы для необратимой адсорбции вируса. Количество молекул рецептора в участке адсорбции вируса может достигать нескольких тысяч.
Взаимодействие между рецептором и антирецептором прикрепительного белка вируса происходит по принципу комплементарности. Комплементарность дополнительность (пространственная, по заряду, электронной структуре и т. д.) является основой взаимного сродства молекул.
Необратимая адсорбция вируса на клеточной поверхности является пусковым механизмом для следующего этапа взаимодействия вируса с клеткой.

3.3.2. Пронинновение-раздевание вирусов
Установлены и охарактеризованы два ведущих механизма проникновения вирусов в клетку трансмембранное проникновение и проникновение путем рецепторного эндоцитоза. Выбор пути, по которому происходит проникновение вируса, зависит от индивидуальных особенностей вируса, типа клеток, температуры и рН среды. Однако эти два механизма не исчерпывают всего многообразия путей, которыми пользуются вирусы для проникновения в клетку. Так, многие вирусы растений не могут преодолеть клеточную стенку и попадают внутрь только при ее механическом повреждении. Уникальным механизмом введения генома в клетку хозяина обладают бактериофаги с сократительным хвостовым отростком. Они прокалывают оболочку бактериальной клетки и впрыскивают геном в тело клетки хозяина («шприцевой» механизм). Другие бактериофаги для преодоления клеточной стенки применяют ее ферментативный лизис.
Таблица 2 Основные механизмы проникновения вирусов в клетку
Механизм
Вирус

Трансмембранное проникновение
Полиовирусы (Picornaviridae)

Проникновение путем рецепторного эндоцитоза
Аденовирусы (Adenoviridae), Ротавирусы (Reoviridae)

Проникновение при повреждении клетки
Вирусы растений

Введение вирусного генома в клетку с использованием «шприцевого» механизма за счет сокращения хвостового отростка фага
Бактериофаг T4 (Mioviridae)

Ферментативный лизис клеточной стенки
Бактериофаг
·6 (Cystoviridae)


Трансмембранное проникновение вирусов
Трансмембранное проникновение вирусов или, другими словами, прямая пенетрация через клеточную мембрану, происходит, минуя стадию эндоцитоза. В основе трансмембранного проникновения вируса лежит взаимодействие со специфическим рецептором, что приводит к конформационным изменениям белков вирусной поверхности, а также конформационным изменениям компонентов цитоплазматической мембраны. Следствием конформационных изменений является проникновение в клетку нуклеокапсида или геномной нуклеиновой кислоты. Такой способ проникновения используют как оболочечные, так и безоболочечные вирусы.
Оболочечные вирусы проникают в клетку путем слияния клеточной мембраны и мембраны вирусной оболочки. Слияние происходит после взаимодействия вируса с рецептором за счет так называемых белков слияния. В клетку проникает внутренний компонент вириона (нуклеокапсид). Белки вирусной оболочки остаются на поверхности клеточной мембраны.
В ряде случаев может наблюдаться слияние не только вирусной и клеточной мембран, но и мембран соседних клеток. Слияние приводит к образованию отдельных многоядерных клеток, симпластов (многоядерный слой слившихся клеток) и синцитиев (конгломераты клеток). При высокой множественности заражения клеточные мембраны сливаются за счет вирусных белков слияния при проникновении вируса в клетку. Это так называемое слияние снаружи (миксовирусы). При низкой множественности заражения слияние клеточных мембран может происходить после проникновения вируса. В таких случаях для слияния необходимо накопление внутриклеточного пула белков слияния за счет внутриклеточного синтеза. Накопление вирусных белков внутри клетки приводит к так называемому слиянию изнутри (герпесвирусы, ретровирусы).
Пенетрация через клеточную мембрану безоболочечных вирусных частиц это конформационно-зависимый процесс. При взаимодействии антирецепторов вирионов с белками-рецепторами клетки капсидные белки претерпевают конформационные изменения, изменяя одновременно состояние мембраны, в результате чего в клетку проникает геномная нуклеиновая кислота вируса.

Теория рецепторного эндоцитоза
Теория проникновения вирусов в клетку путем рецепторного эндоцитоза впервые сформулирована в 1979 г. Голдстайном и в общих чертах повторяет хорошо изученный механизм рецепторного эндоцитоза белков и гормонов (рис. 5). С использованием механизма рецепторного эндоцитоза в клетку проникают как оболочечные, так и безоболочечные вирусы.
Стадия 1. Вирус связывается с клеточной поверхностью за счет комплементарного взаимодействия антирецепторных участков прикрепительных белков и рецепторов клетки мультивалентным способом.
Стадия 2. Комплекс «ВЧ-рецепторы» мигрирует в область окаймленной ямки, которая может быть ассоциирована с цитоскелетом.
Окаймленная ямка представляет собой участок цитоплазматической мембраны, ассоциированный с внутренней стороны мембраны с белковым комплексом, называемым трискелионом. Мажорным белком этого комплекса является клатрин консервативный фибриллярный белок. Трискелион служит структурным элементом чехла окаймленного пузырька, образующегося путем эндоцитоза. Часто окаймленные ямки располагаются над пучками цитоплазматических актиновых филаментов, формирующих цитоскелет.
Стадия 3, 4. Появление комплекса «ВЧ-рецепторы» в окаймленной ямке является сигналом для активизации процесса эндоцитоза (образования эндосомы), который включает следующие стадии переход цитоплазмы в области ямки из золя в гель за счет полимеризации актина и инвагинацию окаймленной ямки, происходящую при сокращении нитей актина (3), замыкание мембраны (4). Образуется покрытая клатрином вакуоль (эндосома).
Стадия 5. На следующем этапе происходит цепь взаимодействий покрытой эндосомы с клеточными непокрытыми везикулами, в основе которых лежит механизм слияния мембран. Слияние эндосомы с клеточной везикулой преследует своей целью освобождение от клатриновой оболочки и завершается образованием так называемой рецептосомы, теряющей клатрин.
Стадия 6. Дальнейшие события, происходящие в рецептосоме, различаются в каждом конкретном случае в зависимости от свойств белков капсида и от наличия или отсутствия вирусной оболочки. Однако общим является акт взаимодействия вирусных белков слияния с мембраной рецептосомы, с последующим раздеванием вирусной частицы и проникновением нуклеиновой кислоты к месту репликации.

У вируса гриппа, относящегося к ортомиксовирусам (оболочечные вирусы, реплицирующиеся в ядре клетки) раздевание идет в два этапа. На первом этапе снижение рН внутри рецептосомы, создаваемое за счет работы K-Na насоса, приводит к взаимодействию вирусного белка гемагглютинина с мембраной рецептосомы, в результате чего происходит слияние мембран. В итоге, в цитоплазму выходит субвирусная частица, потерявшая оболочку. В таком виде она транспортируется к ядру клетки. Второй акт раздевания происходит при взаимодействии матриксного белка субвирусной частицы (M-белок) с ядерной оболочкой, в результате чего в ядро проникает нуклеокапсид.
У ротавирусов (безоболочечные двукапсидные вирусы) раздевание вирусной частицы осуществляется в один этап. Понижение концентрации Ca2+, происходящее в рецептосоме после ее образования, приводит к разрушению наружного капсида вириона. Освободившиеся из состава наружного капсида белки слияния VP4 и VP7 дезинтегрируют мембрану рецептосомы, и в цитоплазму выходит внутренний капсид, содержащий нуклеиновую кислоту.

Примеры белков слияния
Гемагглютинин (HA) вируса гриппа главный вирусный антиген является прикрепительным белком (содержит антирецептор) и белком слияния. Однако эти функции выполняют разные участки HA. HA синтезируется как полипептид-предшественник и нарезается внеклеточной трипсиноподобной протеиназой на 2 субъединицы большую (HA1) и малую (HA2). Вирионы с нерасщепленным HA неинфекционны. Инфекционность в таком случае блокируется на стадии слияния мембран и контролируется хозяином. HA1 служит антирецептором, HA2 выполняет функцию слияния. Для слияния HA с клеточной мембраной необходимо экспонирование на поверхности белковой молекулы гидрофобных аминокислот, которые облегчают внедрение аминокислотной последовательности в липидный бислой клеточной мембраны. Экспонирование происходит в результате конформационной престройки молекулы, индуцируемой при низких значениях pH (рис. 6).

Кроме вируса гриппа, низкие значения pH (5,0-5,5) необходимы для проявления активности белков слияния вирусов везикулярного стоматита, бешенства, лесов Семлики, желтой лихорадки, Эпштейна-Барр.
F-белок парамиксовирусов (вирусы Сэндай, кори, паротита, парагриппа) функционирует при нейтральных значениях pH, в связи с чем эти вирусы могут проникать в клетку трансмембранно.
F-белок представляет собой гидрофобный гликопротеин с высококонсервативным расположением остатков цистеина (рис. 7).
F-белки синтезируются как неактивные предшественники и приобретают функциональную активность после нарезания клеточной трипсиноподобной протеазой на пептиды F1 и F2. Нарезание вызывает конформационные изменения молекулы и экспонирование вновь образованного N-конца, где находится сливающий пептид. Пептид слияния на вновь образованном N-конце содержит высоконсервативную последовательность из 25 гидрофобных аминокислот, способную взаимодействовать с липидами клеточной мембраны. Пептид F2 содержит остатки цистеина, которые также участвуют в процессе слияния путем образования межбелковых-S-S-связей.

3.3.3. Реализация генетической информации
Вирус может попасть внутрь клетки разными путями, однако непременным условием начала инфекционного процесса является сочетание проникновения вируса с его раздеванием и успешным выходом геномной нуклеиновой кислоты в место дальнейших событий ядро или цитоплазму, или, как в случае ряда вирусов растений, в хлоропласты.
Как уже отмечалось, при реализации генетической информации вирусы имеют разную степень зависимости от клеточных систем репликации/транскрипции и полностью зависят от белоксинтезирующих систем клетки хозяина. Таким образом, в синтезе вирусных макромолекул задействованы как клеточные, так и сугубо вирус-специфические молекулярные механизмы, которые представляют собой отдельный аспект вирусной репродукции и будут рассмотрены в “Молекулярных аспектах репродукции вирусов”.
Существует ряд общих ограничений, которые клетка хозяина накладывает на вирус:
1. Ни в ядре, ни в цитоплазме клеток прокариот и эукариот (кроме клеток растений) нет ферментов для транскрипции/репликации вирусного РНК-генома. Это означает, что вирус или должен иметь собственные ферменты в составе вириона или нести их в закодированном виде.
2. В цитоплазме нет ферментов, способных транскрибировать вирусные ДНК. Следовательно, клеточную транскриптазу (ДНК-зависимую РНК-полимеразу) могут использовать только ядерные ДНК-содержащие вирусы. Все цитоплазматические вирусы должны создавать собственные ферменты для синтеза мРНК.
3. В клетках эукариот белоксинтезирующий аппарат клетки приспособлен для трансляции моноцистронных мРНК, так как не распознает внутренних участков инициации. Поэтому вирусы вынуждены синтезировать или отдельные мРНК для каждого гена или мРНК, включающую несколько генов и кодирующую полипротеин, который затем разрезается на индивидуальные белки.
4. В клетках прокариот возможна множественная внутренняя инициация трансляции на полицистронных матрицах.
5. Стратегия реализации генетической информации вирусов включает три известные стадии транскрипцию (процесс синтеза мРНК), трансляцию (процесс синтеза белка на мРНК) и репликацию (процесс самовоспроизведения генетического материала на основе матричного синтеза).
При успешном протекании всех трех стадий реализации генетической информации вируса в клетке на фоне подавления синтеза ее собственных макромолекул наблюдается формирование пула вирусных макромолекул белков капсида, гликопротеинов суперкапсида, геномных нуклеиновых кислот. Это является пусковым механизмом следующего этапа репликативного цикла вируса сборки (морфогенеза) вирионов.

3.3.4. Принципы морфогенеза вирионов
По месту своей репродукции (ядро или цитоплазма) вирусы разделяют на ядерные и цитоплазматические. Сборка вирионов цитоплазматических вирусов происходит в разных компартментах цитоплазмы. Так, поксвирусы созревают в районе цитоплазмы, лишенном мембранных структур, флавивирусы в аппарате Гольджи, реовирусы в каналах ЭПР, многие вирусы растений формируют вирионы в хлоропластах.
Процесс созревания ВЧ включает несколько этапов: формирование капсида, упаковку нуклеиновых кислот, приобретение оболочки. Общие принципы формирования вирусных частиц мы представим на нескольких примерах.
Пример 1. Самым простым примером вирусного морфогенеза является образование РНП. В этом случае сборка белковой оболочки происходит одновременно с включением геномной РНК в состав нуклеокапсида. Субъединицы, представленные идентичными полипептидными глобулами, собираются по принципу самосборки (самопроизвольно, но упорядоченно). Белковые субъединицы, образующие нуклеокапсид, несут как неизменяющиеся комплементарные поверхности, так и разупорядоченные участки, которые упорядочиваются при сборке, играя роль «зажима» для РНК (РНК-связывающий центр).
В случае вируса табачной мозаики (безоболочечный, палочковидный, цитоплазматический (+)РНК-содержащий вирус, входящий в блуждающий род Tobamovirus) морфогенез ВЧ проходит 4 стадии:
1. Образование структуры, состоящей из двух дисков, сформированных белковыми субъединицами.
2. Образование инициаторной петли РНК.
3. Встраивание петли РНК в отверстие диска (инициация сборки).
4. Элонгация (собственно сборка) идет в двух направлениях вдоль цепи РНК, сопровождается закручиванием спирали рибонуклеопротеина.
Такой механизм образования рибонуклеопротеида в общих чертах имеют как безоболочечные палочковидные и нитевидные вирусы, так и оболочечные вирусы со спиральным типом симметрии внутреннего компонента.

Пример 2. Сборка вирионов с икосаэдральным типом симметрии также протекает по принципу самосборки, однако, как правило, капсид собирается из преформированных структурных единиц.
Капсид полиовируса состоит из 60-ти структурных единиц, каждая из которых образована четырьмя полипептидами (VP1, VP2, VP3, VP4). В процессе морфогенеза на первой стадии происходит ассоциация VP0, VP1 и VP3, в результате чего образуется протомер. Пять протомеров агрегируют с образованием пентамера, пентамеры образуют рыхлый провирион. Есть предположение, что на этой стадии происходит инкапсидация РНК, однако механизм ее упаковки неясен. На последней стадии происходит протеолиз VP0 с образованием VP2 и VP4, что приводит к конформационным перестройкам в капсиде и, как следствие, к уплотнению структуры капсида (рис. 8).

Пример 3. Сборка капсида из преформированных субансамблей на примере ядерного аденовируса. Вирусные белки синтезируются в цитоплазме, затем транспортируются в ядро. Для таких белков предусмотрен механизм проникновения через ядерные поры за счет специальных нуклеофильных сигналов, расположенных на N- или C-конце полипептида. Так, белки аденовируса имеют на C-конце нуклеофильный сигнал из пяти аминокислотных остатков, а белки ядерного обезьяньего вируса SV40 из семи.
Капсид аденовириона состоит из 252 структурных единиц, организованных в 12 пентонов, расположенных на вершинах икосаэдра, и 240 гексонов. Названия пентон и гексон происходят от числа структурных единиц, окружающих данное образование. Пентон окружен 5 гексонами, гексон 6-ю. Каждый пентон построен из 5 белков VPIII и трех белков VPIV. Группа из 9-ти гексонов (наномер) выделяется при разрушении вириона в мягких условиях и представляет собой капсомер. Морфогенез вирусной частицы протекает в 5 стадий (рис. 9).
Предполагается, что при сборке икосаэдрических вирусов нуклеиновая кислота инкапсидируется после формирования незрелого вириона, проникая через отверстие в капсиде. Однако известен механизм, когда геномная нуклеиновая кислота икосаэдрического вируса не только аккумулируется в процессе сборки, но и одновременно реплицируется. Так, у реовирусов, геном которых представлен сегментированной двухнитевой РНК, морфогенез запускается в цитоплазме ассоциацией плюс-нитей РНК с белками кора и NS. В процессе созревания первого вирусного капсида происходит синтез минус-нитей РНК и их затягивание внутрь капсида. Наружный капсид формируется в каналах ЭПР.

Морфогенез оболочечных вирусов имеет свои особенности, так как включает стадию приобретения оболочки. У разных вирусов оболочка может приобретаться в процессе почкования через ядерную мембрану, мембрану аппарата Гольджи, мембрану ЭПР, а может формироваться непосредственно в цитоплазме зараженной клетки (поксвирусы).

Прежде чем произойдет почкование вируса через мембрану, она должна быть подготовлена (рис. 9). Это значит, в нее должны быть встроены вирусные поверхностные гликопротеины, которые синтезируются и созревают на мембранах ЭПР и Гольджи, а потом, при необходимости, перемещаются в цитоплазматическую мембрану. Затем необходимы синтез и правильная локализация матриксного белка, который располагается на внутренней поверхности цитоплазматической мембраны. Аутоконденсация гидрофобного матриксного белка сопровождается вытеснением белков хозяина и аккумуляцией вирусных гликопротеинов. После этого мембрана готова и вирусный внутренний компонент может быть отпочкован из клетки. Почкование идет по механизму экзоцитоза.

3.3.5. Типы взаимодействия вирусов с клеткой
В зависимости от исходов выделяют три типа взаимодействия вируса с клеткой.
1. В клетке образуется новое полноценное поколение вирусных частиц вирионов, а сама клетка погибает вследствие цитопатогенного действия вируса. Такой тип взаимодействия получил название продуктивного.
В основе цитопатогенности вирусов лежат прямые и опосредованные механизмы. Прямые механизмы (цитолиз, образование симпластов и синцитиев, апоптоз) зависят от самого вируса.
Цитолиз может быть связан с повышением проницаемости клеточной мембраны. Поступление Са+2 в клетку ведет к ионному дисбалансу, вхождению воды в клетку, ее разбуханию, разрыву мембраны и вытеканию цитоплазмы. При множественном почковании оболочечных вирусов возможен феномен «решета», когда клетка не успевает латать бреши и погибает. Возможна гибель клеток в результате аутолизиса, связанного с повреждением лизосом. Иногда клетка погибает без гиперпродукции вируса, что свидетельствует о существовании и других механизмов цитолиза.
Еще один механизм, приводящий к гибели вирусинфицированные клетки это формирование под действием вирусов многоядерных клеточных образований (симпластов и синцитиев), не способных выполнять обычные клеточные функции и, вследствие этого, обреченных на гибель. Вирусинфицированные клетки могут гибнуть также по механизму апоптоза программированной клеточной гибели. Программа клеточной смерти инициируется сигналами, поступающими с мембраны в ядро клетки после взаимодействия вирусоспецифических белков с рецептором. В результате достаточно сложных молекулярных событий клетка фрагментируется на так называемые апоптотические тельца, покрытые мембраной, и поглощается макрофагами.
Опосредованные механизмы цитопатогенности вирусов реализуются за счет уничтожения вирусинфицированных клеток цитотоксическими Т-лимфоцитами и натуральными киллерами. Кроме того, гибель инфицированных клеток осуществляется с помощью антителозависимой клеточной цитотоксичности с участием антител против вирусных белков и натуральных киллеров.
2. Биосинтез вируса в клетке не достигает завершения, гибнет вирус, а не клетка, которая возвращается к нормальному функционированию. Такой процесс получил название абортивного.
3. Еще одним типом взаимодействия вируса с клеткой является ее трансформация. Онкогенная трансформация блокирует механизмы гибели клетки путем апоптоза, и клетка приобретает способность к непрерывному росту и делению, что может привести к развитию опухоли.
В зависимости от продолжительности пребывания вируса в организме выделяют два главных типа взаимодействия возбудителя с организмом хозяина.
Первый тип взаимодействия характеризуется непродолжительным пребыванием вируса в организме, и проявляется в двух формах инфекционного процесса.
1. Острая или продуктивная инфекция.
2. Инапарантная (субклиническая) форма инфекции бессимптомная инфекция с непродолжительным пребыванием вируса в организме и его выделением во внешнюю среду (например, гепатит A, ротавирусная инфекция).
Второй тип взаимодействия характеризуется длительным пребыванием вируса в организме, когда вирус сосуществует с клеткой и может репродуцироваться, не нанося клетке видимого вреда. Такое состояние длительного сосуществования получило название персистентенции. Персистентная инфекция у человека может проявляться в разных формах.
1. Латентная инфекция при которой вирус «молчит». Инфекционный вирус, находящийся в организме в состоянии провируса (интегрированного в геном клетки хозяина), в нормальных условиях не проявляет себя и не выделяется из клеток организма. Однако в определенных условиях (при снижении иммунитета), он может реактивироваться, вызывая характерные клинические проявления инфекции (например, герпесвирусные инфекции).
2. Хроническая инфекция вирус присутствует в организме постоянно. Возможно полное отсутствие клинических проявлений инфекции непрерывный вариант хронической инфекции, и обострение патологического процесса рецидивирующий вариант хронической инфекции (например, вирусный гепатит C).
3. Медленная инфекция медленно прогрессирующее заболевание с исключительно длинным латентным периодом (например, ВИЧ-инфекция, переходящая в СПИД).

3.3.6. Дефектные вирусы
При взаимодействии вируса с клеткой могут образовываться не только зрелые инфекционные частицы, но и так называемые дефектные вирусы или ВЧ с дефектным геномом.
Дефектный геном это любой вирусный геном, в котором один или несколько генов утратили функцию, необходимую для автономной репликации вируса, в связи с чем для репликации необходима помощь другого вирусного генома или гена. Выделено 5 классов дефектных вирусных геномов, которые сохранили свою биологическую активность:
1. Дефектные геномы, зависящие от вируса-помощника.
2. Дефектные геномы, интегрированные в хромосому клетки хозяина.
3. Вирусы-сателлиты.
4. Псевдовирионы.
5. Условно-дефектные геномы.
Дефектные геномы, зависящие от вируса-помошника. Сюда входят так называемые дефектные интерферирующие вирусы ДИ-частицы. Они представляют собой субгеномные делеционные мутанты, потерявшие существенную часть генома родительского вируса. Делеция может достигать 90%, хотя обнаружены делеции, затрагивающие лишь 1% генома. Для восстановления утраченных функций ДИ-частицы необходимо одновременное заражение родственным вирусом-помощником. При этом, ДИ-частицы угнетают (интерферируют) репликацию вируса-помощника, используя с этой целью продукты его собственных генов.
ДИ-частицы образуются при репликации любого вируса, отличаются размером от нормального вириона и имеют разную степень интерференции. Например, ДИ-частицы полиовируса интерферируют слабо, а ДИ-частицы вируса везикулярного стоматита сильно.
Дефектные геномы, интегрированные в хромосому клетки хозяина. Факт интеграции генома ряда вирусов в геном клетки хозяина в настоящее время не вызывает сомнения. Однако интегрировать могут не только полные, но и дефектные геномы, особенно в клетках бактерий. Как правило, это «молчащие» дефектные гены. В определенных условиях они могут быть индуцированы (активация, запуск репликации) и их экспрессия может влиять на выживаемость и эволюцию клетки хозяина. При индукции таких геномов вирусов бактерий с помощью митомицина или ультрафиолета можно наблюдать образование фрагментов вируса: пустых головок, хвостовых отростков, полных головок без отростков. Индуцированные частицы фагов могут вызывать гибель чувствительных к вирусу штаммов бактерий. Также как и нормальные интегрированные геномы, интегрированные дефектные геномы могут инактивировать гены клетки-хозяина или способствовать их экспрессии, придавать новые генетические свойства, вводить, устранять или способствовать их экспрессии, устранять или перемещать регуляторные элементы, а также способствовать рекомбинационным изменениям ДНК клетки хозяина.
В последние годы установлено, что значительная часть онкогенных РНК-содержащих опухолеродных вирусов это дефектные вирусы, несущие клеточные онкогены и зависящие от вируса-помошника. Например, LTR-последовательности дефектных ретровирусов при встраивании неподалеку от онкогенов, активируют их.
Вирусы-сателлиты крайняя форма вирусного паразитизма. Это вирусы, паразитирующие на генных продуктах, образованных другими, часто неродственными вирусами. Вирусы-сателлиты широко распространены среди вирусов растений. Вирусы-сателлиты могут так же, как ДИ-частицы, интерферировать с вирусом-помощником, однако, в отличие от ДИ-частиц, возникновение вирусов-сателлитов не связано с делецией генов вируса-помощника. Очень часто РНК- или ДНК-геном вируса-помощника не имеет гомологии с геномом вируса-паразита. Вирус-сателлит в своей репликации полностью зависит от одновременного заражения вирусом-помощником. Примеры вирусов-сателлитов:
1. STNV сателлит вируса некроза табака, помощник вирус некроза табака.
2. Сателлит колифаг p4, помощник колифаг p2.
3. AAV аденоассоциированные вирусы, помощник аденовирусы.
4. Дельта вирус, помощник вирус гепатита B.
Псевдовирионы это ВЧ, содержащие вместо геномной нуклеиновой кислоты вируса, нуклеиновую кислоту клетки хозяина. У прокариот образование таких псевдовирусов имеет огромное генетическое значение и представляет собой механизм перемещения генетического материала клетки-хозяина из одной клетки в другую. У эукариот генетическое значение псевдовирионов не установлено, но их образование показано. Например, при инфицировании вирусом полиомы большая доля образующегося потомства представляет собой псевдовирионы.
Условно-дефектные геномы это мутантные геномы, дефектные только в определенных условиях: ts-мутанты (температурочувствительные); hr-мутанты (по спектру хозяев) и другие.
Глава 4. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ АСПЕКТЫ
РЕПРОДУКЦИИ ВИРУСОВ

4.1. Репликация геномов вирусов

Репликация вирусных геномов это матричный комплементарный синтез нуклеиновых кислот, преследующий целью наработку геномных последовательностей для их последующей инкапсидации в вирион.
ДНК-геномы реплицируются клеточными или вирусоспецифическими ДНК-полимеразами. РНК-геномы реплицируются вирусоспецифическими РНК-полимеразами, которые также являются и транскриптазами. Репликация вирусных геномов происходит или одновременно с транскрипцией, или эти два процесса разделены во времени.
Механизмы репликации вирусных геномов различны и определяются видом генома. Существует три модели репликации полуконсервативная, консервативная и дисперсная. Консервативная и дисперсная модели репликации нуклеиновых кислот установлены только у вирусов.
Полуконсервативная модель предполагает, что после первого раунда репликации одна цепь в каждой из двух дочерних молекул является родительской, другая синтезируемой заново. По такой схеме репликацируются днДНК-геномы.
При реализации консервативной модели репликации одна дочерняя молекула состоит из двух родительских цепей, а другая из вновь синтезированных цепей. Согласно консервативной модели реплицируются двухнитевые РНК реовирусов. ДНК-содержащие вирусы, реплицирующиеся таким образом, неизвестны.
Дисперсная модель репликации приводит к образованию молекулы нуклеиновой кислоты, состоящей из фрагментов как родительских цепей, так и вновь синтезированных. Дисперсная модель реализуется на промежуточной стадии репликации онДНК генома парвовирусов.
Единицей репликации является так называемый репликон нуклеотидная последовательность, расположенная между точкой начала репликации (origin) и точкой окончания репликации (terminus). Процесс репликации ДНК разделен на три стадии: инициация цепи, элонгация (удлинение) цепи и терминация.

4.1.1. Репликация ДНК-геномов вирусов. Общие принципы репликации

Инициация синтеза цепи ДНК может происходить только при наличии затравки для ДНК-полимеразы. Вид затравки и способ ее образования различаются у разных вирусов и определяют своеобразие вирусных репликативных систем. Различают три основных способа инициации синтеза ДНК:
Инициация на внутренних участках ДНК характерна для кольцевых матриц. Затравкой служит олигорибонуклеотид, который может быть синтезирован ДНК-зависимой РНК-полимеразой, праймазой или праймосомой. Эти ферменты могут иметь клеточное происхождение, или быть вирус-специфическими. Синтезироваться может одна затравка или несколько затравок.
На однонитевой матрице затравка синтезируется на определенном участке, узнаваемом ферментом. Двухнитевая матрица сначала подготавливается к инициации. На участке ori происходит присоединение хеликазы. Этот фермент расплетает участок матрицы, что приводит к образованию репликативной вилки с последующим синтезом затравки.
Инициация на концах ДНК (терминальная инициация) характерна для линейных матриц. Различают две группы способов концевой инициации ДНК-синтеза: с использованием нуклеотидбелковой затравки и с использованием самозатравочного механизма.
Инициация синтеза с использовании разрывов и брешей затравкой для дальнейшего удлинения цепи может быть 3'-ОН конец разорванной цепи ДНК.
Элонгация цепи при репликации вирусных геномов принципиально не отличается от процесса синтеза клеточных ДНК. Используются ферменты, вспомогательные белки и репликационные белки, принадлежащие как клетке хозяина, так и вирусу. Синтез ДНК, как правило, осуществляет ДНК-зависимая ДНК-полимераза II, в редких случаях ДНК-полимераза III. Основным свойством синтеза является его полярность, при которой очередной нуклеотид присоединяется к 3'-концу растущей цепи. То есть направление синтеза идет от 5'- к 3'-концу, считывание - от 3'- к 5'-концу. Особенности синтеза комплементарных нитей связаны со способом инициации. На днДНК матрице синтез идет через образование репликативной вилки или с вытеснением цепи, на онДНК-матрице по-репарационному механизму.
Стандартный механизм полуконсервативной репликации ДНК с образованием репликативной вилки включает следующие стадии:
1. Инициация репликации расплетением днДНК хеликазой. Репликация начинается не в случайной точке, а в специфическом месте, называемом точкой начала репликации (ori), которых может быть одна или несколько.
2. Синтез РНК-затравки ДНК-зависимой РНК-полимеразой, праймазой или праймосомой.
3. Синтез комплементарных цепей ДНК-полимеразой (II, III). Цепи ДНК синтезируются в результате присоединения дезоксинуклеотидов к 3'-концу растущей цепи, то есть в направлении от 5'- к 3'-концу вдоль матричной цепи. Синтеза цепей в обратном направлении не происходит. Поэтому синтезируемые цепи в репликативной вилке растут в противоположных направлениях. Синтез одной цепи происходит непрерывно это ведущая, или лидирующая цепь. Синтез другой цепи идет импульсами это отстающая цепь. Лидирующая цепь синтезируется в направлении роста репликативной вилки, отстающая в обратном направлении в результате нескольких актов инициации. В итоге образуется несколько коротких цепей (фрагментов Оказаки), которые затем соединяются с образованием непрерывной отстающей цепи. Механизм репликации лидирующей и отстающей цепей в принципе одинаков и требует синтеза коротких РНК-затравок, комплементарных матричной цепи. Скорость копирования в репликативной вилке постоянна и равна 1,5 т.п.н./сек.
4. Дезинтеграция РНК-затравки РНКазой Н.
5. Сшивание фрагментов Оказаки ДНК-лигазой.
6. Снятие сверхспирализации топоизомеразами (топоизомераза I вносит разрывы в одну цепь, топоизомераза II вносит разрывы в обе цепи).
Терминация синтеза
1. Терминация синтеза и расхождение кольцевых геномов упрощены, поскольку синтез цепи идет по кругу и в конце полного оборота в точке ori или при двунаправленной репликации в середине кольца 3'- и 5'-концы вновь синтезированной цепи совмещаются и лигируются. Попарно сцепленные кольца разъединяются топоизомеразой.
2. В линейных ДНК, синтезированных с помощью РНК-затравок, все обстоит сложнее. Удаление РНК-праймера дает молекулу ДНК с выступающим 3'-концом и пробелом на 5'-конце. Предложено 2 способа завершения репликации с образованием полной копии матричной цепи (рис. 10).


Рис. 10. Схемы терминации синтеза линейных ДНК через образование конкатемеров (А) и через образование шпильки (Б)


В 1972 г. Уотсон предложил модель завершения репликации ДНК с прямыми повторами на концах через образование конкатемеров, которые представляют собой несколько тандемно-повторяющихся единиц генома. После образования конкатемера специфическая эндонуклеаза вносит ступенчатый разрыв в месте воссоединения. Это приводит к образованию выступающих 5'-концов и пробелов на 3'-конце, которые наращиваются ДНК-полимеразой. Бреши закрываются или путем репарации или лигирования.
Синтез полноразмерных линейных ДНК с инвертированными повторами на концах может быть завершен через образование шпильки. Инвертированные повторы это две копии одной и той же последовательности ДНК в составе одной молекулы, находящиеся в противоположной ориентации. Прилежащие друг к другу инвертированные повторы образуют палиндромы. На рисунке 10 показано, что терминация 3'-конца через образование шпильки включает лигирование 3'-конца шпильки с 5'-концом комплементарной цепи, внесение одноцепочечного разрыва с образованием выступающего 3'-конца и его удлинение.
Основные схемы репликации ДНК-геномов
1. Репликация с использованием терминальной инициации при помощи самозатравочного механизма
Такой тип репликации геномной ДНК имеют парвовирусы самые мелкие (15-18 нм) икосаэдрические, безоболочечные, ядерные вирусы животных и насекомых. Геном представлен линейной онДНК, оба конца которой имеют самокомплементарные последовательности, формирующие шпилечные структуры. 3'-конец ДНК имеет уникальную последовательность размером 125 нуклеотидов, образующую двухнитевую Т-образную шпилечную структуру. Она выполняет роль затравки для ДНК-полимеразы. ДНК-полимераза в результате репарационного синтеза комплементарной цепи воссоздает дуплекс, обе цепи которого на одном конце ковалентно соединены. При этом 3'-концевой сегмент родительского генома в качестве матрицы не используется. Следовательно, полного воспроизведения вирусного генома пока не произошло. На следующем этапе вирусоспецифический фермент вносит разрыв в родительскую цепь на границе между реплицированным и нереплицированным участками последовательности (между 125 и 126 нуклеотидами). Концевые 125 нуклеотидов родительского генома становятся условной частью вновь синтезированной цепи и возникший таким образом 3'-конец родительской цепи используется для ее регенерации. В результате этих реакций возникает дисперсная двухнитевая репликативная форма вирусной ДНК (рис. 11). Далее следует цепь реакций, включающих образование на одном из концов ДНК-затравки в виде «заячьих ушек», синтез новой цепи с вытеснением родительской, образование еще одной репликативной формы. Вторая репликативная форма ДНК используется в качестве матрицы для дальнейшего синтеза вирусной ДНК, а вытесненная из дуплекса однонитевая молекула или вступает в репликационный цикл, или входит в состав дочерней вирусной частицы.

Рис. 11. Схема первых этапов репликации генома парвовирусов.
матричная нить; вновь синтезированная нить


2. Репликация с использованием терминальной инициации при помощи нуклеотид-белковой затравки
Такой тип репликации геномной ДНК имеют аденовирусы относительно крупные (до 90 нм) безоболочечные с икосаэдрическим типом симметрии капсида ядерные вирусы. Геном представлен линейной днДНК, имеющей на 5'-концах инвертированные повторы и ковалентно присоединенные геномные белки, имеющие молекулярную массу 55 кД (рис. 12).
В инфицированной аденовирусом клетке синтезируется вирусоспецифический белок массой 80 кД, который связывается через серии с дезоксицитидином. Образовавшаяся структура (80)БSerdCTP является затравкой, которая через цитозин связывается с 3'-концевым гуанозином генома и инициирует синтез цепи ДНК. Инициация может наблюдаться на любом конце родительской ДНК и может происходить или одновременно или последовательно. При последовательной инициации синтез дочерней цепи сопровождается вытеснением одной из родительских, а синтез комплементарной цепи идет на однонитевой матрице по репарационному механизму.


Рис. 12. Репликация ДНК аденовируса

Таким образом, каждая последующая двухнитевая молекула наследует одну родительскую цепь, то есть полуконсервативна. Однако процесс протекает без синтеза отстающей цепи, т.е. без образования множественных сайтов инициации и синтеза фрагментов Оказаки.
3. Репликация кольцевых геномов по механизму катящегося кольца
Для реализации данного механизма репликации молекула нуклеиновой кислоты должна или исходно иметь, или воссоздать двухнитевую кольцевую структуру. Вновь созданная двухнитевая структура носит название репликативной формы (РФ). Воссоздание дн-структуры может протекать по-разному:
кольцевые онДНК (фаги 174, М13) образуют репликативный дуплекс по стандартной схеме: синтез затравки удлинение цепи удаление затравки достройка цепи лигирование. Все ферменты, обеспечивающие перевод родительского генома в репликативную форму, имеют клеточное происхождение;
линейная днДНК фага λ приобретает кольцевую форму за счет липких концов;
ДНК герпесвирусов содержит прямые концевые повторы, у которых вирусспецифическая экзонуклеаза отщепляет однонитевые участки, после чего молекула приобретает кольцевую форму.
Репликация по механизму катящегося кольца в общих чертах имеет следующие стадии (рис. 13):
I. Вирус-специфический фермент вносит однонитевой разрыв в уникальном сайте родительской цепи репликативной формы.
II. Фермент остается связанным с 5'-концом, освободившийся 3'-концевой нуклеотид служит затравкой для ДНК-полимеразы.
III. ДНК-полимераза присоединяет нуклеотиды комплементарно замкнутой цепи, то есть синтезируется только лидирующая цепь. 5'-конец родительской цепи вытесняется. Наблюдается образование сигма-молекул (σ).
IV. После того, как репликационная вилка завершит чуть больше полного оборота, вытесненная цепь замыкается в кольцо, а фермент перемещается на вновь синтезированную нить и цикл повторяется.
Таким образом, вновь синтезированная нить, имеющая последовательность геномной, становится компонентом РФ, а предшествующая (родительская) оказывается в свободном виде.
Представленная классическая схема катящегося кольца часто является лишь промежуточной стадией репликации вирусных геномов. Например, при репликации генома фага λ реализуются несколько схем схема Кернса, образование конкатемеров (см. ниже) и модифицированная схема катящегося кольца, которая наблюдается на поздней стадии репликации. В связи с этим, способ поздней репликации генома фага X называют способом вторичного разматывающегося рулона.


Рис. 13. Схема репликации ДНК по механизму катящегося кольца

4. Репликация ДНК по схеме Кернса
Такой тип репликации хорошо изучен на примере обезьяньего вируса SV40, который входит в семейство полиомавирусов. Полиомавирусы это относительно мелкие (45-55 нм) икосаэдрические безоболочечные ядерные вирусы, поражающие животных и человека. Геном двухнитевая кольцевая сверхспирализованная ДНК, ассоциированная с клеточными гистонами.
Репликация протекает по следующей схеме (рис. 14):
1. Вирусоспецифический неструктурный белок (большой Т-антиген, обладающий хеликазной активностью) связывается с последовательностью размером 60 пар нуклеотидов (точка ori) и расплетает двухнитевую структуру.
2. Праймаза синтезирует две РНК-затравки. Образуются две репликативные вилки (2 лидирующие и 2 отстающие цепи), которые в процессе комплементарного синтеза удаляются друг от друга, двигаясь в разных направлениях. Наблюдается образование тета-молекул (θ).


Рис. 14. Репликация ДНК по схеме Кернса


3. Сбрасывание внутримолекулярного напряжения обеспечивает топоизомераза I путем внесения точечных однонитевых разрывов, которые тут же лигируются.
4. Образуются два дн-кольца, где родительские цепи соединены друг с другом. Разъединение осуществляет топоизомераза II, которая вносит двухнитевые разрывы.
5. Репликация ДНК с использование промежуточных конкатемерных форм
Простейшая схема такой репликации наблюдается у бактериофагов T-нечетной серии, например T7. ДНК фага T7 линейная двухнитевая молекула с прямыми концевыми повторами. Инициация репликации начинается на внутреннем участке, где расположен промотор для фаговой ДНК-зависимой РНК-полимеразы, которая синтезирует транскрипт, использующийся в качестве затравки для синтеза ДНК. Внутренняя инициация проходит без разрыва родительской цепи. Возникшие две репликативные вилки движутся в разных направлениях, осуществляя полуконсервативную репликацию вирусного генома. Первая стадия этого процесса заканчивается образованием двух дочерних дуплексов, где вновь синтезированные нити не достроены, так как не произошло копирования 3'-концов родительских цепей, что неизбежно возникает при внутренней инициации на линейной матрице. Таким образом, один из 3'-концов образовавшихся дуплексов находится в однонитевой форме.
Поскольку молекула ДНК фага Т7 имеет прямой концевой повтор, однонитевые 3'-концы сестринских молекул взаимно комплементарны и способны к ассоциации. Ассоциация комплементарных последовательностей приводит к образованию димерных молекул конкатемеров. Далее созревание молекул идет аналогично рассмотренному нами выше способу терминации. Фагоспецифический фермент вносит в димер ступенчатый разрыв таким образом, что выступающими становятся 5'-концы, которые репарируются ДНК-полимеразой (рис. 15).


Рис. 15. Схема репликации ДНК фага T7


6. Репликация вирусных ДНК через интеграцию
Интеграция внедрение вирусной (или другой) последовательности ДНК в геном клетки хозяина, приводящее к ковалентному соединению с хозяйской последовательностью. В таком случае репликация вирусного генома и его транскрипция осуществляются по общим клеточным механизмам.
Интеграция вирусного генома в геном хозяина может происходить несколькими путями:
a) Интеграция с использованием сайт-специфической рекомбинации. В общем смысле рекомбинация это взаимодействие между специфическими участками ДНК. Сайт-специфическая рекомбинация взаимодействие между специфическими парами последовательностей, в пределах которых имеются гомологичные последовательности. Это консервативная рекомбинация.
Например, при интеграции ДНК фага λ в рекомбинации участвуют два совершенно определенных участка вирусного и хозяйского геномов attP и attB, соответственно. Эти участки имеют одинаковые сердцевины, но разные «плечи». Соответственно, фаговая последовательность обозначается как POP', клеточная ВОВ'. В результате интеграции образуется участок ВОР'-----РОВ'.
Для осуществления интеграции необходима интеграза (топоизомераза I) и клеточный белок IHF (клеточный фактор интеграции). Интегрированный вирусный геном существует в виде профага и может выщепляться с участием вирусоспецифического белка.
b) Интеграция и репликация в процессе репликативной транспозиции. Транспозон последовательность ДНК, способная реплицироваться и внедрять одну из копий в новое место генома.
Явление репликативной транспозиции установлено для транспозирующего фага Mu. Геном фага линейная днДНК, размером 30 т.п.н., имеет на концах клеточные, а не вирусные нуклеотидные последовательности, то есть всегда находится в состоянии профага. После попадания вируса в клетку, ДНК приобретает форму, близкую кольцевой, сближая концы. Вирус-специфический белок вносит однонитевые разрывы как в клеточные последовательности фаговой ДНК, так и в ДНК клетки-хозяина. Разрывы могут происходить практически в любом месте ДНК. Выступающие 5'-концы клеточной ДНК ковалентно соединяются с 3'-концами вирусной ДНК. Лишние концы удаляются, бреши репарируются и фаговый геном оказывается встроенным в геном клетки хозяина. Особенностью репликации фага Mu является то, что она идет без выщепления профага. Копии ДНК, образуемые в процессе репликации, эффективно внедряются в новые места ДНК хозяина.

4.1.2. Репликация РНК-геномов вирусов
Репликацию вирусных РНК-геномов в инфицированной клетке осуществляет вирус-специфическая РНК-зависимая РНК-полимераза. В случае вирусов растений и ряда бактериофагов она может быть организована как из вирусных, так и клеточных субъединиц. РНК-зависимая РНК-полимераза это и транскриптаза и репликаза. Репликация и транскрипция вирусных РНК геномов процессы взаимосвязанные. Переключение транскрипции на репликацию, как правило, определяется накоплением белковых продуктов трансляции мРНК, достаточных для морфогенеза вирусных частиц.
Репликация РНК происходит по принципу РНК-зависимого синтеза РНК и идет через образование промежуточных репликативных форм.
Репликациция (+)РНК полиовирусов
Полиовирусы мелкие (27 нм) безоболочечные икосаэдрические вирусы, поражающие позвоночных. Геном линейная однонитевая РНК позитивной полярности. На 5'-конце РНК ковалентно связана с терминальным геномным белком через остаток тирозина, 3'-конец полиаденилирован (рис. 16).
Репликацию/транскрипцию генома осуществляет РНК-полимераза, детерминированная 3'-концом генома, который транслируется сразу после попадания вируса в клетку. На первой стадии репликации происходит образование двухнитевой РФ за счет синтеза минус-нити, инициированного присоединением молекулы урацила к 3'-поли-А концу.


Рис. 16. Схема репликации РНК полиовирусов


Кроме РНК-полимеразы в клетке синтезируется вирус-специфический терминальный низкомолекулярный белок (VPg), который через тирозин связывается с молекулой урацила. Данная структура используется РНК-полимеразой в качестве затравки то есть происходит терминальная инициация с использованием нуклеотид-белковой затравки. Синтез идет с вытеснением цепи. Образующиеся молекулы (+)РНК до накопления достаточного количества вирусоспецифических белков используются как мРНК, после чего они начинают инкапсидироваться в вирусную частицу.
Следует отметить, что представленная схема репликации геномной (+)РНК полиовирусов не является универсальной. Вирусные (+)РНК-геномы различаются организацией 5'- и 3'-концевых структур, что определяет особенности их репликации, связанные с инициацией синтеза.
Репликациция (-)РНК-геномов
Вирусные (-)РНК-геномы могут быть непрерывными или сегментированными. Во всех случаях РНК находится в составе рибонуклеопротеина, что и определяет особенности ее репликации, поскольку депротеинизированная РНК не может служить матрицей для полимеразы. Все вирусы с (-)РНК-геномом имеют собственную РНК-зависимую РНК-полимеразу, входящую в состав РНП. Для получения полноразмерного генома должна быть синтезирована репликативная полноразмерная плюс-нить. Однако на первом этапе репродуктивного цикла геномная (-)РНК служит матрицей для транскрипции, которая протекает с последующим процессингом мРНК, и не может служить матрицей для синтеза полноразмерной копии. Синтез репликативной полноразмерной (+)РНК начинается только после накопления соответствующих вирусных белков, подавляющих преждевременную терминацию РНК на внутренних участках матрицы. Каким образом это происходит, остается пока неизвестным. Синтез антигеномной и геномной РНК происходит в составе РНП.
Репликациция днРНК реовирусов
Реовирусы двукапсидные (60-75 нм) частицы с икосаэдрическим типом симметрии, инфицируют позвоночных, беспозвоночных, растения. Геном состоит из 10-12 фрагментов днРНК.
Репликация днРНК неразрывно связана с транскрипцией, которая является ее первой стадией.
1. Синтез (+)РНК на двухнитевой матрице протекает по консервативному типу без вытеснения цепи и происходит в составе однокапсидной вирусной частицы при участии белков кора вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразы (VP2) и гуанидилтрансферазы (VP3). мРНК покидают частицу через поры внутреннего капсида.
2. Плюс-нити РНК объединяются с вновь синтезированными белками кора и неструктурными (NS) белками. При созревании вириона РНК-полимераза осуществляет синтез минус-нитей на матрице (+)РНК по репарационному механизму, затягивая ее внутрь формирующегося капсида. Сформированная однокапсидная частица может снова начать синтез плюс-нитей РНК.
Как и в случае полиовирусов, представленный способ репликации генома реовирусов не является универсальным для вирусов с днРНК геномом. Например, у фага φб синтез плюс-нитей на родительском дуплексе происходит по полуконсервативной модели и всегда сопряжен с вытеснением предшествующей нити (+)РНК.


