Шпора по Вирусологии к экзамену


Введение в вирусологию: вирусология как наука, известные ученые вирусологи, этапы развития вирусологии.Вирусы – реплицирующиеся микроорганизмы, одна из мельчайших форм жизни. Принадлежат к отдельному царству VIRA. Приоритет в открытии вирусов принадлежит Д.И. Ивановскому, который установил (1892г.), что мозаичная болезнь табака вызывается двумя возбудителями: грибом и неизвестным возбудителем. Если профильтровать массу измельченного листа через фильтр Шамберлена, то полученным фильтратом можно заразить здоровое растение, т.е. в фильтрате содержится вещество, обладающее контагеозностью. 1897 – открытие ящура, 1902 – чума КРС, 1903 – чума свиней, 1903 – оспа кур, коз Причины бурного развития вирусологии.
С началом XX века роль бактериальных болезней начала постепенно снижаться. Причиной тому послужило открытие препаратов, позволявших хорошо контролировать бактериальные болезни. После открытия сульфаниламидов и антибиотиков на первый план вышли бактериальные болезни.
Вирусы послужили базой для исследований в области онкологии, генетики.
Роль вирусных болезней резко возросла в связи с трансформацией технологий животноводства, связанной с образованием крупных откормочных комплексов (массовые болезни вирусной этиологии).
Вирусы вызывают отдельные серьезные патологии. Убиквитарные возбудители существуют в организме в норме, а при ослаблении организма дают патологию.
Экологический аспект – очень многие виды животных, а особенно птицы являются носителями и переносчиками вирусных болезней.
Возможность искоренения онкологических заболеваний – большинство раковых болезней имеют вирусное происхождение.
Вирус: строение и химический состав, функции структуры вириона. Отличия от других инфекционных агентов. Формы существования вирусов. Вирусы устроены очень просто. Они состоят из фрагмента генетического материала, либо ДНК, либо РНК, составляющей сердцевину вируса, и окружающей эту сердцевину защитной белковой оболочкой, которую называют капсидом. Полностью сформированная инфекционная частица называется вирионом. У сложных вирусов, таких, как вирусы герпеса или гриппа, есть еще и дополнительная липопротеидная оболочка, которая возникает из плазматической мембраны клетки-хозяина. В отличие от всех остальных организмов вирусы не имеют клеточного строения. Оболочка вирусов часто бывает построена из идентичных повторяющихся субъединиц – капсомеров. Из капсомеров образуются структуры с высокой степенью симметрии, способные кристаллизироваться. Это позволяет получить информацию об их строении с помощью рентгеновских лучей и с помощью электронной микроскопии. Как только в клетке-хозяине появляются субъединицы вируса, они сразу же проявляют способность к самосборке в целый вирус. Самосборка характерна и для многих других биологических структур, она имеет фундаментальное значение в биологических явлениях. Непременным компонентом вирусной частицы является какая-либо одна из двух нуклеиновых кислот, белок и зольные элементы. Эти три компонента являются общими для всех без исключения вирусов, тогда как остальные липиды и углеводы - входят в состав далеко не всех вирусов. Вирусы, в состав которых наряду с белком и нуклеиновой кислотой входят также липиды и углеводы, как правило, принадлежат к группе сложно устроенных вирусов. Кроме белков, входящих в состав нуклеопротеидного «ядра», вирионы могут содержать еще вирус - специфические белки, которые были встроены в плазматические мембраны зараженных клеток и покрывают вирусную частицу, когда она выходит из клетки или «отпочковывается» от ее поверхности. Кроме того, у некоторых вирусов с оболочкой существует субмембранный матриксный белок между оболочкой и нуклеокапсидом. Вторую большую группу вирус-специфических белков составляют некапсидные вирусные белки. Они в основном имеют отношение к синтезу нуклеиновых кислот вириона. Ещё одним компонентом являются углеводы (в количестве, превышающем содержание сахара в нуклеиновой кислоте). Парамиксовирусы, размножающиеся в различных клетках, могут содержать и соответственно разные липиды. Поэтому специфика вирусной оболочки зависит от вирусных гликопротеидов, находящихся на ее поверхности. У бактериофагов и вирусов животных и растений обнаружены полиамины. Возможно, что их единственная физиологическая функция состоит в нейтрализации отрицательного заряда нуклеиновой кислоты. Например, вирус герпеса содержит достаточно спермина, чтобы нейтрализовать половинку вирусной ДНК, а в вирусной оболочке, кроме того, присутствует спермидин. Отличия: размножаются только в живых клетках, Ген.мат мб как ДНК,так и РНК (грипп,бешенство).Они мб как 1- так и 2-х спиральные,м иметь ДНК в виде кольца. РНК мб фрагментирована. Отсутствие собственной белоксинтезир. сист. и отсутствуют энергосбр. сист.(митохондрии). Иной уровеньнь паразитизма,чем у бакт-й. Он на ген.ур-не: вир-й геном подавляет действие генома к-ки.(сем-воРетровирусов интегрирует(встраивается) геном кл-ки-он наз-ся провирусом,но может вырезаться из генома и сущ-ть отдельно от кл-ки под д-ем УФ,рентген-х лучей). Способ размнож.-разобщенный(дизъюнктивный): 1-в ядре, др-в цитоплазме; разобщено в простр-ве и во времени(сначала белок,потом еще что-то),а затем идет сборка. Сходство:1)Способны к размножению2)Вир облад. наследств. 3)Облад. изменчив. 4)Хар-ся как и др орг-мы приспос-тью к усл. внешней среды(через орг-м хозяина)5)Вир эволюционируют,и движ-й силой эволюции явл ест-й отбор(коллективный специф-й иммунитет) 6)Моделиров-ем ест-го отбора явл-ся искусств-й отбор. Формы существов: внеклеточная, покоящаяся (вирион), внутрикл. Репродуцирующ. (вегетативный вирус).
Характеристика белков вириона: строение и функции структурных белков.Вирусные белки обладают свойством самосборки. Не подвергаются действию протеолитических ферментов. Простые белки (протеины)– состоят из аминокислотных остатков. Сложные (протеиды) - сост. Из нескольких веществ. Структурные белки – это белки, которые входят в состав вириона. Строение: капсидные (простые вирусы, геномные белки и капсомеры) и пепломеры (сложные вирусы, и капсидные белки- геномные и капсомеры, пепломеры находятся в липопротеидной оболочке (гликопротеиды). Функции: - защита вириона , - защита нуклеиновой кислоты, - взаимодействие с мембраной клетки, - взаимодействие с вирусной нуклеиновой к-той, - проникновение в клетку, - самосборка, - способность к саморазрушению для высвобожд. НК, -организация выхода из клетки, - ферменты.
Характеристика белков вириона: строение и функции неструктурных белков. Неструктурные белки – это белки, которые не входят в состав вириона, но принимают участие в его репродукции. Мало изучены. Их сложно выделить и очистить от клеточных белков. К ним относятся: предшественники вирусных белков (существуют в зараженной клетке непродолжительно), ферменты синтеза ДНК и РНК – полимеразы, регуляторы стадий репродукции вирусов, ферменты, модифицирующие вирусные булки – протеиназы, протеинкиназы. Функции: регулятор экспрессии вирусного генома, -
Нуклеиновые кислоты вирусов: их строение, функции. Отличия от нуклеиновых кислот клетки. Нукл к-ты-линейные полимеры,сост из отдельных структур ,кот носят назв нуклеотиды(до неск-х тысяч в 1 мол-ле). Нуклеотид сост из:1)остатка фосфорной к-ты;2)сахара(рибоза-РНК, дезоксирибоза-ДНК)-пятиуглеродный;3)азотистое основание. Азотист основ ДНК: Тимин(Т), Аденин(А), Цитазин(Ц),Гуанин(Г) Азотист основ РНК: Урацил(У),Аденин, Цитазин ,Гуанин. ДНК от РНК отличаетсяся 1 азот осн-м и сахаром 2х спиральн ДНК:в 1953г амер биохимик Чаргафф заметил,что в 2х спир-й ДНК м/ду азот-ми основ-ми образ-ся пары: Т-А, Г-Ц,и кол-во Т=А,а Г=Ц-принцип компле-ментарности. Все жив орг-мы сод-т 2х спир-ые ДНК и 1-спир РНК. Но вир м сод-ть как 2х,так и 1-спир ДНК(как линейные,так и кольцевые). РНК-1- и 2х спир-ые(линейные и кольцевые).Мб РНК фрагментировано(вир гриппа-8 фрагментов). Ф-ции:хронитель наследственной информации.
Таксономия вирусов: основные критерии вирусов для их систематики, основные таксоны. Правила номенклатуры таксонов вирусов. Существует более 2000 вирусов. Классификация. а)Вирусы классифицируются по сердцевине: ДНК-содержащие и РНК-содержащие (ретро) вирусы. б)По структуре капсомеров. Изометрические (кубические), спиральные, смешанные. в)По наличию или отсутствию дополнительной липопротеидной оболочки г)По клеткам-хозяинам. Кроме этих классификаций есть еще много других. Например, по типу переноса инфекции от одного организма к другому. Таксоны: - отряд, - семейство, - подсемейство, - род, - вид.
Вид вирусов: определение, критерии вирусов вида, номенклатура вида вируса. Вид вируса – политетический класс вирусов, составляющих реплецирующую линию и занимающих определенную экологическую нишу. Члены вида имеют общее происхождение, ряд общих признаков, среди которых нет единого определяющего. Критерии: феномены генетических взаимодействий, антигенные свойства , спектр естественных хозяев, клеточный тропизм, патогенность и цитопатология, пути передачи. Название вида вируса состоит из слова вирус, название болезни и места, где был выделен вирус или фамилию описавшего инфекцию – вирус болезни Ауэски.
Род вирусов: определение, критерии вирусов рода, номенклатура рода вируса. Род объединяет группу видов вирусов, имеющих определенные общие признаки: морфология вирионов( тип симметрии и число капсомеров), наличие липопротеидной оболочки, физико-химические свойства (чувствительность к растворителям, рН среды, температуре). Род обозначается словом и оканчивается на –virus.
Семейство вирусов: определение, критерии вирусов семейства, номенклатура семейства вируса. Семейство объединяет группу родов вирусов, имеющих ряд наиболее постоянных общих признаков: тип нуклеиновой кислоты (РНК, ДНК), ее структура (количество цепей и их форма), стратегия вирусного генома (возможность обратной транскрипции для некоторых вирусов). Семейство обозначается словом и оканчивается на – viridae.
Характеристика этапов репродукции вирусов. Способы проникновения вирусов в клетку. 1)фаза: 1. Адсорбция вирусов на поверхность клетки. Начальный контакт происходит в результате случайного столкновения по типу Броуновского движения. Механизмы: неспецифический, специфический. Прикрепление вирусной частицы к клетке происходит путем образования единичной связи вирусной частицы с рецептором клетки. 2. Проникновение вируса в клетку. Способы: а) Рецепторный эндоцитоз происходит в специализированных участках плазматической мембраны, где имеются специальные ямки на дне которых имеются рецепторы. б) слияние вирусных и клеточных мембран. 3. Раздевание (депротеинезация) вируса. В результате раздевания освобождается внуиренний компонент вируса, который вызывает инф процесс. Раздевание ряда вирусов происходит в лизосомах, аппарате Гольджи, околоядерном пространстве, на ядерной мембране. 2)фаза: 1. Транскрипция – это переписывание информации с ДНК на РНК по законам генетического кода. Осуществляется с помощью фермента РНК – полимеразы. 2. Трансляция – это процесс перевода генетической информации, содержащейся в РНК на специфическую последовательность аминокислот в синтезируемых вирусоспецифических белках. Синтез белка происходит в результате трансляции и РНК на рибосомах. Элонгация – удлинение наращивание полипептидной цепи, основана на присоединении новых аминокислот с помощью пептидной связи. 3. Репликация – синтез молекул нуклеиновой кислоты, гомологичных геному. 4. Сборка вирусных частиц. Синтез компонентов (нуклеиновых кислот и белков) вирусных частиц в клетке разобщен и может протекать в разных структурах ядра и цитоплазмы. Как только их концентрация достигнет определенного уровня, начинается сборка вириона. 5. Выход вирусных частиц из клетки. Существует 2 способа выхода вырусного потомства из клетки: путем взрыва и путем отпочковывания.