4.2. Транскрипция геномов вирусов

4.2.1. Общие принципы транскрипции
Транскрипция первая стадия реализации генетической информации, на которой последовательность геномной нуклеиновой кислоты копируется в виде нуклеотидной последовательности мРНК. В основе механизма копирования лежит тот же структурный принцип комплементарного спаривания оснований, что и при матричном синтезе.
Транскрипция осуществляется ферментами РНК-полимеразами. В транскрипции ДНК-геномов вирусов принимает участие ДНК-зависимая РНК-полимераза II, в редких случаях РНК-полимераза III. В транскрипции РНК-геномов участвует уникальный вирусный фермент РНК-зависимая РНК-полимераза.
Большинство ядерных ДНК-содержащих вирусов используют для транскрипции клеточную РНК-полимеразу II. Поксвирусы (цитоплазматические ДНК-содержащие вирусы) содержат свою ДНК-зависимую РНК-полимеразу, имеющую, тем не менее, сходство с РНК-полимеразой II. Часто вирусы бактерий для ранней транскрипции своих генов используют клеточную РНК-полимеразу II, а для поздней собственную вновь синтезированную транскриптазу. В то же время, этот фермент может входить и в состав вириона.
В 1970 г. Балтимор с соавторами продемонстрировали наличие в составе вириона вируса везикулярного стоматита РНК-зависимой РНК-полимеразы. Позже этот фермент был найден у арена-, бунья-, орто- и парамиксо-, реовирусов, то есть у вирусов с (-)РНК и днРНК-геномом. У (+)РНК-содержащих вирусов РНК-полимераза детерминирована геномом. РНК-зависимые РНК-полимеразы обладают как транскриптазной, так и репликазной активностью.
Синтез молекул РНК начинается в определенном месте матрицы, называемом промотором и заканчивается в определенном месте, называемом терминатором. Участок ДНК, ограниченный промотором и терминатором, представляет собой единицу транскрипции транскриптон. В пределах транскриптона копируется только одна цепь, которую называют значащей или матричной. У эукариот в состав транскриптона входит один ген. Транскриптон прокариот содержит несколько генов, его чаще называют оперон. Транскрипционный цикл включает несколько стадий: связывание транскриптазы с матричной цепью, инициацию цепи РНК, элонгацию, терминацию и посттранскрипционный процессинг. Процессинг может включать кэпирование 5'-конца, метилирование гуанидина, полиаденилирование 3'-конца, сплайсинг. При рассмотрении принципов транскрипции следует различать первичную транскрипцию (синтез на геномной матрице) и вторичную транскрипцию (синтез на вновь синтезированной матрице).
Многообразие видов вирусных геномов определяет существование различных подходов к синтезу вирусных мРНК в клетке хозяина. Однако все эти подходы могут быть суммированы в единой схеме стратегии синтеза мРНК (схема 6).


Схема 6. Стратегия транскрипции геномов вирусов

Принципы транскрипции ДНК-геномов
По механизму транскрипции ДНК-геномы вирусов можно разделить на 4 группы:
1. днДНК, транскрипцию которой осуществляют клеточные ферменты (ядерные полиома-, адено-, герпесвирусы, ряд бактериофагов, например λ, Т4).
Как правило, транскрипцию осуществляет РНК-полимераза II, реже РНК-полимераза III (ряд транскриптов аденовируса). Возможны ситуации, когда транскрипцию ранних генов осуществляет клеточная РНК-полимераза, а поздних вирусоспецифическая или модифицированная клеточная РНК-полимераза, содержащая вирусоспецифическую субъединицу (фаги Т7 и Т4, соответственно).

2. днДНК, раннюю транскрипцию которой осуществляют вирусные полимеразы, входящие в состав вириона. Поздние гены транскрибируются вновь синтезированными вирусными полимеразами, детерминированными геномом вируса (поксвирусы, фаг N4).

3. онДНК, которая прежде чем транскрибироваться должна перейти в двухнитевую форму (парвовирусы, включая дефектные вирусы, требующие для размножения наличия вируса-помощника).

4. Кольцевая частично двухнитевая днДНК (вирус гепатита B, вирус мозаики цветной капусты). Прежде чем транскрибироваться, ДНК проходит стадию репарации.

Принципы транскрипции РНК-геномов
1. (+)РНК-геномы
Геномная (+)РНК это мРНК, то есть геномная нуклеотидная последовательность соответствует последовательности мРНК. Для осуществления процесса транскрипции вирусам с таким геномом необходимо синтезировать минус-нить с использованием РНК-зависимой РНК-полимеразы, которая чаще детерминирована вирусным геномом и транслируется непосредственно с геномной РНК. Вирусные (+)РНК-геномы не всегда кодируют полную РНК-полимеразу, возможно детерминирование только одной из субъединиц, которая затем ассоциирует с клеточными белками (фаг Qβ, некоторые вирусы растений).
Транскрипция (+)РНК-геномов может протекать двумя путями:
а) с образованием субгеномных мРНК (необходимы для синтеза ранних белков);
б) без образования субгеномных мРНК. В этом случае транскрипция будет являться также и репликацией.
Субгеномные (+)РНК, так же, как и геномные, считываются с полноразмерной минус-нити. Это может происходить двумя способами.
В одном случае образуются субгеномные РНК (один или несколько видов), которые имеют 3'-концы, идентичные 3'-концу полноразмерной плюс-нити, но имеют разные 5'-последовательности. Это связано с тем, что минус-нити РНК имеют участки, подобные промоторам. РНК-полимераза узнает эти участки, связывается с ними и может начинать синтез РНК с них, а не только с 3'-конца. Таким способом образуются субгеномные РНК у альфавирусов и ряда вирусов растений, в том числе у ВТМ.
Другой вариант образования субгеномных РНК реализуется у коронавирусов. В зараженной клетке обнаруживаются 6 классов субгеномных РНК. Нуклеотидные последовательности этих РНК идентичны (+)РНК не только по 3'-, но и по 5'-концам. Объясняется это тем, что синтез всех плюс-нитей начинается на 3'-конце антигенома с синтеза так называемой лидерной последовательности (-70 нуклеотидов). Этот «лидер» обладает слабой связью с матрицей и может отсоединяться от нее, а затем присоединяться к другому участку в последовательности антигенома. Минус-матрица содержит 6 участков, комплементарных лидерной последовательности, что и определяет существование 6 классов субгеномных РНК.

2. (-)РНК-геномы
Геномная (-)РНК, нуклеотидная последовательность которой комплементарна мРНК, является матрицей для транскрипции и для репликации. Оба эти процесса протекают на матрице, находящейся в составе РНП, при участии вирионной РНК-полимеразы. Синтезируемые мРНК моноцистронны, так как все вирусы с (-)РНК геномом поражают только эукариот. (-)РНК геномы могут быть непрерывны, а могут быть сегментированы.
Механизм образования моноцистронных мРНК на матрице непрерывного (-)РНК-генома до конца не установлен. Наиболее вероятной является модель, установленная для вируса везикулярного стоматита, согласно которой на границах между участками (-)РНК, кодирующими индивидуальные белки, располагаются специальные сигналы, терминирующие и реинициирующие цепи (+)РНК. Каждый такой участок, если идти от 3'- к 5'-концу, заканчивается 7-ю остатками уридиловой кислоты. На этом участке РНК-полимераза как бы пробуксовывает, синтезируя поли-А последовательность, состоящую из нескольких десятков адениловой кислоты. 5'-концы молекул мРНК кэпируются, по всей вероятности, при участии вирусоспецифических ферментов.
Несколько иначе протекает транскрипция сегментированных (-)РНК геномов. Рассмотрим транскрипцию генома вируса гриппа, который представлен 8-ю сегментами (-)РНК. Транскрипция протекает в ядре в составе РНП. В качестве затравки для РНК-полимеразы используются фрагменты транскриптов клеточных мРНК. Вирусоспецифический белок (P-белок) узнает кэпированные 5'-концы этих транскриптов и фиксирует их на 3-конце геномных РНК. Затем этот же или другой белок вносит одноцепочечный разрыв на расстоянии 10-13 нуклеотидов от его 5'-конца. Возникающий при этом короткий кэпированный клеточный олигонуклеотид и является затравкой для синтеза вирусоспецифических мРНК. Поли-А последовательность на 3'-конце образуется за счет пробуксовывания полимеразы так же, как и у вируса везикулярного стоматита. Однако на этом особенности транскрипции генов вируса гриппа не заканчиваются. Два геномных сегмента вируса гриппа являются матрицей для синтеза четырех молекул мРНК, так как имеют альтернативные открытые рамки считывания, подобно ДНК-геномам. Два дополнительных вида мРНК образуются путем сплайсинга, осуществляемого клеточными ферментами по обычному механизму.

3. Диплоидный (+)РНК-геном ретровирусов
Прежде чем произойдет транскрипция ретровирусного генома, он претерпевает целый ряд молекулярных превращений, включающих обратную транскрипцию, интеграцию ДНК в геном хозяина и только после этого синтез мРНК с использованием клеточного транскрипционного комплекса. Геном ретровирусов монолитен, кодирует полипротеин, то есть транскрибируется без образования субгеномных РНК. Первичные транскрипты подвергаются сплайсингу.

4. днРНК-геном реовирусов
Транскрипцию осуществляет вирионная транскриптаза РНК-зависимая РНК-полимераза, находящаяся в составе однокапсидной вирусной частицы.
У сложно устроенных РНК-содержащих вирусов транскрипция происходит не на голой матрице, а в составе транскрипционных комплексов. Капсидные белки обеспечивают правильную конформацию РНК, защиту от клеточных нуклеаз, связь фрагментов генома друг с другом, а также регуляцию транскрипции.

5. Амбисенс (обоюдозначащая, амбиполярная) РНК
Амбиполярная РНК имеет 5'-конец позитивной полярности, а 3'-конец негативной полярности. При попадании в клетку с геномной РНК считываются два класса комплементарных РНК: с 3'-конца считывается субгеномная мРНК и полноразмерный антигеном. Антигеном, в свою очередь, опять служит матрицей для двух классов РНК. С антигенома считывается вторая субгеномная мРНК и полноразмерная обоюдозначащая геномная, которая идет на построение вирусных частиц.

4.2.2. Регуляция транскрипции
В вирусных и клеточных системах молекулярные механизмы транскрипции принципиально сходны. Отличие заключается в существовании различных способов регуляции транскрипции вирусных геномов. Необходимость такой регуляции определяется разной потребностью в вирусоспецифических белках. Структурные белки, как правило, требуются в больших количествах, чем белки-ферменты. Кроме того, на ранних стадиях инфекции нужны белки, обеспечивающие репликацию вирусного генома, а на поздних структурные белки. Поэтому целесообразно, чтобы разные вирусные гены считывались с разной эффективностью, и эта эффективность менялась во времени.
Процесс транскрипции регулируется на уровне транскриптона (оперона) за счет работы репрессоров и активаторов белковой природы и энхансеров (усилителей), которые представляют собой определенные короткие последовательности геномной нуклеиновой кислоты. Транскрипция регулируется количественно и качественно и осуществляется как клеточными, так и вирус-специфическими механизмами.
У вирусов установлено существование целого ряда способов регуляции транскрипции.

Временной тип регуляции. У ДНК-содержащих вирусов существует три периода транскрипции: сверхранний, ранний и поздний. При сверхранней и ранней транскрипции считываются сверхранние и ранние гены, при поздней поздние гены. Количество транскриптов поздних генов превышает количество ранних. Многие сверхранние мРНК являются генами NS белков-ферментов и регуляторов транскрипции и репликации. Поздние мРНК являются генами структурных белков. Фактором регуляции транскрипции у ядерных вирусов является транспорт мРНК в цитоплазму.

Каскадный тип регуляции транскрипции генов. Суть такой регуляции заключается в том, что продукты сверхранней транскрипции, например α-белки, необходимы для транскрипции другой группы генов, кодирующих β-белки, которые, в свою очередь, включают транскрипцию следующей группы генов γ-белков.

Полярный тип регуляции определяется порядком расположения генов в геноме. Количество синтезируемых молекул полипептида зависит от расстояния между геном и промотором. Вдоль генома (-)РНК вирусов существует как бы градиент эффективности транскрипции. Чаще транскрибируются гены 3'-региона, реже гены 5'-конца.

Взаимное расположение и сила регуляторных сигналов. Считывание или несчитывание транскрибируемого участка матрицы зависит от свойств и расположения регуляторных сигналов промоторов (обеспечивают начало транскрипции) и терминаторов (обеспечивают прекращение транскрипции). Основа регуляции взаимное расположение регуляторных сигналов и их сила. Активность сигналов может меняться во времени.
Характер образования транскриптов и способ регуляции зависят от того, имеем ли мы дело с вирусами прокариот или эукариот. Напомним, что в клетках прокариот возможна множественная инициация трансляции на полицистронной матрице, тогда как в клетках эукариот на РНК реализуется только одна точка инициации трансляции и эта мРНК функционально моноцистронна. Ограничения, накладываемые клеткой хозяина, в первую очередь сказываются на механизмах транскрипции и посттранскрипционного созревания мРНК. Приведем конкретные примеры способов регуляции транскрипции вирусных геномов в клетках прокариот и эукариот.
Самый простой способ регуляции транскрипции в клетках прокариот установлен у фагов 1М13 и fd, где разная степень экспрессии фаговых генов регулируется за счет расположения и силы промоторов. За счет наличия «сильных» промоторов активно транскрибируются гены, кодирующие основной структурный белок капсида и ДНК-связывающий белок. В то же время, геномная последовательность, кодирующая минорные вирусные белки, имеет промоторы, отнесенные к разряду «слабых».
Более сложная регуляция транскрипции генов наблюдается у фага λ, имеющего, как минимум, три типа регуляции транскрипции: 1) ретро-регуляция осуществляется при участии нуклеотидных последовательностей, расположенных за транскрибируемым геном. Этот участок комплементарен предшествующему участку гена и в образовавшемся транскрипте возникает внутримолекулярная двухнитевая структура, которая впоследствии разрушается РНКазой III; 2) аутогенная регуляция регуляция активности гена при помощи продукта этого же гена; 3) индукция профага наблюдается в результате инактивации репрессора.
Для бактериофагов показана реализация временного типа регуляции транскрипции, что связано с существованием ранних, средних и поздних генов и соответствующих им промоторов. Так, у фага Т4 структура ранних промоторов близка к таковой промоторов клетки хозяина и именно они сразу узнаются клеточной РНК-полимеразой. Последующая активация средних генов связана с фагоспецифическим белком продуктом трансляции раннего гена. Система регуляции транскрипции генов фага Т4 включает еще один уникальный механизм ковалентную и нековалентную модификацию РНК-полимеразы, способствующую узнаванию ею поздних промоторов. Модифицированная РНК-полимераза перестает узнавать промоторы ранних генов.
Еще один способ временной регуляции наблюдается у фага Т7. Суть этого способа заключается в том, что одним из продуктов ранних генов, транскрибированных клеточной РНК-полимеразой, является фаговая РНК-полимераза, которая узнает уже другой набор промоторов и транскрибирует поздние гены.
Регуляция транскрипции вирусных геномов в эукариотических клетках осуществляется с помощью более сложных механизмов. Кроме промоторов и терминаторов транскрипционная система дополняется новыми регуляторными элементами энхансерами (усилители), а также и разнообразными способами процессинга первичных транскриптов. В данном разделе мы не станем останавливаться на конкретных способах регуляции транскрипции генов вирусов эукариот, которые, в общих чертах, сходны с перечисленными выше.
Как дополнение, рассмотрим процессинг первичных транскриптов на примере ядерного вируса эукариот аденовируса. Процессинг это посттранскрипционные изменения первичных транскриптов или созревание мРНК, включающее кэпирование 5'-конца, полиаденилирование 3'-конца и сплайсинг. У аденовируса лишь кэпирование идет эффективно на разных стадиях репродукции и происходит до завершения синтеза транскрипта. Большой вклад в регуляцию экспрессии аденовирусного генома вносит альтернативное полиаденилирование. Особенно наглядно это видно при образовании поздних мРНК. В первичном транскрипте поздней области генов есть 5 участков, несущих сигнал полиаденилирования (гексануклеотид AAUAAA). Полиаденилирование может произойти в любом участке и из первичного транскрипта может образоваться только одна из 5-ти возможных классов мРНК. От выбора того или иного участка полиаденилирования зависит относительная концентрация той или иной мРНК. Подавляющее большинство кэпированных и полиаденилированных транскриптов аденовирусного генома подвергается альтернативному сплайсингу удалению различных участков первичного транскрипта, что осуществляется при помощи клеточных механизмов. Наличие альтернативного сплайсинга и альтернативного полиаденилирования при процессинге первичных транскриптов вирусов эукариот определяется моноцистронностью эукариотических мРНК.

4.3. Репликация/транскрипция геномов ретроидных вирусов

Ретроидные вирусы это вирусы, репликация/транскрипция генома которых включает стадию обратной транскрипции.
Обратная транскрипция это комплементарный синтез ДНК на матрице РНК. Осуществляется этот процесс ферментом РНК-зависимой ДНК-полимеразой или ревертазой (обратной транскриптазой), которая впервые была обнаружена у ретровирусов. Фермент полифункционален и обладает тремя ферментативными активностями: полимеразной способен использовать в качестве матрицы как РНК, так и ДНК; активностью РНКазы Н разрушает находящуюся в дуплексе с ДНК цепь РНК до олигомеров размером 6-12 нуклеотидов; ДНК-эндонуклеазной активностью вносит одноцепочечные разрывы преимущественно в кольцевую форму ДНК.
Фермент состоит из двух субъединиц, присутствующих в эквимолярных количествах малой α (p65) и большой β (p95). Альфа-субъединица обладает полимеразной активностью и активностью РНКазы Н. Эндонуклеазная активность обусловлена С-концевой областью бета-субъединицы. Ревертаза способна работать только при наличии затравки. Вопрос затравки в группе ретроидных вирусов, включающей вирусы с РНК- и ДНК-геномом, решается по-разному.

4.3.1. Репликация/транскрипция (+)РНК-генома ретровирусов
Геном ретровирусов две молекулы кэпированной и полиаденилированной (+)РНК размером 8-10 т.н. На 5'- и 3'-концах РНК имеет прямые повторы (R), уникальные последовательности (U5 и U3, соответственно) и на 5'-конце участок присоединения тРНК (Р). В результате реакции обратной транскрипции образуются молекулы двухнитевых ДНК с длинными (несколько сотен нуклеотидов) концевыми повторами (LTR), имеющими структуру U3RU5.
При синтезе минус-нити ДНК у ретровирусов затравка необычна, ее роль выполняют клеточные транспортные РНК (тРНК). Для каждого вируса это определенная тРНК, попадающая в вирион в процессе инкапсидации геномной РНК. Реакция обратной транскрипции у ретровирусов многостадийный процесс, включающий так называемые «прыжки» ревертазы. Возможность «прыжков» обеспечивается наличием на концах матрицы прямых повторов (R) и активностью РНКазы Н. Этапы реакции обратной транскрипции генома ретровирусов представлены на рисунке 17.

Реакция обратной транскрипции начинается не с 3'-конца, как это принято для прямой транскрипции, а с синтеза расположенного на 5'-конце короткого фрагмента путем удлинения 3'-конца тРНК. После достижения конца РНК-матрицы синтез останавливается, в связи с чем первый фрагмент (-)ДНК назван strong-stop-ДНК. На следующем этапе ревертаза в комплексе с strong-stop-ДНК совершает «прыжок» на 3'-конец матрицы, в результате которого синтезируется правый LTR.
Следует отметить, что в процессе синтеза ДНК периодически происходит смена матриц, что затрудняет ответ на вопрос, какая из двух молекул геномной РНК в данном случае является матричной. Далее ревертаза синтезирует плюс-нить правого LTR, используя в качестве затравки остаток матричной РНК в области Pu. При этом синтез продолжается за LTR и включает образование участка, комплементарного 3'-концу тРНК (область P). Этот участок обеспечивает возможность второго прыжка в ходе обратной транскрипции. По результатам реакции образуется двухнитевая ДНК протяженностью больше, чем геномная РНК за счет образования длинных концевых повторов.
Синтез вирусоспецифической ДНК происходит в составе коровой частицы в цитоплазме, затем линейная днДНК поступает в ядро клетки, где переходит в кольцевую форму. После образования кольцевой формы в местах стыка LTR возникает короткий инвертированный повтор, выполняющий функцию специфического участка интеграции. Этот участок узнается вирусным ферментом-интегразой (С-концевой участок ревертазы, обладающий эндонуклеазной активностью), который вносит ступенчатые разрывы в LTR и клеточный сайт. Этот же фермент осуществляет и воссоединение цепей ДНК. При этом оба вирусные LTR теряют по две концевые пары нуклеотидов, а участок хозяйской ДНК, куда встраивается провирус, дуплицируется.
Интеграция вирусного генома в клеточную ДНК является обязательной стадией репродукции ретровирусов. Вирусоспецифическая ДНК реплицируется вместе с клеточной ДНК при митозе и передается в дочерние клетки. Синтез ретровирусных (+)РНК происходит толь ко на матрице провирусной ДНК и осуществляется клеточным транскрипционным аппаратом, то есть, транскрипция вирусных генов является также и репликацией вирусного генома.
Синтезированные первичные транскрипты подвергаются обычным посттранскрипционным модификациям: кэпированию, полиаденилированию и сплайсингу. Сплайсингу подвергаются не все первичные транскрипты. Часть из них выходит в цитоплазму, сохраняя полную последовательность, и используется для инкапсидации в вирион. Общая стратегия репликации/транскрипции генома ретровирусов представлена на схеме 7.

Схема 7. Стратегия репликации/транскрипции генома ретровирусов

4.3.2. Репликация/транскрипция ДНК-генома гепаднавирусов
Геном вируса гепатита B представлен частично двухнитевой кольцевой молекулой ДНК размером 3,2 т.п.н., ассоциированной с молекулой ДНК-полимеразы, которая обладает ревертазной активностью. После попадания геномной ДНК вируса в ядро гепатоцита происходит репарация двухнитевой структуры ДНК и ее переход в ковалентно замкнутую кольцевую форму (cccDNA). На следующей стадии такая ДНК служит матрицей для транскрипции. В результате транскрипции образуются три класса субгеномных РНК и прегеномная РНК размером 3,4 т.п.н., что несколько длиннее, чем геномная ДНК. РНК экспортируются в цитоплазму, субгеномные мРНК транслируются, а прегеномная РНК связывается с полимеразой и инкапсидируется в коровую частицу. В составе коровой частицы ДНК-полимераза осуществляет синтез минус-нити ДНК на матрице РНК по механизму самопраймирования. В процессе синтеза происходит деградация матричной РНК. Синтез минус-нити ДНК начинается вблизи 3'-конца прегеномной РНК, вследствие чего 5'-конец негативной ДНК становится связанным с ревертазой.
После завершения синтеза минус-цепи ДНК и удаления основной части матричной РНК остается кэпированный 5'-конец РНК, содержащий копию участка инициации синтеза ДНК (DRI). Этот фрагмент РНК переносится на 3'-концевой комплементарный участок минус-нити ДНК (DR2) и служит затравкой для синтеза плюс-нити ДНК. Затем ДНК-полимераза синтезирует неполную плюс-нить ДНК и геном или реимпортируется в ядро или происходит созревание коровой частицы до инфекционного вириона. Общая стратегия репликации/транскрипции генома гепаднавирусов может быть представлена в следующей схеме (схема 8).
Существует еще несколько вирусов, у которых репликация генома также включает реакцию обратной транскрипции. Это каулимовирусы (вирусы растений), имеющие геном в виде двухнитевой кольцевой ДНК, обе нити которой не непрерывны. Стратегия репликации генома каулимовирусов сходна с репликацией/транскрипцией ДНК гепаднавирусов.

Схема 8. Стратегия репликации/транскрипции генома гепаднавирусов

Таким образом, стратегии репликации/транскрипции (+)РНК-геномных ретровирусов и ДНК-геномных гепаднавирусов позвоночных и каулимовирусов растений имеют общую основу механизм обратной транскрипции, и это сходство, по всей вероятности, имеет эволюционную основу.

4.4. Трансляция

Трансляция процесс синтеза белка на матрице мРНК. Как уже неоднократно отмечалось, вирусы характеризуются полной зависимостью от белоксинтезирующих систем клетки хозяина. Для синтеза простых белков вирусы используют рибосомы цитоплазмы, для синтеза гликопротеинов рибосомы, связанные с мембранами ЭПР. Молекулярные механизмы синтеза вирусных белков принципиально не отличаются от синтеза белков клетки хозяина и включают четыре стадии: инициацию, элонгацию, терминацию синтеза и посттрансляционную модификацию белков.
Первые стадии определяются особенностями белоксинтезирующих систем клетки-хозяина. В клетках прокариот каждый ген полицистронной мРНК может транслироваться независимо. В то же время, в мРНК эукариот, как правило, функционирует только один инициирующий кодон. Для того чтобы образовать несколько функционально-активных белков вирусы эукариот вынуждены преодолевать ограничения, накладываемые клеткой хозяина. Это может происходить за счет сегментации генома или образования субгеномных мРНК. Основная стратегия, которую реализуют вирусы эукариот с (+)РНК геномом это синтез полипротеина, из которого путем ограниченного протеолиза образуются зрелые белки. Нарезание полипротеинов-предшественников обеспечивают как вирусные, так и клеточные протеазы.
В зависимости от строения активного центра протеазы разделены на 4 класса сериновые, цистеиновые, аспарагиновые и цинксодержащие. Протеолиз полипротеина у тогавирусов и флавивирусов обеспечивают вирусоспецифические сериновые протеазы, у пикорнавирусов цистеиновая, у ретровирусов вирусная аспарагиновая и клеточная сериновая протеиназы. Протеолиз может протекать в ходе трансляции, то есть до завершения синтеза полипротеина (флавивирусы), или после завершения трансляции. Так, у пикорнавирусов протеолиз идет по каскадному механизму: сначала образуются крупные фрагменты полипептидной цепи, а затем они нарезаются на более мелкие полипептиды.
Синтезированные вирусные белки подвергаются различным посттрансляционным модификациям:
1. Гликозилирование. Является процессом созревания вирусных поверхностных гликопротеинов и осуществляется клеточными гликозилазами на мембранах ЭПР и аппарата Гольджи. Как правило, белки гликозилируются олигосахаридами маннозного типа, но в ряде случае процесс может идти дальше и эти углеводные цепи замещаются на другие.
2. Ацилирование NH2-конца полипептидных цепей. Широко распространено у вирусов растений. У вирусов человека и животных 1-2 остатка жирных кислот (как правило, это миристиновая кислота) присутствуют в составе белка G вируса везикулярного стоматита, гемагглютинина вируса гриппа (НА), VP2 ротавируса и в белках некоторых других вирусов.
3. Фосфорилирование. Осуществляется ферментом протеинкиназой, который может быть вирусоспецифическим или клеточным. Протеинкиназа обнаружена в составе вирионов целого ряда вирусов вируса оспы, вируса везикулярного стоматита, герпеса, ретровирусов и др. Протеинкиназы вирусного происхождения осуществляют как самофосфорилирование, так и фосфорилирование клеточных белков, что является важным фактором в регуляции экспрессии клеточных и вирусных генов.
4. Протеолитическая модификация. Представляет собой нарезание вирусных полипротеинов и фрагментацию поверхностных белков слияния, что приводит к их активации.
Представленное в настоящем разделе многообразие видов геномов вирусов и различные способы их репликации/транскрипции, отражающие эволюционные связи между вирусами, являются основой классификации вирусов и критериями их таксономии.


Глава 5. ТАКСОНОМИЯ ВИРУСОВ

5.1. Общие положения
В 1966 г. на международном микробиологическом конгрессе в Москве был утвержден Международный комитет по номенклатуре вирусов МКНВ. Практически никто не сомневался, что тысячи вирусов человека, животных, растений и микроорганизмов представляют собой единую группу, объединенную в царство «Vira». Оставался выбор конкретной иерархической системы и признаков, по которым следует составлять классификацию. Согласно схеме, предложенной Львовым, Хорном и Турнье, иерархия признаков должна быть нисходящей и включать тип нуклеиновой кислоты, стратегию репликации, симметрию капсида, наличие мембран и другие структурные особенности. На конгрессе эта схема не нашла поддержки, тем не менее, впоследствии стала основой универсальной системы, используемой в настоящее время. В 1973 г. МКНВ был переименован в МКТВ (ICTV) Международный комитет таксономии вирусов.
Современная таксономия вирусов является универсальной для вирусов позвоночных, беспозвоночных, растений, микроорганизмов. Выделение надвидовых таксонов проводится не по фенотипическим показателям, а на основе фундаментальных свойств.
Формальными таксонами в царстве Vira являются:
Порядок состоит из семейств вирусов с очевидным общим эволюционным происхождением. Обозначается словами, оканчивающимися на virales.
Семейство (подсемейство) объединяет роды, представители которых имеют один вид генома и сходную структурную организацию вирусной частицы. Семейства (подсемейства) вирусов обозначаются словами, оканчивающимися на viridae (virinae).
Род объединяет вирусы на основе стратегии генома, феномена генетических взаимоотношений, архитектуры вириона, круга восприимчивых хозяев, патогенности, географического распространения, способа передачи. Названия родов вирусов оканчиваются на virus.
Вид формально каждый отдельный вирус может быть определен как вид. Название начинается или оканчивается на слово вирус.
Существование дискретных биологических видов у вирусов не вызывает сомнений. Однако концепция вида в вирусологии до конца не разработана. Отсутствуют четкие критерии определения границ вида. При выделении таксонов высокого ранга (от рода и выше) учитывается строение и молекулярная организация вириона, вид генома, способ его реализации, способность вступать в генетические взаимодействия. Принимаются во внимание биологические и экологические характеристики, антигенные свойства, круг хозяев, способ передачи. Поиск критериев для определения видовых границ включил анализ возможности использования ряда других признаков.
Первый признак способность вызывать определенное заболевание (система: нозологическая форма болезни этиологический агент). При использовании в качестве критерия вида только этого признака в вид не укладываются природные авирулентные варианты, аттенуированные варианты, затрудняет полиморфизм клинических проявлений инфекции.
Второй способ видовой дифференцировки основан на определении антигенных свойств. Однако существование постоянного антигенного дрейфа, дающего множество серологических типов одного вируса, делает серологические реакции не универсальными. Например, в семействе буньявирусов выделено 180 серологических типов, у герпесвирусов 89, риновирусов более 100. Многообразие серотипов уменьшает ценность серологического критерия в определении вида. Серологические различия являются качественными, а не количественными, что создает трудности при определении границ вида. Четких критериев принадлежности серологических типов к отдельным видам не установлено и в каждом случае вопрос об определении видовых границ решается индивидуально.
Так, у полиовирусов выделено три серотипа, которые не создают перекрестного иммунитета, но относятся к одному виду, так как вызывают одно заболевание паралитический полиомиелит. В то же время, энтеровирус-71 также вызывает паралитическое заболевание, но относится к другому виду. У аденовирусов в серологическую классификацию введено количественное начало. Серопиты выделяются в отдельные виды в том случае, если в перекрестной реакции нейтрализации с гомологичным и гетерологичным антигенами наблюдается не менее чем 16-кратная разница в титре.
Комплексный подход к определению вида основан на привлечении молекулярно-биологических, биохимических, генетических, биологических и экологических данных. Более четкие результаты дает использование в серологических реакциях МКА и изучение генов и их продуктов путем определения первичной структуры. Применение комплексного подхода позволяет не только определить границы вида, но и оценить многообразие молекулярных проявлений внутри него.
ICTV не классифицирует вирусы ниже вида, однако в практике и научных исследованиях используют дифференциацию вирусов по антигенам, серотипам, генотипам, электрофоретипам в зависимости от применяемых методов исследования.
Внутри вида различают антигенные типы и генотипы вируса. В ряде случаев эти две характеристики могут коррелировать, в других случаях используются как разные подходы к характеристике одного вируса, то есть могут заменять, дополнять друг друга или быть единственной характеристикой вируса. Например, вирус гриппа дифференцируется только на уровне антигенных вариантов. Вирус имеет два антигена
гемагглютинин (Н) и нейраминидазу (N), которые комплексируются в нескольких вариантах. Существует 13 вариантов Н (Н1-Н13) и 9 вариантов N (N1-N9). Антигенные варианты вируса гриппа A описываются как H1N1,H2N1 и так далее.
Ротавирусы описываются как на уровне антигенных вариантов, так и генотипов. По групповому антигену их разделяют на 7 не имеющих серологических связей антигенных групп (А-F). Ротавирусы группы А имеют два поверхностных белка, являющихся основными антигенами вируса: белок VP7 определяет G-серотип вируса, белок VP4 определяет P-серотип/генотип вируса. Природные штаммы ротавирусов описывают как G/P варианты. Генотип вируса определяют по нуклеотидной последовательности с использованием ПЦР или секвенирования.
Для характеристики вирусов разработана система обозначений (криптограмма), включающая следующие признаки;
Антигенная группа вид происхождения место происхождения обозначение штамма год выделения субтип антигена генотип. Согласно этим признакам, например, ротавирус обезьян штамм SA11 описывается следующим образом A/Si/S. Africa/SA11/58/GЗ Р2 [6] SI; вирус гриппа А, штамм Гонконг A/SW/Goncong/Fort Warren/50/H1N2.
В иерархии вирусов «вид» является последним формальным таксоном. Однако с понятием биологический вид неразрывно связаны такие звенья иерархической системы как особь и популяция. В общебиологическом понимании вид включает в себя несколько популяций, а популяция представляет собой совокупность отдельных особей одного вида. Особенности жизненного цикла вируса затрудняют применение к виру, сам термина особь, а следовательно, и популяция. Морфологическими признаками особи обладают лишь покоящиеся внеклеточные формы вируса вирионы. Внутриклеточный репродуцирующийся вирус представлен функционирующими молекулами и образующимися субвирусными компонентами, к которым понятия особь и индивидуум мало применимы. Однако с точки зрения генетики, принципиальным признаком особи является наличие индивидуального геном а, обеспечивающего жизненные функции и воспроизводство, что, в общем-то, заложено в вирионе и реализуется во время жизненного цикла вируса.
Вид у вирусов состоит из автономных популяционных образований с обособленным в той или иной степени генофондом. В вирусологии следует различать локальные популяции и природные популяции вируса.
Локальная популяция это совокупность особей одного вида, имеющих общее место обитания и длительно существующих в определенной части, ареала. Локальная вирусная популяция формируется в естественных условиях в организме зараженных хозяев. Размножающийся вирус объединен экологически, то есть имеет общее место обитания и подвержен сходным воздействиям. Вирус находится в абсолютной пространственной изоляции от других вирусных популяций и проходит на протяжении инфекционного процесса значительное количество генераций. Каждый вид вируса существует в форме природных популяций, связанных с популяциями одного или нескольких хозяев. Популяция хозяев занимает определенный ареал, такой же ареал занимает и природная вирусная популяция.

5.2. Таксономическая классификация вирусов
Классификация вирусов очень подвижная система. Постоянно получаемые новые знания о вирусах о структурной и молекулярной организации, особенностях репликации, филогенетических взаимоотношениях служат основанием для ее перестроек.
По материалам шестого сообщения ICTV (1995 г.) с изменениями, внесенными позже (1997 г.), вирусы классифицированы на 184 рода, 161 из которых был сгруппирован в 55 семейств, 23 определены как «блуждающие». Семейства кластеризованы в соответствии с видом генома днДНК, онДНК, днРНК, (-)РНК, (+)РНК и те, для репликации которых требуется реакция обратной транскрипции (РТ-вирусы, или ретроидные вирусы). Эти более высокие, чем семейства, кластеры не являются формальными таксонами, но очень удобны для систематизации многообразия вирусов.
В седьмом докладе ICTV (Таксономия-2001) в классификации вирусов выделено уже 62 семейства и 222 рода, включая «блуждающие». Как правило, в каждом семействе имеется группа несистематизированных вирусов. Например, в семействе флавивирусов не классифицированы вирус гепатита G и родственные ему вирусы. При получении новых знаний эти вирусы могут быть отнесены к одному из родов семейства или составить свой род. Практически в каждом геномном кластере присутствуют неклассифицированные роды вирусов (всего 23 рода), которые не нашли своего семейства и впоследствии могут составить отдельное семейство вирусов. Примером такой ситуации могут служить роды Deltavirus и Tenuivirus (кластер (-)РНК-геномных вирусов). Другой пример подвижности таксономической системы вирусов вирус гепатита Е, который ранее входил в семейство Caliciviridae, а в настоящее время является типовым вирусом «блуждающего» рода в кластере (+)РНК-содержащих вирусов. В геномном кластере (+)РНК вирусов сосредоточено наибольшее число неклассифицированных родов вирусов растений.
Выделено 2 порядка вирусов:
1) среди вирусов с негативным РНК-геномом сформирован порядок Mononegavirales, включающий 4 семейства (парамиксо-, рабдо-, фило- и борнавирусы);
2) среди вирусов с РНК-геномом позитивной полярности выделен порядок Nidovirales, включающий 2 семейства (корона- и артеривирусы). Порядок выделяют на основе ряда объединяющих признаков, включая очевидную филогенетическую близость между представителями семейств. Например, при формировании порядка Mononegavirales были учтены одиннадцать объединяющих признаков:
1. Сходная геномная организация.
2. Комплементарность геномных концевых последовательностей.
3. Гомологичность последовательностей 3'-НТР.
4. Консервативность транскрипционного сигнала.
5. Прерывание генов внутригеномными последовательностями.
6. Наличие вирионной РНК-зависимой РНК-полимеразы.
7. Синтез репликативных и мРНК идет в составе нуклеокапсида.
8. Репликация РНК включает синтез полноразмерного антигенома.
9. Транскрипция идет путем последовательного прерывистого синтеза от одного промотора.
10. Транскрипция и репликация протекают в цитоплазме.
11. Созревание вириона идет путем почкования переформированного нуклеокапсида через цитоплазм этическую мембрану, содержащую встроенные вирусные белки.
Современная классификация семейств вирусов представлена в таблице 3. При рассмотрении таблицы следует обратить внимание, что четыре семейства дифференцированы на подсемейства; восемь семейств являются смежными, т.е. включают вирусы, поражающие представителей разных царств живого (Birnaviridae, Reoviridae, Rhabdoviridae, Bunyamviridae, Parvoviridae, Iridoviridae, Poxviridae, Picornaviridae); не обнаружено семейств, включающих вирусы прокариот и эукариот.
Кроме вирусов, в царстве Vira рассматриваются и другие молекулярные паразиты, которые систематизируются в рамках неопределенных таксонов. Это вироиды (Viroid), где в настоящее время выделено два семейства и 8 родов, сателлиты вирусов (Sattelites) и прионы (Prions).

Глава 6. БАКТЕРИОФАГИ

6.1. Характеристика семейств вирусов бактерий
Бактериофаги вирусы, размножающиеся в бактериальных клетках. В современной классификации вирусы бактерий распределены на 13 семейств и один неклассифицированный род (табл. 4).
У бактериофагов обнаружены четыре вида геномов. Отсутствуют ретроидные вирусы и (-)РНК-геномные вирусы. Сегментированный РНК-геном содержат цистовирусы (Cystoviridae), (+)РНК-геном левивирусы (Leviviridae). Основная масса бактериофагов это ДНК-содержащие вирусы. Геномная ДНК бактериофагов может быть однонитевой и двухнитевой, линейной, кольцевой или су перс круче иной. Линейные молекулы ДНК могут иметь липкие концы, содержать прямые или инвертированные концевые повторы или геномные белки.
Отличительной особенностью ДНК целого ряда фагов является наличие метилированных оснований (5’-метилцитозина, или 5-МЦ; 6’- метиламинопурина, или 6-МАП), которые могут входить в состав ДНК в качестве минорных или мажорных оснований. Так, ДНК фагов fd и
·X174 (колифаги) содержит 1-2 метилированных основания, а в ДНК фага XI2, лизирующего морскую бактерию Xantomonas oryza, вообще нет обычного цитозина, который полностью замещен 5-МЦ. Источником происхождения таких оснований является энзиматическое метилирование уже синтезированной цепи ДНК. Этот процесс осуществляют специфические метилазы, которые используют в качестве донора метильных групп S-аденозилметионин.
Вирусы бактерий поражают многообразием морфологических типов и размеров, которые колеблются в пределах 20-200 нм. Обнаружены оболочечные и безоболочечные вирионы, изометрические, палочковидные и нитевидные формы. Уникальной дифференцированной организацией обладают бактериофаги с хвостовым отростком. Группа вирусов с хвостовым отростком включает три семейства: бактериофаги с сократительным хвостовым отростком (Myoviridae), с длинным несократительным отростком (Syphoviridae) и бактериофаги с коротким хвостовым отростком (Podoviridae). Внутри каждого семейства вирусы классифицируют на типы и подтипы по размерам и форме головок, размерам и сложности организации хвостового отростка.

Таблица 4

Наиболее сложноустроенными являются бактериофаги T-четной серии. Рассмотрим их организацию на примере бактериофага T4, образованного 30-ю белками (рис. 18).
Головка фага T4 состоит из двух неравноценных частей белкового изометрического капсида с заключенной в нем ДНК, и миниатюрного комплекса, который находится в основании одного из углов капсида. Этот комплекс состоит из муфты и шейки. Шейка, в свою очередь, организована цилиндром и воротничком с 6-ю короткими воротничковыми нитями.
Хвостовой отросток состоит из стержня, окруженного белковым чехлом, и базальной пластинки, ассоциированной с 6-ю длинными и 6-ю короткими фибриллами. Чехол хвостового отростка образован 144 белковыми субъединицами и может находиться в растянутом или сокращенном состоянии. Растянутый чехол это структура, состоящая из стопки дисков (24 диска, каждый образован 6-ю субъединицами), в то время как сокращенный чехол это спирально закрученный тяж из 144 белковых субъединиц.

Рис. 18

6.2. Особенности жизненного цикла бактериофагов

6.2.1. Видовая и штаммовая специфичность бактериофагов
Видовая специфичность бактериофагов, как и в случае других вирусов, определяется наличием на клеточной поверхности специфических рецепторов и реализуется на стадии адсорбции. Адсорбция является физико-химическим процессом взаимодействия структур фаговой частицы, отвечающих за адсорбцию, и особых компонентов клеточной стенки, получивших название фаговые рецепторы. Чаще всего рецепторами являются липополисахариды и белки клеточной стенки. Описаны фаги E. Coli f1 и f2 (Inovirus), адсорбирующиеся на половых пилях, в связи с чем, они размножаются только на мужских штаммах (F+). Взаимодействие фага и рецептора высоко специфично. Именно стадия адсорбции определяет круг бактерий хозяев фага. Как правило, определенный тип бактериофага паразитирует на бактериях одного вида, реже на нескольких близкородственных видах (например, на кишечных палочках и шигеллах). Потеря фаговых рецепторов или их изменение является основной причиной устойчивости бактерий к фагу.
Круг хозяев бактериофагов, кроме наличия у них специфических фаговых рецепторов, определяется и другими специфическими особенностями клеток бактерий. Способность того или иного фага заражать разные виды и штаммы бактерий в определенной степени зависит от систем рестрикции-модификации клеток последнего хозяина, где этот фаг реплицировался. В общем виде сущность феномена модификации хозяином состоит в том, что клетки, где может происходить репликация вируса, имеют специфические эндонуклеазы рестрикции, вызывающие деградацию чужеродных ДНК (система рестрикции или r-система), и одновременно имеют ферменты (метилазы, гликозилазы), защищающие свою ДНК путем придания ей дополнительной, «уточняющей» специфичности в виде минорных метилированных оснований (система модификации или m-система). Клетка защищает свою ДНК от своей r-системы метилированием оснований в строго специфичных местах (сайтах) рестрикции. Поскольку такие сайты (короткие последовательности нуклеотидов) имеются и в ДНК вируса, они также метилируются, то есть клетка как бы метит «свои» вирусы. В разных видах бактерий присутствуют разные эндонуклеазы рестрикции и соответствующие им m-системы. В итоге возникает видовая и даже штаммовая специфичность систем r-m. В связи с этим, пометив и защитив ДНК вируса, бактериальная клетка разрешает размножаться только «своим» вирусам и запрещает реплицироваться «чужим», которые перед этим размножались в других штаммах или видах бактерий.
Целый ряд вирусов бактерий научился сам преодолевать г-систему клетки хозяина за счет приобретения фаговой ДНК хозяйских генов, кодирующих специфические метилазы, и таким образом гарантировать себе получение полноценного потомства. Примером такой приспособляемости бактериофагов является фаг T2 (Myoviridae). Паразитизм и высокая приспособляемость бактериофагов могут идти еще дальше. Некоторые фаги (
·, P1 Syphoviridae) приобрели себе не только т-систему, но и собственные системы рестрикции. При попадании таких фагов в клетку фагоспецифические рестриктазы могут воздействовать на клеточную ДНК, обеспечивая первый этап вирусной инфекции подавление функции генома клетки хозяина.

6.2.2. Введение фаговой нуклеиновой кислоты в бактериальную клетку
Особенности строения бактериальных клеток, имеющих устойчивую к воздействию факторов внешней среды и относительно жесткую клеточную стенку, определяют существование ряда отличительных механизмов введения нуклеиновой кислоты бактериофага в клетку хозяина. Остановимся на двух примерах.
1. Введение ДНК в клетку хозяина фагами с сократительным хвостовым отростком происходит с использованием «шприцевого» механизма. Адсорбция фага на клеточной поверхности и введение нуклеиновой кислоты в клетку представляют собой многоступенчатый энергозависимый процесс, в котором участвуют три структурно и функционально разделенные системы: сенсорная (включает длинные и короткие хвостовые фибриллы), сократительная (хвостовой чехол) и проводящая (хвостовой стержень).
Введение ДНК в клетку хозяина включает несколько этапов:
обратимое связывание длинных фибрилл бактериофага с липополисахаридами клеточной стенки бактерии, сопровождающееся их сгибанием и реорганизацией базальной пластинки, что приводит к контакту коротких фибрилл с клеточной поверхностью;
необратимое связывание коротких фибрилл бактериофага с липополисахарид-белковым комплексом бактериальной стенки;
перестройка базальной пластинки, приводящая к энергозависимому сокращению хвостового чехла (каждая молекула белка хвостового чехла содержит 1 молекулу ГТФ, гидролиз которой обеспечивает энергией процесс сокращения);
сокращение хвостового чехла приводит к экспонированию хвостового стержня, который своим дистальным концом остается связанным с базальной пластинкой, обусловливающей точечный лизис клеточной стенки;
хвостовой стержень проходит через клеточную стенку, проникает в периплазму и достигает цитоплазматической мембраны, ДНК фага из головки по полому стержню поступает в периплазму и через цитоплазматическую мембрану транспортируется в клетку. Строгая специфичность взаимодействия сенсорных систем вируса с клеткой и скоординированность структурных перестроек его специализированных компонентов обеспечивает фагу T4 самую высокую эффективность заражения среди всех известных вирусов.
2. Введение РНК бактериофага
·6 (Cystovirus) в клетку хозяина фитопатогенной псевдомонады Pseudomonas pseudoalcaligenes представляет собой не менее уникальный механизм. Он включает целый ряд уже известных стадий: слияние мембран, лизис пептидогликана клеточной стенки, эндоцитоз и прямую пенетрацию.
Схематично этот процесс выглядит следующим образом: оболочечный вирус адсорбируется на клеточных рецепторах с использованием шипов, образованных прикрепительным белком P3, которые при этом сокращаются. Сокращение P3 позволяет белку слияния P6 войти в контакт с клеточной поверхностью. Слияние P6 с поверхностью псевдомонады активирует литический фермент P5, входящий в состав нуклеокапсида. Фермент Р5 осуществляет разрушение пептидогликана клеточной стенки. В результате этого нуклеокапсид приходит в контакт с цитоплазматической мембраной. Нуклеокапсид проникает через цитоплазматическую мембрану по механизму эндоцитоза, покидая эндосому путем прямой пенетрации с потерей основных белков нуклеокапсида P8 и P5. В цитоплазму выходит полимеразный комплекс, ассоциированный с тремя сегментами днРНК.

6.2.3. Типы взаимодействия фагов с бактериями
На основании особенностей жизненного цикла бактериофаги разделяют на две группы:
1) вирулентные бактериофаги фаги, жизненный цикл которых завершается лизисом клетки хозяина и выходом зрелых фаговых частиц;
2) умеренные или лизогенизирующие бактериофаги фаги, способные после проникновения в бактериальную клетку переходить в состояние профага и длительное время реплицироваться совместно с бактериальным геномом, передаваясь очередному поколению бактерий.
Существуют два основных типа взаимодействия фагов с бактериями продуктивный и лизогенный, осуществляемый, соответственно, вирулентными и умеренными фагами.