Особенности репродукции вирусов с разными геномами. Классификация вирусов по Д. Балтимору. Реализация генетической информации вируса, содержащейся в ДНК, происходит следующим образом: при участии ДНК-зависимой РНК-полимеразы синтезируются и-РНК, которые поступают на рибосомы клетки, где и синтезируются вирусспецифические белки. У двунитевых ДНК-содержащих вирусов, геном которых транскрибируется в цитоплазме клетки хозяина это собственный геномный белок. Вирусы, геномы которых транскрибируются в ядре клетки, используют содержащуюся там клеточную ДНК-зависимую РНК-полимеразу. У РНК-содержащих вирусов процессы репликации их генома, транскрипции и трансляции генетической информации осуществляются иными путями. Репликация вирусных РНК, как минус, так и плюс-нитей, осуществляется через репликативную форму РНК (комплементарную исходной), синтез которой обеспечивает РНК-зависимая РНК-полимераза - это геномный белок, который есть у всех РНК-содержащих вирусов. Репликативная форма РНК минус-нитевых вирусов (плюс нить) служит не только матрицей для синтеза дочерних молекул вирусной РНК (минус нитей), но и выполняет функции и-РНК, т.е. идет на рибосомы и обеспечивает синтез вирусных белков (трансляция). У плюс-нитевых РНК-содержащих вирусов функцию трансляции выполняют ее копии, синтез которых осуществляется через репликативную форму (минус-нить) при участии вирусных РНК-зависимых РНК-полимераз. У некоторых РНК-содержащих вирусов (реовирусы) имеется совершенно уникальный механизм транскрипции. Он обеспечивается специфическим вирусным ферментом - ревертазой (обратной транскриптазой), и называется обратной транскрипцией. Суть ее состоит в том, что в начале на матрице вирусной РНК при участии обратной транскрипции образуется транскрипт, представляющий собой одну нить ДНК. На нем с помощью клеточной ДНК-зависимой ДНК-полимеразы синтезируется вторая нить и формируется двунитевой ДНК-транскрипт. С него обычным путем через образование и-РНК происходит реализация информации вирусного генома. Результатом описанных процессов репликации, транскрипции и трансляции является образование дочерних молекул вирусной нуклеиновой кислоты и вирусных белков, закодированных в геноме вируса. Классификация вирусов по Д. Балтимору. 1. Вирусы, содержащие двуцепочечную ДНК, 2. Вирусы, содержащие одноцепочечную ДНК, 3. Вир содер двучепочечн РНК, 4. Вир содер одноцепочечную РНК. 5. Вир содер одноцепочечную РНК не могут быть транслированы на рибосомах клетки хозяина, предварительно требуется транскрипция вирусными РНК-полимеразами вРНК, 6. Вир содерж одноцепочную РНК реплецирующуюся через стадию ДНК, 7. Вир содерж двуцепочную ДНК реплецирующ через стадию РНК.
Репродукция ДНК геномных вирусов: основные этапы, особенности репродукции. Примеры. 1)фаза: 1. Адсорбция вирусов на поверхность клетки. Начальный контакт происходит в результате случайного столкновения по типу Броуновского движения. Механизмы: неспецифический, специфический. Прикрепление вирусной частицы к клетке происходит путем образования единичной связи вирусной частицы с рецептором клетки. 2. Проникновение вируса в клетку. Способы: а) Рецепторный эндоцитоз происходит в специализированных участках плазматической мембраны, где имеются специальные ямки на дне которых имеются рецепторы. б) слияние вирусных и клеточных мембран. 3. Раздевание (депротеинезация) вируса. В результате раздевания освобождается внуиренний компонент вируса, который вызывает инф процесс. Раздевание ряда вирусов происходит в лизосомах, аппарате Гольджи, околоядерном пространстве, на ядерной мембране. 2)фаза: 1. Транскрипция – это переписывание информации с ДНК на РНК по законам генетического кода. Осуществляется с помощью фермента РНК – полимеразы. У ДНК-содер вирусов иРНК синтезируется на матрице одной из нитей ДНК. Формула переноса: ДНК – транскрип- РНК –трансляция- белок. Пример: вирус оспы и иридовирусы. . 2. Трансляция – это процесс перевода генетической информации, содержащейся в РНК на специфическую последовательность аминокислот в синтезируемых вирусоспецифических белках. Синтез белка происходит в результате трансляции и РНК на рибосомах. Элонгация – удлинение наращивание полипептидной цепи, основана на присоединении новых аминокислот с помощью пептидной связи. 3. Репликация – синтез молекул нуклеиновой кислоты, гомологичных геному. 4. Сборка вирусных частиц. Синтез компонентов (нуклеиновых кислот и белков) вирусных частиц в клетке разобщен и может протекать в разных структурах ядра и цитоплазмы. Как только их концентрация достигнет определенного уровня, начинается сборка вириона. 5. Выход вирусных частиц из клетки. Существует 2 способа выхода вырусного потомства из клетки: путем взрыва и путем отпочковывания.
13. Репродукция РНК – вирусов: основные этапы и особенности репродукции вирусов с позитивной полярностью генома. Пример. 1)фаза: 1. Адсорбция вирусов на поверхность клетки. Начальный контакт происходит в результате случайного столкновения по типу Броуновского движения. Механизмы: неспецифический, специфический. Прикрепление вирусной частицы к клетке происходит путем образования единичной связи вирусной частицы с рецептором клетки. 2. Проникновение вируса в клетку. Способы: а) Рецепторный эндоцитоз происходит в специализированных участках плазматической мембраны, где имеются специальные ямки на дне которых имеются рецепторы. б) слияние вирусных и клеточных мембран. 3. Раздевание (депротеинезация) вируса. В результате раздевания освобождается внуиренний компонент вируса, который вызывает инф процесс. Раздевание ряда вирусов происходит в лизосомах, аппарате Гольджи, околоядерном пространстве, на ядерной мембране. 2)фаза: 1. Транскрипция – это переписывание информации с ДНК на РНК по законам генетического кода. Осуществляется с помощью фермента РНК – полимеразы. У +РНК вирусов функции инфРНК выполняет сам геном передача генетической информации происходит по простой формуле РНК ---- белок. Пример – коронавирус. У них нет необходимости в акте Транскрипции для синтеза вирусоспец белков. 2. Трансляция – это процесс перевода генетической информации, содержащейся в РНК на специфическую последовательность аминокислот в синтезируемых вирусоспецифических белках. Синтез белка происходит в результате трансляции и РНК на рибосомах. Элонгация – удлинение наращивание полипептидной цепи, основана на присоединении новых аминокислот с помощью пептидной связи. 3. Репликация – синтез молекул нуклеиновой кислоты, гомологичных геному. 4. Сборка вирусных частиц. Синтез компонентов (нуклеиновых кислот и белков) вирусных частиц в клетке разобщен и может протекать в разных структурах ядра и цитоплазмы. Как только их концентрация достигнет определенного уровня, начинается сборка вириона. 5. Выход вирусных частиц из клетки. Существует 2 способа выхода вырусного потомства из клетки: путем взрыва и путем отпочковывания.
14. Репродукция РНК – вирусов: основные этапы и особенности репродукции вирусов с негативной полярностью генома. Пример. 1)фаза: 1. Адсорбция вирусов на поверхность клетки. Начальный контакт происходит в результате случайного столкновения по типу Броуновского движения. Механизмы: неспецифический, специфический. Прикрепление вирусной частицы к клетке происходит путем образования единичной связи вирусной частицы с рецептором клетки. 2. Проникновение вируса в клетку. Способы: а) Рецепторный эндоцитоз происходит в специализированных участках плазматической мембраны, где имеются специальные ямки на дне которых имеются рецепторы. б) слияние вирусных и клеточных мембран. 3. Раздевание (депротеинезация) вируса. В результате раздевания освобождается внуиренний компонент вируса, который вызывает инф процесс. Раздевание ряда вирусов происходит в лизосомах, аппарате Гольджи, околоядерном пространстве, на ядерной мембране. 2)фаза: 1. Транскрипция – это переписывание информации с ДНК на РНК по законам генетического кода. Осуществляется с помощью фермента РНК – полимеразы. У –РНК вирусов в клетке синтезируется комплементарная геному РНК, которая и является инфомац. Формула: РНК----инфРНК----белок. Пример: рабдовирус (бешенство) односпиральн, реовирус двуспиральный. 2. Трансляция – это процесс перевода генетической информации, содержащейся в РНК на специфическую последовательность аминокислот в синтезируемых вирусоспецифических белках. Синтез белка происходит в результате трансляции и РНК на рибосомах. Элонгация – удлинение наращивание полипептидной цепи, основана на присоединении новых аминокислот с помощью пептидной связи. 3. Репликация – синтез молекул нуклеиновой кислоты, гомологичных геному. 4. Сборка вирусных частиц. Синтез компонентов (нуклеиновых кислот и белков) вирусных частиц в клетке разобщен и может протекать в разных структурах ядра и цитоплазмы. Как только их концентрация достигнет определенного уровня, начинается сборка вириона. 5. Выход вирусных частиц из клетки. Существует 2 способа выхода вырусного потомства из клетки: путем взрыва и путем отпочковывания.
15. Особенности транскрипции вирусов с разным геномом. Примеры. 2)фаза: 1. Транскрипция – это переписывание информации с ДНК на РНК по законам генетического кода. Осуществляется с помощью фермента РНК – полимеразы. У ДНК-содер вирусов иРНК синтезируется на матрице одной из нитей ДНК. Формула переноса: ДНК – транскрип- РНК –трансляция- белок. Пример: вирус оспы и иридовирусы. 2)фаза: 1. Транскрипция – это переписывание информации с ДНК на РНК по законам генетического кода. Осуществляется с помощью фермента РНК – полимеразы. У +РНК вирусов функции инфРНК выполняет сам геном передача генетической информации происходит по простой формуле РНК ---- белок. Пример – коронавирус. У них нет необходимости в акте Транскрипции для синтеза вирусоспец белков. 2)фаза: 1. Транскрипция – это переписывание информации с ДНК на РНК по законам генетического кода. Осуществляется с помощью фермента РНК – полимеразы. У –РНК вирусов в клетке синтезируется комплементарная геному РНК, которая и является инфомац. Формула: РНК----инфРНК----белок. Пример: рабдовирус (бешенство) односпиральн, реовирус двуспиральный.
16. Трансляция вирусных белков: инициация, элонгация, терминация. Посттрансляционные модификации. Это процесс перевода генетической информации , содержащ в иРНК на специфическую последовательность аминокислот в синтезируемых вирусоспецифических белках. Трасляция – это процесс узнавания рибосомой иРНК и связывание ее с особыми участками. Рибосома узнает иРНК благодаря шапочке на 5” конце и скользит к 3”концу. Элонгация – процесс удлинения, наращивания полипептидной цепи, основанный на присоединении новых аминокислот с помощью пептидной связи. Терминация трансляции. 1 способ формирования вирусных белков (РНК + вирусы) – иРНК транслируется в гигантский полипептидный предшественник, который после синтеза нарезается на зрелые функционально активные белки. 2 способ формирования вирусных белков (ДНК вирусы и большинство РНК вирусов) – иРНК транслируется с образованием зрелых белков. Посттрансляционные модификации
17. Патогенез вирусной болезни. Способы проникновения, диссеминации и выведение вируса из организма хозяина.
Патогенез – механизм действия болезни. Способы передачи вирусов: аэрогенно (воздушно-капельно), алиментарно (с кормом), контактно (прямое соприкосновение), трансмиссивно (через кровососущ насекомых). Большая часть вирусов проникает в организм через барьеры слизистых оболочек дыхательных путей и ЖКТ. Заражение произойдет, если вирус окажется резистентным к защитным факторам – неспецифическим ингибиторам, протеолитическим ферментам, слизи, солям желчных кислот, лизоцимам, Е-киллерам. Вирус оспы способен проникать через неповрежденную кожу. Нахождение вируса на месте внедрения назыв локализацией вируса. Диссеминация – первичная циркуляция вируса по организму, которая осуществляется с током крови (виремия), лимфы или по нервным стволам. Вирус бешенства распространяются по нервам в восходящем (центробежном) направлении. Такую миграцию называют нейропробазией. Распространившись по организму, вирус локализуется в чувствительных к нему клетках определенного типа. Чувствительно к вирусу является та клетка, которая имеет на поверхности рецепторы, комплементарные данному вирусу и необходимые для адсорбции на ней вируса; в цитоплазме чувствительных к вирусу клетках есть ферменты для его депротеинизации. По тому , в каких клетках организма размножается и локализуется вирус, их условно разделяют на нейро-, дерма-, пневмо-, энтеро-, висцеро- и понтропные. Размножение вируса в клетках ведет к изменению их обмена веществ, морфологии и функции. В результате появляется цитопатическое действие вируса и вирусные тельца включения. Вслед за размножением и накоплением вируса в определенных органах происходит его распространение по организму (вторичная циркуляция). Вирус продвигается с током крови, лимфы и нервам. Большинство животных выделяют вирусы с экскретами, секретами, кровью, истечениями, мокротой. При большинстве вирусных инфекций в основе патогенеза лежит вирусемия (ящур, чума и др). При этих заболеваниях вирус выделяется всеми возможными путями. При хроническом течении вирусовыделение менее интенсивно, но может быть длительным. При вирусных заболеваниях локализация ограничивается одним путем: пневмонии – с каплями мокроты. Самое интенсивное выделение вируса во внешнюю среду наблюдается в острый период заболевания, однако при ряде заболеваний и в инкубационный период. Бессимптомные инфекции протекают при вакцинировании живыми вакцинами.