Продуктивный тип взаимодействия
После проникновения нуклеиновой кислоты фага в клетку начинается экспрессия фаговых генов, при этом используется синтетический аппарат клетки-хозяина. В первую очередь синтезируются белки, регулирующие работу фагового генома, ферменты, участвующие в синтезе фаговых нуклеиновых кислот. Затем реплицируется геномная нуклеиновая кислота фага и синтезируются структурные белки фагового капсида. Механизм репликации фагового генома зависит от его вида и в общих чертах подчиняется принципам, изложенным в разделе «Репликация вирусных геномов». На последнем этапе происходит сборка фаговых зрелых частиц.
Продуктивный тип взаимодействия сопровождается наработкой зрелого вирусного потомства и может завершаться двумя исходами лизисом клетки и внезапным выходом в среду вновь образовавшихся вирионов (литический тип взаимодействия) или секрецией вирионов в среду, не сопровождающейся разрушением клетки хозяина (секреторный тип взаимодействия).
При литическом типе взаимодействия к моменту завершения сборки фаговых частиц нарабатываются особые, так называемые, киллерные белки, которые убивают бактериальную клетку, останавливая все метаболические процессы и разрушая клеточную стенку. Зрелые фаговые частицы выходят во внешнюю среду не в результате механического разрушения бактериальной клетки, а в результате лизиса изнутри. Каждая из этих частиц способна инфицировать чувствительную бактериальную клетку и повторить вышеописанный цикл развития.
Уникальное завершение жизненного цикла наблюдается у иновирусов (фаги E. coli f1, M13). Зрелые нитевидные частицы этих фагов секретируются из зараженной клетки без лизиса последней. Иновирусы инфицируют только мужские клетки, так как адсорбируются на кончиках F-пилей. В процессе морфогенеза фаговые белки концентрируются на внутренней поверхности клеточной мембраны, зрелые молекулы ДНК проходят через мембрану, захватывая капсидный белок, и секретируются в среду. Иновирусы выделены из E. coli (фаги f1, fd, M13), Salmonella (фаги if1, if2), Pseudomonas (фаги Pf1, Pf3), Xanthomonas (бактериофаг Xf), Vibrio (бактериофаг v6).
Особый интерес представляет фаг M13. Существование этого вируса в двух формах репликативной (в форме плазмиды) и секреторной (инкапсидированная однонитевая кольцевая ДНК) делают его удобным инструментом молекулярно-генетических исследований. Путем различных модификаций генома фага М13 сконструирован целый ряд удобных векторов клонирования на основе репликативной формы. Секретируемая одноцепочечная рекомбинантная молекула ДНК широко применяется при определении нуклеотидных последовательностей клонированных фрагментов ДНК.

Лизогенный тип взаимодействия
У умеренных бактериофагов первые две стадии жизненного цикла совпадают со стадиями жизненного цикла вирулентных фагов. После введения нуклеиновой кислоты в клетку хозяина умеренные фаги способны в дальнейшем либо пойти по литическому пути, аналогично вирулентному фагу, либо перейти в особое состояние, получившее название «профаг». При этом генетический материал фага интегрирует в бактериальную хромосому или переходит в плазмидоподобное состояние и реплицируется синхронно с геномом клетки. Все бактерии потомки клетки, инфицированной умеренным фагом, содержат профаг. Такая бактериальная культура называется лизогенной. Лизогенная культура может существовать продолжительное время.
Лизогенная культура обладает следующими свойствами: она устойчива к повторной инфекции данным типом фага или фагами, близкородственными ему; всегда содержит небольшое количество зрелых фаговых частиц, о чем свидетельствует спонтанный лизис отдельных клеток в культуре.
Для системы «лизогенная бактерия профаг» описано явление, получившее наименование индукция. При индукции профаг активизируется во всех клетках лизогенной культуры, в результате чего наблюдается продуктивный цикл развития фага, завершающийся полным лизисом клеток и выходом зрелого фагового потомства. Индукция может происходить как спонтанно, без видимых причин, так и в результате воздействия определенных факторов, получивших название индукторов. К индукторам относятся ультрафиолетовое излучение, мутагены, такие как нитрозогуанидин, акридиновые красители и ряд других.
В результате детального изучения различных типов мутантов фага
· было показано, что в формировании и поддержании лизогенного состояния участвует белок cI, получивший название иммунитетный репрессор. Установлено, что белок cI связывается с фаговой ДНК в районе области иммунности. В этой области на хромосомной карте фага
·, между геном N и геном CII находятся два промотора PR (R правый) и PL (L левый) с соответствующими им операторами OR и OL(, (схема 9). Именно с этими операторами и связывается белок cI, выполняя регуляторную функцию белка-репрессора.
Блокирование белком cI левого оператора предотвращает синтез мРНК с гена N, а блокирование правого оператора предотвращает синтез мРНК с генов O и P. Продукты генов N, O, P необходимы для выражения всех остальных генов фага
·, поэтому прямое действие репрессора на операторы OR и OL косвенным образом подавляет выражение практически всего генома.

Схема 9

Каждый оператор состоит из трех участков длиной 16 нуклеотидов, расположенных тандемно, и способен связывать от 1 до 3 молекул белка cI. Присоединение хотя бы одной молекулы репрессора предотвращает достижение РНК-полимеразой точки инициации транскрипции.
Существует репрессор синтеза репрессора cI, являющийся продуктом гена его. В клетке, содержащей геном фага
·, образование репрессора cI и репрессора репрессора cro являются взаимно исключающими состояниями. При лизогенизации и поддержании лизогении синтезируется репрессор cI и подавлен репрессор репрессора cro. При литической реакции репрессор репрессора образуется, а образование репрессора cI подавлено.
В клетке, инфицированной умеренным фагом
·, могут протекать как события, приводящие к лизогенизации, так и события, приводящие к продуктивному развитию фага. Выбор определяется соотношением уровня синтеза репрессора cI и уровня синтеза продукта гена его. Так, суперинфицирование нормальным фагом лизогенных клеток, содержащих продукт его, всегда приводит к литической реакции, а суперинфицирование нормальным фагом лизогенной клетки, содержащей репрессор cI, никогда не приводит к литическому ответу.
Кроме продуктов генов cI, cII, cIII, cro, промоторных и операторных участков существенную роль в процессах регуляции выражения генома фага
· играют гены N, O, P, Q.
Продукт гена N осуществляет позитивный контроль транскрипции всех остальных генов фага
·. При индукции профага, дефектного по гену N, с промотора PL транскрибируется только сам ген N, а с промотора PR только ген его. При наличии продукта гена N с обоих промоторов транскрибируются длинные полигенные мРНК. Действие продукта гена N является примером аттенуаторного контроля (аттенуация регуляция транскрипции на уровне терминации). Аттенуаторные участки закодированы в ДНК фага
· между генами N и CIII, между генами его и CII, а также между генами P и Q. Именно в этих точках обрывается синтез мРНК при отсутствии продукта гена N.
Под контролем группы генов C, генов его и N находится выражение, так называемых, ранних белков, участвующих в рекомбинации фаговой ДНК (int, xis, red, rex), регуляторных белков (cI, cII, cIII, cro, N), белков, участвующих в репликации фаговой хромосомы (С, Р). Ни один из этих белков не относится к компонентам зрелой фаговой частицы.
Структурные компоненты фага кодируются поздними генами, расположенными справа от гена Q. Их выражение начинается после того, как пройдет 1/3 латентного периода. Выражение поздних генов находится под позитивным контролем продуктов генов О, P, Q. Поздние гены транскрибируются в виде единой полигенной мРНК. При отсутствии продуктов генов O и P фаговая ДНК не реплицируется и не синтезируются продукты поздних генов.

Трансдукция
При изучении бактериофагов было открыто явление, получившее название трансдукция перенос фагом генов бактерии-хозяина от клетки к клетке. Различают специфическую и неспецифическую (общую) трансдукцию.
Специфическая трансдукция впервые описана Ледербергом и его сотрудниками на примере колифага
·.. Они проводили заражение различных типов ауксотрофных мутантов штамма E. coli K12 фагом
·, выращенном на исходном прототрофном штамме K12. Чтобы проверить, не передались ли с помощью бактериофага ауксотрофам гены штамма дикого типа, культуры высевали на селективные среды. Результаты были в основном отрицательные, ни один из признаков донора не передавался фагом
· лизогенизированным реципиентам. Было лишь одно исключение бактерии gal- (не способные утилизировать галактозу) с вероятностью 10-6 приобретали от донорского штамма признак gal+. Таким образом, было установлено, что фаг
· способен переносить (трансдуцировать) гены, но трансдукция носит специфический характер и ограничивается только генами gal, так как ДНК фага
· интегрирует в бактериальную хромосому в непосредственной близости от гена gal. С определенной вероятностью при выщеплении профага
· из состава бактериальной хромосомы происходит ошибка, и наряду с генами фага выходит область gal-гена E. coli, а часть фаговых генов остается в хромосоме. Трансдуцирующий фаг
· (
· gal) является дефектным. От 1/4 до 1/3 его генома замещается на область gal бактериальной хромосомы. Такие фаги не способны к вегетативному размножению, не образуют негативных колоний на газоне чувствительных бактерий. Однако при попадании в клетку хозяина, они делают ее устойчивой к повторной инфекции фагом
·. Дефектный фаг размножается и дает структурно полноценное потомство только при наличии фага-помощника (нормального фага
·, присутствующего в клетке-хозяине одновременно с дефектным). Такое возможно при одновременном инфицировании бактерии, как дефектным по гену gal, так и нормальным, диким фагом
·.

Неспецифическая (общая) трансдукция была описана Ледербергом и Татумом несколько раньше, чем специфическая. Это явление было открыто неожиданно, при попытке изучить половой процесс у Salmonella typhimurium. Для этого был использован метод, ранее позволивший продемонстрировать коньюгацию у E. coli. На синтетическую среду, содержащую только соли и углевод как источник углерода и энергии и не содержащую аминокислот, высевали смесь двух ауксотрофных мутантов S. typhimurium. Один из них нуждался для роста в фенилаланине, триптофане, тирозине (Phe-, Trp-, Tyr-), другой в метионине и гистидине (Met-, His-). Одна из 100 000 колоний образовывала прототрофные колонии. Они являлись результатом генетической рекомбинации этих двух штаммов, в котором объединились аллели дикого типа Phe+, Trp+, Tyr+ от одного штамма и Met+, His+ от другого. Был сделан вывод, что у Salmonella, как и у Escherichia, может происходить генетический обмен, в результате которого образуются рекомбинанты с генетическими признаками разных предков. Однако, в отличие от E. coli, Для образования рекомбинантов у сальмонелл не требуется контакта между родительскими клетками. Обмен генов происходил за счет фага P22, который содержался в одном из родительских штаммов в форме профага.
Фаг P22 способен трансдуцировать любой ген Salmonella. Такой вариант трансдукции получил наименование «общая», «неспецифическая». Было выяснено, что частота трансдукции для всех генов приблизительно одинакова и невысока 10-5. Одновременно несколько признаков (генов), как правило, не передаются. Исключение составляют тесно сцепленные гены (расположенные рядом на хромосоме). Величина трансдуцируемого фрагмента ДНК ограничена объемом фаговой головки. Фаговая частица, осуществляющая общую трансдукцию и содержащая только бактериальную ДНК, не способна к вегетативному размножению и не «иммунизирует» клетку хозяина. Такие частицы возникают в результате ошибок при упаковке ДНК в фаговые капсиды.
Фаги, подобные P22, были выделены также и для E. coli, в частности фаг P1. В экспериментах по общей трансдукции генов E. coli фагом P1 была подтверждена правильность построения генетических карт хромосомы E. coli, уточнены расстояния между генами, созданы карты тонкой структуры генома.
При трансдукции фаги изменяют свойства бактериальной клетки, привнося в нее генетическую информацию (фрагмент хромосомы) от предыдущей клетки-хозяина. Однако и сам «дикий» не дефектный профаг при лизогенизации клетки, делая ее «иммунной», может сообщать ей новые признаки. Такое явление получило название «фаговая конверсия». Например, E. coli после лизогенизации фагом
· приобретает устойчивость к ряду мутантов вирулентных T-четных фагов.
Наличие профага P1 в клетке E. coli делает ее устойчивой к инфицированию неродственным фагом
·. Фаг
· способен адсорбироваться на лизогенизированных клетках E. coli и инъецировать в них свою ДНК. Затем эта ДНК подвергается рестрикции (разрезанию на несколько фрагментов) за счет эндонуклеазы, кодируемой профагом P1, после чего внутриклеточное развитие фага
· прекращается.
Наиболее ярким примером лизогенной конверсии служит образование дифтерийного токсина у Corynebacterium diphtheriae. После обработки нетоксигенных штаммов коринобактерий умеренными дифтерийными фагами среди выживших бактерий можно выделить токсигенные штаммы. При этом существует четкое соответствие между токсигенностью и лизогенностью. Однако, в отличие от системы E. coli фаг
·, где конверсия проявляется в состоянии профага, образование дифтерийного токсина происходит только после индукции профага, в период внутриклеточного вегетативного развития фага. Таким образом, дифтерийный токсин является побочным продуктом вегетативного развития фага.

6.3. Фаговые векторы
Генетические исследования фаговых геномов, построение их точных генетических карт, позволили разработать на основе фаговых ДНК векторные системы для решения генно-инженерных задач. Особенно удачный вектор был сконструирован на основе колифага
·.
Фаг
· умеренный колифаг с длинным несократительным хвостовым отростком и днДНК геномом размером 48 502 п.н. Центральная часть генома фага несущественна для его функционирования и используется для заместительной вставки клонируемой ДНК по единственному сайту узнавания для рестриктазы EcoRI. Сам по себе этот вектор короток для упаковки в головку фага (размеры головки накладывают ограничение не только на максимальную, но и на минимальную длину генома). Таким образом, чтобы получить фаг, способный размножаться с образованием зрелых фаговых частиц, в разрезанный родительский вектор должен быть непременно встроен фрагмент чужеродной ДНК. Это приводит к образованию автоматической селективной системы для отбора химерных фаговых геномов. Для удобства отбора рекомбинантных фагов в несущественную область генома, используемую для вставки, введен ген lacZ. Рекомбинантные фаги отбирают из зон лизиса бактериального газона, имеющих белый цвет.
Фаг M13 нитевидный колифаг, имеющий кольцевой онДНК-геном. Для получения рекомбинантных ДНК используют репликативную форму фага, представляющую собой кольцевую двухнитевую ДНК размером 6400 п.н., в которую вставлен ген lacZ, содержащий полилинкер сайтов для целого ряда рестриктаз. Рекомбинантные фаги отбирают из зон лизиса бактериального газона, имеющих белый цвет. Использование векторов на основе фага M13 имеет ряд положительных моментов. Так, одно клонирование дает два вида фагов с однонитевым ДНК-геномом. Каждый вид фага содержит только одну из нитей вставки ДНК, которые могут находиться в разных ориентациях. В связи с этим, клонирование с использованием фага M13 удобно для создания однонитевых ДНК-зондов и секвенирования ДНК.
Попытка объединить преимущества плазмидных и фаговых векторов привела к созданию космид. Это плазмиды со встроенными специфическими последовательностями ДНК (cos сайтами), отвечающими за Упаковку ДНК фага
· в фаговой частице. Такие векторы могут существовать в бактерии в виде плазмид, но могут быть выделены в чистом виде путем их упаковки в фаговые частицы in vitro. Ценность космидных векторов заключается в их большой емкости то есть в возможности клонирования вставок большого размера. На длину этих векторов также накладываются ограничения, обусловленные размером головки фага, но в таком геноме не обязательно присутствие генов, необходимых для литического цикла.

6.4. Лечебные препараты бактериофагов
Применение бактериофагов в качестве антибактериальных лечебных препаратов начато достаточно давно, ранее открытия антибиотиков.
Уступая антибиотикам в спектре антибактериальной активности, технологически, бактериофаги обладают рядом характеристик, которые позволили им сохраниться в перечне лекарственных средств до настоящего времени. В первую очередь, их отличает высокая специфичность и избирательность действия. Они поражают только один вид болезнетворных бактерий, не влияя на нормальную микрофлору человека. Бактериофаги не взаимодействуют с клетками человека, что обуславливает отсутствие противопоказаний к их применению и побочных реакций от их использования.
Бактериофаги преимущественно используются для лечения пациентов с выраженной отрицательной реакцией на антибиотики: недоношенных детей, лиц с аллергическим статусом, дисбактериозами.
В Нижегородском НИИ эпидемиологии и микробиологии совместно с сотрудниками кафедры молекулярной биологии и иммунологии ННГУ им. Н.И. Лобачевского и Нижегородского предприятия по производству бактерийных препаратов под руководством академика РАМН И.Н. Блохиной разработаны фаговые препараты, направленные против большинства бактериальных возбудителей острых кишечных и гнойно-воспалительных инфекций: дизентерийный, сальмонеллезный, колипротейный, клебсиеллезный, стафилококковый, синегнойный бактериофаги. Все перечисленные препараты являются поливалентными, то есть способными разрушать клетки большинства вариантов соответствующего вида бактерий.
Исходно фаговые препараты представляли собой суспензию фаговых частиц в питательной среде. Благодаря разработке методов концентрирования фага были созданы новые формы фаги в таблетках и свечах. Дальнейшее совершенствование технологий производства бактериофагов позволило увеличить активность фагов, приступить к выпуску комплексных форм, эффективных в отношении нескольких видов бактерий, расширить области применения фаговых препаратов.

Глава 7. ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ПАРАЗИТЫ РАСТЕНИЙ

7.1. Вироиды
Первое упоминание о ранее неизвестном субвирусном патогене датируется 1971 годом. Изучая этиологию заболеваний картофеля веретеновидностью клубней, Динер с сотрудниками обратили внимание на необычные свойства возбудителя, который был назван вироидом.
Вироиды (Vd) автономные фрагменты генетического материала, транскрибированного в однонитевую РНК. Вироиды представляют собой небольшие ковалентно-замкнутые молекулы онРНК с м.м. 100-120 кД и размером 350-500 рибонуклеотидов со сложной вторичной структурой, обеспечивающей защиту молекулы от нуклеаз.
РНК вироидов не имеет АУГ-кодонов и не кодирует белковых продуктов. Вироиды функционируют только в вегетативной форме, покоящаяся фаза (наличие вирионов) отсутствует. По всей вероятности, вироиды произошли от нитронов и подвижных генетических элементов транспозонов. Все вироиды обладают выраженным структурным сходством. Все изученные к настоящему времени вироиды имеют гомологию нуклеотидных последовательностей, равную 70-80%. При этом обнаруживаются последовательности, типичные для концов транспозонов, оканчивающихся УГ и ЦА.
Интрон транскрибируемый участок ДНК, который удаляется из состава транскрипта при сплайсинге.
Транспозон последовательность ДНК, способная реплицироваться и внедрять одну из копий в новое место генома.
Структурно вироиды могут быть организованы как мономеры и как мультимеры (рис. 19). Нативная структура мономерного вироида содержит серию коротких расплетенных внутренних петель (О), организованных в 5 структурных доменов. Крайние домены инвертированы относительно центрального консервативного домена. Границы между доменами определены путем сравнения нуклеотидных последовательностей различных вироидов. Наличие двух и более консервативных доменов определяет мультимерность вирида.
Вироиды не имеют собственной системы репликации и не требуют вируса-помощника. Репликация осуществляется за счет ферментов клетки хозяина РНК-зависимой РНК-полимеразы, РНКазы и РНК-лигазы. Репликация вироидов происходит в ядре клетки и идет по типу катящегося кольца. Для ряда вироидов установлено, что процессинг олигомерных интермедиатов репликации осуществляется за счет рибозимазной активности вироида по механизму «самосплайсинга», т.е. аутокаталитического выщепления участков РНК, расположенных между определенными структурными элементами молекулы.

Рис. 19.

Вироиды крайне устойчивы к воздействию физико-химических факторов. Они термостабильны, не разрушаются после обработки хлороформом, фенолом, этанолом, что и является одним из подтверждений их нуклеиновой природы.
Вироиды высокоинфекционные агенты. Они переходят из клетки в клетку только в том случае, если клетка-донор и клетка-реципиент оказываются поврежденными. Вироиды могут распространяться как горизонтально (передаются с посадочным материалом, во время прививок, механической инокуляцией), так и вертикально (с семенами и пыльцой). Биологические переносчики, осуществляющие горизонтальную передачу, не установлены.
Болезни растений, вызываемые вироидами, получили название вироидозы. Вироидозы по своим проявлениям существенно не отличаются от других вирусных болезней растений. Первым вироидозом, привлекшим внимание вирусологов, была, как уже отмечалось, болезнь веретеновидности клубней картофеля, вызываемая вироидом ВВКК (PSTVd). Этот вироид обладает поразительной устойчивостью к действию ингибиторов, которые содержатся в созревающих семенах и обычно инактивируют вирусы картофеля. Это оригинальное свойство ВВКК определяет его способность передаваться с семенами и пыльцой. Другой повсеместно распространенный вироидоз экзокортис цитрусовых. Вироид экзокортиса цитрусовых (ВЭК) поражает лимонные, апельсиновые и мандариновые деревья. Заболевание характеризуется задержкой роста, усилением ветвления побегов, отслаиванием коры, хлорозом листьев. ВЭК передается только горизонтально.
Что лежит в основе патогенетических свойств вироидов пока, не ясно. Предполагается, что эти свойства не являются первичным свойством генетических элементов, от которых произошли вироиды.

7.2. Вирусоиды и вирусы-сателлиты
Вирусоиды кольцевые сателлитные РНК, которые часто сопровождают РНК-содержащие вирусы, полностью зависят в своей репликации от вируса-помощника и реплицируются основным вирусом по типу катящегося кольца. Так например, в растениях, пораженных собемовирусами, обнаруживается кольцевая вирусоидная РНК, которая отличается от линейной РНК вирусапомощника.
Вирусы-сателлиты (SV) субвирусы, вирусы-паразиты вирусов. SV не несут всей информации, необходимой для их репликации, в связи с чем SV паразитируют на генных продуктах, образованных другими, часто не родственными вирусами. Сателлиты вирусов растений имеют небольшой РНК-геном (400-1200 рибонуклеотидов), который, как правило, не имеет гомологии с геномом вируса-помошника и инкапсидирован в капсид. Белок, формирующий капсид может быть продуктом трансляции генома SV, или может быть капсидным белком вируса-хозяина.
Примером SV растений является сателлит вируса некроза табака STNV. Икосаэдрическая частица STNV имеет размер 17 нм, что гораздо меньше размера вириона вируса-помошника TNV (Necrovirus), размер которого составляет 30 нм. Дефектный геном также меньше 1200 нуклеотидов. STNV размножается в присутствии TNV, но кодирует свой собственный белок. Серологически капсидные белки STNV и TNV не имеют никакого родства.
Другой SV сателлит вируса кольцевой пятнистости табака (Nepovirus) не только реплицируется с участием РНК-полимеразы вируса-помощника, но и использует для инкапсидации своей РНК капсидный белок помощника.
Вирусы-сателлиты и сателлитные РНК могут играть важную роль в природе, так как они влияют на характер течения вирусного заболевания растения, ослабляя или утяжеляя его проявления.

7.3. Вирусы растений

7.3.1. Характеристика семейств фитовирусов
Вирусы растений распределены на 16 семейств, включающих 75 родов, 24 из которых являются блуждающими (табл. 5). При рассмотрении таблицы следует обратить внимание на то, что три семейства вирусов растений являются общими с вирусами позвоночных (Reoviridae, Rhabdoviridae, Bunyaviridae), а одно семейство является общим с вирусами грибов Partitiviridae.
У вирусов растений встречаются как оболочечные вирионы, так и вирионы, лишенные оболочки. Оболочку имеют представители рабдовирусов и буньявирусов. Реовирусы представляют собой двукапсидные частицы. Вирионы геминивирусов (Geminiviridae) характеризуются уникальной организацией и представляют собой спаренную структуру, состоящую из двух слившихся икосаэдров (T=1). Вирионы других вирусов являются непокрытыми структурами с икосаэдрическим или спиральным типом симметрии округлые, бациллоформные, палочковидные и нитевидные. Палочковидные и нитевидные (+)РНК-содержащие вирусы относятся исключительно к вирусам растений.
У вирусов растений представлены не все виды геномов. Среди вирусов, поражающих высшие растения, не обнаружено днДНК-геномных вирусов. днДНК-геномные вирусы обнаружены лишь у хлорофиллсодержащих организмов одноклеточных зеленых водорослей (хлорелла), парамеций, микромонад и хризомонад (Phycodnaviridae). Геном в виде однонитевой кольцевой ДНК имеют геминивирусы (Geminiviridae). Двухнитевую незамкнутую кольцевую ДНК, реплицирующуюся через стадию обратной транскрипции, имеют каулимовирусы (Caulimoviridae); все остальные вирусы являются РНК-содержашими: (-)РНК, (+)РНК, амбисенс РНК.

Таблица 5

Среди вирусов растений широко распространено явление мультипартитности (разобщенности генома) то есть распределение фрагментов генома в разные вирусные частицы. Количество различающихся вирусных частиц может быть равно 2, 3 или 4. Соответственно вирусы называют бипартитными, трипартитными, тетрапартитными или квадрипартитными. Размер вирусных частиц мультипартитных вирусов может быть одинаковым, а может различаться, что связано с различиями в длине инкапсидированных фрагментов генома. Явление мультипартитности обнаружено как у изометрических, так и у палочковидных вирусов и наиболее широко распространено среди вирусов с (+)РНК-геномом. Например, бипартитными являются представители семейства комовирусов, геном которых размещен в двух изометрических вирионах одинакового размера. В семействе бромовирусов у альфамовирусов геном размещен в четырех бациллоформных вирионах различной величины (тетрапартитные вирусы), а у бромо- и кукумовирусов в трех изометрических вирионах одного размера (трипартитные вирусы). Трипартитными палочковидными вирусами являются хордейвирусы, бипартитными тобравирусы. Ни полные вирионы, ни входящие в их состав РНК, взятые в отдельности, не обладают инфекционностью. Для запуска инфекционного процесса необходимо попадание в клетку всех фрагментов генома. В случае проникновения в клетку только вириона, несущего РНК, кодирующую РНК-полимеразу, развивается неустойчивая инфекция, при которой образуется лишь одна вирусная РНК. Такой эффект обнаружен у бипартитного палочковидного вируса стеблевой морщинистости табака (Tobravirus).

7.3.2. Распространение фитовирусов
Вирусы растений распространяются в биосфере с участием как природных (ветер, дождь разносят инфицированные семена, пыльцу), так и антропогенных факторов (прививки, вегетативное размножение и размножение семенами, междурядная обработка почвы, импортирование растений). Важную роль в распространении вирусов растений играет орнитохория перенос плодов и семян птицами. В ряде случаев источником заражения сельскохозяйственных растений являются сорняки и дикорастущие виды, которые являются природным резервуаром вирусов. Инфекция у них, как правило, протекает бессимптомно.
Ведущим и древнейшим способом распространения фитопатогенных вирусов является их трансмиссивная передача биологическими переносчиками.
Около полутора десятков вирусов растений могут переноситься почвенными нематодами. Своим стилетом они прокалывают покровы корня около корневого чехлика и высасывают содержимое клеток эпидермиса. Питаясь на больном растении, нематода приобретает вирус, который может персистировать в ее теле до 8 месяцев и передаваться здоровому растению опять в процессе питания.
В ряде случаев вирусы растений распространяются зооспорами грибов-паразитов. Наиболее изученным является хитридиомицет Olpidium brassicae («черная ножка капусты»), паразитирующий на корнях растений. Вирус некроза табака распространяется, находясь на поверхности зооспоры олпидиума, а вирус карликовости табака внутри нее. При отмирании корней растения покоящиеся в них зараженные вирусом споры гриба попадают в почву. Зооспоры прикрепляются к корням здоровых растений и, прорастая, разрушают оболочку клеток корня, после чего цитоплазма гриба проникает в цитоплазму растительной клетки. Нарушение целостности клеток эпидермиса позволяет вирусу проникать в цитоплазму клеток корня растений.
Распространение фитопатогенных вирусов может происходить при помощи повилики. Повилика вьющееся бесхлорофильное растение, лишенное листьев, которое питается соками высшего растения-хозяина путем внедрения в его проводящую систему своих присосок. Повилика может одновременно кормиться на двух и более растениях и как бы мостиком соединяет их проводящие пути. Если одно из растений инфицировано, вирус приобретает возможность проникать в здоровые особи.
Основным естественным переносчиком вирусов растений в природе являются насекомые прыгающие, летающие, ползающие (крылатые и бескрылые тли, цикадки, кузнечики, трипсы, кокциды, жуки-листоеды, галлообразующий клещик). Насекомые могут переносить вирусы растений механически на лапках или с использованием так называемого «стилет-опосредованного» механизма в процессе питания, что широко распространено у тлей. Тли приобретают вирус, насасывая сок инфицированного растения, сохраняют его в течение нескольких часов и вносят вирус в ткани нового растения, прокалывая их своим хоботком.
Как правило, насекомые-переносчики являются промежуточным хозяином вирусов растений, т. е. также инфицируются, репродуцируют инфекционный вирус в своем организме и передают его потомству. Персистенция может быть бессимптомной, в ряде случаев инфицирование наносит вред организму насекомого. С использованием техники инъекций насекомым Мараморошу в 1952 г. показал, что вирус желтухи астр реплицируется в жировом теле переносчика шеститочечной цикады Macrosteles fascifrous и передается потомству трансовариально. До 1% отродившихся личинок наследуют вирус. У инфицированных таким образом цикад наблюдалось отставание в развитии и уродства. То, что вирусы растений, переносимые цикадами, могут передаваться потомству инфицированными женскими особями, показано также для вируса карликовости риса и вируса деформации листьев клевера. Более того, присутствие в жизненном цикле этих вирусов хозяина-растения необязательно.
Таким образом, насекомые являются: механическими переносчиками вирусов растений; хозяевами растительных вирусов; резервуаром потенциально патогенных вирусов растений.

7.3.3. Вирусные заболевания растений
По способу внедрения возбудителя в организм хозяина все вирусные болезни растений относятся к раневым инфекциям. Исключение составляет инфицирование растений-паразитов, куда вирус проникает в ткани при объединении проводящих путей растения-паразита и инфицированного хозяина. Вирусы распространяются в организме растения от клетки к клетке по плазмодесмам при участии элементов цитоскелета со скоростью примерно 1 мм в день, иногда еще медленнее. Когда вирус попадает в проводящие ткани, то может переноситься по растению со скоростью 2,5 см в минуту. В принципе, вирусы могут распространяться по всему растению, причем степень генерализации процесса зависит как от свойств вируса, так и от свойств растения-хозяина. В связи с этим, вирусные инфекции растения могут быть локальными или системными.
Реакция клеток хозяина на вирусную инфекцию варьирует. Одним из крайних проявлений инфекции является некроз. В этом случае клетки отмирают столь быстро, что не успевают передать вирус соседним клеткам. При некротических вирусных инфекциях в тканях листа увеличивается синтез полифенолоксидазы и, соответственно, токсичных полифенолов и хинонов, что, по всей вероятности, и лежит в основе механизма, ведущего к локальному некрозу тканей растения. Другое крайнее проявление реакции растения на вирусную инфекцию бессимптомное вирусоносительство, при котором клетки растения сохраняют способность к делению. Наличие вируса в теле кажущегося здоровым растения обнаруживается по эффекту проявления инфекции у другого вида растения (растение-индикатор) в случае передачи вируса.
Как правило, инфицирование растений вирусами сопровождается мозаичностью, пятнистостью, полосатостью листьев, их скрученностью, отставанием растения в развитии (карликовостью), аспермией (бессемянностью). Одной из характерных особенностей многих фитопатогенных вирусов является их агрегация в виде аморфных кристаллических включений, наблюдаемых в ядре, цитоплазме и хлоропластах. Накопление вирусных включений в хлоропластах, приводящее к потере или изменению пигментации, называют хлорозом. Размножение вирусов, в большинстве случаев, приводит к лизису клеток и может вызывать гибель растения.
Несмотря на то, что проявление симптомов варьирует в зависимости от возбудителя, генотипа растения, климатических и других факторов, первым методом диагностики вирусных заболеваний растений является метод оценки по внешним признакам. Данные, полученные при визуальном обследовании растения, позволяют сделать вывод о природе заболевания. В сомнительных случаях, а также при диагностике латентных инфекций, применяют метод растений-индикаторов и методы иммунологической диагностики латекс-тест, метод двойной диффузии в агаровом геле, иммуноферментный анализ и иммуноэлектронную микроскопию.
Вирусы растений могут иметь узкий, ограниченный или широкий круг хозяев. Например, тенуивирусы поражают только однодольные растения семейства злаковых, представители рода каулимовирусов имеют круг хозяев, ограниченный несколькими семействами однодольных растений, баднавирусы поражают широкий круг хозяев.
Вирусы, имеющие широкий круг хозяев и специфичных переносчиков, способны формировать у растений природные очаги вирусных инфекций. Для формирования природного очага необходимо наличие многих растений-резерваторов (многолетние сорные и дикорастущие растения, которые служат источником инфекции) и нескольких видов специфических переносчиков вируса. Миграция инфицированных насекомых-переносчиков с дикорастущих растений на культурные происходит при изменении условий среды обитания переносчика. В частности, при высокой температуре и засухе дикорастущие растения становятся непригодными для питания насекомых, что заставляет их мигрировать на культурные растения. В таких крайних случаях вирусное заболевание растений может приобретать характер ЭПИФИТОТИИ (массовое инфекционное заболевание растений).
Инфицирование растений теми или иными вирусами может не иметь никакого экономического значения (потивирусы, томбусвирусы). В то же время, целый ряд других вирусов наносят огромный вред сельскохозяйственным культурам. В связи с этим, вирусные болезни растений представляют собой важную проблему фитопатологии., поскольку наносят большой ущерб сельскому хозяйству. Эти болезни поражают плодовые, ягодные культуры и виноград, бахчевые и зерновые культуры, наносят вред тепличному производству и плантациям. Ущерб, наносимый вирусами растений в США, исчисляется биллионами долларов.
Урожаю риса наносят вред вирус карликовости риса (фитореовирус) и вирус стерильной карликовости риса (тенуивирус). Картофель наиболее часто страдает от вируса карликовости картофеля (нуклеорабдовирус), вируса X картофеля (потексвирус), вируса Y картофеля (потивирус). Плодово-ягодные культуры преимущественно поражаются альфамо- и иларвирусами; тепличные культуры и плодовые деревья кри-нивирусами; вирус мозаики цветной капусты (каулимовирус) наносит огромный вред урожаю капусты в Китае. Вирус табачной мозаики (тобамовирус) является причиной потерь не только табака, но и томатов, перцев и бахчевых культур, у которых он вызывает внутренний некроз плодов.
Для борьбы с вирусными заболеваниями растений применяют различные подходы, разработанные как на уровне обычных сельскохозяйственных, так и современных наукоемких подходов:
проведение профилактической дезинфекции инвентаря, пропаривание почвы и субстратов в теплицах, или их замена;
термотерапия посадочного материала. Вирионы многих вирусов растений (но не всех) термолабильны. Это их свойство лежит в основе термотерапии ряда вирусных болезней. Так, основным способом освобождения картофеля от вируса скручивания листьев и X-вируса картофеля является его погружение на несколько минут в воду, прогретую до 50-60 °C; вирус бронзовости томатов инактивируется при 40-48 °C в течение 10 минут. Для освобождения от вируса карликовости тростника термотерапия является производственным приемом;
борьба с естественными переносчиками фитопатогенных вирусов;
хемотерапия с использованием вироцидов;
получение и сохранение свободных от вирусов клонов растений, базирующееся на методе апикальной культуры меристемы;
создание трансгенных растений, устойчивых к вирусным инфекциям, основанное на технологии рекомбинантных ДНК.

Глава 8. Вирусы насекомых

8.1. Группы вирусов членистоногих
Вирусы, поражающие беспозвоночных, условно можно разделить на три группы: первая включает вирусы растений, для которых промежуточными хозяевами являются насекомые; вторая это арбовирусы вирусы человека и животных, для которых членистоногие также являются промежуточными хозяевами; третья группа вирусов это собственно вирусы насекомых или энтомопатогенные вирусы.
Как уже отмечалось, целый ряд фитопатогенных вирусов включает в цепь своей циркуляции насекомых-переносчиков. В основном это разнообразные виды тлей и цикадовых. При этом, фитовирусы, в зависимости от вируса и особенностей биологии насекомого, могут бессимптомно персистировать в его организме или вызывать патологический процесс. Взаимоотношения вируса растений с насекомым могут достигать такого уровня, что вирус растения перестает нуждаться в растении для своего размножения и передачи и может полностью воспроизводиться в организме насекомого, передаваясь вертикально. Такой уровень взаимоотношений установлен для вируса карликовости риса, вируса деформации листьев клевера.
Вирусы растений могут различными путями интерферировать в теле своих насекомых-переносчиков. Так, заражение цикадок одним из штаммов вируса желтухи астр препятствует заражению другим штаммом этого вируса (двусторонняя интерференция), а инфицирование цикадки вирусом карликовости злаков защищает насекомое от повторного инфицирования этим же штаммом вируса (односторонняя интерференция).
Другой аспект взаимоотношений вирусов растений со своими хозяевами-насекомыми заключается в способности фитовирусов помогать насекомому менять круг растений, подходящих для питания. Смена может привести к внезапному появлению «новых» насекомых на тех культурах, которые ранее не подвергались нападению таких вредителей. Открытие «полезного» влияния вируса на своего хозяина-переносчика было сделано при изучении взаимоотношений цикадок с вирусом желтухи астр.
Арбовирусы приобретаются членистоногими в процессе питания (кровососания) на хозяевах, содержащих возбудитель во внутренних средах организма. Эти вирусы могут реплицироваться в организме беспозвоночных и передаваться в ряду поколений трансспермально, трансовариально и в процессе метаморфоза. В цепи циркуляции арбовирусов участвуют иксодовые, аргасовые, гамазовые и краснотелковые клещи, комары, мокрецы, москиты, мухи-кровососки, клопы, блохи. Особенности взаимоотношений этих вирусов с организмом хозяев будут рассмотрены в разделе о природной очаговости вирусных инфекций.
В цепь циркуляции вирусов, возбудителей природно-очаговых заболеваний животных и человека могут вовлекаться хищные насекомые. Так, трупоядные жуки и мясные мухи при питании на умерших от бешенства животных могут приобретать вирус бешенства. В свою очередь, лисы, поедая таких жуков, инфицируются вирусом и способны передавать его далее.

8.2. Характеристика семейств энтомопатогенных вирусов
В современной классификации энтомопатогенных вирусов выделено 12 семейств, включающих 22 рода. Один род не классифицирован и включает вирусы, подобные вирусу паралича сверчков, ранее входившие в состав семейства пикорнавирусов. Пять из 12 семейств образованы только вирусами насекомых (Asco-, Polydna-, Baculo-, Noda- и Tetraviridae). В состав пяти семейств входят также вирусы позвоночных. В состав еще двух семейств, кроме вирусов насекомых, входят вирусы грибов. Краткая характеристика семейств вирусов насекомых представлена в таблице 6.
При рассмотрении таблицы следует обратить внимание, что среди вирусов насекомых обнаружены оболочечные (Pox-, Asco-, Baculo-, Rhabdoviridae) вирусы и вирусы, лишенные оболочки. Отсутствуют палочковидные и нитевидные безоболочечные формы вирионов. Изометрические вирионы могут быть округлыми или бациллоформными. Обнаружены бипартитные (Nodaviridae, Omegatetravirus) и мультипартитные вирусы (Polydnaviridae).
У энтомопатогенных вирусов представлены все виды геномов. Ретроидные вирусы, репликация которых включает стадию обратной транскрипции, представлены вирусами, геном которых содержит последовательности, гомологичные ретротранспозонам. Эти вирусы, обнаруженные у дрозофилы (вирусы копиа и гипси), выделены в самостоятельные семейства, включающие также вирусы сахаромицетов (Pseudoviridae, Metaviridae, соответственно).

Таблица 6

8.3. Взаимоотношения вирусов насекомых с хозяином
Вирусы насекомых распространяются в биосфере как естественным, так и искусственным путем при участии человека. Основная роль в распространении вирусов отводится миграциям самих хозяев-насекомых. Немаловажная роль принадлежит и насекомым-переносчикам энтомопатогенных вирусов (вирусофорам). Например, рабочие пчелы, матки и трутни являются хозяевами для клещей Acaripis. Клещи, питаясь на инфицированных пчелах, становятся вирусофорными. Пчелы могут залетать в чужие ульи и таким образом распространять инфицированных клешей между семьями пчел и пасеками. Таким путем распространяются вирусы Нодамура, Арканзас, вирусы хронического и острого паралича пчел. Энтомопатогенные полиэдрические вирусы могут распространяться хищными насекомыми и мясными мухами, которые питаются гусеницами, погибшими от инфекции. Искусственное распространение вирусов насекомых человеком происходит при организации мер контроля за численностью популяций насекомых-вредителей.
Вирусы насекомых распространяются двумя путями: горизонтальным (насекомое приобретает вирус, питаясь загрязненными субстратами) и вертикальным путем (от родителей потомству).
По спектру хозяев энтомопатогенные вирусы могут быть узкоспецифичными (см. таблицу 6) или иметь широкий круг хозяев. Наиболее широкораспространенным и наиболее вирулентным среди вирусов насекомых является вирус Нодамура (Nodaviridae), обладающий тропностью к мышечным и нервным клеткам. Попадая в организм насекомого, вирус может длительное время бессимптомно персистировать, а затем вызывать острую инфекцию, приводящую к летальному исходу.
Одной из отличительных черт вирусных инфекций насекомых является образование при репродукции вирусов внутриклеточных включений полиэдров и гранул, называемых тельцами включений. Ряд широкораспространенных вирусных заболеваний насекомых получил свое название от места локализации и формы телец включения. К таким заболеваниям относятся ядерный полиэдроз и гранулез, вызываемые бакуловирусами, цитоплазматический полиэдроз, вызываемый реовирусами, и денсонуклеоз, вызываемый энтомопарвовирусами. Эти вирусы имеют большое экономическое значение, так как наносят вред полезным насекомым пчелам, тутовому и сибирскому шелкопряду. Другой аспект экономического значения вирусов насекомых заключается в том, что они используются для борьбы с вредными насекомыми.
Взаимоотношения вирусов насекомых с хозяином не всегда носят характер паразитизма. Описаны случаи симбиотических взаимоотношений. В качестве примеров двух крайних проявлений взаимодействия вирусов насекомых со своими хозяевами рассмотрим два семейства вирусов.

Полиднавирусы (Polidnaviridae)
Семейство включает своеобразную группу вирусов, поражающих насекомых-паразитов.
Вирионы цилиндрические или эллипсоидные нуклеокапсиды вариабельных размеров. Геном сегментированная кольцевая суперскрученная днДНК, интегрирует в хромосомы яйцеклеток и клеток спермы и передается согласно законам менделевского расщепления. В настоящее время установлено, что все особи наездников инфицированы полиднавирусами и являются их бессимптомными вирусоносителями. Вирусы реплицируются в эпителиальных клетках яйцеводов насекомого и обнаруживаются в секретах калекса в большом количестве. В процессе паразитоидного развития насекомого после впрыскивания наездником яиц в тело хозяина (личинка другого насекомого) вирус проникает в его ткани, где реплицируется. Инфицирование полиднавирусами клеток хозяина наездника приводит к физиологическим изменениям в организме последнего. Эти изменения включают ингибирование роста личинок и ингибирование фенолоксидазной активности, которая выполняет у насекомых функцию, связанную с иммунологическим надзором. Результатом ингибирования фенолоксидазной активности является угнетение иммунитета хозяина в ответ на внедрение в его тело яиц паразита. Установлено, что в отсутствие полиднавирусов яйца наездника быстро разрушаются под воздействием иммунного ответа личинки.
Другими словами, жизненный цикл полиднавирусов может быть представлен двумя основными этапами. Один из них, включающий вирусную трансмиссию и репликацию, опосредуется хромосомной ДНК хозяина, в которой вирус находится в состоянии провируса. Второй колонизация хозяина паразита, в организме которого вирусный геном транскрибируется и транслируется, но не реплицируется опосредуется замкнутой некапсулированной молекулой вирионной ДНК.
Наличие уникального симбиотического взаимодействия полиднавирусов с организмом собственного хозяина и индуцирование иммуносупресии в организме хозяина паразита определяют возможность паразитирования наездников на личинках других насекомых.
Выделено два рода полиднавирусов:
1. Ichnovirus вирусы, выделенные из организма наездников с яйцекладом (Ichneumonidae, развиваются в личинках ночной бабочки). Вирионы оболочечные нуклеокапсиды консервативной эллипсоидной формы размером 85x330 нм. Оболочка приобретается в процессе броска через ядерную мембрану. При почковании через плазматическую мембрану могут приобретать вторую оболочку. Геном представлен 20-40 молекулами кольцевых ДНК вариабельных размеров, в сумме составляющих более 300 т.п.н. Геном упакован в один вирион.
2. Bracovirus вирусы, выделенные из организма мелких наездников с коротким яйцекладом или без яйцеклада (Braconidae, развиваются в теле или личинке мелких насекомых, например, тлей). Вирионы нуклеокапсиды диаметром 40 нм и вариабельной длины 30-150 нм, которая определяется размером фрагмента ДНК. Имеют единичную или групповую оболочку, приобретаемую во время лизиса клеток. Геном, так же как и у ихновирусов, представлен 20-40 молекулами кольцевой суперскрученной днДНК различного размера. Однако эти молекулы упакованы в разные вирионы явление, которое называется мультипартитностью.

Бакуловирусы (Baculoviridae)
Семейство бакуловирусов (от греческого bacculum прут, палочка) включает структурно и генетически сложные вирусы, изолированные из личинок многих разновидностей насекомых. Бакуловирусы эволюционно и серологически не связаны ни с одним вирусом позвоночных.
Вирионы оболочечные палочковидные нуклеокапсиды размером 40-60x200-400 нм. Липопротеиновая оболочка может быть ядерного или цито плазматического происхождения и содержит только один гликопротеин вирусного происхождения (gp64). Нуклеокапсид представляет собой суперскрученную ДНК, ассоциированную как минимум с четырьмя белками. Наиболее тесно ДНК связана с низкомолекулярным щелочным белком pб.9, который определяет ее уплотнение. Основной капсидный белок p39 образует вокруг ДНК белковый цилиндр, другие белки распределены в капсиде диффузно. При инфицировании бакуловирусами, как и в случае энтомопоксвирусов и вирусов цитоплазматического полиэдроза насекомых (Reoviridae), в клетке образуется большое количество так называемых телец включения. Тельца включения представляют собой один вирион или пакет вирионов, окутанных толстой прозрачной матрицей, состоящей из белка гранулина или полиэдрина, в зависимости от вируса. Гранулин и полиэдрин сходны по своему строению, их аминокислотные последовательности гомологичны на 60%.
Геном вируса представлен кольцевой суперскрученной днДНК размером 100-180 т.п.н., кодирующей более 100 белковых продуктов. Отличительной особенностью генома бакуловирусов является наличие в ДНК ряда взаимозаменяющих элементов ретротранспозонов и множества неавтономных взаимозаменяющих элементов, что свидетельствует о наличии обмена генетической информацией между хозяйским и вирусным геномами. ДНК содержит энхансеры усилители раннего выражения ряда генов, обеспечивающие суперпродукцию гранулина или полиэдрина. В семействе выделено два рода вирусов, которые различаются морфологией телец включения, местом репликации вируса, хозяином, экологией.

1. Nucleopolyhedrovirus (NPVs) вирусы ядерного полиэдроза.
В клетке вирус образует большие многогранные тельца включений (1x15 мм), представляющие собой, как правило, пакет нуклеокапсидов, покрытых упорядоченным слоем белка полиэдрина, ассоциированного с минорными белками, определяющими инфекционность вируса. Такие структуры получили название полиэдры.
NPVs инфекционны для Lepidoptera, Diptera, Hymenoptera, Trichoptera и ряда видов ракообразных, в частности креветок. На разных этапах жизненного цикла вирусов ядерного полиэдроза происходит последовательная смена двух структурно различных вирусных фенотипов. На ранних стадиях инфекции формируется почкующийся непокрытый полиэдрином вирион. Он ответственен за системное распространение вируса в пределах организма насекомого. Полиэдры образуются на поздних стадиях инфекции и играют основную роль в распространении вируса в окружающей среде. Полиэдры попадают в организм насекомого при его питании. Под воздействием щелочных секретов пищеварительного тракта они распадаются. Первично вирус реплицируется в эпителиальных клетках кишечника. Образующееся потомство инфицирует клетки соединительной ткани, затем клетки крови и, в конечном счете, клетки жирового тела насекомого.
Вирус реплицируется в ядре клетки, которое увеличивается практически до размеров клетки и становится нашпигованным полиэдрами. Полиэдры освобождаются из клетки путем лизиса последней. Заболевание приводит насекомое к фатальному исходу в течение 4-20 дней. Личинки, как и взрослые насекомые, поражаются вирусом при питании на загрязненных растениях. После инфицирования личинки некоторое время еще продолжают кормиться, однако в конце инфекционного цикла становятся вялыми. Их эпидерма становится хрупкой. Личинки умирают в перевернутом положении.

2. Granulovirus (GVs) вирусы гранулеза.
Вирионы GVs, как правило, в единичном виде, упакованы в маленькие (0,15x0,5 мм) эллипсоидные тельца включений, образованные белком гранулином. Первичные стадии репликации вирусов происходят в ядре, однако ядро рано распадается и дальнейшая репродукция вируса происходит в смешанных ядерно-цитоплазматических компартментах клетки. Вирусы гранулеза, аналогично NPVs, формируют две морфологические формы вируса. Инфекционный цикл вирусов гранулеза более длителен, чем у вирусов ядерного полиэдроза личинки после инфицирования остаются живыми более 50 дней. GVs патогенны только для членов семейства Lepidoptera.
Бакуловирусы играют главную роль в регуляции численности насекомых в окружающей среде, определяя его циклический характер. Эпидемия бакуловирусной инфекции приводит популяцию насекомых к гибели. После разложения насекомых вирус механически распространяется ветром, птицами, насекомыми по обширным территориям, что приводит к возникновению новых эпидемий. Бакуловирусы имеют важное экономическое значение:
Поскольку химические инсектициды с широким спектром действия часто уничтожают полезных насекомых, бакуловирусы используются как альтернативное средство борьбы с насекомыми-вредителями. Так, GVs успешно применяют для борьбы с вредителями яблонь, груш, капусты. В тропических странах для борьбы с жуком-носорогом широкое применение нашел Oryctes-бакуловирус. Жуки-носороги наиболее широко распространенные вредители, наносящие огромный экономический ущерб кокосовому производству. Для того чтобы передать вирус неинфицированной популяции, проводят сбор взрослых жуков, заражают их через рот (жуки охотно поглощают сладкую инфекционную жидкость) и выпускают на природу. Инфицированные жуки приводят к гибели всю популяцию в течение трех недель.
Бакуловирусы сами являются важным фактором, наносящим ущерб сельскому хозяйству. NPVs может наносить большой вред шелковичному производству, инфицируя и вызывая смерть личинок тутового и сибирского шелкопряда. NPVs являются также главной проблемой промышленного производства креветок, которые быстро погибают после инфицирования.
На основе генома бакуловирусов созданы высокоэффективные векторные экспрессирующие системы. Как уже отмечалось, ДНК бакуловирусов имеет энхансеры, обеспечивающие суперпродукцию гранулина или полиэдрина. Встраивание чужеродных генов под контроль промотора полиэдрина или гранулина позволяет получать их суперэкспрессию в культуре клеток насекомых. Так, выраженный в бакуловирусной системе экспрессии поверхностный белок ВИЧ был первым белком, использовавшимся для создания вакцины против СПИДа.
ГЛАВА 9. ВИРУСЫ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ
9.1. Вирусы экологической группы
Вирусы экологической группы это возбудители природно-очаговых заболеваний.
Природный очаг это участок территории географического ландшафта, в пределах которого среди диких животных происходит передача возбудителя от донора к реципиенту. В природном очаге независимо от деятельности человека формируется популяция возбудителя вместе с поддерживающими ее существование популяциями позвоночных хозяев и популяциями переносчиков. Основными элементами природного очага являются возбудитель, животное-резервуар, переносчик, пространственное вместилище очага (ареал обитания), наличие благоприятных факторов для формирования очага.
Хозяин (от лат. host) организм, являющийся средой обитания паразита.
Резервуар возбудителя (от лат. reservare сохранять, сберегать) популяции диких животных, обеспечивающих самоподдержание популяции паразита. Очаги с несколькими типами резервуаров называют полигостальными.
Переносчик промежуточный хозяин возбудителя, осуществляющий его биологическую трансмиссию от донора к реципиенту. Переносчиками вирусов являются членистоногие. Природные очаги с разнообразными переносчиками называют поливекторными.
Вирусы циркулируют в природном очаге независимо от деятельности человека. Домашние животные и человек вовлекаются в эпизоотический и эпидемический процесс вторично. Человек, как правило, служит тупиком в цепи циркуляции природно-очаговых вирусов. Очаг зоонозной инфекции, сформировавшийся в связи с деятельностью человека, называют антропургическим.
9.1.1. Арбовирусы
АРБОВИРУСЫ экологическая группа вирусов, передаю путем биологической трансмиссии восприимчивым позвоночным кровососущими членистоногими переносчиками. По определению ВОЗ арбовирусы поддерживаются в природе:
а) путем биологической трансмиссии между позвоночными хозяевами с помощью кровососущих переносчиков;
б) путем трансовариальной или половой передачи между членистоногими.
Вирусы вызывают у позвоночных вирусемию, попадая в организм членистоногого размножаются в его тканях и переносятся новым особям позвоночных путем укуса членистоногими.
Важнейшими переносчиками или векторами арбовирусов являются комары (Culicidae: Aedes, Anopheles, Culex, Mansonia), москиты (Phlebotomus), клещи (Ixodidae, Argasidae), реже мокрецы (Ceratopogonidae: Culicoides). При этом следует отметить, что эти кровососущие членистоногие не являются механическими переносчиками вирусов, а являются их промежуточным или иногда основным хозяином, способствуя сохранению вируса как биологического вида.
В системе «вирус членистоногие» возможно длительное сохранение вирусной популяции. Вирус может передаваться двумя путями:
а) вертикально (трансспермально, трансовариально, трансстадийно);
б) горизонтально (путем алиментарного, то есть с пищей, заражения личинок с дальнейшей передачей вируса имаго).
Предполагается, что эволюционно арбовирусы возникли от симбионтов членистоногих, о чем свидетельствуют следующие факты:
отсутствие существенного вреда для членистоногих при заражении и персистентная инфекция на протяжении жизни имаго;
передача вируса трансстадийным и трансовариальным путем в ходе метаморфоза;
цикличность развития вируса в членистоногих с обязательной фазой размножения в стенке кишечника;
уникальная для вирусов позвоночных, но обычная для вирусов членистоногих способность к репродукции при относительно низкой температуре.
Если рассматривать систему «вирус членистоногие позвоночные», то их взаимоотношения в природном очаге определяются сложной совокупностью различных факторов.
Основными среди них являются:
характер контактов позвоночных с кровососущими членистоногими;
восприимчивость позвоночных к вирусам, в частности развитие вирусемии, достаточной для заражения кровососущих членистоногих;
степень плотности популяций;
направление сезонных миграций;
способность хозяев поддерживать персистентную инфекцию.
Основную роль в циркуляции большинства арбовирусов в природных очагах играют птицы, которые не только сохраняют возбудитель, выступая в качестве резервуара, но и переносят вирусы на огромные расстояния во время сезонных миграций. В эволюционном плане птицы один из древнейших резервуаров возбудителей вирусных болезней.
Арбовирусы обширная экологическая группа вирусов, включающая не менее 500 вирусов, входящих в 14 семейств. Число арбовирусов, способных вызывать заболевания у человека, приближается к 100.
Примеры арбовирусов Семейство

Род

Вирус

Переносчик


Bunyaviridae

Bunyavirus

Тягиня, Инкоо, ЗБ, Буньямвера

Комары




Phlebovirus

Москитной неапольской лихорадки, Уукуниемии

Москиты, комары, клещи




Nairovirus

Конго-Крымской геморрагической лихорадки

Иксодовые клещи


Flaviviridae

Flavivirus

Лихорадки Западного Нила, Клещевого энцефалита

Комары, клещи


Togaviridae

Alphavirus

Карельской геморрагической лихорадки

Комары


Reoviridae

Orbivirus

Синего языка овец, Кемерово

Клещи


Rhabdoviridae

Vesiculovirus

Везикулярного стоматита

Комары


Picornaviridae

Cardiovirus

Сихотэ-Алинь, Сыр-Дарья

Клещи


В таблице 7 приведены примеры некоторых арбовирусов, циркулирующих на территории России. В большинстве случаев человек является тупиком в цепи циркуляции вируса, хотя существует и ряд исключений. Так, больной желтой лихорадкой, или лихорадкой денге практически является единственным источником инфекции. Таким образом, воспроизводство арбовирусов может осуществляться как в классическом зоонозном цикле, так и в антропонозном.
Наибольшее число арбовирусов, поражающих человека, сосредоточено в семействах Bunyaviridae, Togaviridae и Flaviviridae. Однако следует отметить, что не все представители данных семейств являются арбовирусами. В семействе Togaviridae арбовирусами являются только вирусы рода Alphavirus, но не Rubivirus (вирус краснухи). В семействе Flaviviridae арбовирусами являются представители рода Flavivirus, но не Pestivirus и Hepacivirus.

Буньявирусы (Bunyaviridae)
Семейство включает один род вирусов растений (Tospovirus) и четыре рода вирусов человека и животных (Bunyavirus, Phlebovirus, Nairovirus и Hepacivirus), представители которых являются возбудителями природно-очаговых заболеваний.
Вирионы сферические, в форме пончика, диаметр 90-120 нм. Имеют липопротеиновую оболочку с плохо различимыми пепломерами, не имеют матриксного белка. Вирус реплицируется в цитоплазме, созревает в аппарате Гольджи. Внутренний компонент представлен тремя (L, S, M) рыхлыми нековалентно замкнутыми спиральными рибонуклеопротеинами. Каждый РНП состоит из одной цепи РНК негативной полярности, связанной с множеством копий белка нуклеокапсида (N) и несколькими молекулами белка L, являющегося компонентом транскриптазы. L-сегмент кодирует белок L. M-сегмент кодирует поверхностные гликопротеины G1, G2 (факторы заражения и вирулентности) и неструктурный белок NSm. S сегмент кодирует в двух перекрывающихся рамках считывания белки N и NSs. Все сегменты вирусной РНК имеют общую консенсусную последовательность на 3'-конце, которая представляет собой 10 нуклеотидов, общих для сегментов вирусов одного рода, но отличающуюся для представителей разных родов. На 5'-конце имеется комплементарная ей последовательность нуклеотидов. Образование водородных связей между 3'- и 5'-концами РНК формирует кольцевую конфигурацию РНП.
Транскрипция и репликация генома идет в составе РНП. При транскрипции в качестве затравки для транскриптазы вирус использует кэп-фрагменты хозяйских мРНК. У представителей рода буньявирусов для каждого сегмента геномной РНК обнаружена только одна субгеномная мРНК. У флебовирусов, также входящих в семейство Bunyaviridae, при репликации/транскрипции S-сегмента образуются 2 субгеномные мРНК. Одна из них имеет ту же полярность, что и 5'-конец геномной РНК, а другая комплементарна 3'-концу геномной РНК, то есть у флебовирусов S-сегмент обладает амбисенс стратегией кодирования. Транскрипция/репликация представителей семейства осуществляется по следующей схеме:

Переключение транскрипции на репликацию, по всей вероятности, определяется доступностью новосинтезированного нуклеокапсидного белка N.
Род Bunyavirus включает не менее 150 вирусов, объединенных в 17 серогрупп. На территории Российской Федерации эпидемиологическое значение имеют вирусы серогруппы Калифорния (СК), циркулирующие в самых различных ландшафтных зонах Русской равнины.
Серогруппа Калифорния включает вирусы Тягиня (Тяг), Инкоо (Инк), зайца-беляка (ЗБ). Переносчиками вирусов являются комары разных родов, однако абсолютно доминирующее число штаммов вирусов СК изолировано из Aedes. Вирусы выделяют зимой и весной из яиц, личинок и нимф комаров, то есть вирус зимует in ovo. Максимально активная циркуляция вирусов СК отмечена в зоне южной тайги, где АТ к вирусу Инк у людей определяются повсеместно. У жителей степей и лесостепей антитела к вирусам Инк и Тяг встречаются с одинаковой частотой. В зоне полупустынь АТ к вирусу Тяг выявляются в 2 раза чаще, чем к вирусу Инк. Серологические исследования подтверждаются анализом заболеваемости. Так, в зоне смешанных лесов 50,4% заболеваний вызываются вирусом Инк, в зоне полупустынь вирусом Тяг (76,5%). К востоку от реки Енисей во всех ландшафтных зонах изолированы только штаммы вируса ЗБ.
В клинической картине заболевания, вызванного вирусами СК, выделены три формы:
гриппоподобная, без поражения ЦНС, вызывается преимущественно вирусом Тяг;
нейроинфекционная (серозный менингит, менингоэнцефалит, острый энцефаломиелит), вызывается преимущественно вирусом Инк;
с преимущественным поражением бронхолегочной системы, вызывается преимущественно вирусом Тяг.
Заболевания имеют сезонность начинают регистрироваться в середине мая, достигая максимума в июле-августе. В сентябре наблюдаются только отдельные случаи заболеваний.
Род Phlebovirus включает не менее 37 вирусов, объединенных в 8 серогрупп. Недавно в состав рода введена серогруппа вируса Уукуниемии, включающая 8 вирусов.
Вирусы москитных (флеботомных) лихорадок передаются москитами рода Phlebotomus. Возможна передача комарами. К флебовирусам относятся вирус неаполитанской москитной лихорадки и вирус сицилийской москитной лихорадки. Экологически вирусы связаны с птицами и песчанками, которые служат прокормителями москитов. Домашние животные и человек вовлекаются в эпизоотический процесс вторично. Однако в южных курортных зонах в связи со скученностью населения и наличием москитов заболевание может передаваться непосредственно от человека к человеку, минуя промежуточного хозяина. Заболевание характеризуется высокой температурой, болевым синдромом, особенно в глазных яблоках и глазницах, конъюнктивитом, тошнотой, болями в животе.
Инфекция распространена в Европе, Азии, Африке и Америке в пределах обитания переносчика. Ранее флеботомная лихорадка была распространена в курортной зоне Крыма и Кавказского побережья Черного моря, но в настоящее время отсутствует в связи с искоренением москитов.
Вирус лихорадки долины Рифт передается москитами, комарами, слепнями, вызывает энзоотический гепатит. Вирус циркулирует на территории африканского и американского континентов, где имеет большое эпидемиологическое значение. Болеют в основном овцы, но может болеть и человек. В отдельных случаях заболевание имеет летальный исход.
Вирус Уукуниемии (Уукувирус) первоначально выделен из напитавшихся кровью иксодовых клешей, собранных на коровах в юго-восточной Финляндии. Клеши являются основным переносчиком вируса. Вторичным переносчиком могут быть комары. Экологически вирус связан с птицами. У человека Уукувирус вызывает лихорадку. Ареал природных очагов Финляндия, другие страны Скандинавии, восточная Европа, северные районы России. Родственные вирусы выделены в различных районах мира.
Род Nairovirus включает не менее 27 вирусов, образующих 6 серологических групп. Вирусы выделены в Европе, Африке, Азии. Передаются иксодовыми клещами, вторично могут вовлекаться комары, в тропиках вирусы адаптированы, в основном, к аргасовым клещам. Резервуаром вирусов являются мелкие и средние грызуны. Ряд вирусов, на стыках умеренного и субарктического климатических поясов, могут быть экологически связаны с птицами. Вирусы поражают домашних животных и человека.
На юге нашей страны циркулирует вирус Конго-Крымской геморрагической лихорадки (КГЛ). Очаги КГЛ обнаружены в Астраханской и Волгоградской области, на территории степной зоны Украины, в Средней Азии и Болгарии. Болезнь характеризуется высокой температурой с геморрагическим синдромом, кровавой рвотой, кровоизлияниями во внутренние органы и сопровождается высокой летальностью.

Тогавирусы (Togaviridae)
В семействе выделено два рода;
1. Alphavirus включает арбовирусы.
2. Rubivirus включает один вирус краснухи, который не является арбовирусом.
Вирионы сферические, диаметром 70-80 нм, имеют липопротеиновую оболочку, на поверхности которой расположены 80 тримерных шипов. Структурная единица тримера (мономер) образована гликопротеиновым гетеродимером Е1-Е2. Внутренний компонент представлен нуклеокапсидом икосаэдрической симметрии (Т = 4). Капсид образован 240 копиями белка C, который своим карбоксильным концом взаимодействует с гидрофобным доменом оболочечного гликопротеина E2, а консервативным N-концом взаимодействует с РНК.
Предполагается, что вирус проникает в клетку путем рецепторного эндоцитоза, используя Fc-рецептор. Для того, чтобы это произошло, вирус должен связаться с каким-либо антителом, не обладающим нейтрализующими свойствами. Установлено, что поверхностный гликопротеин E2 является основным нейтрализующим антигеном, а E1 гемагглютинином. Антитела к Е1-белку блокируют гемагглютинацию, но не нейтрализуют вирус. Именно при таком связывании антител, благодаря отсутствию нейтрализации, и происходит взаимодействие вируса с Pc-рецептором. Вирусный нуклеокапсид проникает в цитоплазму путем слияния мембраны эндосомы с белком E1, фузионная активность которого зависит от pH среды. Механизм выхода геномной РНК из капсида неизвестен.
Геном линейная кэпированная и полиаденилированная (+)РНК размером 11,7 т.н. Поступившая в цитоплазму РНК в первую очередь является матрицей для синтеза NS-полипротеина, который аутокаталитически расщепляется на неструктурные белки. В результате образуются NS1-метилтрансфераза, обладающая кэпирующей активностью NS2-аутопротеаза, дополнительно имеющая хеликазную и нуклеотидазную активности, NS3 и NS4 полипептиды субъединицы РНК-полимеразы. После этого происходит синтез полной антигеномной (-)49S РНК, с которой транскрибируются (+)49S и субгеномная 26S РНК, которая транслируется в полипротеин структурных белков. Структурный полипротеин за счет аутокаталитической активности капсидного белка каскадно расщепляется с образованием протеина C (капсидный белок), протеина p62 (предшественник E2, состоящий из E2 и сигнального пептида E3), полипептида 6K, ассоциированного с мембраной, и поверхностного гликопротеина E1, обладающего фузионной и гемагглютинирующей активностями. Репликация вирусов происходит в цитоплазме, зрелые вирионы покидают клетку почкованием.
Род Alphavirus включает 21 вирус, которые распределенны на три серокомплекса:
1) комплекс вируса западного и восточного американского энцефаломиелита лошадей;
2) комплекс вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей;
3) комплекс вируса леса Семлики.
Резервуаром в природе могут быть дикие птицы (серокомплекс 1 лихорадка Синдбис, Карельская лихорадка), птицы и лошади (серокомплексы 1, 2 энцефаломиелит лошадей) и приматы (серокомплекс 3 лихорадка леса Семлики). В свою очередь, среди переносчиков альфавирусов существуют орнитофильные переносчики (Culiseta melanura) и энзоотические переносчики (Culex tarsalis, C. stigmatosoma, Aedes melanimon, A. dorsalis).
Альфавирусы распространены на всех континентах, В России эпидемиологическое значение имеют вирусы лихорадки Синдбис и Карельской лихорадки (серокомплекс 1). Эти вирусы вызывают лихорадки с более или менее выраженными поражениями внутренних органов, с проявлениями артралгии и миалгии, сопровождаются сыпью. Впервые Карельская лихорадка была зарегистрирована в Карелии в 1981 г. Позднее в Вологодской и Смоленской областях России.

Флавивирусы (Flaviviridae)
Флавивирусы были выделены в отдельное семейство из состава семейства тогавирусов в 1985 г. В семействе имеется три рода Flavivirus, Pestivirus, Hepacivirus и группа неклассифицированных вирусов. Возбудителями арбовирусных инфекций являются представители рода флавивирусов.
Вирионы сферические, диаметром около 45-50 нм. Обладают липопротеиновой оболочкой, на поверхности которой находятся выступы, образованные гликопротеином E (прикрепительный белок, белок слияния, гемагглютинин, основной нейтрализующий антиген). Оболочечный белок E связан с оболочечным гликопротеином M. Внутренний компонент вириона образован капсидным белком C, который обладает РНК-связывающей активностью, и в процессе сборки вириона вместе с геномной РНК упаковывается в нуклеокапсид, имеющий икосаэдрический тип симметрии.
Геном линейная (+)РНК размером 11-12 т.н.. В клетке функционирует как мРНК. 5'-конец РНК кэпирован и вовлечен в образование 5'-терминирующей вторичной структуры, которая вместе с кэп-структурой выполняет функцию связывания рибосомы. 3'-конец не полиаденилирован. Терминирующая последовательность высоко консервативна среди флавивирусов и образует стабильную вторичную структуру в виде петли. Предполагается, что петля играет важную роль в репликации и инкапсулирован и и вирусной РНК. Геном организован таким образом, что на 5'-конце сосредоточены гены структурных белков, которые занимают одну треть генома. Остальные три четверти занимают гены NS-белков.
Репликация/транскрипция генома флавивирусов связана не с мембранами ЭПР, а с мембраной ядра и идет без образования субгеномных мРНК. В инфицированных клетках обнаруживается только 45S мРНК вируса, которая транслируется в полипротеин. В процессе пострансляционного расщепления полипротеина-предшественника образуются индивидуальные белки, причем выщепление некоторых белков происходит еще до конца трансляции. Созревание вируса идет путем почкования через мембраны ЭПР.
Род Flavivirus включает 74 вируса. Внутри рода различают 8 антигенных комплексов и несколько несгруппированых вирусов. Наиболее изученными являются вирусы 4-х серокомплексов:
1) комплекс японского энцефалита;
2) комплекс клещевого энцефалита;
3) комплекс желтой лихорадки;
4) комплекс лихорадки денге.
1. Серокомплекс японского энцефалита
Вирус японского энцефалита впервые выделен из мозга умершего человека в 1924 г. японским исследователем Хаяши. Это одно из самых тяжелых заболеваний, сопровождающихся летальностью в 20-80% случаев. Японский энцефалит клинически проявляется в разных формах от бессимптомной инфекции до тяжелейшего менингоэнцефалита. В СССР вирус обнаружен в 1938 г. Шубладзе, Смородинцевым и Неустроевым на Дальнем Востоке. В природе резервуаром вируса являются членистоногие, различные виды птиц, летучие мыши, крупный рогатый скот, свиньи, лошади. Человек является тупиком в цепи циркуляции вируса. Переносчики вируса представители родов Culicinae. Заболевание характеризуется выраженной летне-осенней сезонностью.
Вирус лихорадки западного Нила (ЛЗН). Прототипный штамм вируса ЛЗН B956 впервые выделен в 1937 г. от лихорадящей женщины в провинции Западный Нил в Уганде. Затем вирус был выделен от больных людей в Африке, Индии, Европе.
В большинстве случаев заражение ЛЗН протекает бессимптомно и сопровождается образованием антител. В клинически выраженных случаях наблюдается лихорадка 3840°C и генерализованная лимфоаденопатия. Заболевание сопровождается миалгией, артралгией, головной болью, тошнотой, рвотой, в 50% случаев наблюдается сыпь. Летальность достигает 10%.
По современным представлениям вирус ЛЗН является самым широкораспространенным флавивирусом. Его ареал охватывает практически весь африканский континент, Юго-Западную и Южную Азию, Южную Европу, включая и некоторые ее центральные части. На территории бывшего СССР ареал ЛЗН охватывает Молдавию, Украину, Белоруссию, юг европейской части России, Среднюю Азию и Кавказ. Велик риск заражения в пустынных частях Поволжского региона, особенно вдоль долин крупных рек. Наличие стойких природных очагов ЛЗН показано в дельте Волги, где почти ежегодно регистрируются спорадические случаи заболевания.
Вирус ЛЗН был многократно изолирован от различных членистоногих в различных географических регионах. В передаче вируса ЛЗН позвоночным основное значение принадлежит орнитофильным комарам рода Culex. Вирус также легко адаптируется к различным клешам. В дельте Волги основное значение в циркуляции вируса в природных очагах имеет вид C. modestus, а в населенных пунктах C. pipiens, питающийся на диких, синантропных и домашних птицах и охотно нападающий на человека. Комары рода Culex перезимовывают в фазе имаго. Сохранение вируса в зимующих комарах является одним из механизмов сохранения вирусной популяции в межэпизоотическом периоде. Важное значение в сохранении вирусной популяции в неблагоприятные для нее засушливый и зимний периоды играют также аргасовые и иксодовые клещи.

2. Серокомплекс клещевого энцефалита
Вирус клещевого энцефалита открыт в 1937 г. Зильбером с соавторами. Человек является главным звеном в цепи циркуляции вируса. Основными переносчиками и резервуаром вируса на территории нашей страны являются два вида иксодовых клещей Ixodes persulcatus, I. ricinus. Для этих клещей характерен сложный жизненный цикл, в процессе которого происходит смена хозяев (имаго яйцо личинка нимфа имаго). Вирус сохраняется на всех фазах жизненного цикла клеща. Промежуточным хозяином являются дикие и домашние животные мелкого и среднего размера.
В России заболевания клещевым энцефалитом регистрируются от Дальнего Востока до западных границ лесной зоны. В соответствии с видом переносчика выделены два типа вируса восточный или персулькатный (переносчик I. persulcatus) и западный или рицинусный (переносчик I. ricinus). В Греции из клещей Rhipicephalus bursa изолирован третий тип вируса клещевого энцефалита.
После укуса инфицированного клеща или употребления в пищу сырого молока коз вирус проходит стадию распространения в организме гематогенным и лимфогенным путем и в конечном итоге попадает в ЦНС. Заболевание характеризуется полиморфизмом клинических проявлений. Лихорадочная и менингиальная формы как правило протекают благоприятно. При прочих проявлениях прогноз неблагоприятен (менингоэнцефалитическая, полиомиелитическая, полирадикулоневритическая формы). При этом следует отметить, что выраженность клинических симптомов заболевания зависит от типа вируса. При инфицировании восточным вирусом заболевание протекает более тяжело, чем при инфицировании вирусом западного типа.
Вирус Омской геморрагической лихорадки впервые выделен в 1947 г. Чумаковым. Заражение человека происходит после укуса инфицированными клещами рода Dermatocentor (D. pictus, D. marginals), при контакте с зараженными животными или употреблении сырой воды. Основным резервуаром вируса являются клещи, дополнительным .различные мелкие животные и птицы. Часто вирус выделяется от ондатр. Попадая в организм человека, вирус реплицируется в эндотелии капилляров кожи и различных органов. Заболевание проявляется лихорадкой и геморрагиями различной локализации. Летальность достигает 3%.

3. Серокомплекс желтой лихорадки
Вирус желтой лихорадки открыт Ридом в 1901 г. Эндемичные природные очаги расположены в Центральной и Западной Африке, Южной и Центральной Америке. Различают два варианта желтой лихорадки:
зоонозный джунглиевый (резервуар приматы, переносчик комары Haemagogus и Aedes)
антропонозный городской (резервуар человек, переносчик комары Aedes aegypty).
В организме человека вирус распространяется лимфогенно, поражает все органы и ткани, особенно эндотелий капилляров. Заболевание сопровождается печеночно-почечной недостаточностью. При тяжелых формах летальность достигает 85-90%. Циркулируя в крови человека, вирус во внешнюю среду не выделяется. Комар заражается, напившись крови инфицированного человека. В организме комара вирус размножается и накапливается в слюнных железах. Особенно продуктивно вирус реплицируется при высоких температурах окружающей среды (36-37°С). Вирус передаете я венерическим путем и трансовариально. В яйцах комаров вирус может сохраняться продолжительное время.

4. Серокомплекс лихорадки денге
Вирус лихорадки денге выделен и изучен в 1945 г. Сэбином. Природные очаги заболевания находятся в тропических и субтропических районах Африки, Азии, Америки, Австралии и Океании. Единственный резервуар вируса человек, переносчики комары Aedes aegypty, A. albopictus.
Существуют две клинические формы заболевания. Классическая и геморрагическая. Первая характеризуется лихорадкой, суставными и мышечными болями, лимфаденитом и лимфопенией, пятнисто-папулезной сыпью. Геморрагическая лихорадка, возникающая при повторном заражении вирусом другого серотипа, характеризуется более тяжелым течением, сопровождающимся геморрагическими проявлениями, инфекционно-токсическим шоком и высокой летальностью.
К арбовирусам тесно примыкает другая группа вирусов с природной очаговостью, циркулирующих среди позвоночных без участия кровососущих членистоногих. Природным резервуаром вирусов могут быть грызуны, хищники, обезьяны.

9.1.2. Родентвирусы
РОДЕНТВИРУСЫ (rodent-borne viruses) вирусы, экологически связанные с грызунами. ВОЗ дает этим вирусам следующее определение: «Родентвирусы поддерживаются в природе грызунами путем прямого внутривидового и межвидового контакта без участия членистоногих переносчиков. Вирусная инфекция протекает у основной части популяции грызунов хронически и перенос инфекции может осуществляться одним или несколькими способами, включающими прямой контакт, передачу через слюну или половые секреты, молоко, мочу, внутриутробную передачу. Иммунный ответ на инфицирование обычно подавлен, но нередко исходом бывает острая инфекция. Человеку вирус передается непрямым путем, обычно через мочу и слюну хронически инфицированных грызунов».

Аренавирусы (Arenaviridae)
Семейство включает 13 вирусов, поражающих млекопитающих и объединенных в один род Arenavirus (arena песок, песчаный).
Вирионы плейоморфные, 50-300 нм в диаметре. Состоят из сердцевины и липопротеиновой оболочки, содержащей нерегулярные и немногочисленные булавовидные гликопротеиновые шипы. Сердцевина содержит два слабоскрученных рибонуклеопротеина, одну или несколько клеточных рибосом и 3 фрагмента рибосомной РНК. Геном вируса два нековалентно замкнутых фрагмента (S и L) РНК негативной полярности, ассоциированных с основным белком нуклеокапсида и РНК-зависимой РНК-полимеразой. S-сегмент амбиполярен. Часто вирусные частицы имеют более одного S-сегмента. Репликация/транскрипция протекает в цитоплазме. Вирус почкуется через цитоплазматическую мембрану, захватывая рибосомы.
Вирусы имеют ограниченный круг хозяев, поражают диких и синантропных грызунов (Cricetidae и Muridae), вызывая у них персистентную инфекцию. Ряд вирусов патогенен для человека. Вызывает тяжелые, иногда летальные лихорадки с геморрагическим синдромом. Люди заражаются через пищу, воду и воздух, загрязненные выделениями грызунов.
Патогенными для человека аренавирусами являются вирусы антигенной группы Такарибе: вирус асептического лимфоцитарного хориоменингита (ЛХМ), вирусы Ласса и Мачупо (боливийская геморрагическая лихорадка), вирус Хуини (аргентинская геморрагическая лихорадка), вирус Гуапарито (венесуэльская геморрагическая лихорадка).

Хантавирусы (Bunyaviridae)
Род Hantavirus. В результате исследований, проведенных академиком Смородинцевым с сотрудниками на Дальнем Востоке в 1935-40 гг. впервые было описано острое вирусное природно-очаговое заболевание, сопровождающееся поражением почек. Заболевание было названо «геморрагический нефрозо-нефрит». В это же время подобное заболевание было описано японскими и шведскими исследователями, изучавшими его в Маньчжурии. Первый вирус, этиологически связанный с этими заболеваниями, был описан только в 1978 г. (вирус Корейской геморрагической лихорадки вирус Хантаан). Установлена его этиологическая связь со вспышкой заболевания, произошедшей в 1951 г. среди 3000 корейских солдат. Тогда смертность от инфекции составила 15%.
Hantavirus, как отдельный род в семействе буньявирусов, был выделен в 1987 г. Вирус Хантаан и его серологические родственники морфологически и по молекулярной организации подобны другим представителям семейства. Однако они характеризуются отсутствием серологических связей с другими членами семейства, наличием уникальных 3'-концевых последовательностей в трех долях генома и собственной стратегией кодирования.
В настоящее время охарактеризованы 6 хантавирусов. Наиболее изученными являются вирусы Хантаан, Сеул и Пуумала. Заболевания, вызываемые этими вирусами, называли геморрагический нефрозо-нефрит, Корейская геморрагическая лихорадка, эпидемическая геморрагическая лихорадка, эпидемическая нефропатия. В 1983 г. для этих заболеваний ВОЗ приняла единое название геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС). Это название было предложено еще в 1954 г. нашим соотечественником, академиком Чумаковым.
Клинические проявления инфекции хорошо охарактеризованы. Выделены 5 стадий инфекции:
1) Инкубационный период. Составляет 1-2 недели, реже 4 недели.
2) Лихорадочная стадия. Характеризуется токсико-аллергическими проявлениями острым началом с внезапной лихорадкой, миалгией, головной болью, болью в пояснице, орбитальной болью, генерализованной сыпью на лице, шее, груди, сгибах, мягком небе, конъюнктивах.
3) Олигоуретическая стадия. Длится 3-7 дней, сопровождается острой почечной недостаточностью, массивной протеинурией и появлением множественных капиллярных кровоизлияний. В первую очередь страдают почки: снижается количество выделяемой мочи, в крови повышается концентрация мочевины. Приблизительно треть смертных случаев связана с обострением на этой стадии болезни.
4) Полиуретическая стадия. Длится несколько дней, сопровождается ежедневным выделением мочи в количестве 3-6 литров, что приводит к обезвоживанию и нарушению электролитного баланса в организме.
5) Стадия выздоровления. Продолжается 2-3 месяца.
Разделяют серьезные и умеренные формы ГЛПС. Серьезные формы ГЛПС, вызываемые вирусом Хантаан, распространены в сельских районах Кореи, Китая, восточной части России. Умеренные формы связанны с вирусом Сеул и широко распространены в Азии и Европе. Антитела к этому вирусу обнаружены у крыс и людей на Североамериканском континенте, однако заболеваний не зарегистрировано. Наиболее умеренная форма ГЛПС, вызываемая вирусом Пуумала, распространена повсеместно, в том числе и на территории нашей страны.
Резервуаром вируса являются грызуны. Каждый хантавирус инфицирует определенного грызуна: вирус Хантаан мышевидных грызунов (Apodemus), Пуумала полевок (Clethrionomys), Сеул крыс (Rattus). Это ограничивает возможность пересортировки генов и генетического смешения, следствием чего является высокая степень геномного сохранения.
Различают три основные эпидемиологические формы ГЛПС сельский тип (связан с вирусами Хантаан и Пуумала), городской тип (связан с вирусом Сеул) и лабораторный тип (связан с инфицированием лабораторных животных-грызунов).
Заражение людей является результатом прямого контакта с инфицированными экскретами грызунов при употреблении загрязненных продуктов питания. Кроме того, заражение может произойти аэрогенно при лесных, сельскохозяйственных и садово-огородных работах.

9.1.3. Лиссавирусы
ЛИССАВИРУСЫ экологическая группа вирусов, природным резервуаром которых являются хищные животные. Относятся к семейству Rhabdoviridae, род Lyssavirus (lyssa водобоязнь, гидрофобия).
Вирионы рабдовирусов животных имеют пулевидную форму (50-95x130-400 н.м.), окружены липидной оболочкой с выступающими шипами размером 5-10 н.м. Изнутри липидная оболочка выстлана матриксным белком M. Внутренний компонент представлен РНП диаметром 50 нм со спиральным типом симметрии. Геном рабдовирусов представлен одной нитью РНК негативной полярности размером ~ 10-13 т.н., кодирующей последовательности 5-ти белков. Репликация/транскрипция протекает в цитоплазме в составе РНП. Каждый ген транскрибируется отдельно. Вирусы созревают путем почкования через цитоплазматическую мембрану. В процессе репликативного цикла вирус формирует делеционные мутанты ДИ-частицы, требующие для репликации наличия нормального вируса.
Семейство объединяет наиболее обширную как по количеству представителей, так и по спектру хозяев группу вирусов, поражающих млекопитающих, рыб, насекомых и растения. В семействе выделено 5 родов
2 рода вирусов растений и 3 рода вирусов позвоночных и беспозвоночных.
Род Lyssavirus включает вирус бешенства и бешенствоподобные вирусы (Мокола, Дувенхаге патогенны для человека и животных; Лагос вирус летучих мышей, Котонкан, Обохийанг патогенны для животных). Типичный представитель рода вирус водобоязни или вирус бешенства полипатогенный нейротропный вирус. Передается при укусе. Вызывает зооантропонозное смертельное заболевание. Ряд вирусов рода сохранил способность к передаче насекомыми.
Основным представителем рода является вирус бешенства или вирус гидрофобии, экология которого имеет свои особенности.
Бешенство является типичной зооантропонозной инфекцией. Вирус может циркулировать в природных очагах (эпизоотия природного типа; лесное или дикое бешенство), где он существует за счет диких животных. В этом случае резервуаром инфекции являются волки, лисы, песцы и другие виды плотоядных. В странах Американского континента основным природным резервуаром вируса бешенства являются летучие мыши-вампиры Desmodus rotundus. Бешенство вампиров до настоящего времени является главной причиной смерти сотен тысяч голов крупного рогатого скота. У плотоядных животных при заражении вирусом наблюдается летальный исход, в то время как у летучих мышей вирус размножается бессимптомно, локализуясь только в слюнных железах.
Вирус бешенства может сохраняться в антропургических очагах (эпизоотия городского типа). В этом случае в цепь циркуляции вируса вовлекаются уличные и домашние собаки, кошки, крупный и мелкий рогатый скот, лошади. Именно при характеристике возбудителя бешенства, циркулировавшего в антропургическом очаге, был применен термин «вирус уличного бешенства». До середины XX в. неблагополучная ситуация по бешенству определялась, в основном, существованием очагов «уличного» типа. Однако позднее в Европе начал формироваться крупный природный очаг рабической инфекции, поддерживаемый дикими плотоядными животными. В России, в результате ежегодно проводимой вакцинации животных против бешенства, собаки перестали быть естественным резервуаром рабической инфекции. Их место заняли дикие хищники, в частности красная лисица. Эти животные в поисках пищи приближаются к населенным пунктам, посещают зеленые зоны, поля, огороды, свалки, где входят в контакт с бездомными собаками, сельскохозяйственными животными и человеком. Миграция диких животных и увеличение популяции бездомных собак способствуют возникновению не только новых природных очагов рабической инфекции, но и возрастанию роли в эпизоотическом процессе домашних и особенно сельскохозяйственных животных. В связи с этим, для профилактики бешенства в отдельных регионах России начали применять антирабическую вакцину для оральной иммунизации диких животных с использованием приманок.
Бешенство острое инфекционное заболевание ЦНС. Для животных оно всегда заканчивается смертью. Человек относительно устойчив к вирусу гидрофобии. После укуса больным животным заболевает примерно 15% людей. Однако, если не принимать экстренные меры, то смертность достигает 90-95%. Инфицирование вирусом бешенства, как правило, происходит при укусе больным животным или при попадании слюны на поврежденную кожу или слизистую оболочку. При нахождении рядом с больным возможна реализация аспирационного механизма передачи.
Первичное размножение вируса происходит в мышечной и соединительной ткани вблизи входных ворот инфекции. Затем возбудитель внедряется в рецепторы периферийных чувствительных нейронов и продвигается в базальные ганглии и ЦНС, где размножается в сером веществе. После этого вирус опять по периферийным нервам центробежно распространяется в различные органы и ткани, включая легкие, почки, кожу, слюнные железы. У бешеных животных подчелюстные слюнные железы содержат более 100 инфекционных доз в мл. Патоморфологически инфекция в основном проявляется дегенеративными поражениями нейронов, в клетках которых при электронномикроскопических исследованиях наблюдаются эозинофильные тельца включений, известные как тельца Бабеша-Негри.
Инкубационный период заболевания варьирует от недели до года. Имеется опасный предклинический период, во время которого происходит экскреция вируса и наблюдается изменение поведенческих реакций. Животные и человек становятся агрессивными, легко возбуждаются. Передача вируса в этот период заболевания животного увеличивает риск развития инфекции у человека. Заболевание сопровождается нарушением тонуса мышц, что приводит к затруднению глотания сначала жидкостей, а затем и твердой пищи. Позднее развиваются генерализованные судороги и кома.
Лиссавирусы, кроме типового вируса бешенства, включают ряд бешенствоподобных вирусов. Патогенными для животных и человека являются: вирус Лагос (изолирован от фруктоядных летучих мышей в Нигерии, от кошек, собак, человека); вирус Мокола (изолирован от землеройки в Нигерии и Камеруне, кошек, собак, умершего человека). В лабораторных условиях воспроизведено инфицирование Aedes albopictus вирусом Мокола, который передавался трансовариально. К вирусу бешенства наиболее близок вирус Дувенхаге, а вирус Мокола сильно отличается от других представителей рода. Вакцина против бешенства не защищает от инфекции вирусами данной группы.

9.1.4. Филовирусы
В семейство Filoviridae входят Марбург-подобные и Эбола-подобные вирусы млекопитающих, которые не имеют антигенного родства ни с какими другими вирусами. Вирусы Марбург и Эбола вызывают у человека заболевания, протекающие по типу системных геморрагических лихорадок с высокой летальностью, которые относятся к категории особо опасных инфекций.
Вирионы плейоморфные, 80 нм в диаметре и различной длины (до 1400 нм) нитевидные образования прямой (Эбола) или извитой (Марбург) формы. Состоят из жесткого спирального нуклеокапсида диаметром 50 нм, покрытого липопротеиновой оболочкой, которая содержит поверхностные шипы, образованные монотримером гликопротеина.
Геном линейная, несегментированная (-)РНК размером до 19 т.н. Кодирует 7 структурных белков. NS-белки не идентифицированы. Репликация/транскрипция протекает в цитоплазме, вирус почкуется через цитоплазматическую мембрану.
Вирус Марбург впервые был обнаружен в 1967 г. во время вспышек геморрагической лихорадки в Германии (Марбург) и Югославии (Белград) среди людей, контактировавших с зелеными мартышками Cercopithecus aethiops, импортированными из Уганды. Связь вспышки заболевания с мартышками подтверждена выделением вируса из крови и тканей обезьян. Летальность при марбургской лихорадке достигает 30-50%. Заболевание эндемично для стран Восточной и Южной Африки.
Вирус Эбола впервые выделен в 1976 г. в Судане и Заире во время вспышки тяжелейшей геморрагической лихорадки, унесшей жизни 350 человек. Летальность при лихорадке Эбола достигает 90%. Природные очаги вируса не установлены. Предполагается, что резервуаром могут быть дикие грызуны или летучие мыши.
Вирусы Марбург и Эбола различаются по антигенным свойствам. У вируса Эбола выделено два серологических субтипа вируса суданский и заирский. Вирус Эбола серологически связан с другим филовирусом, выделенным от обезьян Macaca fascieularis на Филиппинах и названным вирусом Рестон. Вирус Рестон не патогенен для людей.

9.2. Онкогенные вирусы

9.2.1. История онковирусологии
Онковирусология наука об онкогенных вирусах. Гипотеза о вирусном происхождении злокачественных опухолей была впервые высказана в 1907 г. Боррелем, а в 1911 г. Раус представил доказательства существования вирусов, вызывающих опухоли. Важная роль в развитии онковирусологии принадлежит нашему соотечественнику, выдающемуся ученому Л.А. Зильберу, сформулировшему вирусогенетическую теорию рака. Согласно этой теории, злокачественные новообразования развиваются вследствие влияния на клетки онкогенных вирусов, геномы которых полностью или частично интегрируют в геном клетки хозяина. Вирус наследственно изменяет нормальную клетку в опухолевую. Интегрированные провирусы находятся в латентном состоянии и активируются под действием канцерогенных факторов химической и физической природы.
Вирусогенетическая теория происхождения рака весьма отличалась от классической вирусологической теории происхождения рака, высказанной Боррелем. Согласно теории Борреля, вирус, вызывающий рак, является инфекционным агентом. По Зильберу все происходит иначе вирусы наследственно превращают нормальную клетку в опухолевую и не играют никакой роли в дальнейшем развитии неопластического процесса.
Прогресс онковирусологии напрямую связан с работами Нобелевских лауреатов 1975 г. в области медицины Дульбекко, Темина и Балтимора, внесших существенный вклад в понимание механизмов интеграционных взаимодействий онкогенных вирусов с клеткой.
Онкогенными (опухолеродными) являются вирусы, способные трансформировать клетки в культуре, индуцировать образование опухолей у лабораторных животных и в ряде случаев вызывать злокачественное перерождение клеток in vivo, т. е. являться этиологическим агентом рака.
В общебиологическом смысле трансформация это внесение экзогенной ДНК в клетку. Чужеродная ДНК может интегрировать в ДНК хозяина, а может этого не делать. При характеристике опухолеродных вирусов под трансформацией понимают индуцирование состояния неконтролируемого роста клеток эукариот, которое имеет много общего или совпадает с опухолевым перерождением клеток. На практике трансформированной называют такую клетку, которая приобрела устойчивые ростовые свойства, не характерные для родительской клетки. Опухолеродные вирусы могут быть как ДНК-содержащим и, так и РНК-содержащими.

9.2.2. Опухолеродные РНК-содержащие вирусы
Опухолеродными РНК-содержащими вирусами являются представители пяти родов ретровирусов (Retroviridae) Alpharetrovirus (вирус миелобластоза птиц AMV, вирус саркомы Рауса RSV), Betatetravirus (вирус опухолей молочных желез мышей MMTV), Gammaretrovirus (вирус лейкемии мышей MuLV), Deltaretrovirus (вирус лейкоза крупного рогатого скота, вирус T-клеточного лейкоза человека BLV, HTLV), Epsilonretrovirus (вирус лейкомы роговицы WDSV).
Ретровирусы, как правило, не убивают клетку, а вызывают хроническую инфекцию, для достижения которой геном осуществляет стратегию сохранения ДНК-копии своего генома в геноме клетки хозяина в форме клеточных генов эндогенных провирусов. Это необычное свойство ретровирусов в случае интеграции в ДНК клеток зародышевой линии позволяет вирусу передаваться вертикально по закону Менделя. Ряд других ретровирусов (экзогенные ретровирусы) передаются от хозяина к хозяину горизонтально.
Вирионы имеют диаметр 80-130 нм. Представляют собой электроноплотный нуклеоид, окруженный одно- или двухслойной липидсодержашей оболочкой, имеющей гликопротеиновые поверхностные шипы. Нуклеоид это РНП, окруженный, в свою очередь, икосаэдрическим капсидом. Между оболочкой и капсидом расположен изометрический матриксный белок.
По морфологии выделяют четыре типа вирионов ретровирусов: A, B, C и D. Частицы типа A безоболочечные, обнаруживаются только внутри клеток, не инфекционны. Для частиц типа B характерно асиметричное расположение нуклеоида, формирование вириона в цитоплазме и приобретение оболочки в процессе почкования. У вирионов типа C формирование вириона происходит после почкования. Нуклеоид располагается в центре частицы. Частицы типа D также характеризуются центральным положением нуклеоида, однако формирование вириона происходит в цитоплазме.
Отличительной особенностью ретровирусов является наличие в составе вириона РНК-зависимой ДНК-полимеразы (ревертазы), осуществляющей синтез ДНК на матрице геномной РНК.
Геном ретровирусов диплоиден, представлен двумя идентичными плюс-нитями РНК размером 3,5-9 т.н. Геномные РНК представляют собой мРНК и имеют 5'-концевую кэп-структуру и 3'-поли-A последовательность. С 5'-концом каждой РНК связана, специфичная для каждого вируса, клеточная тРНК, которая играет роль затравки в синтезе ДНК-копии.
Репликация генома ретровирусов на первых стадиях протекает в цитоплазме, далее в ядре. Выделено три необычных свойства репликации:
наличие обратной транскрипции;
дупликация концевых последовательностей РНК с образованием длинных концевых повторов (LTR);
интеграция ДНК в геном клетки хозяина в строго определенной ориентации.
Для репликации ретровирусов необходимы три гена: gag кодирует белки сердцевины, pol кодирует обратную транскриптазу, env кодирует белки оболочки. Кроме этого, геном ряда ретровирусов содержит минигены, которые не участвуют в репликации и выполняют регуляторную функцию.
Кроме наличия в репликации стадии обратной транскрипции и существования некоторых вирусов в форме эндогенных провирусов, опухолеродные ретровирусы имеют еще одно необычное свойство.
Оно заключается в том, что эти вирусы содержат гены, очень близкие высококонсервативным клеточным генам и способные вызывать трансформацию клеток в культуре. Такие гены повышают онкогенный потенциал вируса, но не нужны ему для репликации. Это так называемые трасформирующие гены или онкогены. Их обозначают v-onc, а соответствующие клеточные гены c-onc. Таких генов в клетке много настоящее время они определены, их функции изучены. Онкогены обозначают тремя буквами, например myc, sis, myb. Вирусные онкогены это несколько видоизмененные клеточные онкогены, то есть ряд ретровирусов является переносчиком онкогенов клетки.