18. Этапы патогенеза вирусной болезни. Практическое значение патогенеза болезни при ее диагностике. Патогенез – механизм действия болезни. Способы передачи вирусов: аэрогенно (воздушно-капельно), алиментарно (с кормом), контактно (прямое соприкосновение), трансмиссивно (через кровососущ насекомых). Большая часть вирусов проникает в организм через барьеры слизистых оболочек дыхательных путей и ЖКТ. Заражение произойдет, если вирус окажется резистентным к защитным факторам – неспецифическим ингибиторам, протеолитическим ферментам, слизи, солям желчных кислот, лизоцимам, Е-киллерам. Вирус оспы способен проникать через неповрежденную кожу. Нахождение вируса на месте внедрения назыв локализацией вируса. Диссеминация – первичная циркуляция вируса по организму, которая осуществляется с током крови (виремия), лимфы или по нервным стволам. Вирус бешенства распространяются по нервам в восходящем (центробежном) направлении. Такую миграцию называют нейропробазией. Распространившись по организму, вирус локализуется в чувствительных к нему клетках определенного типа. Чувствительно к вирусу является та клетка, которая имеет на поверхности рецепторы, комплементарные данному вирусу и необходимые для адсорбции на ней вируса; в цитоплазме чувствительных к вирусу клетках есть ферменты для его депротеинизации. По тому , в каких клетках организма размножается и локализуется вирус, их условно разделяют на нейро-, дерма-, пневмо-, энтеро-, висцеро- и понтропные. Размножение вируса в клетках ведет к изменению их обмена веществ, морфологии и функции. В результате появляется цитопатическое действие вируса и вирусные тельца включения. По мере нарастания числа пораженных клеток развиваются патологические изменения в функционировании органа, что ведет к проявлению клинических симптомов. Вслед за размножением и накоплением вируса в определенных органах происходит его распространение по организму (вторичная циркуляция). Вирус продвигается с током крови, лимфы и нервам. В зависимости от локализации патологического процесса вирус выделяется из организма различными путями: с отделяемым слизистых оболочек носа, глаз, со слюной, с молоком, со спермой, с мочой, фекалиями, корочками кожных поражений. Это необходимо учитывать проводя мероприяния по борьбе с тем или иным заболеванием.
19. Нейропробазия и септиневрия (септиневрит), как форма диссеминации нейротропных вирусов на примере вируса бешенства. Диссеминация (первичная циркуляция вируса) вируса бешенства происходит по нервам в восходящем направлении (центростремительном). Такая миграция называется нейропробазией. Проникая центростремительно с периферии (место укуса) по нервным стволам в ЦНС, в организме он распространяется центробежно по периферическим нервами попадает в разные органы, включая слюнные железы. В организме вирус локализуется в ЦНС, а также слюнных железах и слюне. Движение вируса по нервам от ЦНС к периферии называют центробежным, а распространение вируса по всему организму таким образом – септиневритом. Вирус бешенства обнаруживается иногда и во внутренних органах. Выделяется со слюной, через легкие, с мочой и калом.
20. Взаимосвязь этапов патогенеза вирусной болезни и иммунного ответа. Патогенез – механизм действия болезни. Способы передачи вирусов: аэрогенно (воздушно-капельно), алиментарно (с кормом), контактно (прямое соприкосновение), трансмиссивно (через кровососущ насекомых). Большая часть вирусов проникает в организм через барьеры слизистых оболочек дыхательных путей и ЖКТ. Заражение произойдет, если вирус окажется резистентным к защитным факторам – неспецифическим ингибиторам, протеолитическим ферментам, слизи, солям желчных кислот, лизоцимам, Е-киллерам. Вирус оспы способен проникать через неповрежденную кожу. Нахождение вируса на месте внедрения назыв локализацией вируса. Диссеминация – первичная циркуляция вируса по организму, которая осуществляется с током крови (виремия), лимфы или по нервным стволам. Вирус бешенства распространяются по нервам в восходящем (центробежном) направлении. Такую миграцию называют нейропробазией. Распространившись по организму, вирус локализуется в чувствительных к нему клетках определенного типа. Чувствительно к вирусу является та клетка, которая имеет на поверхности рецепторы, комплементарные данному вирусу и необходимые для адсорбции на ней вируса; в цитоплазме чувствительных к вирусу клетках есть ферменты для его депротеинизации. По тому , в каких клетках организма размножается и локализуется вирус, их условно разделяют на нейро-, дерма-, пневмо-, энтеро-, висцеро- и понтропные. Размножение вируса в клетках ведет к изменению их обмена веществ, морфологии и функции. В результате появляется цитопатическое действие вируса и вирусные тельца включения. По мере нарастания числа пораженных клеток развиваются патологические изменения в функционировании органа, что ведет к проявлению клинических симптомов. Одновременно с течением болезни включается клеточный противовирусный иммунитет – активизируются и клонируются Т- и В- лимфоциты. Это приводит к разрушению зараженных вирусом клеток и появлению гуморального иммунитета – противовирусных антител. Вслед за размножением и накоплением вируса в определенных органах происходит его распространение по организму (вторичная циркуляция). Вирус продвигается с током крови, лимфы и нервам. В зависимости от локализации патологического процесса вирус выделяется из организма различными путями: с отделяемым слизистых оболочек носа, глаз, со слюной, с молоком, со спермой, с мочой, фекалиями, корочками кожных поражений. Это необходимо учитывать проводя мероприяния по борьбе с тем или иным заболеванием.
21. Факторы противовирусного иммунитета, их характеристика и роль. Иммунитет – это целостная система биологических механизмов самозащиты организма. Противовирусный иммунитет механизмы: 1) естественная видовая резистентность – это видовой иммунитет, невосприимчивость, обусловленная врожденными биологическими особенностями, присущими данному виду животных. Например: невосприимчивость животных к вирусу брюшного тифа человека. Обусловлена отсутствием условий для размножения вируса (не обеспечена адсорбция, проникновение и депротеинизация). 2) неспецифические факторы: кожа (неповрежденная кожа обл непроницаемым барьером, а потовые железы выделяют секрет с ингибирующим действием), слизистые оболочки (слизь способствует вымыванию и и удалению попавших агентов), функции выделительной системы (освобождение организма от микроорганизмов происходит через ЖКТ, мочевыдел систему и через легкие), температура (38-40 град оказывает инактивирующее действие на вирусы, активизирует макрофаги, влияние гормонов (малые доза кортизона повышают защитные функции организма, большие снижают), функции лимфатических узлов (вирус проникая в оганизм с током лимфы попадает в лимфоузлы, где явл объектом для действия макрофагов), фагоцитоз (уничтожение чужеродного объекта и запускание цепи иммунных реакций, приводящих к формированию иммунитета). 3) специфические факторы: центральные органы (костный мозг, тимус, фабрициева сумка у птиц, печень у млекопитающих) и периферические органы (селезенка, лимфатические узлы, лимфоидные ткани ЖКТ, кровь и лимфа). Т-лимфоциты обеспечивают клеточный тип иммунной реакции, В-лимфоциты – гуморальный тип иммунного ответа.
22. Факторы неспецифического иммунитета при вирусных болезнях. Интерферон: природа, синтез в организме, противовирусное действие. неспецифические факторы: кожа (неповрежденная кожа обл непроницаемым барьером, а потовые железы выделяют секрет с ингибирующим действием), слизистые оболочки (слизь способствует вымыванию и и удалению попавших агентов), функции выделительной системы (освобождение организма от микроорганизмов происходит через ЖКТ, мочевыдел систему и через легкие), температура (38-40 град оказывает инактивирующее действие на вирусы, активизирует макрофаги, влияние гормонов (малые доза кортизона повышают защитные функции организма, большие снижают), функции лимфатических узлов (вирус проникая в оганизм с током лимфы попадает в лимфоузлы, где явл объектом для действия макрофагов), фагоцитоз (уничтожение чужеродного объекта и запускание цепи иммунных реакций, приводящих к формированию иммунитета). Интерферон вырабатывается всеми клетками организма позвоночных животных, но наиболее активно его вырабатывают клетки белой крови (лейкоциты, Т-лимфоциты, макрофаги итд). Противовирусное действие интерферонов проявляется в их способности подавлять внутриклеточное размножение вирусов широкого спектра (ДНК и РНК). Интерферрон не действует на внеклеточный вирус в отличии от антител. Интерферрон подавляет репликацию вируса, т.е. он действует на вирус опосредованно, через чувствительную клетку в которой не нарушен синтез клеточной иРНК и клеточных белков. Свойства интерферрона. Не обладает видоспецифичностью. Экзогенный интерферрон проявляет свое максимальное действие, если заражение клетки ещё не произошло.Стимулирует фагоцитоз Угнетает рост клеток Угнетает АТ-образование. Способствует усилению активности Т-киллеров.
23. Факторы специфического иммунитета при вирусных болезнях. Роль клеточного иммунитета в защите организма от вируса. специфические факторы: центральные органы (костный мозг, тимус, фабрициева сумка у птиц, печень у млекопитающих) и периферические органы (селезенка, лимфатические узлы, лимфоидные ткани ЖКТ, кровь и лимфа). Т-лимфоциты обеспечивают клеточный тип иммунной реакции, В-лимфоциты – гуморальный тип иммунного ответа. Зрелые Т- лимфоциты приобретают способность распознавать чужеродные антигены. Они покидают костный мозг и тимус и заселяют селезенку, лимфатические узлы и другие скопления лимфатической ткани. Подавляющее большинство Т-лимф циркулирует в крови и лимфе. Первичный иммунитет – после первой встречи организма с антигеном, вторичный иммунитет – при повторном контакте с антигеном через 2-3 недели. Т-клетки играют важную роль в образовании антител в ответ на антигены. Способность непосредственно лизировать широкий набор клеток-мишеней, в особенности опухолевых, обладают ПК – они могут лизировать клетки независимо от продуктов МНС (интерферон и ИЛ-2 усиливают литическую активность ПК). ГЗТ – зависимая от Т-клеток иммунологическая реакция, проявляющаяся в виде воспаления в месте попадания в организм АГ, обычно в коже. Лимфоциты, способные переностить ГЗТ, являются Т-клетками и называются ТГЗТ-лимфоцитами (они могут активизироваться и реагировать на белковые АГ, аллоантигены, антигены опухолей, на АГ вирусов, бактерий, грибов, простейших. Большую роль в клеточном иммунитете играю макрофаги. Когда возбудители размножаются внутри фагоцитов внутриклеточное уничтожение происходит лишь после того как макрофаги получают стимул от спецсенсибилизированных Т-лимфоцитов. Т-лимфоциты активируют макрофаги за счет выделения лимфокинов
24. Вирусные белки, их роль в серодиагностике. Специфические антитела. Характеристика иммуноглобулинов. . Обнаружение вирусных антигенов: серологические реакции. В основе лежит спос-ть Ат взаимодействовать со специфическими гомологичными Аг в прбирке(in vitro)с образованием комплекса Аг-Ат. Обычно источником Ат служит сыв-ка крови жив-го=>эти р-ции наз-ся серологическими. РИФ(реакция иммунофлюорисценции. Метод обнаружения – флюоресцентное свечение под микроскопом). ,ИФА – иммуно-ферментный анализ. АТ-ферментным комплексом дает цветную реакцию , РНГА (реакция непрямой гемагглютинации Эритроциты нагружают АГ и при образовании комплекса АГ-АТ происходит агглютинация эритроцитов ) , РСК - реакция связывания комплемента. Задержка гемолиза – реакция положительная. Если произошел гемолиз, значит комплемент связан гем-системой – реакция отрицательная , РДП- реакция диффузной преципитиции. Метод обнаружения – образование контура преципитации. Антитела – специфические или иммунные белки, образующиеся в организме под воздействие различных антигенов в результате естественной инфекции или искусственной иммунизации. Различают 5 классов иммуноглобулинов: IgM – основной класс антител, выделяемых в крови на ранних стадиях первичного иммунного ответа, IgG – при первичном иммунном ответе появляются позднее, чем IgM, но являются основным классом антител при повторном ответе, IgA- основной класс антител в молоке, слюне, слезах, секретах дых путей, урогенитального и пищеварительного тракта. В сыворотке крови 13-14%. IgD в сывотрке мало, обуславливает развитие аутоиммунных процессов и IgE – в сыворотке мало, имеют значение в развитие аллергических реакций.