Схема 10.

По наличию или отсутствию онкогенов в геноме ретровирусы подразделяют на onc+ и onc-. Все onc+ ретровирусы способны к трансформации, но дефектны по репликации, для осуществления которой необходимо присутствие недефектного onc- ретровируса. Встраивание дефектных onc+ онкогенов в геном ретровируса приводит к его инактивации за счет делетирования части гена, участвующего в репликации. Присутствие в клетке, наряду с дефектным v-onc+, нормального v-onc-ретровируса вызывает острую трасформацию и гибель клеток, так как онкоген кодирует белок трасформации.
Дефектными v-onc+ ретровирусами являются вирус опухолей молочных желез мышей (MMTV), вирус лейкемии мышей (MuLV), вирус миелобластоза птиц (AMV). Исключением из правила дефектности является вирус саркомы Рауса, который сохранил способность и к трансформации клеток, и к репликации. Геном этого вируса на 1 т.н. длиннее генома других ретровирусов, так как вирус является рекомбинантом между дефектным вирусом и вирусом-помощником и содержит src-onc, встроенный в ген поверхностных белков вируса (ген gag).
Отсутствие гена onc у ретровирусов не является условием отсутствия опухолеродности. Существует группа HTLV-подобных лимфотропных ретровирусов, являющихся v-onc-, но вызывающих злокачественные перерождения клеток иммунной системы. Эта группа онкогенных ретровирусов включает вирусы T-клеточного лейкоза (лейкемии) человека HTLV-1, HTLV-2, вирус лейкемии быка (BLV) и вирус T-клеточной лейкемии обезьян (STLV). Эти вирусы вызывают острые инфекции, сопровождающиеся иммунодефицитом в связи со злокачественным перерождением CD4+ T-лимфоцитов (рак крови), приводящим к снижению количества нормальных T-хелперов. Вирусы передаются как горизонтально (половым путем, при гемотрансфузиях), так и вертикально (от матери плоду). Могут переноситься комарами.
Трансформирующие свойства вирусов T-клеточного лейкоза обусловлены особенностями, детерминированными геномом. Как и другие ретровирусы, HTLV-подобные вирусы имеют провирусный геном размером 9,032 т.п.н., содержащий на двух концах LTR и интегрированный в геном хозяина в случайном месте. Однако кроме трех основных OPC (гены gag, pol, env), прогеном имеет дополнительную рамку считывания pX, расположенную на 3'-конце нуклеотидной последовательности (схема 10). Эта область генома кодирует три неструктурных фосфопротеина p40tax, p27rex и p21x (трансформирующие факторы). Установлено, что p40tax является активатором транскрипции провируса, p27rex модулятором транспорта мРНК из ядра в цитоплазму. P40tax активизирует транскрипцию провирусных генов опосредованно через ДНК-связанные белки, расположенные на транскрипционном энхансере LTR. Однако этот вирусный фактор активизирует не только энхансер провируса, но и другие, структурно не связанные с LTR, энхансеры транскрипции клеточных генов. При этом активизируется транскрипция генов, функция которых связана с индукцией непрерывного роста клеток гены интерлейкина-2, рецептора интерлейкина-2 и ген c-Fos.

9.2.3. Опухолеродные ДНК-содержащие вирусы
К опухолеродным ДНК-содержащим вирусам относятся представители пяти семейств вирусов: полиомавирусы, папиломавирусы, аденовирусы, герпесвирусы, гепаднавирусы. Следует отметить, что не все вирусы этих семейств обладают онкогенным потенциалом. Кроме того, опухолеродные вирусы этих семейств, обладая трансформирующей способностью, не всегда способны вызывать рак (табл. 8).
Таблица 8
Свойства опухолеродных ДНК-содержащих вирусов
Семейство: Вирус

Способность трансформировать культуру клеток

Способность индуцировать опухоли у лабораторных животных

Способность вызывать рак


Полиомавирусы:
Ру мыши
SV40 обезьян
BKV человека
JCV человека

+
+
+
+

+
+
+
+






Папиломавирусы:
Животных
Птиц
Человека


+
+
+

+
+
+

+
+
Рак шейки матки


Аденовирусы:
Животных
Человека


+ (все)
+

+ (C-E)
+


+


Герпесвирусы:
Вирус простого герпеса
Цитомегаловирус
Вирус Эпштейна-Барр


+
+
+



+



Лимфома Бёркетта, рак носоглотки


Гепаднавирусы:
Грызунов, птиц
Крупного рогатого скота
Человека (HBV)












+


Гепатоцеллюлярная карцинома


Онкогенность ДНК-содержащих вирусов обусловлена наличием у них так называемых трансформирующих генов, кодирующих трансформирующие антигены (Т-АГ), которые выполняют те же функции, что и продукты онкогенов ретровирусов и онкогенов раковых клеток.
Этих функций две:
1. Создание условий неограниченного роста обозначается термином иммортализация. Функция реализуется в ядре клетки и обеспечивается генами, кодирующими большой Т-АГ полиомавирусов, E1A-АГ аденовирусов и онкогеном myc. Продукты этих генов влияют на механизм программируемой клеточной гибели апоптоз, сдвигая регуляторные процессы в сторону неограниченной пролиферации клеток.
2. Создание условий для появления фенотипических признаков полной трансформации изменение морфологии клетки и формирование опухоли. Эта функция закодирована в среднем Т-АГ полиомавирусов, Е1В-АГ аденовирусов и семействе онкогенов ras.
Клетки, трансформированные onc-содержащим и ДНК-геномными вирусами, приобретают целый ряд новых биологических свойств, что обусловлено активацией или репрессией специфических клеточных генов в результате действия Т-АГ. Происхождение Т-АГ не определено. Т-гены не гибридизуются с клеточной ДНК, в то время как онкогены ретровирусов, по всей вероятности, произошли от клеточных генов. В то же время, недавно установлено, что Т-гены аденовирусов (Е1А) структурно родственны онкогенам ретровирусов myc и myb, а онкогены v-myc (вирусный онкоген) и c-myc (клеточный онкоген) содержат целые участки, гомологичные участкам генома цитомегаловируса.
Аденовирусы (Adenoviridae)
Семейство включает крупные, с характерной морфологией ядерные вирусы, поражающие позвоночных (млекопитающих и птиц).
Вирионы безоболочечные, с икосаэдрическим типом симметрии капсида (Т = 25) размером 60-90 нм, организованного по принципу ансамблей. В состав вириона входит 11 полипептидов. Капсид состоит из 252 капсомеров 240 гексонов и 12 пентонов. Гексоновый капсомер это тример, состоящий из трех молекул белка II. Пентоны расположены на вершинах икосаэдра и состоят из основания пентона (5 молекул белка III) и фимбрии (3 молекулы белка IV). Длина фибрилл различается у аденовирусов разных серотипов. В ряде случаев один вирион может содержать фибриллы разной длины, например 8,5 нм и 47 нм. Кроме этого в состав капсида входит еще пять минорных белков (VI, VIII, IX, IIIa,1Va).
Геном линейная днДНК размером до 36 т.п.н., ассоциирована с щелочным белком VII и небольшим полипептидом µ, образует шесть петель нуклеопротеина. Эти петли упакованы в ДНК-белковый комплекс белком V, который на вершинах икосаэдра ассоциирован с капсидным белком VI. Геномная ДНК на 5'-концах каждой цепи содержит терминальный белок 55 кД, ковалентно связанный с инвертированными концевыми повторами, длиной 100-140 п.н., в зависимости от серотипа вируса.
Аденовирусы инфицируют клетки высокодифференцированных тканей скелетных мышц, легких, головного мозга, сердца, желудочно-кишечного тракта. Местом первичной репликации вируса являются эпителиальные клетки бронхов. Вирус адсорбируется на клеточной поверхности за счет взаимодействия фимбрий с клеточными рецепторами, входящими в суперсемейство иммуноглобулинов. После этого во взаимодействие вовлекается RGD-мотив пентонового основания, который взаимодействует с клеточными интегринами. Вирус проникает в клетки путем рецепторного эндоцитоза, который осуществляется с участием цитоскелета актиновых филаментов, динеина и микротрубочек. В эндосоме капсид вириона частично разрушается вирусной протеиназой. В ядро проникает только ДНК вируса, которая инициирует первичную транскрипцию.
Транскрипция протекает в две стадии: ранняя транскрипция осуществляется до репликации ДНК, поздняя после. На ранних этапах транскрибируются четыре так называемых кассетных гена Е1, Е2, ЕЗ и Е4. Их продукты, в свою очередь, стимулируют репликацию вирусной ДНК, выключают синтез клеток хозяина и активируют 5 других кассетных генов L1-L5, кодирующих структурные белки.
Процессинг первичных аденовирусных транскриптов протекает по механизму альтернативного сплайсинга. Предполагается, что в процессе сплайсинга принимают участие особые вирус-ассоциированные (VA) РНК, которые представляют собой небольшие нетранслируемые РНК, синтезируемые РНК-полимеразой III. Необходимо отметить, что наличие сплайсинга у аденовирусов сделало эти вирусы моделью для изучения ряда общебиологических процессов в клетках эукариот.
Репликация ДНК аденовирусов идет с использованием белок-нуклеотидной затравки по полу консервативному механизму без образования репликативных вилок путем вытеснения цепи. Цепи ДНК аденовирусов могут образовывать кольца за счет взаимодействия геномных белков или инвертированных повторов. В связи с этим, среди специалистов обсуждается возможность реализации модифицированной модели катящегося кольца.
Сборка вирусных частиц происходит в ядре, однако этот сложный многоступенчатый процесс начинается в цитоплазме со сборки капсомеров с участием так называемого «белка подложки». В ядре, в первую очередь, происходит самосборка пустых капсидов из капсомеров гексона, которая идет через образование наномеров. Следующим этапом сборки является стадия «легкого капсида», в состав которого включены белки сердцевины.
Голая ДНК, имеющая на левом конце богатый тимином упаковочный сигнал, входит в капсид через одну из открытых вершин стадия «молодого вириона». На этой стадии в составе вириона обнаруживаются также белки пентона. На последней стадии морфогенеза происходит протеолитическое расщепление всех предшественников. Часть белков деградирует, при этом частицы уплотняются и становятся недоступными для нуклеаз. Из ядра вирионы выходят в результате серьезных изменений в проницаемости ядерной мембраны, а из клетки путем дезинтеграции цитоплазматической мембраны.
Взаимодействие аденовирусов с клеткой может проявляться тремя типами инфекции: продуктивной, персистирующей и трансформирующей.
Стратегия выживания аденовирусов направлена на подавление апоптоза инфицированной клетки. Установлен целый ряд молекулярных взаимодействий, обеспечивающих вирусу преодоление механизмов клеточной защиты. Продукт ранней транскрипции гена Е1А влияет на уровень транскрипции клеточного фактора p53, который является опухолевым супрессором генов апоптоза. Продукт Е1В является аналогом клеточного протоонкогена Bcl-2 и регулирует клеточное деление. Один из продуктов группы генов ЕЗ (gp19K) взаимодействует с молекулами гистосовместимости первого класса, чем препятствует их доставке на поверхность клетки. В результате, инфицированная аденовирусом клетка не узнается цитотоксическими B-лимфоцитами. Еще один путь блокирования апоптоза заключается в том, что продукты генов E3 участвуют в удалении Fas(CD95) молекулы, опосредующей апоптоз, с клеточной поверхности и ее деградации. Аденовирусы также блокируют активность ферментов, участвующих в каталитическом расщеплении клеточных белков, которое происходит при апоптозе.
На основе генома аденовирусов созданы векторы, выражающиеся в клетках млекопитающих. Способность этих векторов экспрессироваться в гемопоэтических и эпителиальных клетках широкого круга хозяев, производить устойчивые интеграны, включающие большие (до 7,5 т.п.н.) последовательности, делают аденовирусные векторы перспективными в терапии инфекционных заболеваний. Аденовирусные векторы могут быть использованы: для введения генов, которые приведут к супрессии опухоли и ее элиминации (терапия рака); для доставки генов в ткани с целью исправления дефектных генов (генная терапия); для доставки генов, экспрессия которых будет препятствовать развитию болезни (добавочная терапия).
В семействе выделено два рода, представители которых не имеют антигенной общности. Однако, внутри каждого рода вирусы объединены родоспецифическим антигеном, детерминанты которого расположены внутри гексона.
1. Mastadenovirus включает 53 серотипа (вида) аденовирусов животных (обезьяны, крупный рогатый скот, свиньи, овцы, лошади, козы мыши) и 51 серотип аденовирусов человека, Типоспецифические антигены ассоциированы с фибрами и с поверхностью гексонов.
Аденовирусы человека по гемагглютинирующим свойствам распределены на группы I-IV, по молекулярным характеристикам (электрофоретическому белковому профилю и рестриктному профилю ДНК) на подгруппы от A до F. Аденовирусы человека могут трансформировать клетки крысы в культуре и вызывать опухоли у этих животных. Это свойство, впервые описанное в 1962 г., было использовано еще для одной классификации вирусов. По этому признаку выделяют:
высокоонкогенные аденовирусы, которые индуцируют опухоли у новорожденных крыс в течение месяца;
слабоонкогенные вирусы, которые индуцируют опухоли реже и только через длительный период времени;
неонкогенные (подгруппы C-F), не трансформируют клетки крысы в культуре.
У человека аденовирусы вызывают острые респираторные заболевания, фарингоконъюнктивиты у детей, конъюнктивиты, инфекции дыхательных путей, гастроэнтериты, редко менингоэнцефалит и геморрагический цистит.
2. Aviadenovirus включает 21 серотип вирусов птиц (кур, индеек, гусей, фазанов, уток). Аденовирусы этого рода реплицируются не только в организме птиц. Известны случаи трансформации клеток млекопитающих. У птиц аденовирусы вызывают геморрагический энтерит, «мраморную» болезнь селезенки, водянку, отек и закупорку легких.

9.2.4. Биология и иммунология рака
Раковые клетки имеют ряд особенностей, среди которых можно выделить следующие:
безудержный, неуправляемый пролиферативный рост. Раковые клетки отличаются абсолютной автономностью;
раковые клетки внедряются в другие ткани, метастазируют из основного очага, проникая через стенку кровеносных и лимфатических сосудов. Раковые клетки, отделившиеся от опухоли и попавшие в лимфу, задерживаются в лимфоузлах. В результате происходит увеличение лимфатических узлов раковая лимфаденопатия. То есть, метастазирование бластомы (опухоли) осуществляется через кровеносные и лимфатические сосуды;
канцерогенез рассматривается как перерождение генетической программы клетки, то есть трансформация. Опухоль это клон трансформированных клеток. Две основные теории канцерогенеза гласят, что, во-первых, трансформация обусловлена соматическими мутациями соответствующих клеток. Во-вторых, возможна избирательная активация латентных, запрещенных генов и клонов клеток. Все это приводит к бесконтрольной пролиферации. От первых трансформированных клеток до возможного диагностирования очага проходит в среднем 5 лет. После 30 удвоений в опухоли скапливается до 1 млрд. клеток и весит она 1 г. Но новообразования обнаруживаются, когда количество опухолевых клеток достигает 100 млрд. и опухоль весит 10-100 г.
Предложивший вирусогенетическую теорию происхождения опухолей выдающийся советский микробиолог, вирусолог, иммунолог Лев Зильбер посвятил экспериментальной онкологии многие годы жизни. Его целью было создание противоопухолевой вакцины. Большим вкладом в науку явилась его монография «Учение о вирусах». Основная идея вирусогенетической теории происхождения опухолей заключается в том, что при определенных условиях нуклеиновая кислота вируса может интегрировать в геном клетки. При этом возникает трансформация. Пусковым механизмом в этом процессе может быть действие физических и химических канцерогенов. Именно поэтому охрана и защита окружающей среды рассматриваются как профилактика рака.
Как указано в предыдущем разделе, некоторые РНК- и ДНК-содержащие вирусы онкогенны, могут трансформировать инфицированные ими клетки и тем самым индуцировать образование опухоли. Понимание онкогенных вирусов перекрывается с признанием существования многочисленных протоонкогенов. Протоонкогены, как правило, первично можно рассматривать как физиологические гены. В ряде случаев они подвергаются нормальному транскрибированию и синтезу соответствующего продукта, например, факторов роста некоторых клеток и тканей. Таким образом, утрата нормальной регуляции экспрессии протоонкогенов превращает их в онкогены.
Возможны разные механизмы трансформации пространственное перемещение протоонкогенов в процессе хромосомных перестроек транслокации генов. Например, доказана возможность транслокации участков хромосомы 8, содержащей протоонкоген c-myc и участка 18 в хромосому 14. Эти перестройки являются основой для развития различных вариантов B-клеточных лимфом и других опухолей. Например, лимфома Бёркетта вызывается вирусом Эпштейна-Барр, который относительно часто присутствует в организме в латентном состоянии или может вызвать инфекционный мононуклеоз.
Вирусы являются причиной развития некоторых T-клеточных острых лейкозов взрослых. Примером является вирус HTLV-I, который по ряду свойств сходен с ВИЧ-1. Отличием является то, что HTLV-I вызывает трансформацию и пролиферацию T-лимфоцитов, а не разрушение клеток, как ВИЧ-1. При многих лимфомах происходит комплексное воздействие на организм и вируса и дополнительного эндемического фактора, что связано с генетикой популяций, этносов и биогеохимическими экологическими нишами. Например, эндемической нишей для T-клеточного острого лейкоза взрослых являются Южные Японские острова.
Следует подчеркнуть, что злокачественные заболевания закономерно возникают на фоне иммунодефицита. Различные вторичные иммунодефициты являются основополагающим фоном возникновения рака. Патологическая пролиферация клеток, которая начинается с одной единственной трансформированной клетки, возникает в результате вторжения онковирусов, генной трансформации, превращения протоонкогенов в онкогены. Исключительное значение придается и действию различных химических и физических мутагенов.
В пролиферативные процессы могут вовлекаться принципиально различные клетки. Малигнизации потенциально могут быть подвержены все клетки организма. Основой процесса является ослабление эффективности иммунной защиты. При этом преобладают супрессорные влияния. То есть, при всех злокачественных заболеваниях возникает тотальный иммунодефицит. Рак развивается на фоне иммунодефицитов различного происхождения и приводит к дальнейшей супрессии иммунной системы. В этом заключается порочный круг развития болезни.
Современное направление иммунологической онкологии рассматривает, прежде всего, клеточный иммунитет как основу противобластоматозной защиты. В реализации клеточного иммунитета принимают участие, в первую очередь, цитотоксические T-лимфоциты и натуральные киллеры (NK-клетки). Иммунодефицит с селективным или преимущественным дефектом NK-клеток проявляется высокой чувствительностью не только к раковым процессам, но и к вирусным инфекциям, например, к развитию диссеминированной герпетической инфекции.
Итак, состояние иммунной системы во многом определяет возможность развития опухолей. Конкретных причин и механизмов несколько: снижение клеточного иммунитета; нарушение синтеза интерферона и цитокинов, а также других факторов, например растворимых рецепторов цитокинов. Следует подчеркнуть, что онкогенные антигены, которые представлены на поверхности раковой клетки, являются слабыми и распознавание их затруднено.
Ученик Зильбера, известный профессор Г.И. Абелев, сформулировал ряд общих принципов, которые имеют первостепенное значение для понимания антигенной структуры опухолей, возможностей их иммунодиагностики и иммунотерапии, в том числе и с помощью моноклональных антител. Эти принципы следующие:
возникновение опухоли из одной единственной клетки (моноклональность);
происхождение опухолей в ряде случаев из клеток-предшественников, что создает наибольшую злокачественность;
наличие в опухолях вирусного происхождения полипептидов, кодируемых вирусным геномом.
Возникновение опухолевой ткани из клеток-предшественников ведет к появлению в них особых эмбриональных антигенов. Это альфа-фетопротеин при опухолях печени и яичка; раково-эмбриональный антиген при опухолях кишечника; «общий» антиген при острых B-клеточных лейкозах; трофобластический антиген при хориоэпителиомах и другие. Таким образом, при многих опухолях в клетке возникает возврат к эмбриональным путям белкового и углеводного обмена и, как следствие этого, появление в опухолевых клетках эмбриональных протеинов, используемых в иммунодиагностике в качестве онкомаркеров.

9.3. Возбудители медленных инфекций
Термин «медленные инфекции» был введен Сигурдсоном в 1954 г., когда он впервые сформулировал основные положения учения о медленных инфекциях.
Медленная инфекция это форма взаимодействия вируса с организмом хозяина, являющаяся частным случаем персистенции вирусов. Для этой формы инфекции характерны следующие признаки:
1. Необычайно продолжительный инкубационный период.
2. Медленный прогрессирующий характер течения заболевания.
3. Своеобразное поражение органов и тканей.
4. Как правило, смертельный исход.
Первоначально этот термин использовался в отношении трех инфекций овец мэди, рида и паратуберкулеза. Затем в группу включили болезни висна, скрепи, куру, болезнь Крейцфельдта-Якоба и др. Позднее было установлено, что медленные формы инфекции в определенных условиях могут вызываться многими вирусами, известными ранее лишь как возбудители острых вирусных инфекций. Например, вирус кори может вызывать подострый склерозирующий панэнцефалит; вирус краснухи прогрессирующую врожденную краснуху, вирус герпеса атеросклероз.
Успехи молекулярной биологии и вирусологии в последние годы позволили открыть новые вирусы и установить природу уже известных возбудителей медленных инфекций.

9.3.1. Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ, HIV)
Характеристика ВИЧ (Retroviridae, Lentivirus)
В 1983 г., практически одновременно и независимо, в США, Галло (Национальный институт рака) и во Франции, Монтанье (Институт Пастера) открыли и описали вирус возбудитель иммунодефицита человека, названный HTLV-III и LAV, соответственно. После того, как было установлено, что они являются одним и тем же вирусом, ICTV было утверждено единое название вирус иммунодефицита человека или ВИЧ-1.
Вирионы ВИЧ имеют размер 100-120 н.м., покрыты липопротеиновой оболочкой. Наружная поверхность вириона имеет 80 грибоподобных выступов (d = 15 н.м., h = 9 н.м.). Выступы образованы тетрамером белка gp120, ковалентно связанным с двумя гликопротеинами gp41. Оболочка вируса с внутренней стороны выстлана матриксным белком p17, образующим изометрическую структуру. Внутренний компонент вириона представлен спиральным РНП, заключенным в капсулу. Капсула состоит из белка p24 и имеет форму груши, поскольку РНП расположен экстентрично (вирион B-типа).
Гликопротеины gp120 и gp41 являются основными протективными антигенами вируса и несут в общей сложности более 10 антигенных детерминант. gp120 и gp41 поверхностные белки, играющие определяющую роль в проникновении вируса в клетку.
gp120 это прикрепительный белок, служащий лигандом клеточных рецепторов вируса. Рецепторами являются молекула CD4, выполняющая роль «фиксатора» вируса, и рецепторы для ряда хемокинов. Поскольку тропизм к конкретным типам клеток обеспечивается соответствующими хемокиновыми рецепторами, не все CD4-положитель-ные клетки инфицируются ВИЧ. Чувствительными к ВИЧ являются T-лимфоциты, моноциты, макрофаги и некоторые другие клетки. Небольшое количество gp120 может произвольно отделяться от вириона и попадать в кровь и ткани в виде растворимой субстанции.
gp41 белок слияния. Этот белок участвует в трех процессах:
слияние вирусной оболочки с клеточной мембраной;
слияние соседних участков клеточных мембран;
слияние мембран соседних клеток.
Первый из этих процессов обеспечивает проникновение вируса в клетку. gp41 индуцирует слияние мембран при нейтральных значениях pH. Слияние ВИЧ с мембраной клетки приводит к проникновению вируса в клетку, дезинтеграции вируса и выбросу РНП ВИЧ в цитоплазму. Здесь РНК подвергается транскрибированию с помощью обратной транскриптазы в двухнитевую ДНК, которая транспортируется в ядро и с помощью интегразы встраивается в геном. Теоретически вирион может проникать в клетку и путем эндоцитоза и путем прямой пенетрации.
Геном ВИЧ, так же, как и у других ретровирусов, представлен двумя молекулами РНК позитивной полярности размером 9200 н.о. В вирионе РНК ассоциирована с нуклеокапсидным белком, ревертазой и интегразой. РНК кэпирована, полиаденилирована и каждая ассоциирована с лизиновой тРНК. Геном содержит гены gag, pol, env и minigene, но отличается от других ретровирусов тем, что гены pol и env не перекрываются, а отделены друг от друга рядом регуляторных генов (схема 11). Другой отличительной особенностью организации генома ВИЧ является наличие регуляторных генов, названных трансактиваторами. Они расположены на некотором расстоянии от генов, на которые воздействуют. Трансактиваторы усиливают работу структурных и NS генов более чем в 100 раз.

Схема 11.

Репликация ВИЧ идет по схеме, характерной для ретровирусов, и включает стадию обратной транскрипции (синтез кДНК происходит в цитоплазме в составе РНП), транспорт кДНК в ядро и ее интеграцию в геном клетки. В состоянии латентного провируса ВИЧ может находиться до 10-15 лет без проявления клинических симптомов заболевания. Лиц, содержащих ВИЧ в латентном состоянии, называют ВИЧ-инфицированными. Активация провируса приводит к репликации вируса и развитию клинических проявлений инфекции, заканчивающейся летально. При активации провируса ВИЧ-инфекция переходит в заболевание, названное синдромом приобретенного иммунодефицита (СПИД).
Активация провируса приводит к транскрипции полноразмерных геномных РНК, часть которых в процессе сплайсинга образует мРНК gag, gag-pol и env и ряд коротких субгеномных РНК. Основные субгеномные РНК транслируют полипротеины-предшественники, которые затем нарезаются вирус-специфическими и клеточными протеазами на функциональные белки. Продукт гена gag нарезается вирус-специфической аспарагиновой протеазой на 4 белка p17 (матриксный белок), p24 (капсидный белок), p7 и p9 (белки нуклеокапсида). Продукт гена gag-pol, состоящий из протеазы и ревертазы, расщепляется на функциональные белки-ферменты за счет аутокаталитической активности протеазы. Продукт гена env (gp160) нарезается клеточной трипсиноподобной протеазой на поверхностные белки p120 и p41, которые после нарезания гликозилируются в аппарате Гольджи.
Сборка вирионов ВИЧ осуществляется на цитоплазматической мембране, куда транспортируются поверхностные белки. Матриксный белок, ассоциированный с капсидным белком, заякоривается на внутренней поверхности цитоплазматической мембраны за счет своего миристилированного N-конца. Спиральный нуклеокапсид собирается в цитоплазме самостоятельно и почкуется через мембрану в местах скопления матриксного белка.
Как уже отмечалось, gp41 обеспечивает слияние клеток изнутри. При достижении определенной концентрации этого гликопротеина на мембране клетки происходит слияние мембран соседних клеток, что приводит к образованию многоядерных синцитиев, которые включают десятки, и даже сотни лимфоцитов. Клетки, входящие в состав синцития, погибают. Цитопатическое действие вирус оказывает только на T-лимфоциты, что постепенно приводит к их количественному уменьшению. Моноциты являются резервуаром вируса, так как вирус может длительное время персистировать в ядре, не нанося ущерба этим клеткам.
ВИЧ характеризуется очень высокой скоростью изменчивости, которая в 10 раз превышает скорость мутаций у вируса гриппа и в 100 раз скорость мутаций клеточных ДНК. В процессе репродукции ВИЧ в организме за счет высокой изменчивости происходит образование и накопление нескольких подтипов вируса (квазивидов). Это придает вирусу селективные преимущества в борьбе за выживание под прессом иммунной системы, позволяя уходить от иммунологического надзора. Скорость образования квазивидов, как правило, выше скорости формирования эффекторных клонов иммунокомпетентных клеток хозяина (T- и B-лимфоциты). В результате, даже здоровая иммунная система не в состоянии бороться с ВИЧ-инфекцией.

История происхождения ВИЧ/СПИД
Много загадок и принципиальных вопросов связано с происхождением ВИЧ-инфекции. Несомненно, что эта антропонозная инфекция имела (и имеет) резервуар в природе, в животном мире; этиологический объект, полагают, взаимосвязан с персистирующими вирусами зеленых мартышек. Именно в Африке существует наибольшее количество обезьян, пораженных ретровирусами. Однако для того, чтобы изменилась тропность вируса, круг его хозяев необходима мутация вируса и изменение реактивности хозяина (популяции). Такие эффекты, очевидно, и произошли при возникновении медленной ВИЧ-инфекции.
Что может привести к мутациям, увеличить число естественных перестроек генома? Прежде всего повышенная реактивность и некоторые агрессивные химические агенты-мутагены. Кстати, в районах Центральной Африки отмечена повышенная радиация за счет огромных залежей урана и соответствующих разработок.
Вообще новые инфекции появляются и проявляются во время развития цивилизации в периоды различных экологических и социальных катастроф и кризисов. В настоящее время на фоне экологического кризиса это нашествие наиболее знаково. Так, за последние десятилетия появились десятки новых инфекций и, главное, проявилось принципиально новое течение старых инфекций, модифицировался видовой, специфический барьер, произошла трансформация микроорганизмов и вирусов, изменились взаимоотношения макро- и микроорганизмов. В этом плане следует вспомнить такие инфекционные заболевания, как широкий и расширяющийся спектр гепатитов, сибирская язва, стрептококковая инфекция (например, «стрептококк мясоед»), лихорадка Эбола, болезнь легионеров, кишечная инфекция, вызываемая кишечной палочкой 0-157 в Японии, и разнообразные медленные инфекции, например, губчатый энцефалит коров, инвазионный для человека, и многие другие новые и трансформированные заболевания, например сапронозы. Но на первом месте стоит загадка человечества СПИД, как «наказание» за экологический и нравственный кризис цивилизации.
Сегодняшний уровень биологической науки и практики здравоохранения позволяет успешно бороться со многими, если не с большинством инфекционных заболеваний. Победа человечества над оспой, успехи в снижении заболеваемости тифами, полиомиелитом, столбняком, дифтерией, туберкулезом, корью и другими инфекциями позволяют сегодня разрабатывать и осуществлять конкретные меры по стабилизации и последовательному снижению инфекционной патологии, сделать их управляемыми.
На фоне реализации конкретных научных и практических программ первые сообщения о возникновении ВИЧ-инфекции явились большой неожиданностью, равно как и мрачные социально-медицинские прогнозы относительно широты распространения и уровня летальности новой болезни, которая в последних стадиях СПИДа достигает, по существу, 100%. ВИЧ-инфекция это единственная инфекция, которой была посвящена сессия ООН в 2001 году, постольку социально-медицинские проблемы ее глобальны.
В мире от эпидемии СПИДа уже погибло 17,3 миллиона человек, из них почти 4 миллиона дети. И это произошло за очень короткий срок. Первые случаи СПИДа и смерть пятерых молодых мужчин в США описаны в 1981 году. И вот спустя всего 20 лет цифра в 17,3 миллиона. Прогноз экс-директора глобальной программы по СПИДу Манна состоял в том, что к концу XX века число зараженных ВИЧ составит 20 миллионов человек. Но их оказалось почти вдвое больше 36 миллионов.
Каждый день приносит 8500 новых случаев заражения ВИЧ. И мы просто обязаны признать за этой болезнью особый статус. Статус явления демографического и социально-политического. Всемирный день памяти умерших от СПИДа это не только реквием по 17,3 миллионам, это предостережение человечеству.
Ситуация в Нижегородской области по заболеваемости ВИЧ-инфекцией неотделима от ситуации в России и в мире, поскольку тенденции развития эпидемии одинаковы во всех странах мира, где сегодня она в полной мере приобрела характер пандемии.
На территории России эпидемия ВИЧ-инфекции продолжает распространяться. Начиная с 1987 года, когда был выявлен первый ВИЧ-инфицированный в СССР, по 1995 год заболеваемость в стране составляла всего 0,48 на 100 тыс., населения. В 1996 году началась эпидемия, которая явно обозначилась на тех нескольких территориях, где активными действиями здравоохранения эпидемический процесс был выявлен. Заболеваемость в России в 1996 году возросла до 1,03, в 1998 - до 2,38, в 1999 году последовал резкий рост до 10,31, а в 2000 году заболеваемость выросла еще в 3,5 раза и достигла 36,53.

Происхождение СПИДа
В июне 1981 года, когда Готлиб с соавторами сообщили о пневмоцистной пневмонии у 5 молодых гомосексуалистов в Лос-Анджелесе, они едва ли могли предполагать, что эта информация означала начало новой пандемии, которая уже через несколько лет унесет десятки и сотни тысяч жизней и поставит под угрозу здоровье еще миллионов людей на всех континентах.
Особенностью заболевания пневмоцистной пневмонией было то, что оно приобретало затяжное, хроническое, злокачественное, агрессивное течение и заканчивалось смертью больного. У всех больных установлен резко выраженный иммунный дефицит. Вскоре в Америке были обнаружены случаи агрессивного течения редкой до этого формы геморрагического рака кожи саркомы Капоши. Ранее эта опухоль имела три характерные черты: развивалась у людей старше 60 лет, локализовалась преимущественно на нижних конечностях, имела длительное, в том числе доброкачественное течение. Однако мы еще в 1974 году отметили, что саркома Капоши облигатно сопровождается иммунодефицитом (Н.А. Добротина). Естественно, к СПИДу это не имело никакого отношения. При СПИДе саркома Капоши имела ряд особенностей. Во-первых, она значительно «помолодела» ее обнаруживали у людей моложе 40 лет. Во-вторых, саркома Капоши, причем в более агрессивной форме, стала появляться в необычных локализациях, приобрела генерализованный характер с поражением лимфоидной ткани, слизистых оболочек и внутренних органов. В-третьих, у всех больных наблюдалась также глубокая иммунная недостаточность с избирательным поражением клеточного иммунитета.
Тщательный анализ этих случаев позволил американским исследователям прийти к заключению о развитии у больных нового, ранее неизвестного синдрома, который клинически проявляется неуклонно прогрессирующими случайными инфекциями и злокачественными опухолями, а иммунологически глубокими поражениями системы клеточного иммунитета.
Сообщения о подобных заболеваниях среди молодых людей приобрели лавинообразный характер, что в значительной мере связано с сексуальной революцией 70-80 годов, развитием принципов свободной любви, признанием гомосексуализма, движением хиппи. Стало очевидным, что в мире возникла новая, возможно инфекционная, форма иммунного дефицита, которая имеет медицинское, социальное, биологическое значение.
В 1986 году Международный комитет по таксономии вирусов рекомендовал ввести единое обозначение нового ретровируса, вызывающего иммунодефицит Human Immunodeficiency Virus type I (HIV-1), которое со временем стало общепринятым. В дальнейшем сходные вирусы были выделены от различных видов обезьян (Simian Immunodeficiency Virus, SIV), а также от инфицированных людей в Западной Африке. Этот последний вирус, более близкий к SIV, чем к HIV-1, был назван вирусом иммунодефицита человека типа 2 (HIV-2). Таким образом, уже в начальный период открытия семейства вирусов иммунодефицита человека стала ясна его исключительная гетерогенность, полиморфизм. Было понятно, что предковые гены, основополагающий геном этих вирусов, который дал такую трансформацию, находился в природе.
В 1984-1985 гг. были получены многочисленные вирусологические, серологические и клинические данные, которые свидетельствовали об основной этиологической роли HIV-1 в возникновении СПИДа. Исследования банков сывороток, собранных в 1959 г. в Заире, продемонстрировали факт наличия HIV-1 у людей в течение, по крайней мере, четырех последних десятилетий.
Тем не менее, широкое распространение инфекции и ее клинически выраженной формы началось только на рубеже 80-х годов. При общем согласии о природном происхождении возбудителя СПИДа, вопрос о географическом регионе его возникновения и источнике собственно эпидемического штамма HIV-1 остается не совсем ясным.
Откуда же «пришел» вирус? Первое предположение о природе и происхождении СПИДа высказал американский ученый Роберт Галло, который использовал для его обоснования результаты более чем 10-летних исследований по выделению первых ретровирусов иммунодефицита человека.
Уточняя географию HTLV-1, исследователи показали наличие эпидемических очагов инфекции не только в Африке, но и на островах Японии и в некоторых районах США, в большинстве стран Карибского региона, Южной Америки. Установлено, что многие виды африканских зеленых обезьян имеют антитела, специфически реагирующие с HTLV-1. От этих обезьян выделены близкородственные HTLV-1 вирусы, что дало возможность предположить тесную связь между антигенным гомеостазом обезьян и человека. Все эти факты, по мнению Галло, свидетельствуют в пользу того, что T-лимфотропные вирусы человека, к которым исследователь относит и возбудитель СПИДа, в прошлом возникли в Африке от одного общего предшественника.
Высказывались бездоказательные версии об искусственном происхождении вируса СПИДа, о рождении его в лабораториях Пентагона в связи с разработкой нового вида бактериологического оружия.
Таким образом, версия, обвиняющая генную инженерию в преднамеренном создании возбудителя СПИДа в научных лабораториях и использовании его в качестве нового вида бактериологического оружия, не имеет убедительных доказательств. Большинство вирусологов, эпидемиологов, инфекционистов, занимающихся вопросами эпидемиологии и профилактики СПИДа, считают, что эпидемия СПИДа началась в 1976-1977 годах в Африке, на Гаити и в США, а вирус, вызывающий ее, имеет скорее всего «обезьянье» происхождение.
Неразрешенной загадкой, несмотря на множество гипотез, остаются вопросы «как, когда, где и почему» вирус СПИДа обезьян преодолел видовой барьер и приобрел эпидемическое распространение в человеческой популяции.
Относительно того, как вирус за короткое время вышел за пределы африканского континента, высказано следующее предположение. Известно, что США используют развивающиеся страны Африки и Латинской Америки в качестве сырьевой базы для получения крови, применяемой как при производстве ряда лечебных препаратов, так и для прямых переливаний крови. Считают, что именно таким путем и был завеян возбудитель СПИДа в Америку, а из нее и в другие страны, закупающие эти препараты, но это лишь один из возможных вариантов. Более оправдан естественный путь половой передачи вируса, что связано с миграцией населения и сексуальной революцией.

Заражение ВИЧ-инфекцией
ВИЧ-инфекция относится к антропонозным инфекциям и потому всякие измышления о прямом заражении от животных беспочвенны. В опытах на крысах, мышах, различных обезьянах, кошках, как и на энтомологических объектах ни разу не удалось получить заражения.
Для возникновения конкретного инфекционного заболевания и развития эпидемического процесса необходим выход возбудителя, его накопление в критической массе и, затем, проникновение его в организм, инвазия через определенные входные ворота (Л.В. Громашевский). Для ВИЧ-инфекции характерен парентеральный механизм заражения с использованием полового и искусственного путей, а также заражение при рождении ребенка от больной матери. Вирус может передаться от больной матери во время беременности и родов; заражаются от 30 до 50% рожденных детей. К заражению приводят 1 из 100 гетеросексуальных контактов и 1 из 10 гомосексуальных половых актов с носителем вируса, хотя эта статистика подтверждается только на большом материале. При гомосексуальных контактах заражение происходит закономерно, что обусловлено измененным и сниженным местным иммунитетом в прямой кишке. Исходя из распространения СПИД гомосексуалистами, это извращение должно рассматриваться как исключительно опасное социальное явление.

Как же протекает ВИЧ-инфекция? Клиника заболевания
ВИЧ-инфекция моделируется в виде айсберга. Над водой выступает вершина больные СПИДом, летальность, по существу, составляет 100%, хотя уже описываются отдельные, единичные случаи ремиссии. Многие теоретики (Б. М. Медников, С. Лем и др.) справедливо считают, что любая, даже особо опасная инфекция, в том числе и ВИЧ-инфекция, будет эволюционировать в плане «сохранения» хозяина, повышения его специфического иммунитета.
Первые составляющие подводной громады айсберга больные с отдельными проявлениями ВИЧ-инфекции, а глубоко под водой огромная часть айсберга носители вируса. По данным В.В. Покровского, в год могут заболеть до 3-5% зараженных (по данным Н. Новгорода эта цифра ниже).
Ведущим звеном в развитии иммунодефицита считается поражение CD4-положительных лимфоцитов (хелперов), которое подтверждается у больных СПИДом прогрессирующей лимфаденопатией. Уменьшается количество не только Т-хелперов, но и снижается соотношение CD4+/CD8+ клеток (иммунорегуляторный индекс), который при СПИДе всегда меньше единицы. Снижение соотношения CD4+/CD8+ клеток является главной особенностью иммунологического эффекта при СПИДе и определяется при всех его клинических вариантах. Дальнейшее сложное преобразование иммунной системы под влиянием инфекции приводит к тому, что организм оказывается неспособным элиминировать ВИЧ и противостоять вторичной инфекции. Он становится беззащитным в отношении воздействия многих вирусов, грибов, некоторых бактерий. Ведущими в клинике СПИДа становятся оппортунистические инфекции и опухоли.
ВИЧ-инфекция подразделяется на периоды. Ее течение исключительно индивидуально и зависит от общей реактивности организма, состояния иммунитета, ассоциированных инфекций и других факторов. Бессимптомный период рассматривают как инкубационный период. Он может длиться годы и заканчивается переходом ВИЧ-инфекции в СПИД. В этот период можно установить сам факт инфицирования путем определения в крови вирусных белков (антигенов) или антител к ним. Количество вирусных белков в крови в первое время резко увеличивается, затем, начиная с 6-8 недели, когда появляются антиВИЧ-антитела, снижается, то есть происходит сероконверсия.
В большинстве случаев в инкубационный период симптомов заболевания нет. Однако у некоторых отмечается синдром, похожий на мононуклеоз: лихорадка, увеличение различных групп лимфатических узлов, иногда острый энцефалит. Но проявления этого синдрома проходят обычно в течение нескольких недель.
Второй период период персистирующей генерализованной лимфаденопатии характеризуется стойким, в течение нескольких месяцев, увеличением различных групп лимфатических узлов. В основе лимфаденопатии лежит неспецифическая гиперреактивность В-клеток, проявляющаяся фолликулярной гиперплазией лимфатических узлов (увеличение лимфоидных фолликулов и их центров). Длительность этого периода может достигать 3-5 лет.
При быстром локальном увеличении размеров лимфатических узлов. У больного следует думать о саркоме Капоши или о злокачественной лимфоме. Особенно характерно поражение этими опухолями бедренных, парааортальных, забрюшинных лимфоузлов. Бубоны обычно наблюдаются при злокачественной лимфоме, туберкулезе или атипичной микобактериальной инфекции. Одним из характерных признаков генерализованной лимфаденопатии является температурная реакция. Отмечается подъем температуры до 38-39 градусов, которая сопровождается обильными ночными потами. Наблюдается диарея, приводящая к снижению массы тела.
Третий период заболевания, возникающий на фоне умеренного иммунодефицита, называют преСПИДом или СПИД-ассоциированным комплексом. Для него характерны лихорадка, лимфаденопатия, диарея, незначительная потеря массы тела. На этом фоне появляется наклонность к развитию вторичных инфекций, опоясывающего лишая, пиодермии и др. Этот период длится несколько лет.
Четвертый период заболевания, который продолжается около двух лет, это период синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД). Для него характерны оппортунистические инфекции и опухоли, истощение и деменция. В этот финальный период, как правило, снижается количество антиВИЧ-антител (они могут вообще не определяться), а количество вирусных антигенов нарастает, что необходимо учитывать при диагностике СПИДа. Клинические синдромы, наблюдаемые при СПИДе, можно сгруппировать по системным органам: легочный синдром, неврологический синдром, кишечный синдром, поражение кожи и слизистых оболочек, лимфаденопатия, лихорадка неясного генеза, ретинальный синдром.
Пневмоцистная пневмония наиболее частая оппортунистическая инфекция при СПИДе, встречается у 85% больных. Другая частая оппортунистическая инфекция у больных СПИДом атипичная микобактериальная инфекция, вызываемая M. avium intracellulare. Эта инфекция поражает тонкую кишку.
Следует помнить, что оппортунистические инфекции и саркома Капоши не являются специфичным проявлением ВИЧ-инфекции и могут наблюдаться при тяжелых вторичных дефицитах иммунитета различного генеза, в частности, связанных с длительным применением антибиотиков, цитостатиков, кортикостероидов или других лекарственных препаратов, обладающих иммуносупрессивным действием.

Факторы и механизмы, которые могут рассматриваться как этиотропные в появлении ВИЧ-инфекции
Большой риск передачи генетической информации и трансформации у вирусов, образование новых форм. Незащищенность путей передачи генетической информации при обратной транскрипции
РНК-> ДНК-> РНК-> Белок.
Наличие колоссального резервуара вирусов вообще.
Нарушения биоценозов организма, что приводит к выраженным иммунодефицитам, нарушениям системы факторов патогенности и соответствующей неспецифической резистентности и иммунитета. Уменьшение и изменение бактериальных и паразитарных биоценозов, в частности снижение стрептококкового влияния и влияния других микроорганизмов, появление L-форм, хламидиозов, вирусных оппортунистических инфекций.
Применение многочисленных лекарственных препаратов и химических воздействий при наличии ретровирусов, являющихся возбудителями медленных инфекций у животных. Например, в Африке, где, возможно, возник ВИЧ, урановые рудники создают условия для сильного мутагенеза, что, вероятно, предшествовало переходу вируса от зеленых мартышек к человеку.
Антигенные перегрузки организма, обусловленные биологическими и химическими загрязнениями в условиях экологического кризиса: вирусные гиперинфекции (цитомегаловирусы, вирус Эпштейна-Барр, вирусы герпеса, гепатитов, онковирусы) и многие другие, которые резко нарушают антигенные биоценозы и гомеостаз организма, способствуя формированию иммунодефицитов.
Новые социальные факторы: колоссальная миграция населения, сексуальная революция, новые медицинские и биотехнологические вмешательства и манипуляции, что породило новое ограничивающее направление биоэтику.

Воздействие ВИЧ на иммунную систему
Нарушения иммунитета при СПИДе исключительно значительны. При ВИЧ-нфекции развивается дисфункция как гуморального, так и клеточного звена иммунитета. Несмотря на нормальное количество циркулирующих B-лимфоцитов, реакция их на антигены резко снижена. В то же время увеличено число B-лимфоцитов, спонтанно секретирующих Ig.
Установлено, что ВИЧ, вызывая повышенную продукцию интерлейкина-6 и интерлейкина-10, активирует B-лимфоциты, в результате чего развивается поликлональная гипергаммаглобулинемия за счет роста концентрации IgG, IgM, IgA. Однако количество специфических клонов B-лимфоцитов, обеспечивающих продукцию антител против белков ВИЧ, сведено к минимуму.
По мере развития ВИЧ-инфекции B-клеточный ответ постепенно истощается. В результате прекращается продукция специфических антител ко всем другим микроорганизмам.
ВИЧ-инфекция приводит к глубоким нарушениям клеточного иммунитета. Вирус поражает оба типа CD4+ T-хелперов. Обнаружено, что в клетках Th1 хелперов, которые продуцируют гамма-интерферон, интерлейкин-2, фактор некроза опухолей и индуцируют клеточный ответ, вирус встраивается в геном рядом с регуляторными последовательностями гена интерлейкина-2, подавляя продукцию интерлейкина-2. Этого не происходит в случае инфицирования Th2 клеток, продуцирующих интерлейкины-4, 5, 10 и индуцирующих гуморальный ответ.
Главной чертой T-клеточного ответа при ВИЧ-инфекции является снижение продукции цитокинов первого типа (Th1-клетки), причем более значительное, чем нарастание продукции цитокинов-2 типа (Th2-клетки). Указанный дисбаланс играет роль пускового механизма для реализации программированной клеточной гибели (апоптоза) T-хелперов. Данный механизм является одной из основных причин снижения количества CD4 лимфоцитов, и в первую очередь, T-хелперов 1 типа. Результатом происходящих нарушений является, кроме того, смещение равновесия между Th1 клетками и Th2 лимфоцитами в сторону последних.