25. Противовирусные вакцины. Классификация. Способы получения. Их роль в борьбе с вирусными болезнями. Примеры. 1 поколение. Живые вакцины: Живые противовир.вакцины предст. собой лиофилизированные взвеси вакцин. штаммов вирусов, выращ. в разл. биосистемах (КЭ, КК, в лаб жив.)-получают ослабл-й штамм). Осн. Св-вом явл. стойкая утрата способ. вызывать в орг-ме привитого жив. типичное инф. Заболевание, также обл. способностью «приживляться» в орг. жив., т.е размножатся. Пребывание и размножение вакцинного штамма продолжается обычно 5-10дн. до неск. недель и не сопр. клин. проявлениями, хар. для данной б., приводят к форм. иммунитета против инф. забл. Преимущества: 1)высокая напряженность и длительность создаваемого ими иммунитета, приближ. к постинфекц(1 год и более). 2)возможность для большинства однократного введения в малых дозах.3)Введение не только п/к, но и перорально и интерназально. Недостатки:1)чуств к неблагоприятным факторам. 2)Строгие рамки хранения и транспортировки – темпер – 4-8С. 3)Недопустимо наруш. вакуума в апулах с вакцинами. 4)нужно долгое время для их получения5)м возвращаться в патогенное состояние 6)Строгие соблюдения правил асептики(чтоб не занести кондаменанты, др вирусы). Вакцина против чумы КРС, чумы плотоядных, болезни ньюкасла и др. Инактивированные вакцины – сложные по составу препараты. Производство их требует большого количества вируса, технология производства более сложная, чем производство живых вакцин. Основное требование, предъявляемое к убитым вакцинам, - полная и необратимая инактивация генома при максимальной сохранности АГ детерминанты и иммунная защита привитых животных. Для получения инактивированных вакцин в качестве инактивантов широко используются формалин, хлороформ, тиомерсал, гидроксиламин, этанол, бета-пропиолактон, этиленимин, УФ-, гамма-облучение, температура. Инактивированные вакцины применяются только парентерально. В состав их обязательно входят адъюванты – неспецифические стимуляторы иммуногенеза. Требуется большая дозировка и, как правило, повторное введение. Они создают менее напряженный, непродолжительный иммунитет, чем при употреблении живых вакцин. Пример: инакт вакцина против вирусной диареи КРС. 2 поколение . Преим-ва: -безопасны,тк не сод-т вируса, -свободны от вредных примесей, -стабильны и не требуют хранения в рефрижератарах. 3 метода получения: 1)получают большое кол-во вируса, очищают и выделяют иммуногенные субъединицы(«Сплит-вакцины»)-очень дорого. 2)Получение синтетич вакцин-синтез иммуногенных Аг: 4 белка вир ящура VP-1-4.Иммуногенный белок VP-1.К нему «пришивают» синтетич полимеры=> увелич-ся иммуногенность. Напр против ящура,гепатитаВ, инцефал-го клеща. 3)С использ-ем методов генной инженерии: сшивание нукл к-ты и бактериофага(микроба), и заставить его синтезировать белки(субъед или молекул-ую вакцину) 3 поколение . Осн ДНК вакцины-бактериальные плазмиды, сповобные эффективно размн-ся в кл-ах E.Coli.Плазмиду получ генноинженым методом. Затем рекомбинантную плазмиду вводят E.Coli и выращ-ют на питат средах. Очищают, выделяют рекомбинантные плазмиды и вакцинируют жив-х. Плазмида проникает в кл-ку и в ядро=>транскрипция=>иРНК=> на рибосомы=>иммуногенные белки,кот разрезаются на отдельные пептиды. Пептиды+ГКГС=>транспорт на пов-ть кл-ки. Подходят Т-киллеры=>их активация=> могут убивать кл-ки,инфец этим вирусом. Если захв-ся макрофагами=>то подходят Т-хелперы=>стимул-т Т-киллеры и В-лимфоциты Преим-ва: -действ 3-6 мес, -доза введ минимальная.
26. Первое поколение вакцин: виды, методы получения, достоинства и недостатки. Примеры. Живые вакцины: Живые противовир.вакцины предст. собой лиофилизированные взвеси вакцин. штаммов вирусов, выращ. в разл. биосистемах (КЭ, КК, в лаб жив.)-получают ослабл-й штамм). Осн. Св-вом явл. стойкая утрата способ. вызывать в орг-ме привитого жив. типичное инф. Заболевание, также обл. способностью «приживляться» в орг. жив., т.е размножатся. Пребывание и размножение вакцинного штамма продолжается обычно 5-10дн. до неск. недель и не сопр. клин. проявлениями, хар. для данной б., приводят к форм. иммунитета против инф. забл. Преимущества: 1)высокая напряженность и длительность создаваемого ими иммунитета, приближ. к постинфекц(1 год и более). 2)возможность для большинства однократного введения в малых дозах.3)Введение не только п/к, но и перорально и интерназально. Недостатки:1)чуств к неблагоприятным факторам. 2)Строгие рамки хранения и транспортировки – темпер – 4-8С. 3)Недопустимо наруш. вакуума в апулах с вакцинами. 4)нужно долгое время для их получения5)м возвращаться в патогенное состояние 6)Строгие соблюдения правил асептики(чтоб не занести кондаменанты, др вирусы). Вакцина против чумы КРС, чумы плотоядных, болезни ньюкасла и др. Инактивированные вакцины – сложные по составу препараты. Производство их требует большого количества вируса, технология производства более сложная, чем производство живых вакцин. Основное требование, предъявляемое к убитым вакцинам, - полная и необратимая инактивация генома при максимальной сохранности АГ детерминанты и иммунная защита привитых животных. Для получения инактивированных вакцин в качестве инактивантов широко используются формалин, хлороформ, тиомерсал, гидроксиламин, этанол, бета-пропиолактон, этиленимин, УФ-, гамма-облучение, температура. Инактивированные вакцины применяются только парентерально. В состав их обязательно входят адъюванты – неспецифические стимуляторы иммуногенеза. Требуется большая дозировка и, как правило, повторное введение. Они создают менее напряженный, непродолжительный иммунитет, чем при употреблении живых вакцин. Пример: инакт вакцина против вирусной диареи КРС.
27. Второе поколение вакцин: виды, методы получения, достоинства и недостатки. Преим-ва: -безопасны,тк не сод-т вируса, -свободны от вредных примесей, -стабильны и не требуют хранения в рефрижератарах. 3 метода получения: 1)получают большое кол-во вируса, очищают и выделяют иммуногенные субъединицы(«Сплит-вакцины»)-очень дорого. 2)Получение синтетич вакцин-синтез иммуногенных Аг: 4 белка вир ящура VP-1-4.Иммуногенный белок VP-1.К нему «пришивают» синтетич полимеры=> увелич-ся иммуногенность. Напр против ящура,гепатитаВ, инцефал-го клеща. 3)С использ-ем методов генной инженерии: сшивание нукл к-ты и бактериофага(микроба), и заставить его синтезировать белки(субъед или молекул-ую вакцину)
28. Третье поколение вакцин: виды, методы получения, достоинства и недостатки. Осн ДНК вакцины-бактериальные плазмиды, сповобные эффективно размн-ся в кл-ах E.Coli.Плазмиду получ генноинженым методом. Затем рекомбинантную плазмиду вводят E.Coli и выращ-ют на питат средах. Очищают, выделяют рекомбинантные плазмиды и вакцинируют жив-х. Плазмида проникает в кл-ку и в ядро=>транскрипция=>иРНК=> на рибосомы=>иммуногенные белки,кот разрезаются на отдельные пептиды. Пептиды+ГКГС=>транспорт на пов-ть кл-ки. Подходят Т-киллеры=>их активация=> могут убивать кл-ки,инфец этим вирусом. Если захв-ся макрофагами=>то подходят Т-хелперы=>стимул-т Т-киллеры и В-лимфоциты Преим-ва: -действ 3-6 мес, -доза введ минимальная.
29. Основные биотехнологические подходы к изготовлению вакцин первого поколения. Инактиванты, адьюванты, стабилезаторы. Живые вакцины: Живые противовир.вакцины предст. собой лиофилизированные взвеси вакцин. штаммов вирусов, выращ. в разл. биосистемах (КЭ, КК, в лаб жив.)-получают ослабл-й штамм). Осн. Св-вом явл. стойкая утрата способ. вызывать в орг-ме привитого жив. типичное инф. Заболевание, также обл. способностью «приживляться» в орг. жив., т.е размножатся. Пребывание и размножение вакцинного штамма продолжается обычно 5-10дн. до неск. недель и не сопр. клин. проявлениями, хар. для данной б., приводят к форм. иммунитета против инф. забл. Преимущества: 1)высокая напряженность и длительность создаваемого ими иммунитета, приближ. к постинфекц(1 год и более). 2)возможность для большинства однократного введения в малых дозах.3)Введение не только п/к, но и перорально и интерназально. Недостатки:1)чуств к неблагоприятным факторам. 2)Строгие рамки хранения и транспортировки – темпер – 4-8С. 3)Недопустимо наруш. вакуума в апулах с вакцинами. 4)нужно долгое время для их получения5)м возвращаться в патогенное состояние 6)Строгие соблюдения правил асептики(чтоб не занести кондаменанты, др вирусы). Вакцина против чумы КРС, чумы плотоядных, болезни ньюкасла и др. Инактивированные вакцины – сложные по составу препараты. Производство их требует большого количества вируса, технология производства более сложная, чем производство живых вакцин. Основное требование, предъявляемое к убитым вакцинам, - полная и необратимая инактивация генома при максимальной сохранности АГ детерминанты и иммунная защита привитых животных. Для получения инактивированных вакцин в качестве инактивантов широко используются формалин, хлороформ, тиомерсал, гидроксиламин, этанол, бета-пропиолактон, этиленимин, УФ-, гамма-облучение, температура. Инактивированные вакцины применяются только парентерально. В состав их обязательно входят адъюванты – неспецифические стимуляторы иммуногенеза. Требуется большая дозировка и, как правило, повторное введение. Они создают менее напряженный, непродолжительный иммунитет, чем при употреблении живых вакцин. Пример: инакт вакцина против вирусной диареи КРС.
30. Устройство вирусологической лаборатории.
31. Правила работы в вирусологической лаборатории. Основные требования при работе с вируссодержащим материалом. 1. Все работы с вирусами проводят в специально отведенных замкнутых пространствах – боксах. 2. Работают в спецодежде. 3. Работы проводят вблизи пламени горелки. 4. Используют стерильный инструментарий, лабораторную посуду, реагенты. 5. Запрещено пить, курить, принимать пищу. 6. В случае аварии и попадании вируссодержащего материала на стол, руки и халат, проводят дезинфекционные мероприятия. 7 .После окончания работы все твердые отходы помещают в контейнер для автоклавирования, жидкие отходы в дезраствор, инструментарий в стерелизатор. Стол и руки обрабатывают дезраствором. Правила работы с вируссодержащим материалом: 1. Недопущение распространения вирусной инфекции за пределы лаборатории. 2 . Недопущение контаминации (загрязнения) вируссодержащей суспензии посторонней микрофлорой. 3. Соблюдение мер личной безопасности. 1)Наглухо застегнутый халат. 2)В лаб-ии не принимать пищу и воду. 3)Чистота и порядок на раб. месте, не должно при работе быть лишних предметов. 4)Работать сидя, не отвлекаясь. 5)Переливать жидкий вирус только над дизенфецир. жидкостью. 6)не брать пипеток в рот, пользоваться грушей. 7)Использ. предметы собирать в стерилизатор. 8)Запр. выносить ПМ за пределы ауд. 9)При разлитии исл. материала сообщить преподавателю для проведения дезинфекции. 10)После работы привести в порядок раб. место.
32. Хранение и уничтожение вирусов: цели, методы. Направления борьбы с вирусными болезнями. Хранение и консервация. Цель: 1. Научно-исследовательская работа. 2. Лабораторная диагностика. 3 . Изготовление вакцин. Методы: физические – 0+4 – неделя, -20 – 6 мес-1 год, -70 –6-10 лет, -196 (жидкий азот) – 12-15 лет. Леофильная сушка (высущивание под вакуумом из замороженного состояния) 0+4 до 12 лет. Химический: 50% р-р глицерина (только пат материал, кроме бешенства!). Уничтожение стерилизация. Цель: борьба с вирусными болезнями. Методы: физические 100гр. – 30 мин спецодежда, инструменты, фламбирование – прожигание пламенем, сухой жар – пластиковая посуда, автоклавирование (выс темп, выс давление) – автоклавируют все, УФ лучи –помещения, боксы. Химические: кислоты (соляная, борная), едкие щелочи (КОН, NaOH), окислители (перекись водорода, марганц), хлоросодержащие (хлорамин), современные средства (Аламинол, Бианол). Направления борьбы с вирусными болезнями. Профилактика: специфическая: активная (вакцинация), пассивная (серопрофилактика), неспецифическая: ветсанмероприятия (карантин, дезбарьер), зоотехнические (уход, кормление, содержание). Диагностика: 1. Предварительный диагноз. 2. Эпизоотологические данные. 3. Клинические признаки. 4. Патанатомические изменения. 5. Отбор пат материала. 6.лабораторные исследования. 7. Окончательный диагноз.
33. Правила отбора, транспортировки и хранения патологического материала. Подготовка первичного патологического материала для лабораторных исследований. При отборе патматериала учитывают патогенез и тропизм вируса. 1. Патматериал отбирают с учетом мест локализации вирусаи путей его выделения из организма. 2. Пм берут во время яркого проявления клинических признаков. 3. Соблюдают правила антисептики. 4. Доставляют в лабораторию не позднее 2 часов с момента взятия патм в термосе со льдом или термоконтейнере. Вид патматериала. От больных животных:1. Смывы со слизистых оболочек ватно-марлевыми тампонами. 2. Кровь, если вирус репродуцируется в клетках крови (сыворотку).3. Фекалии (кишечные инфекции), моча (урогенитальные инфекции), сперма. 4. Кусочки пораженной кожи (ящур, оспа). От павших животных: 1. Кусочки 10-20 гр органа на границе здоровой и пораженной ткани паренхиматозного органа (печень, почки, селезенка). 2. Региональные лимфоузлы. 3. Кусочки пораженных органов. Подготовка патматериала. Смывы со слизистых оболочек: Ватно-марлевый тампон отполаскивают в стерильном р-ре, отжимают и удаляют. Смыв центрифугируют 1500-3000 об в мин 10-15 мин. Надосадочную жидкость переносят в стерильную пробирку, добавляют антибиотик (стрептомиц или пеницил 2 ч при t 24 гр). Проводят бактериологический контроль (посев на питат среду). Если микрофлора отсутствует, то можно использовать для вирусологического исследования. Кусочки органов: помещают в фарфоровую ступку и растирают со стерильным песком до гомологичной массы. Добавляют стерильный физраствор (1:10). Суспензию центрифугируют при 1500-3000об в мин 15-20 мин. Надосадочную жидкость переносят в стерильную пробирку, добавляют антибиотик (стрептомиц или пеницил 2 ч при t 24 гр). Проводят бактериологический контроль (посев на питат среду). Если микрофлора отсутствует, то можно использовать для вирусологического исследования.
34. Методы экспресс диагностики вирусных болезней. Индикация вируса в патологическом материале. 1.Обнаружение – световая микроскопия крупных вирусов (Poxviridae оспа), электронная микроскопия. 2.Обнаружение телец-включений. (тельца Бабе-Шенегри при бешенстве)Тельца включения – это внутриклеточные включения, образующиеся в клетке при рапродукции в них некоторых вирусов. Тельца включения чаще всего находятся в цитоплазме(чаще это РНК вирусы, кроме оспы)Оспа кур- т. Боллингера, чума плотоядных –т. Ленца, вирус Бешенства –т.Бабеша-Негри(при обнаруж их в мазках отпечатках павших животных диагноз бешенство считается доказанным).3. Обнаружение вирусных антигенов: серологические реакции. В основе лежит спос-ть Ат взаимодействовать со специфическими гомологичными Аг в прбирке(in vitro)с образованием комплекса Аг-Ат. Обычно источником Ат служит сыв-ка крови жив-го=>эти р-ции наз-ся серологическими. РИФ(реакция иммунофлюорисценции. Метод обнаружения – флюоресцентное свечение под микроскопом). ,ИФА – иммуно-ферментный анализ. АТ-ферментным комплексом дает цветную реакцию , РНГА (реакция непрямой гемагглютинации Эритроциты нагружают АГ и при образовании комплекса АГ-АТ происходит агглютинация эритроцитов ) , РСК - реакция связывания комплемента. Задержка гемолиза – реакция положительная. Если произошел гемолиз, значит комплемент связан гем-системой – реакция отрицательная , РДП- реакция диффузной преципитиции. Метод обнаружения – образование контура преципитации.4. Обнаружение вирусных НК (ДНК-зонды и ПЦР – полимеразно-цепная реакция) Не серолог. р-ция,напр-на на обнар-ие вир-й нукл-й к-ты(генома). Принцип:у выд-й из пат мат вир-й нукл к-ты многократно воспроизводят(копируют) опред-й наиболее консервативный уч-к «in vitro», а затем его идентифицируют . 5.Обнаружение активной формы вируса путем биопробы (лабораторные животные, куриные эмбрионы, культура клеток) экспериментальное заражение материалом от больных жив. лаб. или естественно восприимчивых жив.6. Обнаружение гемаглютининов у гемаглютинирующих вирусов. Геагглютинирующ вирусы способны агглютинировать эритроциты животных определенных видов в условиях соответствующих температур и рН среды. Иногда используют реакцию гемагглютинации (РГА) для обнаружения гемагглютинирующего вируса в материале.
35. Культивирование вирусов. Живые системы: классификация, характеристика, требования при работе, достоинства и недостатки. Лаб жив :белые мыши и крысы ,кролики, хомячки, мор свинки. Требования:1)получ из питомников, благопр по инф заб-м;2) должны быть того вида и возраста, кот наиболее чувствителен к данному вир; 3)их сод-т в спец помещ-вивариях;4)при зараж жив-х метят 5)животные должны быть линейными (полученными от одной родительской пары). Заражение лабораторных животных. 1.подкожно – спина.2.Внутрикожно – пятка. 3.Внутримышечно –бедро. 4.Внутривенно – в хвост (предварительно растерев горячей водой и пережав).5.Интранозально – капля в нос (предварительно дают слабый эфирный наркоз, что бы предупредить чихание).6.Интероцеребрально – череп аккуратно просверливается иголочкой, не нажимать, капля уходит сама. Все поверхности предварительно смазывают йодированным спиртом. КЭ: нельзя пол-ть специф картину забол-я. Получ-т из благопол-х птицеф-к от здорового пог-я. Скорлупа д б чистая,ср размеров, однозарод, бел цвета. Куриный эмбрион развивается 21 день. Заражение вирусом производится с 5-го по 12-й день. Заражение в аллантоисную полость (болезнь ньюкасла). Все операции проводят асептично с горящей газовой горелкой. Место введения обрабатывают 2% йодированным спиртом, вводят 0,1-0,2 мл жидкости. Отверстие закрывают каплей расплавленного парафина. На скорлупе пишут: название вируса, дату, фамилию. Заражение на ХАО (вирус оспы голубей). Делается отверстие в области воздушной камеры. Делается окошко «А». Отсасывается воздух из воздушной камеры. В окошко «А» капается вирус содержащая жидкость. Отверстие заклеивается лейкопластырем. На скорлупе пишется название вируса, дата, фамилия. КК-кл-ки многокл орг-в,жив-ие и размн-ся вне орг-ма. 3 вида: 1)Первично трипсинизированные культ-ы- полученные непоср-но из орг-ма.(почка, печень,легкие)-монослой(растет в 1слой), те Кл-ки др на др не наползают. 2)Диплоидные к-ры-получ из первичных. М пройти 50+-10 пассажей;диплоидный набор хромосом. 3)Перевиваемые к-ры-были пол-ны из первичных.Их можно перевив из флакона во флакон;неогран-ое кол-во пассажей.Имеет гетероплоидный набор хромосом.Некот м обладать онкогенной активностью-опухоли. 5) перевиваемые КК в суспензии. КК можно получить практически из любого органа или ткани человека или животного. Лучше это удается сделать из эмбриональных органов, т.к. клетки эмбрионов обладают более высокой потенцией роста. Чаще всего для получения их используют почки, легкие, кожу, тимус, тестикулы. Для получения первичных клеток от здорового животного не позднее 2-3 часов после убоя берут соответствующие органы или ткани, измельчают, обрабатывают трипсином, панкреатином, коллагеназой. Ферменты разрушают межклеточные вещества, полученные при этом отдельные клетки суспендируют в питательной среде и культивируют на внутренней поверхности пробирок или матрасов в термостате при 37С. Клетки прикрепляются к стеклу и начинают делится. На стекле формируется слой толщиной в одну клетку, обычно через 3-5 дней. Питательную среду меняют по мере загрязнения ее продуктами жизнедеятельности клеток. Монослой сохранят жизнеспособность в течение 7-21 дня. При культивировании вирусов в КК удается получать препараты с высоким титром вируса, что важно при получении АГ и вакцин.
36. Тропизм вирусов. Выбор способа заражения живой системы. Методы заражения куриных эмбрионов. Тропизм- способность вирусов репродуцироваться (размножаться) только в определенных чувствительных клетках данного организма. Эпителиотропные (внутрикожный, подкожный) – вир ящура (пор кл эпителия). Дерматропные ( накожный скарификация) – Оспа (пор кл кожи), пневмортропный (интраназальный) – грипп (пор кл респират тракта), нейротропные( интрацеребрально) – бешенство (пор кл ЦНС), пантропные ( в/венный, в/брюшинный, в/мышечный) – чума (пор все клетки). Куриный эмбрион развивается 21 день. Заражение вирусом производится с 5-го по 12-й день. Заражение в аллантоисную полость (болезнь ньюкасла). Все операции проводят асептично с горящей газовой горелкой. Место введения обрабатывают 2% йодированным спиртом, вводят 0,1-0,2 мл жидкости. Отверстие закрывают каплей расплавленного парафина. На скорлупе пишут: название вируса, дату, фамилию. Заражение на ХАО (вирус оспы голубей). Делается отверстие в области воздушной камеры. Делается окошко «А». Отсасывается воздух из воздушной камеры. В окошко «А» капается вирус содержащая жидкость. Отверстие заклеивается лейкопластырем. На скорлупе пишется название вируса, дата, фамилия. После заражения инкубируют при 37 гр – 5 дней
.
37. Культура клеток: классификация, получение первичной КК, сравнительная характеристика различных видов КК. Культура клеток (КК) – это клетки многоклеточного организма, живущие и размножающиеся в искусственных условиях вне организма. Методика трипсинизации тканей и получения однослойных КК. Классификация: 1 по продолжительности жизнеспособности: а) переживающая (клетки не делятся, но сохраняют жизнеспособность длительное время), б) растущая (клетки делятся, но сохраняют жизнеспособность определенное время). 2. По способу культивирования: а) суспензионная (клетки прикреплены на носитель и находятся в виде взвеси), б) однослойная: 1 первичнотрипсинезированная (клетки, полученные непосредственно из органов или тканей организма, растущие in vitro в один слой. КК можно получить практически из любого органа или ткани человека или животного. Лучше это удается сделать из эмбриональных органов, т.к. клетки эмбрионов обладают более высокой потенцией роста. Чаще всего для получения их используют почки, легкие, кожу, тимус, тестикулы), 2 диплоидная - морфологически однородная популяция клеток, стабилизированная в процессе культивирования in vitro, имеющая ограниченный срок жизни, характеризующаяся 3 фазами роста, сохраняющая в процессе пассирования кариотип свойственный исходной ткани, свободная от контаминантов и не обладающая туморогенной активностью при трансплантации хомячкам. Их тоже получают из первичных клеток. В отличие от них имеют ограниченные возможности пассирования. Максимальное число пассажей 50 -\+ 10, затем количество делящихся клеток резко уменьшается и они гибнут. Преимущества перед перевиваемыми КК – 10-12 дней могут быть в жизнеспособном состоянии без смены питательной среды; при смене среды один раз в неделю остаются жизнеспособны в течение 4 недель; особенно пригодны для длительного культивирования вирусов, у них сохранена чувствительность исходной ткани к вирусам. 3 перевиваемая КК – клетки, способные к размножению вне организма неопределенно длительное время. В лаборатория их поддерживают путем пересевов из одного сосуда в другой (при условии замены питательной среды). Получение первичной КК: Кусочки ткани здорового животного расщепляют протеолитическими ферментами на отдельные клетки.1. В лабораторных условиях особой стерильности кусочки ткани измельчают ножницами и отмывают от крови и слизи солевыми растворами. 2. Измельченные кусочки переносят в колбу с магнитом. Заливают 0.25% теплым р-ром трипсина и помещают на магнитную мешалку ( белки межклеточного вещества более чувствительны к трипсину, чем белки клеточной оболочки и расщепляются раньше, жидкость мутнеет). 3. Полученные клетки помещают во флакон и ставят на -4 грС. 4. Оставшийся кусочек снова заливают трипсином и тд , образовавшиеся клетки сливают в отдельный флакон. 5. Полученные клетки центрифугируют 10-15 мин при 1000 об. Клетки оседают на дно, трипсин удаляют. 6. Количество клеток подсчитывают в камере Горяева, доводят до посадочной концентрации 10 в 6 степени, помещают в культурный флакон (матрас), заливают ростовой питательной средой и помещают в термостат 37гр.