Напомним, что противовирусный иммунитет связан с Th1 клетками. Переход от Th1 к Th2 ответу сопровождается одновременным нарастанием функциональной недостаточности иммунного ответа, наблюдаемой при развитии ВИЧ-инфекции. Прогрессирующая T-клеточная дисфункция характеризуется исчезновением пролиферативного ответа на антигены, снижением продукции T-клетками интерлейкина-2 и гаммаинтерферона на фоне роста продукции интерлейкина-4 и интерлейкина-10. Это изменение означает смещение равновесия T-хелперов в сторону Th2 клеток, то есть от клеточного иммунитета к гуморальному. Чем более выражено преобладание гуморального звена иммунного ответа, тем в большей степени прогрессирует ВИЧ-инфекция.
Однако только смещением равновесия популяций T-хелперов не ограничивается многофакторное действие ВИЧ. Из числа дополнительных механизмов цитопатического действия ВИЧ на CD4+ клетки выделяют следующие:
Непосредственная гибель клеток в результате репликации ВИЧ внутри клетки.
Формирование синцития, приводящего к функциональной неполноценности и гибели клеток.
Некроз инфицированных клеток.
Повреждение и гибель инфицированных клеток-предшественников в тимусе.
Цитотоксическое действие высоких концентраций фактора некроза опухолей, реализуемое через индукцию апоптоза.
Специфический иммунный ответ на инфицированные вирусом клетки со стороны CD8+ цитотоксических T-лимфоцитов и NK-клеток.
Взаимодействуя с макрофагами, ВИЧ подавляет их антиген-представляюшую функцию. Таким образом, нарушается цикл активации Т-хелперов с развитием специфического иммунного «паралича».
Моноциты под действием ВИЧ гибнут медленнее, чем CD4+ лимфоциты. В зараженных клетках вирус способен размножаться (формируется резервуар вируса в организме), что приводит их или к гибели, или к изменению уровня продуцируемых цитокинов, что, в свою очередь, приводит к формированию цитокинового дисбаланса. При СПИДе антимикробные функции моноцитов сохраняются, но значительно снижаются.
В целом, все перечисленные изменения ведут к значительной супрессии иммунной системы, что в дальнейшем способствует развитию различных оппортунистических инфекций, в свою очередь также подавляющих иммунитет. Таким образом, иммунопатологические проявления ВИЧ-инфекции исключительно многообразны, что и приводит к полному поражению иммунной системы, организм становится «голым среди волков» оппортунистических инфекций.

Новые варианты вируса СПИДа
В апреле 1986 года в журнале «Сайенс» было опубликовано сообщение, что группа американских ученых выделила у здоровых людей в Сенегале вирус, сходный с вирусом африканских зеленых мартышек. Сыворотки зараженных людей содержали антитела, реагирующие с антигенами вируса мартышек, но не давали реакции (или они были слабыми) с антигенами ВИЧ. Предполагалось, что вирус мог быть предшественником ВИЧ. Авторы наименовали выделенный вирус HTLV-4.
HTLV-4, подобно ВИЧ, инфицирует T-хелперы, но не убивает их. Электронный микроскоп не зафиксировал его отличий от ВИЧ. По мнению исследователей, хотя HTLV-4 инфицирует T-хелперы у клинически здоровых людей, не исключено, что в последующем они заболеют.
В конце 1986 года Монтанье и сотрудники объявили об открытии нового вируса у двух больных СПИДом. По своему строению он не отличался от ВИЧ, тоже убивал T-хелперы, но, в противоположность ВИЧ, в сыворотках больных отсутствовали антитела к последнему и РНК обоих вирусов не были идентичны. Авторы обозначили новый вирус как HIV-2 (ВИЧ-2). Сыворотки больных при ВИЧ-2 реагировали с вирусом зеленых мартышек, поэтому Монтанье считает, что у них может быть общее происхождение.
Сравнительное изучение геномов ВИЧ-1 и ВИЧ-2 показало, что в эволюционном плане ВИЧ-2 далеко отстоит от ВИЧ-1. Авторы высказывают предположение, что оба вируса существовали задолго до возникновения современной эпидемии СПИДа. В некоторых странах Западной Африки встречены типичные случаи СПИДа при отсутствии антител к ВИЧ. У больных выделены ретровирусы, которые подобно ВИЧ-1, обладают сродством к CD4+-хелперам и вызывают их гибель. ВИЧ-2 обнаруживается, главным образом, в Западной Африке. Он родственен возбудителю СПИД-подобного заболевания у макак и способен инфицировать разные виды приматов, удаленные от человека на лестнице эволюции, тогда как ВИЧ-1 заражает только людей и шимпанзе.
Предполагается, что непатогенный вирус HTLV-4 эволюционировал в безвредный вирус африканских зеленых мартышек, который затем превратился в патогенный ВИЧ-2 предшественник ВИЧ-1.
Изучение СПИД стимулировало поиски сходных возбудителей. Помимо ВИЧ-1, в разных странах, преимущественно в Западной Африке, встречаются различные ВИЧ-подобные варианты вируса, патогенные и непатогенные для человека. С другой стороны, в этих же странах циркулируют варианты обезьяньих вирусов. Возможно, что новые ВИЧ-подобные вирусы человека больше сходны по своим биологическим и антигенным свойствам с обезьяньими вирусами, чем с ВИЧ.
Можно предположить, что по мере исследований будут найдены неизвестные ранее разновидности ВИЧ-подобных вирусов человека. Сообщение об одном из таких открытий появилось в 1990 году. Предполагается, что выделен новый тип вируса иммунодефицита человека ВИЧ-3. Вирус выделен от клинически здоровой женщины, которая была половым партнером положительного по антителам к ВИЧ мужчины. Сыворотка женщины давала слабо положительную реакцию на наличие антител к ВИЧ. Более детальное изучение обнаруженного ретровируса показало, что выделенный изолят не является ВИЧ-1. Сравнение белков выделенного изолята с белками ВИЧ-1 и ВИЧ-2 выявило, что их молекулярная масса отличается от соответствующих белков ВИЧ-1 и ВИЧ-2.
Нуклеотидная последовательность генома выделенного вируса существенно отличается от последовательностей геномов ВИЧ-1 и ВИЧ-2. 3'-концевая последовательность вирусного генома отличается примерно на 30% от 3'-концевой последовательности ВИЧ-1 и более, чем на 50% от последовательности ВИЧ-2. Обнаруженные отличия дают основания полагать, что выделен новый, третий представитель семейства вирусов-возбудителей СПИД ВИЧ-3.

9.3.2. Прионы (Неопределенный таксон)
Природные медленные инфекции (подострые спонгиозные энцефалопатии), вызываемые «неканоническими вирусами», известны давно. Это куру, болезнь Крейцфельдта-Якоба, синдром Герстманна-Штраус-слера-Шейнкера и смертельная семейная бессонница у людей, скрепи у овец и коз, губчатообразная энцефалопатия у крупного рогатого скота и др. Основной особенностью этих заболеваний является то, что все они связаны с патологией центральной нервной системы (продолговатый и средний отделы головного мозга). Размножение инфекционного агента при таких заболеваниях идет очень медленно и сопровождается нарастанием симптомов энцефалопатии в течение нескольких месяцев или лет с последующей деменцией и неизбежной смертью. Инфекционный агент не вызывает иммунного ответа, не способен индуцировать интерферон и не чувствителен к его действию. За доказательство небактериальной инфекционной природы куру, скрепи и болезни Крейцфельдта-Якоба в 1976 году Гайдушеку была присуждена Нобелевская премия.
На первых этапах изучения природы инфекционных агентов этих заболеваний в тканях мозга умерших были обнаружены белковые фибриллы размером 10-20x100 нм, способные к агрегации с образованием еще больших филаментов, однако морфологически различимые вирионы обнаружены не были. Также не было обнаружено и присутствие в фибриллах нуклеиновой кислоты. Долгое время считалось, что отсутствие нуклеиновой кислоты у инфекционных агентов куру и скрепи связано с методическими ошибками. Однако интенсивное развитие молекулярной биологии вирусов позволило уяснить, что это не так, и что причиной спонгиозных энцефалопатий является новый инфекционный агент белковой природы прион. Концепция прионовой природы губчатообразных спонгиозных энцефалопатии разработана американским ученым Стенли Прузинером, за что в 1997 г. он также получил Нобелевскую премию. Таким образом, за расшифровку природы прионовых заболеваний в разное время исследователи получили две Нобелевские премии, что отражает исключительную сложность и драматизм решаемой ими проблемы.
Прионы (proteinaceous infections particle) белковые инфекционные частицы. Новый инфекционный агент белковой природы, не содержащий нуклеиновой кислоты, классифицирован в пределах царства Vira в виде неопределенного таксона Prione. Инфекционный модифицированный прион обозначают PrPsc (от screpi). Этот белок имеет нормальный клеточный аналог PrPc (от cellular), который превращается в модифицированный PrPsc в ходе посттрансляционных изменений.
Нормальный клеточный прионовый белок играет чрезвычайно важную роль в жизнедеятельности организма: участвует в передаче нервных импульсов и в поддержании суточных ритмов, регулируя циклы активности и покоя в клетках, органах и в организме в целом.
Нормальная клеточная изоформа приона (PrPc) это белок с м.м. 33-35 кД. Его концентрация в норме достигает 1 мкг/г ткани мозга. Белок является мембранной молекулой, заякоренной на поверхности клеток гликозилинозитольным фосфолипидным якорем (GPI). PrPc синтезируется в шероховатом эндоплазм этическом ретикулюме. Затем от M-конца отщепляется сигнальный пептид длиной 22 аминокислоты, а от C-конца пептид длиной 23 аминокислоты, после чего к C-концу прикрепляется GPI и белок транспортируется на поверхность клетки. Человеческий PrPc состоит из 253 аминокислот. Из них 40% аминокислот находится в составе
·-спиралей и 3% в виде
·-структур.
В молекуле приона установлено наличие 4
·-спиральных доменов -H1, H2, HЗ и H4. Домен H1 соответствует трансмембранному участку и отсутствует у искусственно созданных рекомбинантных секретируемых форм. M-конец прионового белка связывает два атома меди. Медь влияет на содержание
·-спирали в белке. Предполагается, что накопление в нервной ткани прионовых белков может привести к нарушению метаболизма меди вследствие его повышенного связывания. Снижение уровня меди может приводить к дисфункции ЦНС, как это показано для человека и животных, но не доказано в отношении прионов.
Инфекционная форма приона (PrPsc) также обнаруживается на поверхности нервных клеток, но в гораздо больших концентрациях более 10 мкг/г ткани мозга. PrPsc имеет ту же первичную структуру, что и PrPc, но отличается от нормального белка вторичной и третичной структурой то есть характером укладки полипептидной цепи. В структуре PrPsc, в отличие от PrPc, обнаруживается существенно больше
·-складчатых структур (43%) при одновременном уменьшении содержания
·-спиралей. Белок PrPsc является конформационным изомером нормального прионового белка. Изменение конформации происходит при непосредственном взаимодействии нормального и прионового белка. Идентифицировано два участка белковой молекулы, с помощью которых происходит взаимодействие. Эти участки соответствуют аминокислотам в положении 95-170 и 180-205.
Молекулярно-генетические исследования с использованием трансгенов показали, что PrPsc действует в качестве матрицы для рефолдинга (изменения конформационной структуры) PrPc в PrPsc. В этом процессе принимает участие дополнительный белок (X-фактор), который, по всей вероятности, является шапероном (вспомогательным белком, поддерживающим конформационное состояние белка). В ходе превращения нормального клеточного прионового белка в PrPsc, часть его
·-спиральных и неупорядоченных участков переходит в форму
·-структуры.
Наиболее существенным является то, что при этом аминокислотная последовательность остается соответствующей нормальному белку. На протяжении более чем 25 лет общепринятым было то, что аминокислотная последовательность определяет одну биологически активную конформацию белка. На примере прионового белка показано, что одна и та же первичная структура может принимать, по крайней мере, 2 разные конформации, что и объясняет существование PrPsc и PrPc. Другими словами, репликация инфекционного приона представляет собой уникальный механизм конформационной перестройки белковой молекулы, индуцируемой и облегчаемой другой белковой молекулой.
Ограниченный протеолиз PrPsc, происходящий на клеточной поверхности, приводит к отщеплению с N-конца 67 аминокислот. В результате образуется белок 27-30 кД, который и является протеазоустойчивым и термостабильным инфекционным прионом. Этот белок гидрофобен и склонен к образованию как in vitro, так и в мозговой ткани агрегатов в виде нерегулярных стержнеподобных фибрилл неправильной формы, сходных с фибриллами амилоида. Процесс агрегации происходит спонтанно и может приобретать характер цепной реакции. Образование на поверхности нейрона агрегатов миелоидоподобных фибрилл и бляшек приводит на ранних стадиях инфекции к слиянию и гибели отдельных клеток, а позже к очаговому дегенеративному перерождению серого вещества мозга. У больных губчатообразной энцефалопатией в головном мозге образуются полости. Мозг становится похожим на губку.
Уникальной особенностью прионовых заболеваний является то, что они могут возникать двумя путями. Известны две формы прионовых болезней наследственная и инфекционная. Нужно заметить, что вне зависимости от возникновения заболевания, оно может быть передано далее инфекционным путем.
Наследственная форма прионовых заболеваний проявляется редко, предполагается, что у людей наследственная форма прионового заболевания возникает с частотой 1 случай в год на 1 млн. человек. Эта форма заболевания является результатом точковых мутаций в гене PrP, определяющих изменение первичной структуры белка и обеспечивающих его превращение в инфекционный прион, который индуцирует превращение всех вновь синтезированных молекул в конформационно измененную форму.
Ген PrP расположен у человека в коротком плече хромосомы 20, а у мыши в коротком плече хромосомы 2. Животные, гомозиготные по делеции гена PrP, устойчивы к прионовым заболеваниям, т. к. не имеют клеточного белка, способного к конформационным изменениям. Нормальный ген PrP имеет одну OPC внутри одного экзона, которая ограничена 5' и 3' HTP. Такая особенность гена белка-приона исключает возможность происхождения различных форм прионового белка путем альтернативного сплайсинга РНК.
Ген PrP является высококонсервативным и характеризуется высоким уровнем экспрессии в нейронах, где концентрация мРНК PrPc в 50 раз выше, чем в глии. В настоящее время известно более 20 мутаций PrP-гена, приводящих к наследуемой прионовой болезни. Все известные точковые мутации PrP, имеющие биологическое значение, происходят или внутри или рядом с зонами, определяющими вторичную структуру PrPc, и дестабилизируют ее. Показано существование внутримолекулярной дисульфидной связи, наличие которой необходимо для образования PrPsc. Мутантный ген PrP генетически связан с развитием семейной прионовой болезни.
Еще одна форма наследственной прионовой болезни может возникать как следствие увеличения N-концевых повторов аминокислотной последовательности прионового белка. На N-конце обычно находится 5 повторов, состоящих из 8 аминокислот, которые играют существенную роль в организации структуры белка и влияют на возможность его превращения в прион-инфекционную форму. Показано, что увеличение числа повторов до 12 приводит к наследственной прионовой болезни.
Инфекционная форма заболевания распространена гораздо шире. Примером могут служить болезни куру, скрепи, губчатый энцефалит крупного рогатого скота. Болезнь Крейцфельдта-Якоба также вызывается инфекционным прионом. Однако до 15% случаев заболевания имеют наследственную природу. Инфекционная форма заболевания возникает вследствие попадания в организм измененной формы прионового белка с последующим превращением нормальных белковых молекул в патогенную форму приона.
Существует несколько вариантов укладки конформационно измененных молекул. Такие варианты воспроизводятся при последующем попадании прионового белка в новый организм Важным является то, что при этом не происходит каких-либо изменений в первичной структуре белка и в строении кодирующего его гена.
Инфицирование патогенными прионами здоровых лиц может происходить при попадании в организм ксеногенных образцов тканей, и в первую очередь мозговых тканей, а также в результате использования недостаточно стерилизованного инструментария (парентерально). Основным механизмом передачи инфекционных прионов признан алиментарный, осуществляемый в процессе питания. Так, распространение первого из описанных хронических нейродегенеративных заболеваний человека куру (дрожание, тряска), поражавших аборигенов Новой Гвинеи, было связано с ритуальным каннибализмом.
Источником заболеваний крупного рогатого скота губчатообразной энцефалопатией, приобретавших характер эпизоотии, явилось добавление в рацион их питания мясокостной муки, получаемой из туш овец, среди которых были животные, больные скрепи. Возможность осуществления пищевого пути передачи прионных инфекций связана с особенностями свойств прионного белка, его уникальной устойчивостью к воздействию физико-химических факторов. Отметим его протеазоустойчивость и устойчивость к высоким температурам.
Инфекционные прионы, попав в организм тем или иным путем, аккумулируются в клетках органов иммунной системы (миндалинах, тимусе, лимфатических узлах, особенно в селезенке). Прионы обнаруживаются в В-лимфоцитах, разносятся током крови по организму. Нормальный прионовый белок является мембранным протеином и синтезируется клетками иммунной системы. В 2001 году он был включен в номенклатуру дифференцировочных антигенов клеток иммунной системы и обозначен как CD232 антиген.
Предполагается, что из клеток иммунной системы инфекционные прионы или их производные могут каким-то образом передаваться на мембрану нервных клеток и транспортироваться вдоль аксонов в разные участки головного мозга. Здесь они служат причиной конформационных перестроек нормального клеточного белка и образования агрегатов кристаллической формы, состоящих из конформационно модифицированного приона.
Начавшаяся в 1986 г. эпизоотия коровьего бешенства в Великобритании явилась причиной обсуждения проблемы межвидовой трансмиссии инфекционных прионов. Эпизоотия была связана с кормлением животных мясокостной мукой, полученной из туш овец, среди которых были больные скрепи. Возможность трансмиссии была подтверждена в эксперименте на трансгенных мышах, оказавшихся чувствительными к прионам хомяка. Вопрос о преодолении прионами межвидового барьера был поднят повторно, когда в 1995 г. от новой болезни, очень похожей ,на болезнь Крейцфельдта-Якоба, впервые стали умирать люди молодого возраста. Официальная причина употребление в пищу говядины, зараженной возбудителем коровьего бешенства. К 2001 г. умерли 80 больных. Следствием произошедших событий явилось ограничение потребления говядины в Европе.
В большинстве случаев межвидовые барьеры не абсолютны, они не препятствуют, а лишь затрудняют передачу инфекционных агентов от особей одного вида к особям другого вида. Перенос прионов между видами почти всегда сопровождается продолжительным инкубационным периодом в ходе первого переноса и его уменьшением в ходе последующих пассажей. На сроки инкубационного периода влияют:
величина различий в аминокислотной последовательности прионовых белков донора и реципиента, поскольку прионы, синтезируемые de novo, отражают последовательность гена хозяина, а не донорской инфекционной молекулы;
недавно обнаруженные штаммовые особенности приона, проявляющиеся в различной третичной структуре инфекционного белка. Они обусловлены наличием естественного полиморфизма, возникающего в результате мутаций гена, или же появлением новых форм прионов без изменений первичной структуры белка;
видовая специфичность X-фактора, связывающего клеточный прион и ускоряющего его переход в инфекционную форму.
Феномен прионов распространен в природе более широко, чем представлялось ранее. Белки с прионоподобными свойствами обнаружены у низших эукариот у дрожжей Saccharomyces и гриба Podospora.

9.4. Гепатотропные вирусы

Вирусы, обладающие тропностью к гепатоцитам и вызывающие гепатит, различаются видом генома (ДНК- и РНК-содержащие) и механизмом передачи (энтеральный и парентеральный). Группа вирусов гепатита, объединенных парентеральной передачей, включает вирусы гепатита B, C, G, D; энтеральной вирусы гепатита A, E.

9.4.1. Вирус гепатита B человека (HBV; ВГВ)
Идентификация вируса гепатита B человека (Hepadnaviridae, Orthohepadnavirus) была проведена в два этапа. В 1963 году Бламберг с соавторами обнаружили в крови австралийского аборигена основной поверхностный антиген вируса, названный сначала австралийским антигеном, а затем HBs-антигеном (HBsAg). В 1970 году Дейн дал электронно-микроскопическую характеристику вирусных частиц.
Инфицирование вирусом гепатита B приводит к острому или хроническому гепатиту с последующим возможным развитием цирроза печени и гепатоклеточной карциномы (первичный рак печени). Вирус гепатита B обладает сильным тропизмом к гепатоцитам и продукцией, наряду с инфекционными частицами, большого количества дефектных неинфекционных вирусных частиц, которые могут обнаруживаться в крови в высоких концентрациях (до 0,5 мг/мл). Вирусы персистируют в печени и крови на протяжении многих лет, а нередко и всю жизнь.
Вирионы HBV или «частицы Дейна» выглядят как сферические частицы диаметром 42-47 нм. Внутри сферы находится плотная сердцевина диаметром 22-25 нм. Оболочка вируса построена из трех полипептидов, названных большим (L), средним (M) и малым (S) белками, а также из мембранных липидов клетки-хозяина (рис. 20). Иначе эти белки называют пре-S1, пре-S2 и HBsAg.

Рис. 20. Строение вириона HBV

Капсид состоит из 240 мономеров сердцевинного core-белка (HBcAg), образующих икосаэдрическую структуру с триангулярным числом T = 4. В капсиде заключена частично двухнитевая геномная вирусная ДНК и вирусная ДНК-полимераза (обратная транскриптаза).
У больных вирусным гепатитом B количество вирусных частиц может колебаться от 103 до 109 на 1 мл крови. Кроме частиц Дейна сыворотка больных содержит также свободную нуклеиновую кислоту вируса, липид-содержащие сфероподобные и стержнеподобные (нитевидные) субвирусные структуры, построенные, в основном, из S-белка и небольшого количества M и L белков. Субвирусные сфероподобные структуры не содержат ДНК и имеют диаметр 22 нм. Стержнеобразные субвирусные структуры также лишены ДНК и белка капсида, имеют ширину 20 нм и длину до 200 нм. Концентрация субвирусных структур может превышать концентрацию полных вирионов в 100-1000 раз.
Геном HBV представлен частично двухнитевой ДНК длиной 3,2-3,3 т.п.н., находящейся в кольцевой форме. Такие размеры ДНК являются наименьшими среди всех известных вирусов животных. 5'-концы двух нитей ДНК связаны перекрывающимися последовательностями примерно из 220 нуклеотидов. В то время как минус-нить содержит полную копию вирусного генома, плюс-нить ДНК является неполной и составляет примерно 60% от длины минус-нити.
5'-конец минус-нити ковалентно связан с вирусной ДНК-полимеразой. Минус-нить ДНК является матрицей для синтеза транскриптов вирусной РНК и имеет 4 открытые рамки считывания (OPC).
Первая OPC кодирует вирусный капсидный белок молекулярной массой 21 кД, названный HBcore-антиген (HBcAg), и полипептид прекор (pre-core) массой 16-18 кД, названный HBeAg. В отличие от HBcAg входящего в состав капсида, HBeAg секретируется клеткой в растворимой форме. Функция HBeAg неизвестна. Этот полипептид транслируется с инициирующего кодона, предшествующего терминирующему кодону AUG core-белка.
Вторая OPC кодирует белки оболочки пре-S1 (L), пре-S2 (M) и HBsAg (S). S-белок (HBsAg) является основным трансмембранным поверхностным компонентом частиц Дейна и субвирусных структур. Существуют гликозилированные и негликозилированные формы HBsAg. Белок способен к самосборке, результатом которой является образование субвирусных структур. Сборка приводит к образованию дисульфидных связей между S-белками.
Трансляция L (пре-S1) и M (пре-S2) белков начинается с инициирующих кодонов, локализованных выше места инициации трансляции S-белка. Все три полипептида имеют одинаковые C-концы, но разные N-концы, связанные с олигосахаридами. N-конец L-полипептида модифицирован миристиновой кислотой. L-белок, вероятно, служит лигандом рецептора вируса гепатита B. Обнаружено, что при хроническом инфицировании долговременная экспрессия L-белка в гепатоцитах может приводить к развитию гепатоклеточной карциномы. Уровень экспресии L и M белков составляет 5-15% и 1-2% в сравнении с уровнем экспресии S-белка.
Третья OPC содержит ген вирусной обратной транскриптазы. Молекулярная масса белка, обладающего транскриптазной активностью, составляет 90 кДа. Протеин выполняет несколько функций, необходимых для синтеза вирусного генома на матрице прегеномной РНК:
РНК-зависимой ДНК-полимеразной активностью (обратная транскриптаза);
ДНК-зависимой ДНК-полимеразной активностью, необходимой для синтеза плюс-нити ДНК;
активностью РНКазы H, позволяющей вирусному протеину обеспечивать расщепление РНК в гетеродуплексе РНК-ДНК;
ДНК-полимераза действует как праймер при обратной транскрипции минус-нити ДНК (принцип самопраймирования). Ферментативная активность данного протеина характерна для частиц Дейна и нуклеокапсидных частиц, локализованных в ядре инфицированных гепатоцитов.
Четвертая OPC кодирует протеин массой 170 кДа, названный pX и функционирующий в качестве трансактиватора промоторов, включая промоторы генов core и S. Недавно обнаружено, что белок X обладает протеинкиназной активностью. Однако в полном объеме роль X-белка в механизмах реализации инфекции пока неясна. Показано, что X-белок играет важную роль в индукции гепатомы.
Механизм, с помощью которого гепаднавирусы проникают в клетку, пока неизвестен. После инфицирования клетки внутренний компонент вируса транспортируется в ядро. По мере доставки в ядро плюс-нить ДНК достраивается (репарируется), и геном вируса превращается в ковалентно-замкнутую кольцевую молекулу (cccDNA) длиной 3,2 т.п.н., которая выполняет роль матрицы для транскрипции мРНК и прегеномной РНК длиной 3,4 т.п.н. Интересно, что прегеномная РНК длиннее геномной вирусной ДНК. Она характеризуется удлиненными 5’- и 3’-концами и короткими повторами нуклеотидной последовательности, названными DR1 и DR2.
Вирус гепатита B очень эффективно использует свой небольшой геном. С одних и тех же последовательностей геномной ДНК может считываться несколько различных матричных РНК. В HBV-инфицированных клетках печени обнаруживается три вида субгеномных мРНК и прегеномная (+)РНК. Они имеют перекрывающиеся нуклеотидные последовательности и служат матрицами для синтеза всех вирусных белков. После того, как РНК синтезируются в ядре, происходит их перемещение в цитоплазму. Здесь 3 вида субгеномных РНК выступают в роли матриц для синтеза разных белков: L-протеина; M- и S-протеинов; и X-протеина, соответственно.
Прегеномная (+)РНК транслирует core-белок и полимеразу. После синтеза этих белков прегеномная РНК упаковывается вместе с полимеразой во вновь формирующиеся капсиды, построенные из core-белка. Внутри капсидов происходит обратная транскрипция с образованием минус-нити ДНК, а затем и плюс-цепи вирусной ДНК. Сформировавшиеся капсиды либо направляются обратно в ядро, либо транспортируются во внеклеточное пространство. В первом случае они достраивают ДНК до полностью замкнутой двухцепочечной цепи и включаются в наработку новых копий вирусных РНК. Во втором случае они покрываются оболочкой, состоящей из компонентов вирусного происхождения (M-, L-, S-протеины) и мембранных компонентов клетки хозяина.
Все вновь синтезируемые вирусные белки подвергаются посттрансляционной модификации. Core-белок фосфорилируется по остаткам серина протеинкиназами клетки-хозяина. Поверхностные белки связываются с олигосахаридами. Одновременно с core-белком синтезируется пре-core, который подвергается эндопротеолизу и секретируется клеткой отдельно от вирусных частиц. Секретируемую в кровь форму пре-core называют HBe-антиген.
Сборка нуклеокапсидов и вирионов происходит на внутриклеточных мембранах. Собранные зрелые вирусные частицы (частицы Дейна) накапливаются внутри цистерн ЭПР и транспортируются по секреторному пути к цитоплазматической мембране. Затем они выбрасывается из инфицированной клетки в кровь. Таким же образом выделяются субвирусные частицы, не содержащие нуклеокапсидов и образующиеся вследствие избыточного синтеза поверхностных вирусных белков.

HBV-инфекция. От человека к человеку вирус передается парентерально. Чаще всего передача вируса происходит при переливании инфицированной крови. Возможна передача половым путем, а также от матери к ребенку. В нашей стране в последние несколько лет распространение вирусного гепатита B нередко происходит за счет передачи вируса из крови в кровь при внутривенном употреблении наркотиков.
В отдельных районах Азии и Африки большое число случаев инфицирования связано с перинатальным инфицированием плода от матери. В таких случаях заболевание протекает скрытно или в легкой форме, но с высокой частотой хронизации. В западных странах чаще инфицируются взрослые.
Инкубационный период заболевания составляет от 12 до 24 недель. В большинстве случаев заболевание протекает в форме острого гепатита завершаясь выздоровлением, и только в 5-10% случаев переходит в хронический гепатит В. Чаще болеют мужчины. В мире насчитывается свыше 200 млн. носителей вируса гепатита В.
При хроническом носительстве вируса гепатита B возможно встраивание вируса в геном хозяина. Специфический механизм интеграции вирусного генома в геном человека неизвестен, однако предполагается, что встраивание вируса сопряжено с повышенным риском развития цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы, часто обнаруживаемой у жителей Центральной Африки, среди которых распространен хронический вирусный гепатит В. Ежегодно в мире от HBV-инфекции умирает около 2 млн. человек.
Широко используемый маркер инфицирования вирусом гепатита B это HBs-антиген (S-протеин). Наличие вирусной ДНК в сыворотке крови также является маркером инфицирования вирусом гепатита B. Маркером активной репликации вируса служит присутствие в крови HBe-антигена. Некоторые носители HBs-антигена, у которых в крови не определяется HBe-антиген или вирусная ДНК, но присутствуют антитела к HBe-антигену, могут не иметь инфекционного вируса и не передавать инфекцию.
Причины, по которым одни лица переболевают острым гепатитом B и выздоравливают, а другие становятся хроническими носителями вируса, видимо, в большей степени связаны с состоянием иммунной системы организма-хозяина, чем со свойствами вируса. При остром гепатите B обычно регистрируется сильный T-клеточный ответ, характеризующийся мощной поликлональной активацией как CD4-положительных T-лимфоцитов (T-хелперы), так и CD8-положительных цитотоксических T-лимфоцитов. Следствием этого является наработка противовирусных антител и клонов вирусоспецифических цитотоксических клеток. При хроническом гепатите В, наоборот, T-клеточный ответ очень слаб, что служит причиной развития персистирующей инфекции.
Аналогичным образом, формирование хронического гепатита B у детей, рожденных от HBV-инфицированных матерей, связано с толерантностью новорожденных к вирусу. HBe-антиген вируса гепатита B способен проникать через плаценту в организм эмбриона. Это приводит к тому, что иммунная система новорожденного настраивается на восприятие вирусных белков как своих собственных. Следствием является развитие хронического гепатита B.
Несомненная роль в защите от вируса отводится антителам, способным нейтрализовать вирус, а также участвовать в реализации антителозависимого клеточного ответа. Взаимодействие антител с HBs-антигеном приводит к образованию крупных агрегатов «антиген-антитело». Образование таких агрегатов лежит в основе болезни иммунных комплексов, сопровождающей вирусный гепатит B. Важную функцию в противовирусном иммунитете выполняют дендритные клетки и макрофаги. Они одними из первых встречают попавшие в организм вирусные частицы, осуществляют мощный выброс цитокинов, привлекают другие фагоцитирующие клетки, натуральные киллеры и инициируют адаптивный иммунный ответ, приводящий к выработке специфических клонов лимфоцитов и противовирусных антител.
Вирус гепатита B является нецитопатическим вирусом. Его репликация не приводит к разрушению клетки или воспалительным явлениям. В качестве основного механизма повреждения печени рассматривают цитотоксический эффект лимфоцитов. Элиминация вируса происходит вследствие цитотоксического действия T-лимфоцитов с последующей гибелью вирус-инфицированных клеток путем апоптоза. Известен также нецитопатический способ элиминации вируса, основанный на воздействии интерферонов альфа и гамма. Воздействуя на клеточный метаболизм, последние способны нарушать репликативный цикл вируса.
В настоящее время вирусный гепатит B рассматривают как управляемую инфекцию. Существуют вакцины против гепатита B, основанные на рекомбинантном HBs-антигене. Организовывается вакцинация детей, подростов и лиц, подверженных повышенному риску инфицирования (контингенты риска). В целях предупреждения распространения инфекции проводится обязательное и массовое тестирование переливаемой крови на наличие в ней HBs-антигена. Важным моментом в борьбе с распространением инфекции является практика применения одноразового медицинского инструментария (перчатки, шприцы и т.д.).

9.4.2. Вирус гепатита Дельта (HDV; ВГД)
Вирус гепатита Дельта выделен в самостоятельный блуждающий род Deltavirus в кластере (-)РНК-геномных вирусов. Это вирус-сателлит, требующий для осуществления своего жизненного цикла вируса-помощника (вирус гепатита B) и использующий его белок для формирования вириона.
Вирус обнаружен в 1977 году. Через три года вирус был идентифицирован как возбудитель нового гепатита, ассоциированного с вирусным гепатитом B. Выявляемый в ядре инфицированных гепатоцитов новый вирусный антиген напоминал по своей локализации HBcore-антиген и был назван дельта-антигеном (HDAg). Клонирование генома с последующим секвенированием выявило уникальное строение вирусной РНК, которая является замкнутой и напоминает РНК растительных патогенов, вирусоидов и вироидов.
Вирион имеет диаметр 36 нм и несет в своем составе HBsAg. Геном HDV представлен однонитевой замкнутой РНК длиной 1,7 т.н. с высокой степенью внутримолекулярной комплементарности. Примерно 70% нуклеотидов образуют пары. В естественных условиях РНК HDV образует стержнеобразную двухнитевую структуру, содержащую 60% ГЦ пар.
РНК HDV содержит несколько OPC, локализованных как на плюс- так и на минус-нитях. Из них только одна рамка неизменна среди всех исследованных изолятов вируса. Она принадлежит минус-нити, определяется в инфицированных клетках и кодирует дельта-антиген. Часть РНК HDV имеет гомологию с 7S РНК млекопитающих.
Обе нити РНК (геномная и антигеномная) обладают аутокаталитической расщепляющей и лигирующей (рибозимазной) активностью. Расщепление идет в присутствии ионов магния и в отсутствии каких-либо белков. Нуклеотидная последовательность, необходимая для проявления рибозимазной активности, состоит из 85 нуклеотидов и локализована вокруг сайта расщепления. Последовательность РНК HDV, с помощью которой осуществляется рибозимазная активность, отличается от аналогичной последовательности РНК вироидов и не перекрывается с участком, кодирующим дельта-антиген.
РНК HDV обладает высокой генетической гетерогенностью. Изоляты, собранные в разных географический регионах, обнаруживают вариабельность, достигающую 21%. Имеется 5 генотипов HDV. Изоляты, выделенные от одного и того же больного, также могут различаться по структуре РНК. Такие различия достигают 0,5-1,0%. У больных хронической HDV-инфекцией мутации накапливаются со скоростью 10-3-10-2 на нуклеотид в год. Необычной характеристикой этих мутаций является то, что заменяется C на U или A на G. В некоторых случаях наблюдаются делеции генетического материала.
На рамке считывания, кодирующей дельта-антиген, транскрибируется две матричные РНК, отличающиеся положением терминирующего кодона на C-конце. Матричные РНК кодируют два белка, в сумме составляющих HDAg и имеющих молекулярную массу 24 и 27 кД. Второй белок содержит дополнительные 19 аминокислот на C-конце. В крови эти два протеина находятся в равных количествах. В печени их количество сильно варьирует.
HDAg фосфорилирован, но не гликозилирован. Специфически связывается с РНК. В инфицированных клетках он локализуется исключительно в ядре. На поверхности вириона HDAg не представлен и может быть выявлен только после разрушения вирусной оболочки, содержащей HBsAg.
Белки, составляющие HDAg имеют несколько функциональных доменов. Первый домен участвует в направленном транспорте HDAg в ядро и расположен в первой трети N-концевой аминокислотной последовательности. Второй домен содержит РНК-связывающий мотив и находится в средней части аминокислотной последовательности. Третий домен состоит из 19 C-концевых аминокислот и способен взаимодействовать с HBsAg в ходе сборки частиц вируса. Кроме того, он принимает участие в ингибировании репликации вирусной РНК.
Способ проникновения вируса в клетку неизвестен. Вероятно, вирус проникает в клетку за счет взаимодействия HBs-антигена с рецептором. Проникнув в клетку, РНК HDV реплицируется уже без помощи вируса гепатита B. На первом этапе РНК HDV с помощью дельта-антигена транспортируется в ядро. Здесь РНК реплицируется с участием РНК-полимеразы II клетки-хозяина. Репликация идет по типу катящегося кольца, давая длинную молекулу антигеномной РНК, имеющую множество повторов генома вируса. Мультиплицированная антигеномная РНК расщепляется аутокаталитически до отдельных геномных единиц. Затем мономерная антигеномная РНК аутокаталитически лигируется в замкнутую молекулу. Результатом является наработка множества копий негативной геномной РНК, каждая из которых аутокаталитически замыкается в кольцо, завершая цикл репликации.
На замкнутой минус-нити РНК вируса синтезируются субгеномные плюс-цепи, длиной около 0,8 kb. Они транспортируются в цитоплазму, где служат матричной РНК для трансляции HDAg. Большой и малый белки, составляющие HDAg транслируются двумя отличающимися мРНК. В первую очередь синтезируется малый HDAg, который транспортируется в ядро, где его присутствие необходимо для репликации РНК. В ходе репликации геномной РНК происходят мутации, изменяющие терминирующий кодон для синтеза HDAg. Мутации приводят к изменению терминирующего кодона и продукции большой формы HDAg. Последняя, соединяясь с малым HDAg, ингибирует дальнейшую репликацию РНК.
После трансляции обе формы HDAg фосфорилируются и путем самосборки упаковываются в вирусные частицы. Комплекс РНК- HDAg взаимодействует с HBsAg с образованием вирусной частицы. Капсид образующегося потомства содержит примерно равные количества большого и малого HDAg. Оболочка вируса содержит все три вида поверхностных белков вируса гепатита B, но в разных соотношениях. Преимущественно оболочка построена из HBs-антигена.
HDV-инфекция. Передача HDV от человека к человеку происходит только в результате коинфицирования или суперинфицирования вирусами гепатитов B и Дельта. В среднем примерно 5% носителей вируса гепатита B инфицированы вирусом гепатита Дельта.
HDV-инфекция встречается во всех регионах мира. Существуют районы с повышенной встречаемостью HDV. Такими районами являются Южная Европа, Бразилия, Западная Африка, острова Тихого океана. В Азии HDV встречается сравнительно редко, несмотря на высокую частоту встречаемости гепатита B. HDV-инфекция имеет спорадический характер и часто ассоциирована с внутривенными манипуляциями. Возможна передача вируса половым путем.
Предполагаются два возможных патогенетических механизма развития инфекции. Первый заключается в прямом цитопатическом действии вируса на клетку, другой связан с иммуно-опосредованной цитопатичностью.
Инкубационный период длится 3-7 недель. Заболевание обычно начинается с неспецифических симптомов (повышенная утомляемость, отсутствие аппетита, тошнота), затем появляются типичные признаки гепатита, такие как желтуха и повышенный уровень трансам и казной активности в крови больного. В случае коинфицирования HBV и HDV острые симптомы проходят через 12-16 недель. Если болезнь является результатом суперинфекции, то инфицирование часто приводит к хроническому гепатиту. 60-70% больных хроническим гепатитом Дельта заболевают циррозом печени. Результатом HDV -инфекции может явиться фульминантный (бурно протекающий) гепатит, характеризующийся высокой вероятностью смертельного исхода. В целом, при гепатите Дельта смертность намного выше, чем при других вирусных гепатитах. Прямой связи между HDV -инфекцией и гепатоклеточной карциномой не выявлено, однако цирроз печени увеличивает риск заболеваемости первичным раком печени. Суперинфицирование HBV-носителей нередко приводит к ингибированию репликации HBV. В ходе острой фазы HDV-инфекции ингибируется синтез HBs-антигена и ДНК HBV. При хронической инфекции также супрессируются маркеры вирусного гепатита B. Известно, что HDAg в состоянии ингибировать транскрипцию генома HBV.
В ходе острой фазы гепатита Дельта определяются РНК HDV и HDAg. Затем появляются антитела класса IgM против HDAg. Несколько позже в крови появляются антитела класса IgG против HDAg. Определение антител класса IgM, направленных против HDAg обычно используют для постановки диагноза HDV-инфекции. Все маркеры инфекции, включая IgM и IgG антитела, исчезают через несколько месяцев после выздоровления. При хроническом гепатите Дельта в крови сохраняются антитела обоих классов, а также определяется вирусная РНК.
Вакцина против гепатита Дельта не разработана. Меры профилактики заболевания заключаются в ограничении распространения вирусного гепатита B.

9.4.3. Вирус гепатита C (HCV; ВГС)
Вирус гепатита C (Flaviviridae, Hepacivirus) РНК-содержащий вирус. Долгое время исследователи предполагали существование вируса гепатита C, однако сам вирус оставался неизвестен. Случаи парентерально передаваемого вирусного гепатита, не относящиеся к вирусным гепатитам A, B и D, называли вирусными гепатитами ни-A, ни-B. Решающий шаг в обнаружении этиологического агента таких гепатитов был сделан в 1989 году. У больных гепатитом ни-A, ни-B было выявлено наличие вирусной РНК, характерной для флавивирусов. Последующие исследования позволили идентифицировать обнаруженную РНК, как РНК вируса гепатита C. Была установлена широкая распространенность вируса и способность к частому формированию хронического гепатита с переходом в цирроз печени и гепатоклеточную карциному (первичный рак печени). В настоящее время в мире насчитывается до 500 млн. инфицированных вирусом гепатита C, что характеризует вирус как один из наиболее распространенных вирусных патогенов.
Вирусные частицы имеют оболочку, содержатся в крови в следовых количествах и ассоциированы с липопротеинами низкой плотности и антителами к белкам HCV. Вирусы, выделенные из комплексов с липопротеинами и анти-HCV антителами, имеют диаметр 60-70 им. При электронно-микроскопическом изучении на поверхности вириона выявлены хорошо выраженные выступы высотой 6-8 нм.
HCV инфицирует не только гепатоциты, но и лимфоциты. Рецептором HCV на B-лимфоцитах является молекула TAPA-1 (CD81 антиген), входящая в состав B-клеточного корецептора и относящаяся к тетраспанам, то есть белкам, 4 раза пронизывающим мембрану. Кроме того, известно, что HCV проникает в клетки в составе частиц, образуемых липопротеинами низкой плотности. Липопротеины взаимодействуют с соответствующими рецепторами, локализованными в окаймленных ямках на поверхности клеток и затем поглощаются внутрь клеток.
Геном вируса состоит из однонитевой РНК позитивной полярности длиной 9,4-9,5 т.н. Геном имеет одну открытую рамку считывания и кодирует полипротеин длиной 3008-3037 а.о. в зависимости от генотипа вируса. Кроме различий в длине генома и полипротеина, у разных изолятов вируса выявлена высокая гетерогенность генома на уровне нуклеотидной последовательности. Различия связаны с высокой скоростью мутаций вирусного генома и могут достигать 30%. Изоляты вируса, геном которых имеет различия, достигающие 30%, относят к разным генотипам. Выявлено, по крайней мере 6 различных генотипов и более чем 30 субтипов вируса. Между субтипами различия нуклеотидной последовательности достигают 15%. Инфицирование организма вирусами разных генотипов приводит к развитию гепатита с разной тяжестью течения. В России наиболее распространены генотипы 1b (плохо поддается терапии интерфероном-альфа) и генотип 3a.
На 5'- и 3'-концах генома вируса находятся нетранслируемые регионы (HTP). 5'-HTP состоит из 340 н.о., отличается высокой консервативностью и образует упорядоченную вторичную структуру, состоящую из нескольких шпилек. Функция 5'-HTP заключается в инициации трансляции. Специфически связываясь с рибосомами и факторами трансляции клетки-хозяина, он направляет рибосому к инициирующему кодону AUG в позиции 342, после чего начинается синтез полипротеина.
Полипротеин процессируется комбинацией вирусных протеиназ и протеиназ клетки-хозяина. Идентифицировано 10 белков, на которые расщепляется полипротеин. В первой трети полипротеина, начиная с М-конца, локализованы структурные белки, ближе к С-концу неструктурные (схема 12).
Непосредственно на N-конце полипротеина локализован core-белок, формирующий вирусный капсид. Он освобождается из полипротеина за счет клеточных протеиназ и имеет гидрофобную C-концевую последовательность. Внутри клетки core-белок локализован на мембране ЭПР, а также в ядре клетки. Ядерный core-белок супрессирует отдельные гены клетки-хозяина. Цитоплазматический core-белок специфически подавляет апоптоз инфицированных клеток, обеспечивая длительную персистенцию вируса. Core-белок изменяет также клеточный метаболизм триглицеридов в гепатоцитах. В результате развивается стеаноз (жировое перерождение печени). При образовании нуклеокапсида происходит мультимеризация core-белка и его взаимодействие с вирусной РНК.