38. Жизненный цикл культуры клеток. Растворы и питательные среды (примеры). Поддержание КК в лабораторных условиях. 1. Адаптация (клетки оседают на дно и прикрепляются к стеклу) – 3-4 часа. 2. Логарифмический рост (образование монослоя) – 3-4 дня. 3. Стационарная фаза (клетки не делятся, но сохраняют жизнеспособность) – 7-8 дней. Проводится пассаж – перенос клеток в новую питательную среду с целью получения новой популяции клеток. 4. Старение и гибель клеток. Контактная ингибиция- свойство делящихся клеток прекращать деление при соприкосновении стенок соседних клеток. Растворы: 1) солевые – используют как основу для приготовления питательной среды или для манипуляций на КК (р-р Хенкса, р-р Эрла). 2) диспергирующие – р-ры ферментов используют для трипсинизации и снятия клеток со стекла (0.25 % трипсина, 0,002% р-р версена. Питательные среды: 1) ростовые – позволяют клеткам прикрепиться к стеклу и начать делиться (среда 199, среда Игла + 10% сыворотка крови КРС), 2) поддерживающие ((среда 199, среда Игла).
39. Живые системы в вирусологии: виды, цели, использование, преимущества, недостатки. Лаб жив :белые мыши и крысы ,кролики, хомячки, мор свинки. Требования:1)получ из питомников, благопр по инф заб-м;2) должны быть того вида и возраста, кот наиболее чувствителен к данному вир; 3)их сод-т в спец помещ-вивариях;4)при зараж жив-х метят 5)жив должны быть линейными (полученными от одной родительской пары). Заражение лабораторных животных. 1.п/к– спина.2.В/к – пятка. 3.В/м –бедро. 4.В/в– в хвост (предварительно растерев горячей водой и пережав).5.Интраноз – капля в нос (предварительно дают слабый эфирный наркоз, что бы предупредить чихание).6.Интероцеребр– череп аккуратно просверливается иголочкой, не нажимать, капля уходит сама. Все поверхности предварительно смазывают йодированным спиртом. КЭ: нельзя пол-ть специф картину забол-я. Получ-т из благопол-х птицеф-к от здорового пог-я. Скорлупа д б чистая,ср размеров, однозарод, бел цвета. Куриный эмбрион развивается 21 день. Заражение вирусом производится с 5-го по 12-й день. Заражение в аллантоисную полость (болезнь ньюкасла). Все операции проводят асептично с горящей газовой горелкой. Место введения обрабатывают 2% йодированным спиртом, вводят 0,1-0,2 мл жидкости. Отверстие закрывают каплей расплавленного парафина. На скорлупе пишут: название вируса, дату, фамилию. Заражение на ХАО (вирус оспы голубей). Делается отверстие в области воздушной камеры. Делается окошко «А». Отсасывается воздух из воздушной камеры. В окошко «А» капается вирус содержащая жидкость. Отверстие заклеивается лейкопластырем. На скорлупе пиш назв вируса, дата, фам. КК-кл-ки многокл орг-в,жив-ие и размн-ся вне орг-ма. 3 вида: 1)Первично трипсинизированные культ-ы- полученные непоср-но из орг-ма.(почка, печень,легкие)-монослой(растет в 1слой), те Кл-ки др на др не наползают. 2)Диплоидные к-ры-получ из первичных. М пройти 50+-10 пассажей;диплоидный набор хромосом. 3)Перевиваемые к-ры-были пол-ны из первичных.Их можно перевив из флакона во флакон;неогран-ое кол-во пассажей.Имеет гетероплоидный набор хромосом.Некот м обладать онкогенной активностью-опухоли. 5) перевиваемые КК в суспензии. КК можно получить практически из любого органа или ткани человека или животного. Лучше это удается сделать из эмбриональных органов, т.к. клетки эмбрионов обладают более высокой потенцией роста. Чаще всего для получения их используют почки, легкие, кожу, тимус, тестикулы. Для получения первичных клеток от здорового животного не позднее 2-3 часов после убоя берут соответствующие органы или ткани, измельчают, обрабатывают трипсином, панкреатином, коллагеназой. Ферменты разрушают межклеточные вещества, полученные при этом отдельные клетки суспендируют в питательной среде и культивируют на внутренней поверхности пробирок или матрасов в термостате при 37С. Клетки прикрепляются к стеклу и начинают делится. На стекле формируется слой толщиной в одну клетку, обычно через 3-5 дней. Питат среду меняют по мере загрязнения ее продуктами жизнед клеток. Монослой сохранят жизнеспособность в течение 7-21 дня. При культив вирусов в КК удается получать препараты с высоким титром вируса, что важно при получении АГ и вакцин.
40. Индикация вирусов в КК, заражение, видимые изменения и методы контроля. Для заражения отбирают пробирки (матрасы) со сплошным клеточным монослоем, просматривая их под малым увеличением микроскопа. Ростовую питательную среду сливают, клетки 1-2 раза промывают раствором Хенкса, чтобы удалить сывороточные АТ и ингибиторы. В каждую пробирку вносят по 0,1-0,2 мл вируссодержащего материала и покачиванием распределяют его равномерно по слою клеток. Оставляют на 1-2 часа при 22-37С для адсорбции вируса на поверхности клеток. Вируссодержащий материал удаляют из емкостей и наливают поддерживающую среду. Для индикации существуют следующие основные методы индикации вируса в КК: по цитопатическому эффекту или цитопатическому действию – это любые изменения монослоя или морфологии клеток под действием вируса (сетовая микроскопия); по положительной реакции гемадсорбции (световая микроскопия) ; по образованию бляшек; по обнаружению внутриклеточных включений; по выявлению вирусов в реакции иммунофлуоресценции; по обнаружению интерференции вирусов; по подавлению метаболизма клеток (цветная проба); электронной микроскопией. Выявление специфической дегенерации клеток (по ЦПД) – простым признаком являются дегенеративных изменения в клетках (проявление ЦПД). Наступившие видимы изменения в клетке называются цитопатические изменения. Эти изменения в инфицированных клетках зависят от дозы и биологических свойств исследуемого вируса время проявление ЦПД и его особенности иногда позволяет провести идентификацию выделенных вирусов. При инфицирования КК средними дозами вируса характер этих изменений специфичен и может быть классифицирован на группы: очаговое мелкозернистое перерождение, мелкозернистое перерождение по всему монослою, очаговое гроздевидное скопление округлых клеток, равномерная зернистость, объединение клеток в гигантские многоядерные симпласты и синцитии. Степень дегенерации оценивают по 4 бальной системе. Иногда наблюдают отсутствие ЦПД, но это считают за отсутствие вируса нельзя и потому проводят 2-3 слепых пассажа и на 2-3 пассаже вирусы могут проявлять желаемые свойства.
41. Индикация вирусов в куриных эмбрионах: заражение, признаки репродукции вируса. Основной метод индикации гемагглютинирующих вирусов. Заражение. Куриный эмбрион развивается 21 день. Заражение вирусом производится с 5-го по 12-й день. Заражение в аллантоисную полость (болезнь ньюкасла). Все операции проводят асептично с горящей газовой горелкой. Место введения обрабатывают 2% йодированным спиртом, вводят 0,1-0,2 мл жидкости. Отверстие закрывают каплей расплавленного парафина. На скорлупе пишут: название вируса, дату, фамилию. Заражение на ХАО (вирус оспы голубей). Делается отверстие в области воздушной камеры. Делается окошко «А». Отсасывается воздух из воздушной камеры. В окошко «А» капается вирус содержащая жидкость. Отверстие заклеивается лейкопластырем. На скорлупе пишется название вируса, дата, фамилия. После заражения инкубируют при 37 гр – 5 дней. Признаки репродукции вируса: Гибель куриного эмбриона в характерные для данного вируса сроки. Гибель эмбрионов в первые сутки не специфична. Эмбрионы погибшие в более поздние сроки переносятся в холодильник (+ 4С). Все эмбрионы извлекают из термостата в момент максимального накопления вируса. Срок для каждого вируса – справочные данные. Вскрытие эмбриона и анализ патологоанатомических изменений. Отечная ХАО и белые узелки некроза (оспины). Мутность или изменение цвета аллантоисной и амниотической жидкостей. Красноватый цвет жидкостей – результат гемолиза. Изменения зародыша: карликовость, кровоизлияния, мумификация. Органы зародыша – некроз, кровоизлияния. Наличие гемаглютинации при проведении капельной реакции ГА. (аллантоисная жидкость + 5% р-р эритроцитов кур). Основной метод индикации гемагглютинирующих вирусов. Гемагглютинация –это склеивание эритроцитов под действием вируса, который в своем составе имеет белок гемагглютенин, который взаимодействует со специфическими рецепторами эритроцитов. Каждый вирус агглютинирует эритроциты определенного вида животного: в. Бешенства- эрит. Гуся, в. Б-ни ньюкасла – эрит. Кур, парагрипп 3 – эрит. Морской свинки. По цели проведения РГА бывают: 1.)капельная – качественная. Учет реакции: зонтик – 100%эритроцитов агглютинировали (***), неполный зонтик 50% эрит аггл (**), маленький зонтик (*), пуговка (-) эритроц не агглютиноровали и осели на дно лунки. 1ГАЕ- наибольшее разведение вируса, дающее неполный зонтик. 2) количественная – определение гемагглютинирующего титра вируса. Титр вируса – это во сколько надо развести вирус, чтобы получить 1 ГАЕ. Стадии РГА:1)адсорбция вируса на поверхность эритроцитов. 2)склеивание эритроцитов за счет образования между ними мостиков из вирусов. 3)элюция (сползание) вируса с поверхности эритроцитов за счет разрушения рецепторов эритроцитов.
42. Индикация активного вируса: методы, живые системы, признаки положительной биопробы. Примеры. Обнаружение активной формы вируса путем биопробы (лабораторные животные, куриные эмбрионы, культура клеток). Заражение. Куриный эмбрион Признаки репродукции вируса: Гибель куриного эмбриона в характерные для данного вируса сроки. Гибель эмбрионов в первые сутки не специфична. Эмбрионы погибшие в более поздние сроки переносятся в холодильник (+ 4С). Все эмбрионы извлекают из термостата в момент максимального накопления вируса. Срок для каждого вируса – справочные данные. Вскрытие эмбриона и анализ патологоанатомических изменений. Отечная ХАО и белые узелки некроза (оспины). Мутность или изменение цвета аллантоисной и амниотической жидкостей. Красноватый цвет жидкостей – результат гемолиза. Изменения зародыша: карликовость, кровоизлияния, мумификация. Органы зародыша – некроз, кровоизлияния. Наличие гемаглютинации при проведении капельной реакции ГА. (аллантоисная жидкость + 5% р-р эритроцитов кур). Культура клеток. Для индикации существуют следующие основные методы индикации вируса в КК: по цитопатическому эффекту или цитопатическому действию – это любые изменения монослоя или морфологии клеток под действием вируса (сетовая микроскопия); по положительной реакции гемадсорбции (световая микроскопия) ; по образованию бляшек; по обнаружению внутриклеточных включений; по выявлению вирусов в реакции иммунофлуоресценции; по обнаружению интерференции вирусов; по подавлению метаболизма клеток (цветная проба); электронной микроскопией. Выявление специфической дегенерации клеток (по ЦПД) – простым признаком являются дегенеративных изменения в клетках (проявление ЦПД). Наступившие видимы изменения в клетке называются цитопатические изменения. Эти изменения в инфицированных клетках зависят от дозы и биологических свойств исследуемого вируса время проявление ЦПД и его особенности иногда позволяет провести идентификацию выделенных вирусов. При инфицирования КК средними дозами вируса характер этих изменений специфичен и может быть классифицирован на группы: очаговое мелкозернистое перерождение, мелкозернистое перерождение по всему монослою, очаговое гроздевидное скопление округлых клеток, равномерная зернистость, объединение клеток в гигантские многоядерные симпласты и синцитии. Степень дегенерации оценивают по 4 бальной системе. Иногда наблюдают отсутствие ЦПД, но это считают за отсутствие вируса нельзя и потому проводят 2-3 слепых пассажа и на 2-3 пассаже вирусы могут проявлять желаемые свойства. Лабораторные животные. Заражение лабораторных животных. 1.подкожно – спина.2.Внутрикожно – пятка. 3.Внутримышечно –бедро. 4.Внутривенно – в хвост (предварительно растерев горячей водой и пережав).5.Интранозально – капля в нос (предварительно дают слабый эфирный наркоз, что бы предупредить чихание).6.Интероцеребрально – череп аккуратно просверливается иголочкой, не нажимать, капля уходит сама. Все поверхности предварительно смазывают йодированным спиртом. Признаки индикации: 1) Клинические признаки (повышение t, изменение поведения, выделения) неспецифические. 2) гибель в определенные сроки. 3) патологоанатомическое вскрытие. От положительной биопробы отбирают вторичный патматериал дла дальнейших вирусологических исследований.
43. Экспресс-методы в вирусологии. Методы индикации вирионов вирусов. Достоинства и недостатки. Индикация вируса в патологическом материале. 1.Обнаружение – световая микроскопия крупных вирусов (Poxviridae оспа), электронная микроскопия. 2.Обнаружение телец-включений. (тельца Бабе-Шенегри при бешенстве)Тельца включения – это внутриклеточные включения, образующиеся в клетке при рапродукции в них некоторых вирусов. Тельца включения чаще всего находятся в цитоплазме(чаще это РНК вирусы, кроме оспы)Оспа кур- т. Боллингера, чума плотоядных –т. Ленца, вирус Бешенства –т.Бабеша-Негри(при обнаруж их в мазках отпечатках павших животных диагноз бешенство считается доказанным).3. Обнаружение вирусных антигенов: серологические реакции. В основе лежит спос-ть Ат взаимодействовать со специфическими гомологичными Аг в прбирке(in vitro)с образованием комплекса Аг-Ат. Обычно источником Ат служит сыв-ка крови жив-го=>эти р-ции наз-ся серологическими. РИФ(реакция иммунофлюорисценции. Метод обнаружения – флюоресцентное свечение под микроскопом). ,ИФА – иммуно-ферментный анализ. АТ-ферментным комплексом дает цветную реакцию , РНГА (реакция непрямой гемагглютинации Эритроциты нагружают АГ и при образовании комплекса АГ-АТ происходит агглютинация эритроцитов ) , РСК - реакция связывания комплемента. Задержка гемолиза – реакция положительная. Если произошел гемолиз, значит комплемент связан гем-системой – реакция отрицательная , РДП- реакция диффузной преципитиции. Метод обнаружения – образование контура преципитации.4. Обнаружение вирусных НК (ДНК-зонды и ПЦР – полимеразно-цепная реакция) Не серолог. р-ция,напр-на на обнар-ие вир-й нукл-й к-ты(генома). Принцип:у выд-й из пат мат вир-й нукл к-ты многократно воспроизводят(копируют) опред-й наиболее консервативный уч-к «in vitro», а затем его идентифицируют . 5.Обнаружение активной формы вируса путем биопробы (лабораторные животные, куриные эмбрионы, культура клеток) экспериментальное заражение материалом от больных жив. лаб. или естественно восприимчивых жив.6. Обнаружение гемаглютининов у гемаглютинирующих вирусов. Геагглютинирующ вирусы способны агглютинировать эритроциты животных определенных видов в условиях соответствующих температур и рН среды. Иногда используют реакцию гемагглютинации (РГА) для обнаружения гемагглютинирующего вируса в материале.
44. Тельца-включения: характеристика, методы индикации, роль данного метода в диагностике бешенства. Классификация. По происхождению и составу: 1)клеточные –скопление отдельных структур клеток. 2) вирусные – скопления компонентов клеток. 3) смешанные. По локализации: 1)ядерные (ДНК вирусы),2)цитоплазматические (РНК вирусы, исключение в. Оспы ДНК, но имеет цитоплазматические включения). Обычно удается рассмотреть вирионы вирусов и установить их структуру с помощью электронной микроскопии, позволяющей различать объекты размерами до 0,2-0,4 нм. Способность к окраске теми или иными красителями, размеры, форма, структура, местоположение в клетке телец-включений, образованных разными вирусами, неодинаковые, но специфичные для каждого вируса. Поэтому обнаружение в материале от больных животных внутриклеточных телец-включений с определенными характеристиками позволяет судить о том, каким вирусом они образованы, а значит, и о присутствии этого вируса в исследуемом материале. Для обнаружения телец-включений готовят мазки или отпечатки (посмертно или прижизненно), которые подвергают специальным методам окраски с последующей микроскопией. Для телец-включений, образуемых разными вирусами, методы окраски различны. Для индикации вируса бешенства – световая иммерсионная микроскопия, окраска по Селлерсу и Туревичу, обнаружение телец Бабеша-Негри. Тельца включения – это внутриклеточные включения, образующиеся в клетке при рапродукции в них некоторых вирусов. Тельца включения чаще всего находятся в цитоплазме(чаще это РНК вирусы, кроме оспы)Оспа кур- т. Боллингера, чума плотоядных –т. Ленца, вирус Бешенства –т.Бабеша-Негри(при обнаруж их в мазках отпечатках павших животных диагноз бешенство считается доказанным).
45. Титрование вирусов по инфекционной активности. ЭД50 вируса, методика титрования и статистическая обработка результатов титрования (метод Кербера). Эффективная доза (ЭД) – это такая доза вируса, которая при введении четному количеству живых систем вызывает эффект в 50% случаев. Эффективная доза зависит от вида живой системы и от эффекта, по коротому титруют вирус.
Эффект действия Лабораторн. Животные КЭ КК
Летальность ЛД50 летальная доза ЭЛД 50 ---
Клинич. Признаки ИнфД50 --- ---
Патанатомич. Изменения ИД ЭИД50 ЦПД50 цитопатич д.
Локальные изменения --- ООЕ оспа обр. един. БОЕ бляшкобредин
1)1мл вируса+9мл физ р-ра (1:10)-V –перенос 1 мл(1:10 в2ст)V-перенос 1мл (1:10 в 3 ст)V-перенос 1 мл(1:10 в 4 ст)V-перенос 1мл(1:10 в 5 ст)V- перенос 1мл(1:10 в 6 ст)V-1мл в дез р-р.2)каждым разведением вируса заражают четное равное количество живых систем в дозе 0.2 мл. Реакция гемадсорбции(РГАд) – не серологическая реакция. Некоторые вирусы имеют в своем составе белок гемагглютенин. При проникновении такого вируса сквозь клеточную оболочку, вирусные булки встраиваются в нее и она приобретает их свойства. В основе гемадсорбции лежит родство рецепторов вируса находящегося на поверхности зараженной клетки с рецепторами эритроцитов. Принцип РГАд заключается в адсорбции эритроцитов определенного вида на клетках зараженных вирусом. То разведение, где половина живых систем проявит гемадсорбцию – будет 1 ЭД50. Титр вируса равен числу во сколько раз развели вирус, чтобы получить 1 ЭД50. Количество вируса можно определить по эффективности его действия в живой системе. Типы эффективного действия вируса:1) инфекционная активность вируса (обладают все вирусы), 2) гемагглютинирующая активность. Цели определения титра вируса: 1)определение рабочей дозы вируса для серологических реакций.2) определение противовирусной активности вакцин.3)контроль активности вируса при хранении.4)постановка биопробы.5) получение гипериммунных сывороток.
46.Титрование вирусов по гемагглютинирующей активности. ГАЕ вируса, методика титрования и определение титра вируса. Не серологическая реакция. Основной метод индикации гемагглютинирующих вирусов. Гемагглютинация –это склеивание эритроцитов под действием вируса, который в своем составе имеет белок гемагглютенин, который взаимодействует со специфическими рецепторами эритроцитов. Каждый вирус агглютинирует эритроциты определенного вида животного: в. Бешенства- эрит. Гуся, в. Б-ни ньюкасла – эрит. Кур, парагрипп 3 – эрит. Морской свинки. По цели проведения РГА бывают: 1.)капельная – качественная. Учет реакции: зонтик – 100%эритроцитов агглютинировали (+++), неполный зонтик 50% эрит аггл (++), маленький зонтик (+), пуговка (-) эритроц не агглютиноровали и осели на дно лунки. 1ГАЕ- наибольшее разведение вируса, дающее неполный зонтик. 2) количественная – определение гемагглютинирующего титра вируса. Титр вируса – это во сколько надо развести вирус, чтобы получить 1 ГАЕ(++). Стадии РГА:1)адсорбция вируса на поверхность эритроцитов. 2)склеивание эритроцитов за счет образования между ними мостиков из вирусов. 3)элюция (сползание) вируса с поверхности эритроцитов за счет разрушения рецепторов эритроцитов. Титр – это кол-во вируса, содер в ед объема материала.Вир имеют белок- гемагглютинин.Они склеивают эр. Титр опред-ют по эф-ту гемагглютинации.Выр-ся ГАЕ(гемагл ед). Р-ция пров-ся в плестеглазовых (пласти-ковых) планшетах.Не треб-ся стирильн условий: 1)Готовят последов-ое 2х кратное развед вир(1:2,1:4,1:8…) 2)В каждое развед доб-ют равный V 1% взвеси эритр-в опред-го вида и оставл-ют на контакт 3) Учет реакции с того момента как сработал контроль: зонтик – 100%эритроцитов агглютинировали (+++), неполный зонтик 50% эрит аггл (++), маленький зонтик (+), пуговка (-) эритроц не агглютиноровали и осели на дно лунки. 4)Опред-ют гемаглют-й титр(Тга):снач узнают в каком развед нах-ся 1ГАЕ. Титр вируса – это во сколько надо развести вирус, чтобы получить 1 ГАЕ(++) Берем 6 пробирок,6-контроль(эр+физ р-р): 1)(1:2)0,2мл физ р-ра(разбавитель)+0,2мл вир БН+0,2мл 1%взвеси эр-в петуха;2)(1:4)0,2мл из пред-й проб-ки+0,2физ р-ра+0,2 1%взвеси и тд до 5-й.Оставляем на контакт на 30 мин при комн-й темпер-ре. От чего зав-т р-ия ГА:1)от наличия вир гемагглютинирующего 2)исп-ся эр опред-го вида хозяина(ВБН-эр кур и петухов); 3)опред усл для постан р-ции:буф-й р-р (физ р-р,карбонатный,фосфатный буфер); рН(нейтр),комн темп,время конт(30мин)
47. Вирусовыделение (изоляция): биопроба на живых системах, способы заражения, признаки репродукции. Лаб жив :белые мыши и крысы ,кролики, хомячки, мор свинки. Требования:1)получ из питомников, благопр по инф заб-м;2) должны быть того вида и возраста, кот наиболее чувствителен к данному вир; 3)их сод-т в спец помещ-вивариях;4)при зараж жив-х метят 5)животные должны быть линейными (полученными от одной родительской пары). Заражение лабораторных животных. 1.подкожно – спина.2.Внутрикожно – пятка. 3.Внутримышечно –бедро. 4.Внутривенно – в хвост (предварительно растерев горячей водой и пережав).5.Интранозально – капля в нос (предварительно дают слабый эфирный наркоз, что бы предупредить чихание).6.Интероцеребрально – череп аккуратно просверливается иголочкой, не нажимать, капля уходит сама. Все поверхности предварительно смазывают йодированным спиртом. Признаки репродукции: . Признаки индикации: 1) Клинические признаки (повышение t, изменение поведения, выделения) неспецифические. 2) гибель в определенные сроки. 3) патологоанатомическое вскрытие. От положительной биопробы отбирают вторичный патматериал дла дальнейших вирусологических исследований. Культура клеток. Для заражения отбирают пробирки (матрасы) со сплошным клеточным монослоем, просматривая их под малым увеличением микроскопа. Ростовую питательную среду сливают, клетки 1-2 раза промывают раствором Хенкса, чтобы удалить сывороточные АТ и ингибиторы. В каждую пробирку вносят по 0,1-0,2 мл вируссодержащего материала и покачиванием распределяют его равномерно по слою клеток. Оставляют на 1-2 часа при 22-37С для адсорбции вируса на поверхности клеток. Вируссодержащий материал удаляют из емкостей и наливают поддерживающую среду. Для индикации существуют следующие основные методы индикации вируса в КК: по цитопатическому эффекту или цитопатическому действию – это любые изменения монослоя или морфологии клеток под действием вируса (сетовая микроскопия); по положительной реакции гемадсорбции (световая микроскопия) ; по образованию бляшек; по обнаружению внутриклеточных включений; по выявлению вирусов в реакции иммунофлуоресценции; по обнаружению интерференции вирусов; по подавлению метаболизма клеток (цветная проба); электронной микроскопией. При инфицирования КК средними дозами вируса характер этих изменений специфичен и может быть классифицирован на группы: очаговое мелкозернистое перерождение, мелкозернистое перерождение по всему монослою, очаговое гроздевидное скопление округлых клеток, равномерная зернистость, объединение клеток в гигантские многоядерные симпласты и синцитии. Иногда наблюдают отсутствие ЦПД, но это считают за отсутствие вируса нельзя и потому проводят 2-3 слепых пассажа и на 2-3 пассаже вирусы могут проявлять желаемые свойства. Заражение. Куриный эмбрион развивается 21 день. Заражение вирусом производится с 5-го по 12-й день. Заражение в аллантоисную полость (болезнь ньюкасла). Все операции проводят асептично с горящей газовой горелкой. Место введения обрабатывают 2% йодированным спиртом, вводят 0,1-0,2 мл жидкости. Отверстие закрывают каплей расплавленного парафина. На скорлупе пишут: название вируса, дату, фамилию. Заражение на ХАО (вирус оспы голубей). Делается отверстие в области воздушной камеры. Делается окошко «А». Отсасывается воздух из воздушной камеры. В окошко «А» капается вирус содержащая жидкость. Отверстие заклеивается лейкопластырем. На скорлупе пишется название вируса, дата, фамилия. После заражения инкубируют при 37 гр – 5 дней. Признаки репродукции вируса: Гибель куриного эмбриона в характерные для данного вируса сроки. Гибель эмбрионов в первые сутки не специфична. Эмбрионы погибшие в более поздние сроки переносятся в холодильник (+ 4С). Все эмбрионы извлекают из термостата в момент максимального накопления вируса. Срок для каждого вируса – справочные данные. Вскрытие эмбриона и анализ патологоанатомических изменений. Отечная ХАО и белые узелки некроза (оспины). Мутность или изменение цвета аллантоисной и амниотической жидкостей. Красноватый цвет жидкостей – результат гемолиза. Изменения зародыша: карликовость, кровоизлияния, мумификация. Органы зародыша – некроз, кровоизлияния. Наличие гемаглютинации при проведении капельной реакции ГА. (аллантоисная жидкость + 5% р-р эритроцитов кур).