Схема 12 . Строение полипротеина вируса гепатита C

Гликопротеины E1 и E2 освобождаются из полипротеина за счет действия сигнальных пептидаз клетки-хозяина. Белки высоко гликозилированы. С белком E2 иногда ассоциирован небольшой протеин p7. При сборке вириона E1 взаимодействует своим C-концом с core-белком, а E2 с NS2-протеином. При этом E1 и E2 образуют комплексы, сшитые дисульфидными связями. Образование комплексов происходит внутри ЭПР с участием шаперона калнексина.
E2 регион генома HCV является наиболее вариабельным регионом. Вариабельность является следствием беспорядочных мутаций. В ходе постоянно идущего мутационного процесса отбираются мутанты, способные уклоняться от действия нейтрализующих антител, продуцируемых иммунной системой хозяина. Скорость мутаций настолько велика, что в организме одного и того же HCV-инфицированного индивидуума возникает множество вариантов вируса, отличающихся от родительского варианта. Такие варианты называют квазивидами. Основная часть возникающих мутаций связана с гипервариабельным участком E2-лротеина, расположенным между 383 и 414 ао.
NS2 протеин является трансмембранным белком. Его C-конец смотрит в просвет цистерн ЭПР, вконец смотрит в цитозоль. NS2 протеин является цинк-зависимой протеазой, разрезающей NS2 и NS3 белки, то есть это аутопротеаза. При расщеплении белков освобождается N-конец NS3, что является важным моментом в репликации HCV.
NS3 белок выполняет несколько различных функций. Во-первых, он участвует в процессинге полипротеина, являясь сериновой протеазой, отщепляющей от полипротеина все неструктурные белки. Причем отщепление NS3 от NS4A является аутокаталитическим процессом. Во-вторых, NS3 белок играет важную роль в репликации вируса, обладая хеликазной и нуклеотидтрифосфатазной активностью. NS3 способен связываться с РНК, отдавая предпочтение двухнитевым структурам. При репликации вируса NS3 белок связывается с поли-U последовательностью на 3'-конце вирусного генома своим РНК-связывающим доменом и затем происходит раскручивание двунитевой РНК, свернутой в шпильки и другие пространственные структуры. Одновременно идет гидролиз нуклеотидтрифосфатов, осуществляемый другим доменом NS3. В третьих, NS3 белок способен специфически взаимодействовать с каталитической субъединицей клеточной протеинкиназы A, участвующей в передаче клеточных сигналов. Длительное присутствие NS3 протеина в клетке может привести к злокачественной трансформации гепатоцитов и развитию гепатоклеточной карциномы.
NS4 регион полипротеина состоит из двух белков NS4A и NS4B. Первый имеет молекулярную массу 8 кДа и при такой небольшой массе обладает несколькими функциями. NS4A протеин является кофактором для NS3 протеазы, образуя с NS3 белком единый комплекс. Существование такого стабильного гетеродимерного комплекса, поддерживаемого атомом цинка, подтверждено кристаллографически. NS4A белок выполняет также функцию кофактора, необходимого для гиперфосфорилирования NS5A протеина, и функцию якоря, удерживающего на мембране ядра клетки репликативный комплекс HCV. Функция NS4B протеина остается неясной, однако предполагается, что он также принимает участие в формировании репликативного комплекса.
NS5 регион полипротеина построен из двух больших белков NS5A (56 кДа) и NS5B(65 кДа). Белки освобождаются из полипротеина с помощью NS3-NS4A протеазного комплекса. NS5A аутокаталитически фосфорилируется по остаткам серина. Гиперфософорилирование идет при участии NS4A протеина. Биологическая функция фосфорилирования неясна. NS5A белок высококонсервативен и обнаруживается на ядерной периплазматической мембране инфицированных клеток, где совместно с NS5B образует мембранно-связанный репликативный комплекс.
NS5A протеин играет важную роль в формировании механизмов устойчивости клеток к действию интерферона. NS5A протеин взаимодействует с протеинкиназой PRK, активность которой индуцируется интерфероном. Результатом взаимодействия является ингибирование молекулярных механизмов ответа инфицированных клеток на интерферон.
NS5B протеин является РНК-зависимой РНК-полимеразой. Он высоко консервативен и является функционально наиболее важным компонентом репликативного ядерного комплекса, который обеспечивает репликацию/транскрипцию вирусной РНК. На позитивной нити геномной РНК транскрибируется минус-нить, которая является матрицей для синтеза (+)РНК. Затем происходит формирование комплекса РНК с core-белком и его последующая транспортировка в эндоплазматический ретикулюм, где с core-белком взаимодействуют поверхностные белки E1 и E2, достраивающие вирусную частицу.

HCV-инфекция. Диагностика вирусного гепатита C основана на определении антител к белкам HCV с помощью иммуноферментного анализа. При остром гепатите C преимущественно определяются IgM и IgG антитела против core-белка HCV. При хроническом гепатите C определяются антитела класса IgG против структурных и неструктурных белков вируса. Кроме того, в диагностических целях определяют РНК вируса с помощью ПЦР. В качестве праймеров используют олигонуклеотиды, соответствующие консервативным участкам нуклеотидной последовательности РНК вируса. Генотипы HCV также определяют с помощью полимеразной цепной реакции.
В широких масштабах проводят обязательный скрининг донорской крови на присутствие антител к белкам HCV. Вирусный гепатит является сопутствующей инфекцией у ВИЧ-инфицированных лиц. До 90% ВИЧ-инфицированных лиц имеют в крови антитела к белкам HCV. Большое количество HCV-инфицированных лиц регистрируется среди шприцевых наркоманов.
Клинически HCV-инфекция протекает в форме гепатитов легкой и средней тяжести с высокой степенью хронизации. На одного больного гепатитом C в разных регионах мира регистрируется от 5 до 30 хронически инфицированных лиц, у которых заболевание протекает в скрытой форме. Через 15-25 лет после инфицирования в 20-40% случаев хронический гепатит C приводит к формированию цирроза печени и гепатоклеточной карциномы. Вирус гепатита C получил образное название «ласковый убийца», поскольку медленно и скрыто приводит к деструкции гепатоцитов или их злокачественной трансформации.
Наиболее эффективным способом лечения гепатита C является терапия интерфероном-альфа. Однако освобождение организма от вируса происходит лишь в 10-30% случаев и зависит от генотипа вируса и хозяина. Наиболее резистентны к терапии интерфероном лица, инфицированные HCV генотипа 1b.
Вакцина для профилактики вирусного гепатита C находится в стадии разработки. Профилактика HCV-инфицирования основана на устранении путей парентеральной передачи вируса.

9.4.4. Вирус гепатита G (HGV; GBV-C)
Вирус гепатита G входит в группу неклассифицированных HGV-подобных вирусов в семействе Flaviviridae. Этот вирус был открыт при изучении случаев гепатитов ни A, ни A двумя независимыми группами ученых в 1995-96 гг. с использованием молекулярно-генетических методов исследования.
Возбудитель гепатита G образует классические для семейства Flaviviridae вирусные частицы с гликопротеинами, расположенными на наружной оболочке вириона. Отличительной особенностью вирусных частиц HGV является отсутствие вирусоспецифичного нуклеокапсидного core-белка.
Геном HGV представлен одной нитью РНК позитивной полярности размером около 9,4 т.н., кодирующей 2877 аминокислот. 5'- и 3'- концевые участки геномной РНК вируса содержат HTP размером около 500 и 300 н.о., соответственно. 3'-конец РНК HGV не имеет поли-A последовательности и образует термодинамически стабильную вторичную структуру, состоящую как минимум из 5-6 петель. Роль 3'-HTP предположительно заключается в терминации трансляции и регуляции транскрипции.

Схема 13. Структурная организация РНК HGV

Расположение генов в РНК вируса гепатита G имеет сходство с некоторыми флавирусами, пестивирусами и HCV, у которых последовательности, кодирующие структурные белки, представлены на 5'-области генома (E1, E2), а гены, кодирующие неструктурные белки (NS2, NS3, NS4, NS5), расположены в 3'-концевой области (схема 13).
Однако отсутствие нуклеокапсидного белка привело к выделению HGV в отдельную ветвь семейства флавивирусов. Инициация трансляции происходит на AUG кодоне, расположенном непосредственно перед последовательностью предполагаемого E1-гликопротеина HGV и включает область предполагаемого core-белка, кодирующую 16 аминокислот. Однако роль этого пептида в жизненном цикле вируса остается неизвестной. Представленный в полипротеине HGV «core»-пептид не соответствует характеристикам нуклеокапсидных белков других представителей данного семейства. По всей вероятности, роль капсидного белка может играть какой-либо клеточный белок, или core-белок поставляется другим, еще не определенным, вирусом, подобно вирусу гепатита дельта.
Так же как HCV, ВИЧ и другие РНК-содержащие вирусы, вирус гепатита G обладает двумя уровнями вариабельности геномной РНК. Первый заключается в различиях между вирусными геномами, находящимися в одном организме (квазивиды). Второй уровень вариабельности основан на различиях между изолятами, обнаруженными в разных организмах (генотипы и субтипы). Квазивиды HGV обладают разной тканевой специфичностью. Большинство нуклеотидных последовательностей генома HGV, обнаруженных в печени, образуют между собой близкородственную группу и отличаются от квазивидов, обнаруженных в мононуклеарных клетках периферической крови.
К настоящему времени выделено пять генотипов HGV, которые коррелируют с географическим происхождением изолятов. К первому генотипу относятся изоляты, преобладающие на территории Западной Африки (1a и 1b), ко второму в США и Европе (2a и 2b), к третьему в Центральной Азии, к четвертому в Юго-восточной Азии и к пятому в Южной Африке.
РНК вируса гепатита G содержит одну большую OPC, которая транслирует полипротеин размером приблизительно 2800 а.о. Полипротеин процессируется за счет клеточных и вирусных протеиназ с образованием двух структурных и как минимум пяти неструктурных белков. Структурные белки E1 (188 а.о.) и E2 (280 а.о.) выщепляются из полипротеина за счет клеточных сигнальных петидаз (сигналаз) и составляют белковый компонент липопротеиновой оболочки вируса гепатита G. Процессинг неструктурной части полипротеина происходит за счет NS2 и NS3 вирусных протеиназ. Разрыв в NS2/NS3 соединении является аутокаталитическим и происходит с помощью металлозависимой протеиназы NS2. Разрыв между NS3 и NS4 происходит за счет сериновой протеиназы NS3 и сопровождается полным выщеплением ее из оставшейся части полипротеина.
Следует отметить, что протеиназная активность свойственна только аминоконцевой части NS3-белка, C-концевая часть которого обладает хеликазной и нуклеотидтрифосфатазной активностями. Сериновая протеиназа NS3 катализирует процессинг незрелой части полипротеина на NS4A-, NS4B-, NS5A- и NS5B-белки. Разрыв между NS4B и NS5A протеинами происходит только в присутствии NS4A-белка, который выступает в качестве кофактора NS3-протеазы.
У вируса гепатита C NS5A-белок является кофактором NS5B РНК-зависимой РНК-полимеразы и принимает участие в активации вирусной транскрипции в ингибировании воздействия интерферона на течение HCV-инфекции. Разные последовательности NS5A гена соответствуют разным генотипам вируса гепатита C и ассоциированы с разным ответом на интерферонотерапию. У HGV NS5A-протеин также принимает участие в активации транскрипции вируса, однако аминокислотная последовательность NS5A HGV не оказывает влияния на терапию интерфероном.

HGV-инфекция. Основным методом, применяемым для диагностики и изучения эпидемиологических особенностей распространения вирусного гепатита G, является ОТ-ПЦР и определение анти-E2 антител с использованием ИФА. Параллельное использование этих двух методов позволило установить ряд особенностей HGV-инфекции:
РНК вируса обнаруживается приблизительно в 3% случаев среди здоровых и в 38% случаев в группах риска парентерального заражения, например среди больных, которым часто переливают кровь (больные гемофилией);
РНК HGV может персистировать в организме 9-12 лет;
анти-E2 HGV IgG антитела также определяются в течение длительного периода (до 14 лет);
РНК вируса определяется чаще всего в отсутствие антител к E2-протеину вируса, частота одновременного выявления двух маркеров HGV составляет лишь 5%;
наличие антител против E2 HGV почти на !00% совпадает с присутствием РНК HCV в сыворотках крови больных гепатитом C.
Случаи моно инфицирования HGV очень редки. Среди больных острым гепатитом ни-A, ни-E, РНК HGV выявляется в 6% случаев. При коинфекции HGV с вирусами гепатитов A, B и C, а также HIV не выявлено значительных изменений в течении заболевания, указывающих на присутствие HGV. Случаи острого гепатита G могут протекать в клинически выраженной и бессимптомной формах. Исходом острой HGV-инфекции может быть или выздоровление с элиминацией вирусной РНК и появлением антител к E2-белку HGV или формирование хронического заболевания с длительным носительством РНК HGV.
Вирус обладает тропизмом к целому ряду клеток. Предполагается, что наибольшим тропизмом он обладает к лимфоцитарным клеткам. Показано присутствие РНК HGV в T-лимфоцитах, B-лимфоцитах, моноцитах, стволовых клетках костного мозга, в селезенке и печеночной ткани. Описаны случаи, когда вирус гепатита C обнаруживался в крови и отсутствовал в печеночной ткани. Объяснением того, что попадая в организм человека, HGV не всегда вызывает поражение печени, является отсутствие первичной гепатотропности HGV. Так, HGV может вторично инфицировать гепатоциты, попадая в печень с плазмой и клеточными элементами крови.
Вирусный гепатит G относят к инфекциям с парентеральным механизмом передачи возбудителя, который может реализовываться различными путями. Так, многоразовое использование шприцов служит причиной повышенного распространения HGV среди наркоманов, вводящих наркотики внутривенно. Результаты тестирования сывороток крови наркоманов на анти-E2 и РНК HGV свидетельствуют о чрезвычайно высоком (88,9%) распространении вируса гепатита G в данной группе населения. Вирус гепатита G может быть обнаружен в препаратах, изготовленных из крови человека. Такие находки были сделаны в анти-D иммуноглобулине человека и иммуноглобулине для внутривенного введения. При гепатите G возможен половой путь передачи вируса, выявлен вертикальный путь передачи HGV от инфицированной матери ребенку.

9.4.5. Вирус гепатита A (ВГА; HAV)
Вирус гепатита A (Picornaviridae, Hepatovirus) является этиологическим агентом вирусного гепатита A, ранее носившего названия: болезнь Боткина, инфекционный гепатит, эпидемический гепатит. Вирус относится к группе кишечных (энтеральных) вирусов с фекально-оральным механизмом передачи. В период вирусемии может передаваться парентерально.
Вирус идентифицирован в 1973 году. На фотографиях, полученных с помощью электронной микроскопии, вирусные частицы выглядят как сферы с неровной поверхностью диаметром 30 нм. Капсид лишен оболочки, имеет икосаэдрическую симметрию и содержит по 60 копий каждого из трех структурных вирусных белков.
Однонитевой линейный (+)РНК-геном клонирован и охарактеризован в 1983 году. Геномная организация вируса характерна для пикорнавирусов, имеющих одну большую рамку считывания, кодирующую полипротеин (схема 14).
Геном вируса имеет длину 7500 оснований. На 5'-конце геномной РНК находится кэпирующий протеин VPg. 3'-конец полиаденилирован. 735 оснований 5'-конца генома составляют нетранслируемый регион, имеющий вторичную структуру в виде шпилек. 5'-НТР высококонсервативен и несет сайт посадки рибосом клетки-хозяина. Функция НТР заключается в ориентации рибосом в направлении инициирующего кодона AUG, находящегося в начале открытой рамки считывания.
РНК вируса кодирует полипротеин, процессирующийся в ходе репликации с образованием 12 протеинов разной молекулярной массы, выполняющих различные функции. Треть генома, прилегающая к 5'-НТР, кодирует 4 структурных протеина (VP1-VP4). В состав зрелого вириона входят только первые три белка (VP1, VP2, VP3).

Схема 14. Организация геномной РНК вируса гепатита A

Внутри большой рамки считывания выявлена высокая вариабельность нуклеотидной последовательности. Различия в последовательности РНК могут доходить до 15% и более. То есть вирусы, принадлежащие разным изолятам, могут различаться по каждому шестому-седьмому нуклеотиду РНК, Наиболее вариабельным является регион, соответствующий генам VP1 и 2A. В соответствии с различиями в нуклеотидной последовательности выделено 7 генотипов вируса. У человека идентифицировано 4 генотипа. Еще три генотипа обнаружено у обезьян, которые также заболевают вирусным гепатитом A.
Несмотря на высокую вариабельность региона VP1-2A, белок VP1 участвует в формировании двух высоко консервативных иммунодоминантных эпитопов, одинаковых у всех штаммов вируса гепатита A. Эпитопы являются конформационными, т. е. построены из аминокислот, находящихся в разных участках аминокислотной последовательности белка. Более того, в формировании одного из иммунодоминантных эпитопов принимает участие остаток аспарагина белка VP3. Совокупность иммунодоминантных консервативных эпитопов обозначают как HAV-антиген. Вирусы, принадлежащие разным генотипам, относятся к одному серотипу, определяемому общим HAV-антигеном.
Неструктурные белки вируса принимают участие в репликации вируса. За исключением протеина 3B, являющегося 5'-связанным кэпирующим белком, они не входят в состав вириона. Протеин 2C является хеликазой, белок 3C является протеазой, отвечающей за посттрансляционную модификацию полипротеина. Белок 3D является РНК-зависимой РНК-полимеразой. Функция остальных протеинов исследуется.
Рецептором для HAV является мембранный муциноподобный белок, относящийся к суперсемейству иммуноглобулинов. Связывание вируса с клетками имеет кальций-зависимый характер.
Схема репликации вируса подобна схеме репликации других пикорнавирусов и проходит через стадию образования промежуточной минус-нити РНК, которая присутствует в инфицированных клетках в небольших количествах. Особенностью репликации является высокое сродство позитивной РНК к капсидным белкам. Вследствие этого вновь образующаяся геномная РНК быстро включается в состав капсида. Тем самым, снижается количество свободной РНК, которая могла бы служить матрицей для дальнейшей репликации, и размножение вируса быстро завершается. Такой механизм репликации является одной из причин ограниченной персистенции вируса в культуре клеток. Репликация вируса не нарушает синтеза внутриклеточных белков и обычно не приводит к выраженному цитопатическому эффекту.
Геномная РНК используется и в качестве матричной РНК. Трансляция начинается после посадки рибосомальной субъединицы 40S на 3'-конец 5'-НТР выше инициирующего кодона AUG. В этом процессе принимают участие клеточные факторы инициации трансляции. После синтеза полипротеина происходит его расщепление, которое идет с участием белка 3C, являющегося протеазой. Протеолиз структурного участка полипротеина приводит к образованию белков VP1, VP3 и белка-предшественника VP0. Они собираются в незрелый капсид, не содержащий РНК. Последующее включение РНК в состав вирусной частицы сопровождается расщеплением VP0 с образованием структурного белка VP2 и короткого полипептида VP4. В отличие от VP4-протеина других пикорнавирусов, VP4-протеин вируса гепатита A не включается в состав вирусной частицы, его судьба остается неясной. Капсиды накапливаются в клетке в избытке как во время репликации, так и после ее окончания. Они обнаруживаются в клеточных везикулах, а затем секретируются в околоклеточное пространство.
HAV-инфекция. В инфицированном организме нарабатываются анти-HAV антитела, обеспечивающие многолетний протективный иммунитет. Сначала в крови появляются антитела класса IgM, значительно позднее антитела класса IgG. В период от начала заболевания до клинических проявлений инфекции в фекалиях обнаруживается HAV антиген, что свидетельствует об активной репликации вируса в гепатоцитах с последующим его поступлением через билиарный тракт в кишечник.
Вирусный гепатит A распространен во всем мире. Однако чаще он встречается в регионах и странах с относительно низкими санитарными стандартами. Регистрируются вспышки гепатита A в организованных коллективах (детские сады, воинские части, дома отдыха и т. д.). Нередко причиной эпидемических вспышек является вода, контаминированная фекальными массами, содержащими вирус. В связи с этим, санэпиднадзором проводится определение HAV антигена в источниках питьевой воды. Выявление HAV антигена, как и определение антител к белкам вируса, проводят с помощью иммуноферментного анализа. В отдельных случаях определяют РНК HAV с помощью ПЦР.
Клинически гепатит A характеризуется относительно легким течением, редким развитием тяжелых форм, выздоровлением в течение 2 месяцев без угрозы хронизации. Инкубационный период короче, чем при других вирусных гепатитах и составляет срок от 10 дней до 1 месяца. Гепатит A нередко может протекать без видимых клинических проявлений (желтухи). Такие формы гепатита A называются инаппарантными, чаще встречаются у детей.
Профилактика гепатита A основана на соблюдении санитарных норм и применении вакцины против гепатита A.

9.4.6. Вирус гепатита E (ВГЕ; HEV)
Вирус гепатита E является единственным представителем блуждающего рода Hepevirus. До недавнего времени его относили к семейству Caliciviridae. Однако наличие молекулярно-биологических особенностей, характерных только для этого вируса, заставило исследователей в 2000 году вынести его за пределы семейства калицивирусов. Вирус гепатита E серологически и молекулярно-генетически не имеет сходства с вирусом гепатита A.
HEV не имеет оболочки, диаметр вириона равен 30 н.м. Геном состоит из РНК позитивной полярности длиной 7,5 т.н. с полиаденилированным 3'-концом. В составе генома имеется 3 открытых рамки считывания и два консенсусных мотива, свидетельствующих о наличии гена РНК-зависимой РНК-полимеразы и нуклеотидтрифосфат-связывающего участка, необходимого для реализации хеликазной активности.
5'-конец генома содержит первую OPC и кодирует РНК-РНК-полимеразу и хеликазу. Вторая OPC, примыкающая к 3'-концу, кодирует структурный белок. Третья OPC начинается с последнего нуклеотида первой рамки считывания и включает 2 первых основания стоп-кодона первой рамки (UG) с образованием соответствующего стартового кодона. Третья рамка кодирует протеин с молекулярной массой 14,5 кД, функция этого белка не определена.
У изолятов вируса, выделенных в разных географических регионах мира, наблюдается высокая гомология геномных нуклеотидных последовательностей. Все изоляты вируса несут общие антигенные детерминанты, однако выявлены и типоспецифические эпитопы, характерные для изолятов, выделенных в отдельных регионах мира.

HEV-инфекция. Вирусный гепатит E распространен в Средней и Южной Азии среди лиц молодого и среднего возраста. Заболевание ассоциировано с фекальным загрязнением воды. Механизм передачи фекально-оральный. Впервые гепатит E был описан в Индии в 1955 году, когда вследствие фекальной контаминации питьевой воды заболело 29 тысяч человек. Крупные вспышки в это же время наблюдались в Киргизии. Особенностью вирусного гепатита E явилась высокая смертность инфицированных беременных женщин (до 20%). В Средней полосе России вирусный гепатит E встречается крайне редко, обычно такие случаи являются завозными.
Природным хозяином вируса является человек, однако вирус может инфицировать и организм обезьян. Эндемичными районами для ВГЕ являются регионы тропического и субтропического пояса. Вспышки вирусного гепатита E регистрируются чаще всего в периоды муссонных дождей, наводнений, приводящих к загрязнению воды. Зарегистрированы также вспышки в Африке.
Инфицируются вирусом чаще всего лица в возрасте от 15 до 45 лет. Наиболее частый фактор риска контаминированная фекалиями вода. Инкубационный период 6 недель. Вирус реплицируется в гепатоцитах и выделяется из организма через билиарный тракт. В фекалиях целые вирусные частицы встречаются в небольших количествах, что является следствием их частичного разрушения протеиназами пищеварительного тракта (трипсин, химотрипсин).
Вирусный гепатит E может протекать как в легкой форме (субклинически), так и в тяжелой форме, вплоть по фульминантного гепатита. Отличительной чертой является высокая смертность беременных женщин. Заболевание сопровождается наработкой антител классов IgM и IgG. Последние могут определяться в течение года после перенесенного заболевания. Дифференциальная диагностика вирусного гепатита E основана на определении специфических антител и РНК.

9.5. Энтеральные вирусы

Энтеральные вирусы одни из первых паразитов, которые колонизируют кишечник новорожденных. По взаимодействию с организмом хозяина вирусы, обнаруживаемые в содержимом кишечника, можно разделить на несколько групп:
Вирусы, которые реплицируются в энтероцитах, вызывая симптоматическую кишечную инфекцию (рота-, адено-, энтеровирусы). Эти же вирусы могут выступать в роли «молчащих» вирусов, которые характеризуются бессимптомной репродукцией, что особенно часто проявляется у новорожденных.
Вирусы, которые используют желудочно-кишечный тракт как входные ворота инфекции, где могут реплицироваться прежде, чем вызвать системное заболевание (энтеровирусы).
Вирусы, вызывающие некишечные системные поражения, которые могут в определенных условиях также реплицироваться в энтероцитах и вызывать симптомы энтерита (вирус кори, ЦМВ, ВИЧ).
Вирусы, попадающие в кишечник с пищей (фаги, вирусы растений) или секретами носоглотки (респираторные вирусы).

9.5.1. Вирусы возбудители острых кишечных инфекций
Острые кишечные инфекции (ОКИ) традиционно являются одной из актуальных проблем ветеринарии и здравоохранения во всем мире. По данным ВОЗ, ежегодно регистрируется 1-1,2 миллиарда диарейных заболеваний, умирает до 4 миллионов человек, причем 60-70% заболевших составляют дети до 14 лет. В России общая заболеваемость ОКИ традиционно остается на высоком уровне и кишечные инфекции устойчиво занимают 3-4 место среди всех инфекционных заболеваний детей. Острые кишечные инфекции, по терминологии ВОЗ «диарейные болезни», это группа инфекционных заболеваний, клинически характеризующихся острым диарейным синдромом. В настоящее время по родовому признаку различают более 30 нозологических форм ОКИ, вызываемых бактериями, простейшими и вирусами.
Таблица 9
Этиологические агенты вирусных диарей
Вид генома

Семейство

Вирус

Частота обнаружения при ОКИ у детей, (%)


ДнДНК

Adenoviridae

Аденовирусы группы F типов 40,41

2-17


ОнДНК

Parvoviridae

Парвовирусы

?


ДнРНК
Reoviridae
Ротавирусы группы A
Ротавирусы группы C

20-40
1-2



Birnaviridae

Пикобирнавирусы

0,1-8


(+)РНК
Coronaviridae

Коронавирусы, торовирусы
3-27



Astroviridae

Астровирусы
1-4



Caliciviridae

Вирусы Норволк, Саппоро

5-14



Picornaviridae

Энтеровирусы (ЕСНО, Коксаки A)
1-1,5



Flaviviridae

Пестивирусы
_


Вирусы, являющиеся этиологическими агентами острых кишечных заболеваний это многочисленная группа вирусов, относящиеся как минимум к 9 семействам вирусов (табл. 9). В таблице представлены вирусы, вызывающие диарею у человека и животных. Не все вирусы гастроэнтерита животных патогенны для человека. Так, роль парвовирусов, широко циркулирующих среди собак, в инфекционной кишечной патологии детей до сих пор не доказана. Неясна ситуация с пикобирнавирусами, которые ассоциированы с диареей только у ВИЧ-инфицированных. Пестивирусы, являющиеся ведущим патогеном телят, от людей не выделены.
Основными этиологическими агентами вирусных диарей являются ротавирусы, аденовирусы, калицивирусы и коронавирусы. Среди них первое место в инфекционной кишечной патологии принадлежит ротавирусам.
Ротавирусы (RV, PB)
Ротавирусы (Reoviridae) являются основным этиологическим агентом острого инфекционного гастроэнтерита у детей, молодняка животных и птиц. Как причина диареи у мышат РВ были идентифицированы в 1950 г., у обезьян и телят в 1960 г., у детей в 1973 г. австралийской исследовательницей Бишоп. В отдельный род Rotavirus РВ выделены на IV Международном конгрессе вирусологов в 1978 г.
Характеристика вируса
Ротавирион двукапсидная, не содержащая липопротеиновой оболочки вирусная частица, размером 76,5 н.м., организованная согласно принципам икосаэдральной симметрии (Т = 13). Под электронным микроскопом ротавирион напоминает колесо с короткими спицами и хорошо различимым ободом, что послужило основанием названия вируса («rota» колесо). В препаратах РВ, выделенных от больных животных и человека, под электронным микроскопом при негативном контрастировании можно наблюдать три типа частиц гладкие двукапсидные (76,5 н.м.), шероховатые однокапсидные (70 н.м.) и сердцевины (50 н.м.), что отражает существование трех структурных элементов вириона наружного и внутреннего капсидов и сердцевины.
Наружный капсид ротавириона представляет собой сотоподобную решетку толщиной около 10 нм, образованную гликопротеином VP7. На поверхности решетки расположено 60 выступов длиной 4,0 н.м. с утолщенным дистальным концом (димеры протеазочувствительного VP4). Поверхность пронизана 132 каналами трех типов, различающихся размерами и расположением. Они проникают сквозь оба капсида, достигая сердцевины. Внутренний капсид ротавириона имеет толщину 15-20 н.м., построен по принципу скошенного икосаэдра с Т = 13. Он состоит из 780 структурных единиц, организованных в 260 тримеров и состоящих из молекул единственного белка VP6. Сердцевина ротавирусной частицы (core) имеет гексагональную форму, характеризующуюся осями симметрии 2-го, 3-го и 5-го порядков. Оболочка core, имеющая толщину 0,15 нм, образована основным белком кора VP2, ассоциированным с РНК-полимеразой (VP1) и гуанилтрансферазой (VP3), и пронизана маленькими порами вдоль 5-ти и 3-х кратных осей симметрии. Поры сердцевины соединены с каналами внутреннего капсида.
Геном ротавируса состоит из 11-ти сегментов двухнитевой РНК размером от 667 до 3302 п.н., суммарный размер составляет 18 556 п.н. Десять сегментов ротавирусного генома являются моноцистронными матрицами. Каждая предназначена для синтеза только одного белка. В то же время, ген VP7 является бицистронным и кодирует 2 гликопротеина, синтезирующихся с первого и второго инициирующих кодонов в одной рамке считывания.
Наличие на 5'-конце кэп-структуры, состоящей из метилгуанидина, свидетельствует, что плюс-нить РНК выполняет роль мРНК для синтеза вирусных белков, однако 3'-конец таких РНК не содержит поли-A последовательности. Семь концевых нуклеотидов консервативной последовательности 3'-конца ротавирусных генов выполняют роль минимального промотора при синтезе минус-нитей РНК.
При электрофорезе в ПААГ одиннадцать сегментов ротавирусного генома распределяются с образованием характерного профиля, состоящего их четырех классов генов (схема 15). Распределение сегментов внутри классов определяет электрофоретип ротавируса, который является стабильным признаком штамма и эпидемиологическим маркером.

Схема 15. Картирование генома ротавирусов группы A

Репродукция ротавирусов
Ротавирусная инфекция начинается прикреплением двухкапсидной вирусной частицы к специфическому клеточному рецептору, находящемуся на клетках цилиндрического эпителия, покрывающего вершины ворсинок слизистой оболочки тонкого кишечника. Рецепторами ротавирусов на поверхности энтероцитов являются мембранные белки, относящиеся к суперсемейству интегринов и состоящие из двух полипептидных цепей (
·2
·1 и
·4
·1 интегрины). Лигандами рецепторов являются белки VP7 и VP4. После адсорбции вируса на клеточной поверхности происходит его проникновение в клетку, которое происходит с использованием механизма рецепторного эндоцитоза. Для запуска инфекционного процесса необходимо сочетание проникновения вириона с его «раздеванием», которое напрямую зависит от протеолитической активации VP4. Центральный консервативный регион полипептидной цепи VP4 имеет участок, расщепляемый трипсином. При обработке трипсином VP4 нарезается на два пептида VP5 и VP8. В результате расщепления происходит образование свободного NH2 -конца на полипептиде VP5, что приводит к активации инфекционности вируса. Существенным моментом в эффективном «раздевании» ротавириона является также низкая концентрация Ca2+ во внутриклеточной среде, определяющая выход кальция из рецептосомы. Снижение концентрации кальция в рецептосоме приводит к дезинтеграции наружного капсида ротавириона, белки которого, в частности VP4, дезинтегрируют мембрану рецептосомы, в цитоплазму выходит однокапсидная вирусная частица.
Потеря ротавирионом наружного капсида приводит к активации РНК-зависимой РНК-полимеразы (VP1). Транскрипционная функция этого фермента направлена на синтез плюс-нитей РНК, являющихся как мРНК для синтеза вирус-специфических белков, так и матрицей для синтеза минус-нитей при сборке ротавирионов. Для проявления транскриптазной активности РНК-полимеразе необходимо присутствие VP6, который конформационно стабилизирует РНК-полимеразный комплекс. Вследствие этого, наработка плюс-нитей идет только в составе однокапсидной вирусной частицы по консервативному механизму без вытеснения цепи. Синтезированные мРНК кэпируются внутри частицы и покидают ее через поры однокапсидной частицы.
Большинство структурных и неструктурных белков ротавируса синтезируется на свободных рибосомах цитоплазмы. Только гликопротеины VP7 и NSP4 синтезируются на рибосомах, ассоциированных с мембраной ЭПР.
Предложена модель морфогенеза однокапсидной вирусной частицы. В инфицированных клетках существует три типа субвирусных частиц, обладающих репликазной активностью - прекор (45 н.м.), кор (65 н.м.) и однокапсидный вирион (75 н.м.). Прекор образуется в вироплазме как результат геномного группирования 11-ти плюс-нитей РНК и белков VP1, VP3, а также четырех NS белков. После ассоциации этих компонентов вирусная репликаза (VP1) инициирует синтез минус-нитей РНК на матрице мРНК. Когда минус-нити подвергаются удлинению, прекор конкурентно подвергается морфогенезу в кор путем добавления VP2. В основе образования коровой частицы лежит явление самосборки, что подтверждается способностью VP2 в условиях in vitro образовывать сферические, вытянутые и спиралевидные структуры.
Двигаясь к периферии вироплазмы, коровая частица приобретает VP6. VP2 содержит остаток миристиновой кислоты, которая связывается с N-концевым глицином в молекуле VP6. Известно, что VP6 способен образовывать, как в клетке, так и в условиях in vitro, гексагональные решетки и тубулярные структуры, что свидетельствует о роли белок-белковых взаимодействий и явления самосборки и в процессе формирования внутреннего капсида.
Субвирусная репликазная частица, состоящая из структурных белков, входящих в состав однокапсидного вириона и неструктурных белков, необходимых для репликации генома, имеет размер 100 н.м. В составе такой частицы продолжается удлинение минус-нитей РНК, при этом (+)РНК, выступающая из репликазной частицы, затягивается внутрь. Снижение количества выступающих из репликазных частиц нитей коррелирует по времени с уменьшением размера частиц, которое, по мнению авторов модели, может быть связано как с окончанием образования полноразмерных сегментов генома и их упаковкой внутри частицы, так и с потерей неструктурных белков, выполнивших свои функции.
Следующим этапом в морфогенезе ротавириона является почкование однокапсидной вирусной частицы через мембрану ЭПР, в процессе которого субвирусная частица приобретает временную псевдооболочку. Этот процесс является уникальной особенностью морфогенеза ротавирусов, отличающей их от других членов семейства Reoviridae. Рецептором однокапсидного ротавириона на цитоплазматической стороне ЭПР является C-конец полипептидной цепи трансмембранного гликопротеида NSP4, который присутствует в ЭПР в форме тетрамера. После транслокации однокапсидной частицы в просвет каналов ЭПР она теряет псевдооболочку, быстро замещающуюся белками наружного капсида. Белки VP4 и VP7 появляются в зрелой двукапсидной частице в течение 10-15 минут после почкования. Механизм транслокации VP4 с цитоплазматической стороны ЭПР в каналы ретикулюма остается неясным. Процесс связывания VP4 и VP7 при сборке наружного капсида носит спонтанный характер, о чем свидетельствует способность этих белков ассоциировать в условиях in vitro в присутствии Ca2+.
Инфекционный цикл заканчивается освобождением полных двукапсидных вирусных частиц, происходящим в результате клеточного лизиса уже через шесть часов после инфицирования клетки и достигающим максимума через 15-24 часа. Собственно процесс сборки ротавириона занимает по времени менее часа. Гибель клеток является следствием накопления вирусных токсинов, но не связана с образованием инфекционных вирусных частиц. При освобождении вирионов из клеток слизистой кишечника происходит протеолитическое расщепление VP4, и ротавирионы, попадающие в окружающую среду, не имеют целого VP4.

Антигенные свойства ротавирусов
Род Rotavirus объединяет 7 антигенных групп вирусов (A, B, C, D, E, F, G). К ротавирусам человека относятся вирусы, принадлежащие группе A (типичные ротавирусы), а также группам B и C (параротавирусы). Серологически группы различают по антигенам, локализованным на протеине VP6 (групповые антигены). Внутри групп по серологическим свойствам различают подгруппы и серотипы.
Наиболее эпидемически значимыми являются ротавирусы группы A, которые выделены от человека и молодняка животных. Ротавирусы группы B являются зооантропонозными возбудителями и вызывают заболевания у людей (эндемичны для Китая) и животных. Резервуаром возбудителя являются крысы. Ротавирусы группы C поражают людей, но преимущественно выделяются от свиней с диареями. Ротавирусы групп D и F возбудители диарей у птиц.
98% ротавирусных диарей у детей вызывается ротавирусами антигенной группы A. Эти ротавирусы характеризуются широким антигенным разнообразием. По наличию подгрупповых антигенных детерминант, локализованных на VP6, различают две подгруппы ротавирусов SI и SII. По серотиповым детерминантам, локализованным на гликопротеине VP7 (G-серотип ротавируса), выделено 9 серотипов ротавируса. Доминирующими являются G1-4 серотипы. Серотиповые свойства ротавирусов группы A определяются, кроме того, детерминантами, локализованными на протеазочувствительном VP4. Выделено 5 P-серотипов ротавируса. В настоящее время дифференциацию ротавирусов по VP4 проводят с использованием ПЦР. Доминирующими являются P4, P6, P8 генотипы вируса. Гены VP7 и VP4 существуют независимо, в связи с чем природные штаммы ротавирусов описываются как G/P варианты.

Ротавирусная инфекция
Ротавирусная инфекция (РВИ) широко распространенное высококонтагиозное острое кишечное заболевание, нередко протекающее в тяжелой форме. В Российской Федерации заболеваемость населения ротавирусной инфекцией занимает 8-е ранговое место в структуре острых кишечных инфекций, а среди детей до 3-х лет в период сезонного подъема инфекции ротавирусы вызывают 60-90% острых кишечных инфекций неясной этиологии.
Клиническая картина РВИ мало отличается от кишечных инфекций другой этиологии и проявляется диареей, лихорадкой, рвотой и симптомами острого респираторного заболевания. В тяжелых случаях диарея и рвота приводят к обезвоживанию организма (эксикоз), что может явиться причиной смерти. У новорожденных детей РВИ протекает атипично, часто наблюдаются перфорации стенки кишечника. Ведущим синдромом при РВИ является гастроэнтерит, в связи с чем заболевание часто называют ротавирусным гастроэнтеритом (РВГЭ).
Ротавирусы поражают население разных возрастных групп, однако преимущественно болеют дети в возрасте до 3-х лет и пожилые люди в возрасте после 60 лет. Взрослые, как правило, являются бессимптомными вирусоносителями.
В странах северных широт с умеренным климатом РВИ чаще наблюдается в холодное время года, т. е. характеризуется выраженной осеннее-зимнее-весенней сезонностью проявлений. В летние месяцы ротавирусы выявляются у больных с диареями в единичных случаях.
РВИ характеризуется фекально-оральным механизмом передачи, который реализуется различными путями водным, пищевым, бытовым, пылевым. Ротавирусы способны инфицировать клетки слизистых респираторного тракта и полноценно репродуцироваться в них, что создает условия для реализации аспирационного механизма передачи инфекции.

9.5.2. Энтеровирусы
Энтеровирусы (Enterovirus) входят в семейство пикорнавирусов (Picornaviridae), включающее также еще 5 родов вирусов: Rinovirus (113 серотипов риновирусов), Cardiovirus (вирусы энцефаломиокардита млекопитающих), Hepatovirus (вирус гепатита A), Aphthovirus (вирус ящура), Parechovirus (уникальные эховирусы) и 30 неклассифицированных вирусов насекомых.
Термин пикорнавирусы (pico маленький, RNA рибонуклеиновая кислота) был введен в 1962 г., до этого вирусы обозначались как «нани-вирусы», т. е. вирусы-карлики.
Энтеровирусы впервые выделены в самостоятельный род в 1957 г. Род включает вирусы, патогенные для человека, обезьян, свиней, коров, мышей. Одной из особенностей пикорнавирусов является обилие серотипов, что хорошо видно у энтеровирусов человека. Среди энтеровирусов человека выделено 66 серотипов: полиовирусы (3 серотипа), вирусы Коксаки A (23 серотипа), вирусы Коксаки B (6 серотипов), эховирусы (ECHO 30 серотипов), Энтеровирусы серотипов 68-70.

Характеристика вируса
Вирионы безоболочечные икосаэдры диаметром 24-30 н.м. Капсид состоит из 60 капсомеров (T = 1). Каждый капсомер образован четырьмя белками: VP1, VP2, VP3, экспонированных снаружи, и VP 4, находящегося во внутренней части капсомера. Кроме того, в состав капсида входят 1-2 молекулы VP0-протомера, из которого нарезаются VP2 и VP4.
Антигенная структура энтеровирусов представлена двумя антигенами типоспецифическим (N-антиген, основной нейтрализующий антиген), который определяется в интактном вирионе, и группоспецифическим (H-антиген), который образуется при удалении РНК. Механизм перехода N-H связан с изменением конформации поверхностных белков вириона.
Основные нейтрализующие антигенные детерминанты расположены на белке VP1. Способность моноспецифической антисыворотки нейтрализовать инфекционность вируса лежит в основе определения его серотипа.
VP1 несет антирецепторные участки. Для разных серотипов энтеровирусов клеточными рецепторами являются разные мембранные молекулы:
Вирусы Коксаки A
·V
·3-интегрин,
·2-микроглобулин, CD54 антиген (ICAM-1).
Вирусы Коксаки B общий с аденовирусами CAR (суперсемейство иммуноглобулинов);
Вирусы Коксаки B1, 3, 5 CD55 антиген и
·V
·6 -интегрин;
Эховирусы CD55 антиген и
·2
·1 -интегрин;
Полиовирусы белок PVR, относящийся к суперсемейству иммуноглобулинов. Этот же рецептор является интермедиатом проникновения в нейроклетки
·-герпесвирусов.
Геном энтеровирусов (+)РНК размером 7,2-8,5 т.н. имеет на 5'-конце ковалентно связанный пептид (VPg), 3'-конец полиаденилирован, что детерминировано 5'-концевой последовательностью генома. Организация генома энтеровирусов сходна с таковой вируса гепатита A.
Вирусы проникают в клетку в конформационно зависимом процессе, детальные события которого до настоящего времени не установлены. Показано, что в процессе взаимодействия энтеровирионов с рецепторами клеточной поверхности теряется VP4. Процесс сопровождается абортивными явлениями, например «слущиванием» с клеточной поверхности ВЧ, лишенных VP4. Такие частицы иногда составляют 50-80% инфицирующей популяции. Доля продуктивно раздевающегося вируса составляет 1%. В цитоплазму проникает геномная РНК, которая выполняет функцию мРНК.
При энтеровирусных инфекциях наблюдается ярко выраженное подавление синтеза белков клетки-хозяина. Одним из вероятных механизмов такого подавления, как предполагают, является инактивация клеточного кэп-связывающего комплекса, необходимого для присоединения кэпированных мРНК к рибосоме. При связывании с рибосомой РНК энтеровируса теряет VPg и транслируется в полипротеин. Полипротеин затем протеолитически каскадно расщепляется сначала с помощью клеточных протеиназ на три предшественника P1, P2 и P3. Затем P3 аутокаталитически расщепляется на VPg, протеазу и полимеразу. Вновь синтезированная РНК-полимераза реплицирует вирусную РНК с использованием VPg-dU-затравки через образование промежуточной РФ формы. Сборка вирионов происходит в несколько этапов в цитоплазме (см. раздел «Общие принципы морфогенеза вирионов»). Зрелые вирионы покидают клетку путем лизиса последней.

Энтеровирусные инфекции
Энтеровирусы являются этиологическими агентами целого ряда заболеваний, характеризующихся полиморфизмом клинических проявлений инфекции. Это значит, что одни и те же вирусы могут обусловливать несколько клинических синдромов и, напротив, каждый из этих синдромов может вызываться энтеровирусами разных серологических типов.
Многие энтеровирусные заболевания склонны к эпидемическому распространению, так как вирусы реализуют два механизма передачи фекально-оральный и аспирационный. Заболевания, связанные с энтеровирусами, встречаются во всех группах населения. В связи с выше сказанным, энтеровирусные инфекции представляют важную проблему здравоохранения во всем мире.
Полиморфизм клинических проявлений инфекции связан с различной тканевой тропностью энтеровирусов разных серотипов нейротропностью, кардитропностью, тропностью к клеткам респираторного тракта, желудочно-кишечного тракта и клеткам других тканей.
С инфицированием энтеровирусами связаны такие заболевания, как ОРВИ, ОКИ, серозный менингит, энцефалиты, миокардиты и эндокардиты, герпангина, геморрагический коньюктивит, хронический увеит, хронический пиелонефрит, ювенильный сахарный диабет, полиомиелит и вялотекущие параличи. Каждое из этих заболеваний может вызываться несколькими типами энтеровирусов.

9.6. Респираторные вирусы

Острые респираторные заболевания (ОРЗ) находятся на первом месте среди всех инфекционных заболеваний людей не только в нашей стране, но и в мире. Ведущее место среди ОРЗ принадлежит острым респираторным вирусным инфекциям (ОРВИ).
Группа респираторных вирусов включает вирусы, обладающие выраженным тропизмом к мукополисахаридам клеток слизистых оболочек респираторного тракта. Инфицирование такими вирусами может сопровождаться острым поражением слизистых носоглотки, верхних и нижних отделов респираторного тракта и клинически проявляться в виде ринита, катара, трахеита, бронхита, воспаления легких.
Острые респираторные инфекции вызываются вирусами пяти семейств, включающих как ДНК-, так и РНК-содержащие вирусы (табл. 10).
Поражение слизистых верхних дыхательных путей часто наблюдаются при инфицировании вирусами кишечной группы, которое часто сопровождается выраженными катаральными явлениями. В частности, поражения верхних дыхательных путей отмечаются в 50-90% случаев при ротавирусном гастроэнтерите, вызываемом ротавирусами. Входными воротами энтеровирусной инфекции также является слизистая ротоглотки.
К группе респираторных вирусов также относятся вирусы, передающиеся воздушно-капельным путем и вызывающие системные заболевания, сопровождающиеся поражением слизистых оболочек респираторного тракта. Это вирус кори (Paramyxoviridae, Morbillivirus), вирус эпидемического паротита свинки (Paramyxoviridae, Rubulavirus), вирус краснухи (Togaviridae, Rubivirus).
Таблица 10
Респираторные вирусы


Семейство

Род

Вирус


1.

Picornaviridae
Rhinovirus
Enterovirus

Риновирусы
(>100 с/т) ЕСНО, Коксаки

2.

Coronaviridae
Coronavirus

Инфекционного бронхита

3.

Paramyxoviridae:
Paramyxovirinae
Pneumovirinae
Respirovirus
Pneumovirus
Парагриппа человека
Респираторно-синцитиальный вирус.

4.

Adenoviridae
Mastadenovirus
Аденовирус C человека

5.

Orthomyxoviridae

Influenza virus A
Influenza virus B
Influenza virus C
Вирус гриппа A
Вирус гриппа B
Вирус гриппа C


9.6.1. Парамиксовирусы (Paramyxoviridae)
Семейство объединяет вирусы млекопитающих и птиц, обладающие выраженным сродством к клеточным рецепторам, содержащим сиаловую кислоту. Вирусы передаются воздушно-капельным путем. Входными воротами инфекции являются верхние отделы дыхательных путей, затем, после стадии виремии и распространения, происходит специфическое поражение органов и тканей.
Вирионы плейоморфные частицы диаметром 150-250 н.м. и более, описаны нитевидные формы, которые могут содержать два и более эквивалента генома (явление полиплоидии). Вирусные частицы состоят из двух структурных элементов внутреннего нуклеокапсида и наружной липидсодержащей оболочки, в состав которых входят 6 структурных белков. Нуклеокапсид имеет диаметр 18 н.м. и представляет собой РНК, связанную с белком (2000 молекул) и закрученную в гибкую спираль. Белок полностью защищает РНК от действия нуклеаз. В состав нуклеокапсида также входят 200 молекул белка P и 20 молекул белка L, которые обеспечивают транскрипцию/репликацию. На поверхности липопротеиновой оболочки расположены шипы, образованные белками NH и Fo. Гликопротеин NH обладает двумя активностями гемагглютинирующей и нейрамидазной, однако он не обладает функцией слияния. Фузионной активностью обладает протеолитически активированный белок Fo (см. «Примеры белков слияния»). Слияние этого белка с цитоплазматической мембраной позволяет вирусу проникать в клетку непосредственно через клеточную мембрану при нейтральных значениях pH без образования эндосомы. Если вновь синтезированный Fo, экспонированный на поверхности цитоплазматической мембраны, протеолитически активируется, то он может вызвать так называемое слияние клеток изнутри, приводящее к образованию многоядерного синцития. Внутренняя поверхность вирионной оболочки ассоциирована с матриксным белком.
Геном парамиксовирусов линейная несегментированная молекула РНК негативной полярности размером 15 т.н. Репликация/транскрипция протекает в цитоплазме с участием собственной полимеразы в отсутствие экзогенной затравки. Сборка нуклеокапсидов также происходит в цитоплазме. Вирус созревает, почкуясь через цитоплазматическую мембрану.
В семействе выделено два подсемейства, объединяющих 5 родов вирусов:
Paramyxovirinae
Род Paramyxovirus включает вирусы парагриппа типов 1 и 3 человека (ВПГЧ), крупного рогатого скота, мышей (вирус Сэндай), обезьян. Вирусы парагриппа вызывают гриппоподобные ОРВИ катар верхних дыхательных путей, бронхеолит, пневмонию.
Род Morbivirus включает вирусы чумы крупного и мелкого рогатого скота, собак, морских млекопитающих. Морбивирусом, патогенным для человека, является вирус кори. Этот вирус имеет антигенные детерминанты, общие с другими морбивирусами. Все известные штаммы принадлежат к одному серотипу. Вирус тропен к клеткам ретикулоэндотелиальной системы. Заболевание сопровождается ринитом, фарингитом, коньюктивитом с симптомами фотофобии, лихорадкой, папулезной сыпью. Отличительный признак инфекции наличие на слизистых щек пятен, называемых пятнами Бельского-Филатова-Коплика. Инфекция управляется с помощью вакцинопрофилактики.
Род Rubulavirus включает вирусы парагриппа типов 2, 4а, 4в человека, вирусы парагриппа типов 1 и 2 птиц (Болезнь Ньюкасла и Юкейпа, соответственно), парамиксовирусы типов 5 и 41 обезьян, рубулавирусы свиней. Эпидемически значимым в инфекционной патологии человека является вирус паротита или «свинки». Инфекция проявляется поражением околоушных желез, яичек, яичников, поджелудочной и щитовидной желез. Чаще болеют мальчики. Инфекция управляется с помощью вакцинопрофилактики.
Pneumovirinae
Род Pneumovirus включает вирус пневмонии мышей, респираторно-синцитиальные вирусы крупного рогатого скота и человека. Респираторно-синцитиальный вирус (РС) человека вызывает заболевания нижних дыхательных путей чаще у новорожденных и детей раннего возраста. У взрослых инфицирование протекает легко или бессимптомно. Вирус проявляет выраженные иммуносупрессивные свойства, что определяет высокую частоту возникновения вторичных бактериальных инфекций.

9.6.2. Вирусы гриппа (Orthomyxoviridae)
Название лихорадочному заболеванию «грипп», сопровождающемуся острым респираторным синдромом, было дано в XVIII в. французским врачом Бруссе («gripper» схватить), в Италии заболевание было названо «инфлюенца» (влияние холода). Грипп вызывается тремя вирусами - вирусами гриппа A, B и C. Наибольший вред здоровью людей и экономике наносят вирусы гриппа А, вызывающие эпидемии и пандемии заболевания. Эпидемии заболевания наблюдаются ежегодно. Крупнейшие пандемии гриппа наблюдались в 1889, 1957, 1968, 1977 гг.
Семейство объединяет вирусы гриппа позвоночных (млекопитающих и птиц) и ортомиксовирусы беспозвоночных (клещей), обладающие выраженным тропизмом к мукополисахаридам и гликопротеинам.
1. Influenzavirus A включает наиболее вирулентные и эпидемически значимые вирусы гриппа A человека. К данному роду относятся также вирусы гриппа A лошадей, свиней, тюленей, а также кур, уток и других видов птиц.
2. Influenzavirus B вирусы гриппа B слабопатогенны для животных, в результате чего потеряли источники шифтов. Вызывают более ограниченные эпидемии.
3. Influenzavirus C включает вирусы гриппа C человека и свиней. Вирусы вызывают относительно легкие спорадические заболевания, не принимающие эпидемического характера. Геном вирусов гриппа C представлен 7-ю сегментами РНК, отсутствует ген нейраминидазы.
Вирионы относительно небольшие сферические частицы диаметром 80-120 н.м., часто обнаруживаются нитевидные формы. Состоят из двух структурных элементов внутреннего спирального нуклеокапсида и наружной липопротеиновой оболочки. Нуклеокапсид образован 8-ю сцепленными сегментами онРНК, соединенными с основным структурным белком нуклеокапсида (NP) и белковым комплексом P, который представлен тремя полипептидами (PB1 узнает кэп-структуру клеточных мРНК, PB2 содержит активный центр РНК-зависимой РНК-полимеразы, PA участвует в репликации). Белки нуклеокапсида ассоциированы с негликозилированным матриксным (М) белком, который с другой стороны связан с белками оболочки. В состав оболочки входят два вирусных гликопротеина гемагглютинин (HA) и нейраминидаза (NA). Тримеры HA и тетрамеры NA образуют шипы вирусной оболочки. Гликопротеин HA опосредует связывание вириона с клеточным рецептором, содержащим сиаловую кислоту. Протеолитически активированный HA обладает фузионной активностью и участвует в слиянии мембран вируса и эндосомы при низких значениях pH. NA фермент, отщепляющий остаток сиаловой кислоты от любой олигосахаридной цепи, включая собственные цепи HA и NA.
HA и NA несут антигенные детерминанты вируса. На их сочетании основана классификация вирусов гриппа. У вируса гриппа A выделено 12 типов HA и 9 типов NA. Сочетание этих типов определяет антигенный тип вируса гриппа. Так например вирус Испанского гриппа обозначен как H1N1, вирус гриппа Гонконг H3N2.
Геном представлен 8-ю сегментами онРНК негативной полярности, общим размером -13,6 т.п.н. Сегментированность генома делает возможным пересортировку генов (реассортацию), что приводит к появлению новых генных комбинаций и лежит в основе высокой скорости эволюции вирусов гриппа. 6 сегментов РНК являются моноцистронными. Два бицистронны, в связи с чем 8 сегментов РНК кодируют 10 белков, семь из которых являются структурными и три неструктурными. Транскрипция РНК происходит в ядре и предусматривает кооперацию клеточных и вирусных факторов. Собственная РНК-зависимая РНК-полимераза не способна инициировать синтез мРНК и поэтому использует в качестве затравки кэпированный и метилированный 5'-конец (10-13 нуклеотидов) клеточных мРНК, синтезированных РНК-полимеразой II. В репликации участвует тот же набор белков, что и при транскрипции. Переключение транскрипции на репликацию, по всей вероятности, определяется пулом новосинтезированных белков. На первом этапе репликации синтезируются полноразмерные (+)РНК копии сегментов, которые не кэпированы и не полиаденилированы (это антигеномные РНК, содержащие полный набор информации). (+)РНК служат матрицей для синтеза геномной (-)РНК. Ни геномные, ни антигеномные РНК никогда не обнаруживаются в свободном виде, они всегда инкапсидированы полным набором нуклеокапсидных белков.
На основе антигенных различий главных белков нуклеокапсида (HA и NA) и белка M выделено четыре рода ортомиксовирусов. Антигены рода строго специфичны и не дают перекрестных реакций с представителями другого рода. Внутри рода вирусы гриппа характеризуются высокой антигенной вариабельностью.
Уникальная изменчивость вирусов гриппа A проявляется двумя не связанными друг с другом процессами антигенным дрейфом и антигенным шифтом.
Антигенный дрейф последовательное замещение одних штаммов вируса гриппа A другими, антигенно новыми штаммами является результатом точечных мутаций генов поверхностных белков (HA, NA) и иммунологической селекции. Мутации не приводят к изменению антигенного типа вируса, но снижают специфичность циркулирующих в организме антител.
Антигенный шифт внезапное появление новых антигенных типов вируса является результатом значительных антигенных изменений, при которых в результате реассортации (пересортировки) происходит замена генов, определяющих антигенные характеристики вируса. Образовавшееся потомство приобретает новые антигенные свойства, и, как следствие этого происходит возникновение «новых» вирусов. Антигенный шифт обусловлен генетической рекомбинацией между штаммами вирусов человека и животных. Образование нового шифтового варианта вируса, как правило, вызывает пандемию.
Пандемии гриппа у людей вызывают только вирусы гриппа A и только эти вирусы выделены от низших млекопитающих и птиц. Молекулярно-генетическое изучение штаммов вирусов гриппа A, выделенных от человека, животных и птиц позволило выдвинуть гипотезу, что источником происхождения вирусов гриппа человека являются вирусы гриппа животных.
Первое предположение, что пандемические варианты вируса гриппа A возникают в процессе рекомбинации с вирусами животных было сделано в 1964 г. Позднее возможность возникновения новых гибридных штаммов вируса гриппа была показана в условиях in vivi in vitro. В 1970 году было сообщено о получении гибридных вирусов гриппа путем одновременного инфицирования свиньи вирусами гриппа свиней и птиц. В это же время наши соотечественники (Д.К. Львов с соавторами) из вирусов гриппа птиц получили рекомбинантный вирус, соответствующий по антигенной структуре вирусу гриппа A азиатского типа (H2N2). Эти исследования показали, что два различных штамма вируса гриппа A могут рекомбинировать в условиях in vivo, если они одновременно введены одному животному. При этом новые гибридные вирусы могут приобретать новые селективные преимущества перед обеими родительскими штаммами.
Вирусы гриппа A широко, распространены среди домашних и диких животных. В настоящее время среди свиней широко циркулируют вирусы Гонконгского типа (H3N2), которые также изолированы от птиц в Европе, на Дальнем Востоке, в Центральной России. Вирусы Азиатского гриппа (H2N2) изолированы от домашних и диких уток. Огромное разнообразие экологических групп животных дает простор для циркуляции вирусов гриппа. В процессе циркуляции могут длительное время сохраняться старые штаммы и возникать новые рекомбинантные варианты. В этих процессах особая роль отводится птицам, которые являются древнейшим резервуаром вирусов.

9.6.3. Коронавирусы (Coronaviridae)
В семейство входит немногочисленная группа вирусов человека, животных и птиц, объединенных в два рода Coronavirus и Torovorus, представители которых не имеют антигенных связей. Торовирусы являются возбудителями диарейных заболеваний человека и животных. Корона вирусы вызывают диарейные и респираторные заболевания.
Вирионы относительно крупные (75-180 нм в диаметре), состоят из сердцевины и внешней оболочки. Оболочка образована липидным бислоем клеточного происхождения и содержит булавовидные выросты-пепломеры гликопротеина E2 (80-200 кД), чередующегося с погруженным в мембрану гликопротеином E1 (20-35 кД). gpE2 является антирецептором, вызывает слияние мембран, индуцирует образование нейтрализующих антител. Матриксный gpE1 обеспечивает отпочкование от мембран ЭПР и Гольджи, взаимодействует с вирусным нуклеокапсидом. Сердцевина гибкий нуклеокапсид со спиральным типом симметрии. Образован РНК, ассоциированной с тримерами фосфопротеина (50-60 кД). Геном (+)РНК размером 16-21 т.н., которая кэпирована и полиаденилирована.
Вирионы проникают в клетку путем рецепторного эндоцитоза или слияния мембран и после депротеинизации РНК транслирует 5-концевую часть генома, кодирующую РНК-полимеразу. РНК-полимераза осуществляет репликацию геномной РНК с образованием минус-нити, на матрице которой из одной точки инициации синтезируются геномная и набор субгеномных РНК разной длины, что является особенностью репликации/транскрипции коронавирусов. Геномная и субгеномные РНК имеют кэп, полиадениловый участок и общую лидерную последовательность на 5'-конце. Транскрипция с минус-нити требует затравки, роль которой выполняет лидерная последовательность, детерминированная 5'-концом геномной РНК. Синтез субгеномных мРНК происходит путем удлинения лидерной последовательности со специфических внутренних участков минус-цепи. Каждая мРНК транслирует только один полипептид, кодированный на 5'-конце генома, что отличает коронавирусы от других (+)РНК вирусов, которые транслируют полипротеины. Вирионы созревают путем почкования РНП через мембраны ШЭР и аппарата Гольджи, но не через цитоплазматическую мембранную, покидают клетку в результате лизиса или слияния мембран, ряд вирусов могут покидать клетку в процессе клеточной секреции.
Род Coronavirus включает 4 антигенные группы вирусов, вызывающих разные заболевания домашних животных, которые могут иметь важные экономические последствия. Большинство коронавирусов обладают тропностью к клеткам эпителия дыхательных путей и кишечного тракта и вызывают респираторные инфекции и диарейные заболевания. Респираторные коронавирусы у человека вызывают заболевания, повсеместно регистрируемые как «банальная простуда» или ОРВИ. На долю респираторных коронавирусных инфекций приходится 20% ОРЗ. Респираторные инфекции у людей протекают по типу катара верхних дыхательных путей, чаще болеют подростки и взрослые. Для коронавирусной инфекции характерна сезонность с пиком в зимне-весенние месяцы. Коронавирусы характеризуются антигенной гетерогенностью, что обусловливает высокую частоту реинфекций другими серотипами вируса.
В качестве примера коронавирусов могут быть приведены: вирус инфекционного бронхита птиц, вирус гепатита мышей, респираторный коронавирус человека, энтеральный коронавирус человека.

Глава 10. Происхождение и эволюция

10.1. Полифилетическое происхождение вирусов
Происхождение вирусов вопрос, который на протяжении многих лет составлял предмет дискуссий. Было выдвинуто три гипотезы происхождения вирусов:
1. Вирусы потомки бактерий и других одноклеточных организмов, претерпевших дегенеративную (регрессивную) эволюцию.
2. Вирусы потомки древних доклеточных форм жизни, перешедших к паразитическому способу существования.
3. Вирусы дериваты (производные) клеточных генетических структур, ставших относительно автономными, но сохранивших зависимость от клеток.
Идея регрессивной эволюции вирусов впервые была высказана французским ученым Николлем, развита американцем Грином и модернизирована Барнетом в 1943 г. Основанием для выдвижения этой гипотезы явилось существование крупных сложноустроенных ДНК-содержащих вирусов, имеющих сотни генов и обладающих относительной автономностью систем репликации/транскрипции. Примером могут служить поксвирусы (вирусы оспы). Согласно идее регрессивной эволюции, вирусы оспы находятся последними в ряду облигатных внутриклеточных паразитов потомков бактерий:
Бактерии -> микоплазмы и риккетсии -> хламидии -> вирусы оспы
В свете современных данных о вирусах, эта гипотеза не находит сторонников, так как мир вирусов слишком велик, чтобы признать возможность столь глубокой дегенеративной эволюции. Наиболее веским аргументом против теории регрессивного происхождения вирусов является неклеточная организация вирусов.
Вторая гипотеза происхождение вирусов из доклеточных форм жизни базируется на многообразии видов генетического материала у вирусов, которое «исчерпывает» все возможные формы однонитевые и двухнитевые ДНК и РНК, их линейные, кольцевые, сегментированные формы. Природа как бы испробовала на вирусах возможные варианты нуклеиновых кислот. В настоящее время известны генетические паразиты, не кодирующие белков и обладающие рибозимазной активностью (вироиды), которые, по всей вероятности, являются прародителями отдельной эволюционной линии РНК-геномных вирусов. Вирусные геномы обладают кодом, который реализуется с использованием клеточных механизмов репликации/транскрипции, что делает маловероятной возможность возникновения вирусов до появления клеточных форм жизни.
Третья гипотеза была сформулирована около 30 лет назад и получила название гипотезы «взбесившихся генов». Она предполагает, что вирусы являются видоизмененным генетическим материалом клеток.
Вирусы автономные генетические элементы, которые во многом сходны с другими видами переносимых генетических элементов: R- и F-факторами бактерий, плазмидами, вироидами, транспозонами. Их функционирование не может происходить без взаимодействия с клеткой. В связи с этим, истоки происхождения вирусов целесообразно рассматривать в контексте происхождения жизни на земле.
Согласно современным представлениям, биологической эволюции предшествовала химическая эволюция, которая длилась около 1 млрд. лет. Именно на этапе «первичного бульона», обладавшего большим химическим многообразием, произошло образование полинуклеотидных цепей из пуриновых и пиримидиновых оснований, одним из свойств которых явилась комплементарность. Эволюция нуклеиновых кислот протекала за счет аутокаталитической активности. В настоящее время мы уже знаем, что ряд автономных кольцевых РНК (вироидов) обладают аутокаталитической (рибозимазной) активностью. Следующим этапом молекулярной эволюции было появление матричного синтеза полипептидов, которое стало возможно с появлением тРНК. Появление тРНК означало появление генетического кода. Полагают, что генетический код стал универсальным 2,5 млрд. лет назад. С появлением матричного синтеза начинает действовать естественный отбор то есть размножаются и сохраняются наиболее приспособленные формы.
Предполагается, что первичные формы жизни содержали в качестве генетического материала РНК. ДНК появилась позже и с ее появлением произошло разделение функций между ДНК и РНК. ДНК хранитель генетической информации, РНК кодопереводчик. Возникшая протоклетка (прогенот), содержащая как ДНК, так и РНК, далее развивалась своим чередом, дав начало прокариотическим клеткам.
Наиболее вероятно, что основой для возникновения альтернативной генетической формы жизни вирусов, явились сформировавшиеся первичные генетические системы репликации/транскрипции, которые по простоте и поведению соответствовали вирусным системам. При этом вирусы могли возникнуть на этой стадии первично или обособиться от клеточных генов, о чем свидетельствует наличие сходных нуклеотидных последовательностей у вирусов и подвижных генетических элементов клеток.
В настоящее время известен целый ряд подвижных генетических элементов, которые присутствуют как в прокариотических, так и эукариотических клетках. Основными из них являются:
Интроны транскрибируемые участки ДНК, которые удаляются из состава транскрипта при сплайсинге. Это явление обнаружено только у эукариот.
Транспозоны последовательности ДНК, способные реплицироваться и внедрять одну из копий в новое место генома.
Ретротраспозоны мобильные генетические элементы эукариотических клеток, транспозиция которых происходит при транскрипции или обратной транскрипции.
Плазмиды внехромосомные элементы наследственности прокариот, способные к автономной репликации.
Интроны образуются в эукариотических клетках путем сплайсинга первичных транскриптов, то есть их последовательности присутствуют в клеточной ДНК. Получены факты, свидетельствующие о том, что интроны присутствовали в самых первых генах. Однако это не означает, что они не могли внедряться в уже существующие кодирующие области. Недавние эксперименты позволили установить механизмы (генная конверсия и обратный самосплайсинг) с помощью которых ин троны могут внедряться в ДНК. Наиболее простые по молекулярной организации генетические паразиты растений вироиды (кольцевые онРНК) имеют последовательности, гомологичные интронам ядерной и митохондриальной ДНК, что свидетельствует об их филогенетических взаимосвязях. Вироиды не кодируют никаких белков, но эволюционно связаны с вирусоидами, некоторые из которых приобрели способность одеваться за счет кодирования своего белка. Есть веские основания полагать, что вироиды и вирусоиды соответствуют начальным стадиям формирования РНК-геномных вирусов.
Особенностью РНК-геномных вирусов является наличие РНК-зависимой РНК-полимеразы, которая также имеется у растений. По-видимому, именно растительные клетки явились источником происхождения многих РНК-содержащих вирусов. В этом контексте представляет интерес существование семейств вирусов, представители которых поражают растения, животных и насекомых рабдо-, рео- и буньявирусы. Наиболее древними из них являются рабдовирусы.
Другая эволюционно обособленная группа вирусов ретроидные вирусы. Сравнительная таксономия указывает на очень древнюю связь ретровирусов и ретроидных элементов гепаднавирусов и каулимовирусов с транспозонами и другими подвижными генетическими элементами клетки. Ретроидные элементы найдены во всех типах клеточных организмов. Это придает правдоподобность предположению, что ретроидные вирусы являются очень древними и могли образоваться одновременно или после возникновения обратной транскрипции, которая была вовлечена в самую раннюю стадию жизни на земле, когда ДНК геномы развились на основе РНК. Однако интересным и удивительным является тот факт, что ни один из классов ретротранспозонов не имеет прокариотических партнеров. Ретротраспозоны по структуре, особенностям транскрипции и механизму транспозиции ведут себя как ретровирусные провирусы. Ретротраспозоны кодируют несколько белков, одним из них является обратная транскриптаза, другие белки вместе с транскриптами образуют внутриклеточные рибонуклеклеопротеиновые частицы.
На основании структурно-функционального сходства и гомологии генома в настоящее время выделены две филогенетические линии вирусов

Многие вирусы папиломавирусы, герпесвирусы, вирусы дрожжей персистируют в организме хозяина в виде эписом (кольцевые молекулы ДНК, способные интегрировать в ДНК хозяина), что делает их похожими на внехромосомные элементы наследственности бактерий плазмиды. Плазмиды могут иметь клеточное происхождение или быть дериватами бактериофагов. Можно предположить, что в основе происхождения эписомных форм вирусов и плазмид лежат одни и те же механизмы, а именно механизмы образования транспозирующих элементов.
В происхождении другой группы ДНК-содержащих вирусов бактериофагов, исследователи не сомневаются. Фаги, по крайней мере умеренные (способные интегрировать в бактериальную хромосому и существовать в виде профага), являются фрагментами бактериального генома, которые приобрели способность к независимой репликации и к построению вирионов.
Можно предположить, что в прокариотических клетках возникли всевозможные формы переносимых генетических элементов, из которых одни имели больший, другие меньший успех в эволюции. В результате перехода в клетку нового хозяина они могли стать паразитами и эволюционировать своим путем.
Таким образом, совершенно очевидно, что нельзя говорить о каком-то общем происхождении вирусов. Кажется бесспорным, что РНК-содержащие вирусы более древние, ДНК-геномные более молодые. Эти группы вирусов произошли разными путями: от разных предковых последовательностей нуклеиновых кислот и в разное время на разных этапах эволюции. При этом разные группы вирусов (ДНК-содержащие, РНК-содержащие, ретроидные вирусы) имеют филогенетическое родство с различными клеточными элементами, то есть имеют полифилетическое происхождение происхождение из разных источников. Возникнув разными способами на разных этапах эволюции .клеток-хозяев, вирусы эволюционировали своим путем, в определенной степени зависимым от эволюции организмов, в которых они репродуцируются.
10.2. Эволюция вирусов
Биологическая эволюция это процесс накопления изменений в организме и увеличение их разнообразия во времени.
Вирусы это не организмы, это неклеточные формы жизни, основой которой является функционально активный геном. На генетическом уровне эволюция представляет собой накопление изменений в генетической структуре популяций и включает два этапа: первоначально происходит возникновение изменений в результате известных молекулярных механизмов изменчивости, затем их накопление и закрепление в популяции под действием естественного отбора.
Вирусы, являясь генетическими паразитами и представляя собой несовершенную форму жизни, подчиняются законам эволюции органического мира и обладают необходимыми атрибутами жизни наследственностью и изменчивостью, а также подвержены естественному отбору. Изменчивость вирусов затрагивает различные биологические свойства морфологию, антигенную структуру, иммуногенность, тканевой тропизм, патогенность, круг восприимчивых хозяев, биохимические свойства, устойчивость к физическим и химическим воздействиям. Основу наследственной изменчивости вирусов составляют изменения их генетического материала.
10.2.1. Молекулярные механизмы изменчивости вирусов
Вирусы имеют полифилетическое происхождение. В связи с этим, 20% вирусов несут в качестве генетического материала ДНК, 80% РНК. Как генетический материал ДНК и РНК обладают разным эволюционными возможностями, так как с разной эффективностью реализуют внутренние источники наследственной изменчивости. Внутренними источниками изменений являются спонтанные генные мутации и рекомбинационные процессы, включающие интеграционные взаимодействия с геномом хозяина.
Мутации (точковые и множественные) представляют собой изменение генетического кода в результате замены (транзиции, трансверсии), выпадения (делеции) или вставки (инсерции) одного или нескольких нуклеотидов в геномной последовательности. Большинство мутаций носит нейтральный характер. К изменению фенотипа ведут только мутации, затрагивающие функционально активные последовательности белковой молекулы. По изменению фенотипа различают летальные, условно-летальные и нелетальные мутации. Примером летальных делеционных мутантов вирусов служат ДИ-частицы, условно-летальных температурочувствительные (ts) мутанты. Нелетальные мутации обеспечивают антигенный дрейф и определяют существование различных серотипов и генетических вариантов вирусов.
В естественных условиях размножения движущей силой изменчивости вирусов являются спонтанные мутации, частота которых существенно варьирует внутри различных генетических групп вирусов. Скорость спонтанных мутаций в ДНК-геномах чрезвычайно мала и составляет 10-8-10-11 на цикл репликации независимо от размера генома, в РНК-геномах эта величина составляет 10-3-10-4. Относительно низкая мутабельность ДНК-геномных вирусов компенсируется высокой численностью вирусных популяций (108-109 вирионов в мл тканевой суспензии), где имеет значение не столько частота возникновения мутаций, сколько их абсолютное количество.
Различают два механизма мутагенеза ошибка включения и ошибка репликации. В первом случае причиной мутаций является присутствие в клетке веществ, обладающих мутагенным действием аналогов нуклеотидных оснований, свободных радикалов, перекисей и т. д. Во втором случае причина заложена в точности воспроизведения геномной нуклеиновой кислоты в процессе репликации. В отличие от ДНК-содержащих вирусов, РНК-содержащие обладают повышенной мутабельностью. Это свойство определяется химическим составом, структурой и способом репликации РНК, исключающим возможность исправления ошибок на неповрежденной комплементарной цепи. Вследствие отсутствия репарационного механизма при репликации РНК в каждом репликационном цикле около 10% потомства РНК-содержащих вирусов имеет мутации. У вирусов гриппа и ВИЧ замещается около 1% последовательности в год.
Сами по себе мутации, изменяющие генетические признаки отдельных вирусных частиц не могут привести к изменению наследственных свойств вирусной популяции в целом. Для этого необходим второй фактор селекция, или направленный отбор мутантов, обладающих преимуществами для размножения в измененных условиях. Классическим примером выживания вируса за счет присутствия в популяции мутантов является выработка устойчивости к противовирусным препаратам. Другим широко известным проявлением естественной изменчивости вирусов является изменение антигенной структуры вируса гриппа A. В этом случае основной причиной изменчивости являются мутации в гене гемагглютинина, и как следствие антигенный дрейф, который используется вирусом как механизм ухода из-под иммунологического надзора.
Рекомбинация физическое взаимодействие между вирусными геномами в смешанно-зараженной клетке, при котором потомство, называемое рекомбинантами, содержит последовательности нуклеотидов, происходящие от обоих родителей. Различают два вида взаимодействий между геномами внутримолекулярную рекомбинацию и реассортацию.
Внутримолекулярная рекомбинация представляет собой перераспределение последовательностей внутри одной молекулы геномной нуклеиновой кислоты. Установлена как для непрерывных, так и для сегментированных геномов, независимо от вида нуклеиновой кислоты.
У ДНК-содержащих вирусов внутримолекулярная рекомбинация является основной причиной эволюционных изменений и происходит обычным образом по механизму разрыв-воссоединение. Кроме этого, источником наследственной изменчивости вирусов может служить включение в вирусный геном генетического материала хозяина, которое наблюдается при интегративной вирусной инфекции.
У РНК-геномных вирусов в основе внутримолекулярной рекомбинации лежит механизм смены матрицы путем так называемого «прыжка» РНК-полимеразы на гомологичную область нуклеотидной последовательности. Рекомбинационные взаимоотношения могут наблюдаться на уровне одного вируса, между разными серотипами вируса и между разными вирусами. Описана внутримолекулярная рекомбинация между сегментами РНК трипартитного бромовируса растений, когда дефектный 3'-конец одной нити РНК был восстановлен за счет рекомбинации с 3'-концом другого РНК-сегмента.
Подтверждением межтиповой рекомбинации служит обнаружение природных штаммов полиовируса вакцинного происхождения, геном которых содержал последовательности генома всех трех серотипов вируса. Такие рекомбинанты возникают при вакцинации живой пероральной поливалентной полиовирусной вакциной, что создает возможность заражения одной клетки кишечника всеми тремя полиовирусами с последующей сменой матрицы РНК-полимеразой в процессе их репликации.
В качестве примера рекомбинационных взаимоотношений между разными вирусами может быть приведен вирус западного энцефалита лошадей (Alphavirus), который является гибридом вируса восточного энцефаломиелита лошадей и вируса Синдбис, от которого он приобрел регион, кодирующий поверхностный гликопротеин. РНК-содержащие вирусы могут изменяться путем приобретения последовательностей генома клетки-хозяина как за счет интегративных взаимоотношений (ретровирусы), так и без них. Так, пестивирус вирусной диареи быка рекомбинирует с клеточными мРНК, в результате чего нецитопатогенный вирус может стать цитопатогенным и вызвать смертельную мукозальную болезнь у хозяев.
Реассортация перераспределение фрагментов сегментированного генома, является разновидностью рекомбинации. При реассортации вирусы с сегментированным геномом обмениваются сегментами, в результате у потомства, называемого реассортантами, в геном входят гены каждого из родителей. У вирусов с сегментированным геномом при реассортации сегменты перемешиваются случайным образом. Наиболее вероятно, что обмен происходит на стадии морфогенеза при условии двойного инфицирования клетки разными штаммами вируса. Явление реассортации в естественных условиях широко распространено у реовирусов, ротавирусов, бирнавирусов, вирусов гриппа. В том случае, если в результате реассортации произошла замена гена, определяющего антигенные характеристики вируса, и образовавшееся потомство приобретает новые антигенные свойства, речь идет об антигенном шифте.
Реассортация генов при смешанном инфицировании клеток вирусами разной видовой специфичности может служить причиной возникновения реассортантов не только с новыми антигенными свойствами, но и с новым эпидемическим потенциалом, дающим возможность реассортантам преодолевать межвидовые барьеры (межвидовая трансмиссия, переход от одного вида хозяина к другому). В общебиологическом смысле межвидовая трансмиссия процесс смешения популяций, приводящий к нарушению их изоляции, влекущий за собой одно-, или двусторонний обмен генами и приводящий к увеличению запасов наследственной изменчивости популяций за счет поступления генов из генофонда другой популяции. Явление межвидовой трансмиссии широко распространено в природе у вируса гриппа и ротавирусов.
Для вируса гриппа преодоление межвидового барьера является одним из источников формирования пандемичных штаммов. Известные в .настоящее время пандемичные штаммы вируса гриппа A возникли в результате реассортации генов вируса гриппа человека и вируса гриппа птиц при смешанной инфекции в организме свиней. Для ротавирусов человека показано появление новых штаммов, связанных с трансмиссией от кошек, свиней, собак, овец, крупного рогатого скота. Реассортанты, несущие гены ротавирусов животных, привнесли в популяции ротавирусов человека новые серотип-определяющие гены.
10.2.2. Эволюционные процессы
Эволюция вирусов базируется на тех же принципах, что и эволюция живых организмов, где выделяют микроэволюцию, видообразование и макроэволюцию.
Микроэволюция эволюционные процессы внутри популяции и вида, которые базируются на принципе нейтральности молекулярной эволюции. Суть этой теории, применительно к вирусам, заключается в том, что изменения генетического материала, возникающие на протяжении значительного числа поколений, не влияют на функциональные свойства вируса, изменяются лишь частные признаки, не влияющие на стратегию вирусного генома. Возникновение нейтральных и псевдонейтральных мутаций, происходящее в периоды так называемого относительного покоя, может приводить к вспышкам эволюционной активности микроскачкам. В процессе микроскачков происходит образование селективно ценных мутантов и рекомбинантов, которые обеспечивают дальнейшее процветание и распространение вируса среди хозяев. Примером эволюционно ценной мутации может быть одна точковая мутация в гене гемагглютинина вируса гриппа птиц, заменившая участок гликозилирования. Такая единственная точковая мутация привела к увеличению вирулентности вируса, что вызвало развитие эпизоотии среди домашних птиц на Американском континенте в 1982 г.
Видообразование. Постепенное накопление в геноме нейтральных мутаций и рекомбинационные процессы, обусловленные естественными механизмами изменчивости, приводят к увеличению эволюционного потенциала вируса и создают условия для качественного перехода или «большого скачка». В общей теории эволюции процесс внезапного образования организмов с новыми свойствами называется квантовым видообразованием. «Большой скачок» у вирусов проявляется внезапным появлением стабильного мутанта или рекомбинанта с новыми свойствами, способного быстро распространиться среди неиммунных хозяев, вызвать эпидемии неизвестных болезней.
Примером появления нового вируса является вирус гриппа свиней. Его образование проявилось внезапной вспышкой заболевания у свиней, зафиксированного после пандемии гриппа 1918 г. Существует достаточно доказательств, что вирус гриппа свиней это результат или реассортации с участием пандемических штаммов вируса гриппа человека или адаптации человеческого вируса к свиньям.
Достоверными случаями внезапного видообразования являются возникновение энтеровируса 70 и парвовируса, вызывающего диарею и миокардит у щенков. Энтеровирус 70 (Picornaviridae, Enterovirus) появился внезапно в 1968 г. в Гане (Марокко) и был связан с новым заболеванием острым геморрагическим коньюктивитом. Из-за полного отсутствия иммунитета у населения заболевание получило эпидемическое распространение. В 1969 г. энтеровирус 70 вызвал пандемию заболевания в Африке и распространился на Азию, Америку, Австралию и Новую Зеландию. В 1979 г. наблюдалась вторая пандемия, захватившая преимущественно Юго-Восточную Азию. Энтеровирус 70 отличается от других энтеровирусов антигенными свойствами, спектром патогенности и тканевым тропизмом. Основным местом его репликации служит конъюнктива, в кишечнике вирус не обнаруживается. Источник происхождения энтеровируса 70 неясен.
В 1977 г. в штате Техас (США) впервые было зарегистрировано заболевание диареи и миокардита щенков, вызванное неизвестным ранее парвовирусом (Parvoviridae, Parvovirus). У молодых щенков этот вирус вызывал миокардит, а в более старшем возрасте диарею, так как обладал сродством к рецепторам некоторых активно делящихся клеток. У новорожденных щенков вирус обладал тропизмом к клеткам миокарда, а у взрослых собак к клеткам эпителия кишечника. Происхождение нового парвовируса неизвестно. Предполагают, что он ведет свое начало от парвовируса кошек.
Примером нового вируса, возникшего как результат «удачной» мутации, позволившей преодолеть межвидовой барьер между обезьяной и человеком, является ВИЧ-1. Первые случаи СПИД зарегистрированы в США в 1981 г., вирус обнаружен в 1983 г. Получены убедительные данные, сидетельствующие о взаимосвязях ВИЧ-1 с вирусом иммунодефицита африканских зеленых мартышек.
Приведенные выше примеры появления новых видов вирусов не являются примерами образования новых форм. По структурной организации, организации генома, способу репродукции и другим фундаментальным свойствам вирус гриппа свиней является типичным вирусом гриппа. Этиологические агенты геморрагического конъюнктивита, миокардита и диареи щенков, СПИДа, несмотря на своеобразие, относятся к известным семействам пикорнавирусам, парвовирусам и ретровирусам, соответственно. Это свидетельствует о том, что возникновение данных вирусов явилось результатом микроэволюционных процессов.
Вымирание вирусов. Благодаря высокой мутабельности генетического материала эволюция РНК-геномных вирусов идет чрезвычайно быстро, что может привести к разрушению генетической структуры вируса под влиянием избыточности мутаций и служить внутренней причиной вымирания вирусов. Нейтральный характер молекулярной эволюции замедляет этот процесс и служит защитой РНК-геномных вирусов от форсированной эволюции. Однако барьер, установленный нейтральностью мутаций, может быть преодолен за счет их избыточности и накопления псевдонейтральных мутаций. Также, как и в случае квантового видообразования, накопление вредных изменений может привести к скачку, сопровождающемуся резкой перестройкой генома и внезапными функциональными нарушениями в жизненно важных белках. Жизнеспособность вируса снижается, создаются предпосылки для исчезновения вируса.
Подтверждением существования таких процессов служит внезапное прекращение эпидемий и исчезновение эпидемических штаммов вируса гриппа A при наличии восприимчивого населения. Внезапное прекращение циркуляции доминировавших штаммов вируса нельзя объяснить только давлением коллективного иммунитета. Предполагается, что шифтовые штаммы вируса гриппа заходят в эволюционный тупик. Молекулярная эволюция таких вирусов проходит неблагоприятно (сказывается груз подспудно накопленных вредных мутаций), что накладывает ограничения на продолжительность жизни вируса. Шифтовые варианты вируса гриппа способны пройти лишь ограниченное число генераций, не могут бесконечно передаваться от хозяина к хозяину, что приводит к их вымиранию.
Остается неясным, распространяется ли процесс вымирания, которому подвержены отдельные штаммы РНК-геномных вирусов, на популяции в целом и вид вируса. Нельзя исключить, что время существования известных на сегодня РНК-содержащих вирусов ограничено. Теоретически перед ними открываются два пути погибнуть или измениться. Вирусы подвергаются дивергентной эволюции, итогом которой являются изменения в нуклеотидном составе, которые могут привести к снижению жизнеспособности вида.
Важное значение для эволюции вирусов имеет деятельность человека, направленная на прекращение их циркуляции среди населения. Это достигается за счет повышения уровня коллективного иммунитета под влиянием массовой иммунизации. В частности это касается возбудителей таких заболеваний, как полиомиелит и корь, вакцинопрофилактика которых носит крупномасштабный и постоянный характер. Высокий уровень коллективного иммунитета является для вирусов полиомиелита и кори неблагоприятным фактором внешней среды, который заставляет вирусы приспосабливаться и уходить из-под иммунологического прессинга. Подсчитано, что циркуляция вируса кори прекратится, если величина иммунной прослойки достигнет 96% и будет поддерживаться на этом уровне длительное время. Однако в реальных условиях достигнуть таких результатов трудно и среди населения продолжается ограниченная циркуляция возбудителя, при которой постоянное иммунное давление создает селективный фон для отбора антигенно измененных вариантов. Считается, что вирусы кори и полиомиелита не подвержены антигенному дрейфу. Однако известно, что такая способность вырабатывается эволюционно. Массовая вакцинация против кори и полиомиелита может создать условия, способствующие приобретению этими вирусами способности к антигенному дрейфу. Подтверждением этому служит эпидемия полиомиелита в Финляндии в 1986 г., где полиомиелит не регистрировался 20 лет. Эпидемия была вызвана измененным в антигенном отношении вирусом полиомиелита типа III.
Макроэволюция эволюция на уровне более высоких, чем вид, систематических категорий. Этот процесс у вирусов приводит к образованию родов, семейств, порядков.
На уровне макроэволюции вирусов реализуется еще один из законов, управляющих ходом эволюционных процессов, а именно консервация блоков наследственной информации. Эти блоки перемещаются от таксона к таксону и в настоящее время функционируют в отдаленных хозяевах. Так у РНК-геномных вирусов растений, относящихся к разным семействам, и у ряда вирусов позвоночных наблюдается высокая степень сходства белков полимеразного комплекса (ВТМ и вирус Синдбис; вирус коровьего гороха и вирусы ящура и полиомиелита). Комплекс обратной транскрипции встречается у вирусов животных и растений ретровирусов, гепаднавирусов, каулимовирусов. Сходные по строению РНК-хеликазы также встречаются как у вирусов растений, так и у вирусов животных.
Консервация генов и многократное использование блоков наследственной информации связано с тем, что эволюция нашла оптимальный способ решения проблемы. Наличие таких общих генов у групп вирусов, по всей вероятности, отражает прошлые биологические взаимоотношения этих вирусов с клеточными организмами.
Изучение особенностей эволюции вирусов на уровне родов и более высоких таксонов стало возможным, начиная с 70-х годов, когда были разработаны методы секвенирования ДНК и РНК и методы определения первичной структуры белков. Сравнительный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей вирусов дал возможность устанавливать филогенетические связи между вирусами. На основе расчета сходства двух кодирующих последовательностей, выраженного в %, могут быть установлены: время с момента дивергенции генов от единого предкового гена; скорость накопления мутаций в генах; скорость фиксации мутаций в популяции. Процент различий, накопившихся в двух последовательностях одного гена у разных видов за определенный промежуток времени, называют скоростью эволюции. За единицу скорости эволюции принимается время, за которое две кодирующие последовательности дивергируют на 1%. Эта единица обозначается UEP (unit evolutionery period).
Вирусы открыты немногим более 100 лет назад и для сравнительного анализа доступны природные штаммы вирусов, собранные в короткий исторический период. Тем не менее, основываясь на скорости накопления мутаций, может быть определена эволюционная дистанция между филогенетически родственными вирусами, то есть, можно определить тот момент, когда вирусы дивергировали от своего общего предшественника.
В настоящее время сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей с целью изучения филогенетических отношений вирусов проводят с использованием компьютерных программ. По результатам анализа частоты и позиций нуклеотидных замен в сравниваемых последовательностях и расчета эволюционных дистанций строятся филогенетические деревья (дендограммы), которые дают полезную информацию о происхождении вируса и способе воздействующей селекции.

Глава 11. Основные открытия и Нобелевские премии в области вирусологии
Нобелевские награды определены великим автором А. Нобелем как премии по физике, химии, физиологии и медицине, литературе и общественному движению гуманистической направленности. Естественно не определено премий непосредственно по вирусологии, но de facto значительное количество наград получено именно за выдающиеся достижения в области генетики и вирусологии. Вирусы оказались той моделью, тем механизмом, которые открыли многие новые концепции в области физико-химической биологии, медицине и молекулярной генетике.
В 1938 году Астбери ввел понятие молекулярной биологии. Однако, по существу, рождение молекулярной биологии произошло 21.04.1953 г., когда в журнале Nature была опубликована статья Уотсона, Крика и Уилкинсона (900 слов), посвященная вторичной структуре ДНК. Было показано, как ДНК может выполнять функцию гена на основе закона комплементарности; заложены основы механизмов репликации, т. е. синтеза гена. Премия обозначена «За открытие структуры нуклеиновых кислот и их роли в переносе информации в живом веществе». История открытия ДНК описана Уотсоном в его замечательной книге «Двойная спираль» (1968 г.). В ней он вспоминает элементы творчества, научных контактов и счастливых обстоятельств, которые сопутствовали группе Уотсона (ему тогда было 23 года!) и помогли понять и создать модель ДНК.
Очень важно знать и принять, что концепция комплементарности имеет глубокие истоки. Считается, что биологическая парадигма комплементарности родилась в семинарах С.С. Четверикова и Н.В. Тимофеева-Ресовского в России. Из Москвы она была перенесена в Европу, обсуждена физиками Бором, Дельбрюком, перевезена в Америку и воспринята талантливым бакалавром, биохимиком Уотсоном.
Затем, в течение 25 лет триумфального развития молекулярной биологии были раскрыты общие механизмы хранения генетической информации, репликации, транскрипции, трансляции для самых разных организмов (разных царств живого).
Нобелевская премия была присуждена Корнбергу за расшифровку механизмов биосинтеза РНК и ДНК и открытие ДНК-полимеразы (1959 г.). В 1968 году Нобелевская премия присуждена Корана, Холли и Ниренбергу за открытие новых законов в области молекулярной генетики. Корана за синтез гена; Холли за создание модели структуры тРНК, Ниренбергу за расшифровку генетического кода, что было наиболее знаменательным.
Важными работами для вирусологии непосредственно были исследования Дельбрюк, Лурия и Херши, которые были посвящены особенностям генетической структуры вирусов, механизмам их синтеза и репликации (1969 г.).
Еще в 1939 году Дельбрюк с соавторами изучали процесс воспроизводства и размножения фагов. Обнаружено, что процесс состоит из трех периодов: прикрепление фага к бактерии, скрытый период, в течение которого возможно размножение фага и, наконец, период лизиса бактериальной клетки и выхода большого количества фаговых частиц. Уже тогда было известно, что генетическая основа вирусов это нуклео-протеины, подобные хромосомам высших организмов. Поэтому именно фаги стали рассматриваться в качестве модели для изучения функций гена.
В1946 году Дельбрюк и группа Херши открыли явление рекомбинации генов у вирусов и построили генетические карты.
В 1952 году Херши и его группа методом меченых атомов доказали, что именно ДНК несет генетическую информацию, что имеет значение и для репликации вирусов.
Таким образом, в возникновении молекулярной генетики как науки, вирусология сыграла фундаментально-прогрессирующую роль. Исключительные заслуги в этой области имеют Дельбрюк (физик), Херши (биохимик) и Лурия (врач), которые превратили учение о бактериофагах не только в прикладную, но и в фундаментальную науку.
Революционное значение в области вирусологии связано с работами группы Темина по открытию РНК-геномных вирусов (1975 г.). История этого прозрения поучительна. В 1970 году группа Темина получила совершенно новые, убедительные данные, что т УНГО возможен синтез ДНК на РНК-матрицах у некоторых вирусов. Результаты были доложены на микробиологическом конгрессе и отвергнуты, «освистаны», как абсурдные, неграмотные, волюнтаристские, «лысенковские», не соответствующие общепринятой логике передачи генетической информации:



Через несколько лет Темин перепроверил свои экспериментальные данные и подтвердил существование РНК-геномных вирусов, которые, как потом оказалось, широко распространены в природе. Таким образом, было доказано, что первая стрелка в формуле передачи генетической информации поворачивается и существует особый фермент ревертаза или обратная транскриптаза, а РНК у вирусов может быть матрицей.
Интересно вспомнить, что возможность передачи генетической информации с РНК на ДНК впервые была экспериментально получена отечественным профессором Гершензоном, однако эксперимент это не концепция и не открытие.
Практическое и теоретическое значение имеют работы, удостоенные Нобелевских премий, позволившие открыть некоторые вирусы, расшифровать инфекционную природу патологии, разработать методы исследования, которые исключительно перспективны.
В 1952 году Роббинс, Уэллер, Эндерс получили премию за разработку важнейшего метода культивирования вирусов культуры клеток.
В 1976 г. Бламберг получил Нобелевскую премию за открытие антигена вируса гепатита В. В этот же год Гайдушек был удостоен премии за расшифровку инфекционной природы таких заболеваний, как куру, скрепи, болезни Крейцфельдта-Якоба, а в 1997 г. Прузинер за разработку прионовой концепции этих заболеваний.
К направлениям вирусологии примыкает одна из самых актуальных проблем человечества вирусогенетическая теория происхождения рака, эта концепция впервые провозглашена российским ученым Львом Александровичем Зильбером. К сожалению, отечественным ученым очень редко давали (и дают) Нобелевские премии, хотя они их заслуживали и заслуживают. История развития учения о вирусном происхождении бластоматозных опухолей нисходит к 1911 году, когда Раус установил, что один из видов саркомы у птиц (саркома Рауса) вызывается вирусом. Однако это открытие не было принято. В 30-х годах появились важнейшие работы Л. Зильбера. В 1965 г. итальянский ученый, работающий в США, Дульбекко установил, что геном ряда вирусов может присоединяться и интегрировать в клеточную ДНК хозяина, становясь ее составной частью. Эти вирусы в культуре тканей могут привести к неопластической трансформации, что еще раз подтвердило вирусную теорию происхождения онкопроцессов. Выяснилось, что большинство заинтересованных и «подозрительных» онковирусов принадлежит к РНК-содержащим. К числу таких вирусов относится и вирус саркомы Рауса. С большим опозданием Раусу (Роусу) присудили Нобелевскую премию в 1966 г. В 1975 г. Дульбекко, Темин и Балтимор были удостоены Нобелевской премии за раскрытие механизмов интеграционных взаимодействий онкогенных вирусов с клеткой.
Открытия в области вирусологии имеют прямое отношение и к генной инженерии, становление которой было результатом деятельности большого количества школ и ученых. Основополагающим фундаментом возникновения генной инженерии является открытие рестриктаз. Впервые в 50-х годах Лурия заметил интересный феномен - высокая специфичность фагов, в том числе по отношению к различным штаммам бактерий, может быть связана не только с определенными генетическими сайтами, но и ферментативными системами. Этими ферментами оказались эндонуклеазы совершенно нового класса, которые исключительно специфично узнают 4-6 пар нуклеотидов и разрезают обе цепочки ДНК. Рестриктазы ферменты-ограничители, так как они охраняют, то есть ограничивают генетическую информацию в клетке. Решающий вклад в учение о рестриктазах внесли Арбер, который по существу открыл рестриктазы; Смит, который выделил первые рестриктазы; Натане создал метод выделения генов с применением рестриктаз и провел полное картирование нескольких вирусных геномов. За эти исключительные достижения и открытия им в 1978 году была присуждена Нобелевская премия по физиологии и медицине.
Заголовок 215

Приложенные файлы

  • doc 8852874
    Размер файла: 1 MB Загрузок: 0

Добавить комментарий