48. Экспресс-методы в вирусологии. РДП: принцип, задачи, компоненты, достоинства и недостатки. 1.Обнаружение – световая микроскопия крупных вирусов (Poxviridae оспа), электронная микроскопия. 2.Обнаружение телец-включений. 3. Обнаружение вирусных антигенов: серологические реакции. В основе лежит спос-ть Ат взаимодействовать со специфическими гомологичными Аг в прбирке(in vitro)с образованием комплекса Аг-Ат. Обычно источником Ат служит сыв-ка крови жив-го=>эти р-ции наз-ся серологическими. РИФ(реакция иммунофлюорисценции. Метод обнаружения – флюоресцентное свечение под микроскопом). ,ИФА – иммуно-ферментный анализ. АТ-ферментным комплексом дает цветную реакцию , РНГА (реакция непрямой гемагглютинации Эритроциты нагружают АГ и при образовании комплекса АГ-АТ происходит агглютинация эритроцитов ) , РСК - реакция связывания комплемента. Задержка гемолиза – реакция положительная. Если произошел гемолиз, значит комплемент связан гем-системой – реакция отрицательная , РДП- реакция диффузной преципитиции. Метод обнаружения – образование контура преципитации.4. Обнаружение вирусных НК (ДНК-зонды и ПЦР – полимеразно-цепная реакция) Не серолог. р-ция,напр-на на обнар-ие вир-й нукл-й к-ты(генома). Принцип:у выд-й из пат мат вир-й нукл к-ты многократно воспроизводят(копируют) опред-й наиболее консервативный уч-к «in vitro», а затем его идентифицируют . 5.Обнаружение активной формы вируса путем 6. Обнаружение гемаглютининов у гемаглютинирующих вирусов. РДП. Принцип АГ и АТ помещенные в лунки агарового геля, диффундируют в нем в разных направлениях и если они гомологичны друг другу, то образуется комплекс АГ+АТ, который виден в виде белой линии преципитата.
1)индикация вируса: 2)Идентиф вируса: 3) обнаружение антит
АS (конт+) АN(контр-) SS(чума пл) SS(аденолвир) SSчума плот SN
SS (специф сыв) АГх AS спецАГ
АГ АГ SS(парвовир) SS(гепатит) Sx 1 соб Sx 2соб Исследуемый материал напр иммун
4)определение титра антител- принимают наибольшее разведение сыворотки дающее линию приципитата.
Sx(1:2) Sx(1:4) Титр антител – 1:8. Достоинства: экспресс метод, не требует стерильности, Р-ция
AS обладает высокой специфичностью, но низкой чувствительностью.Sx(1:16) Sx(1:8)
49. Серологические реакции как метод идентификации выделенного вируса: принцип, компоненты, учет результатов. РИФ: принцип, варианты, задачи, компоненты, достоинства и недостатки. В реакциях антиген – выделенный вирус, антитела – стандартные сыворотки. РИФ – реакция иммунофлюорисценции. АГ + АТ меченные флюорохромом (При искусственном введении в организм Ф. адсорбируются клетками и придают им способность люминесцировать) интенсивным. Дают контакт 30 минут при 37 С, затем производят тщательный отмыв в физрастворе. Метод обнаружения – флюоресцентное свечение под микроскопом. При взаимодействии специфических АТ соединенных с флуорохромами с АГ образуют комплекс АГ+АТ, который обнаруживают по характерному свечению в люминесцентном микроскопе. Прямой вариант: Диагностика бешенства: мазок отпечаток АГ + SS (сыворотка коньюгат к предполагаемому вирусу) ---30 мин37гр влаж кам--- контакт отмыть--- наносят нефлуоресц масло= свечение в микроскоп (обнаружение вируса –индикация, идентификация). Непрямой вариант: мазок отпечаток АГ + SS (гипериммунная сыворотка к предполагаем вирусу)----30 мин37 гр. ---- контакт отмыв ---наносят антивидовую флуоресцир сывороткусоот виду животного- продуцента гомологичн противовирусн антител----30 мин 37 гр. ---отмыв--- наносят нефлуоресц масло-----свечение. Позволяет не только обнаружить и идентифицировать антиген, но и выявить и определить титр антител. Достоинства: экспресс метод, не требует стерильности компонентов, Высокая чувствительность и специфичность.
50. РНГА: принцип, задачи, компоненты, учеты результатов. Этапы изготовления эритроцитарных диагностикумов. Основана на том, что эритроциты, на которых предварительно адсорбированы антигены, приобретают способность агглютинироваться в присутствии гомологичных сывороток (антител). Эритроциты при этом выполняют роль носителей агглютинация которых происходит в результате реакции АГ+АТ. Приготовление эритроцитарных диагностикумов: 1) фиксация эритроцитов (барана, кур, человека)формальдегидом. Такие эритроциты длительно сохраняются. 2) обработка фиксированных эритроцитов раствором танина. В результате эритроциты приобретают способность адсорбировать на совей поверхности белки (вирусы и антитела). 3)сенсибилизация танизированных эритроцитов вирусами и антителами. Методика: 1) к последовательным 2-кратным разведениям сыворотки добавляют равные дозы эритроцитов, сенсибилизированных антигеном. 2) смесь оставляют на 2-3 часа при комнатной темп. Или на 16-18ч при 4 гр. Учет результата: Если в сыворотке содержатся антитела к вирусу, которым были нагружены эритроциты, наблюдают гемагглютинацию, которую оценивают в крестах. За титр антител принимают наивысшее разведение сыворотки, оторое обеспечивает гемагглютинацию на два креста. Задачи: обнаружить антитела и определить их титр в сыворотке крови с помощью известного эритроцитарного антигенного диагностикума. 2) индикация и идентификация неизвестного вируса с помощью известного эритроцит антительного диагностикума. Достоинства: высокая чувствительность. Быстрота техники постановки и быстрого ответа. Недостатки: необходимость готовить эритроцитарные диагностики для каждого вида вируса.
51. Современные методы идентификации вирусов на примере ИФА: принцип, варианты, задачи, компоненты, учет результатов. При взаимодействии антител меченных ферментной меткой с гомологичным антигеном образуется комплекс АГ+АТ. Добавление к нему фермент чувствительного в-ва (субстрата) ведет к образованию цветного продукта ферментативной реакции. Результат учитывают визуально или на спектрофотометре. Материал: мазки, отпечатки различных органов, парафиновые срезы, КК. Прямой метод(сендвич):на фиксированный препарат наносят конъюгат ( АТ к предполагаемому вирусу меченные ферментом) ----37гр. 1-2 часа во влажн камере ---отмыв физ р-ром--- наносят субстрат--- инкубируют 5-10мин—промыв физ р-ром. Положительный случай (наличие антигена в исслед метериале), видны диффузные желто-коричневые окрашивания, или гранулы коричневого цвета. В контроле окрашивания не обнаруживают. Непрямой мотод: на фиксированный препарат наносят специфическую к предполагаемому вирусу сыворотку, выдерживают 37 гр 1-6 ч, далее как в прямом методе. Достоинства: экспресс метод, не требует стерильности компонентов.
52. Методы индикации и идентификации гемагглютинирующих вирусов. РГА, РТГА: принцип, задачи, компоненты, учет результатов. Основной метод индикации гемагглютинирующих вирусов. Гемагглютинация –это склеивание эритроцитов под действием вируса, который в своем составе имеет белок гемагглютенин, который взаимодействует со специфическими рецепторами эритроцитов. Каждый вирус агглютинирует эритроциты определенного вида животного: в. Бешенства- эрит. Гуся, в. Б-ни ньюкасла – эрит. Кур, парагрипп 3 – эрит. Морской свинки. По цели проведения РГА бывают: 1.)капельная – качественная. Учет реакции: зонтик – 100%эритроцитов агглютинировали (+++), неполный зонтик 50% эрит аггл (++), маленький зонтик (+), пуговка (-) эритроц не агглютиноровали и осели на дно лунки. 1ГАЕ- наибольшее разведение вируса, дающее неполный зонтик. 2) количественная – определение гемагглютинирующего титра вируса. Титр вируса – это во сколько надо развести вирус, чтобы получить 1 ГАЕ(++). Стадии РГА:1)адсорбция вируса на поверхность эритроцитов. 2)склеивание эритроцитов за счет образования между ними мостиков из вирусов. 3)элюция (сползание) вируса с поверхности эритроцитов за счет разрушения рецепторов эритроцитов. Титр – это кол-во вируса, содер в ед объема материала.Вир имеют белок- гемагглютинин.Они склеивают эр. Титр опред-ют по эф-ту гемагглютинации.Выр-ся ГАЕ(гемагл ед). Р-ция пров-ся в плестеглазовых (пласти-ковых) планшетах.Не треб-ся стирильн условий: 1)Готовят последов-ое 2х кратное развед вир(1:2,1:4,1:8…) 2)В каждое развед доб-ют равный V 1% взвеси эритр-в опред-го вида и оставл-ют на контакт 3) Учет реакции с того момента как сработал контроль: зонтик – 100%эритроцитов агглютинировали (+++), неполный зонтик 50% эрит аггл (++), маленький зонтик (+), пуговка (-) эритроц не агглютиноровали и осели на дно лунки. 4)Опред-ют гемаглют-й титр(Тга):снач узнают в каком развед нах-ся 1ГАЕ. Титр вируса – это во сколько надо развести вирус, чтобы получить 1 ГАЕ(++) Берем 6 пробирок,6-контроль(эр+физ р-р): 1)(1:2)0,2мл физ р-ра(разбавитель)+0,2мл вир БН+0,2мл 1%взвеси эр-в петуха;2)(1:4)0,2мл из пред-й проб-ки+0,2физ р-ра+0,2 1%взвеси и тд до 5-й.Оставляем на контакт на 30 мин при комн-й темпер-ре. От чего зав-т р-ия ГА:1)от наличия вир гемагглютинирующего 2)исп-ся эр опред-го вида хозяина(ВБН-эр кур и петухов); 3)опред усл для постан р-ции:буф-й р-р (физ р-р,карбонатный,фосфатный буфер); рН(нейтр),комн темп,время конт(30мин)РТГА. Одной из простейших серологических реакции является реакция торможения гемаглютинации. Она основана на том, что АТ при встрече с гомологичным АГ нейтрализуют не только его инфекционную, но и гемагглютинирующую активность, т.к. блокируют рецепторы вирионов, ответственные за гемагглютинацию, образуя с ними комплекс «АГ+АТ». Принцип РТГА состоит в том, что в пробирке смешивают равные объемы сыворотки крови и суспензии вируса и после экспозиции определяют, сохранился ли в смеси вирус, путем добавления суспензии эритроцитов. Агглютинация эритроцитов указывает на наличие, а отсутствие гемагглютинации – на отсутствие вируса в смеси. Исчезновение вируса из смеси вирус + сыворотка расценивается как признак взаимодействия АТ сыворотки и вируса. РТГА позволяет решать следующие задачи: определять титр АТ к гемагглютинирующему вирусу в сыворотке; идентифицировать неизвестный гемагглютинирующий вирус по известным сывороткам; установить степень АГ родства двух вирусов. Достоинства РТГА: простота техники, быстрота, не требуется стерильной работы, специфичность, дешевизна. Недостаток РТГА: возможна только с гемагглютинирующими вирусами. Принцип титрования АТ в РТГА состоит в следующем: готовят ряд последовательных (обычно 2-х кратных) разведений исследуемой сыворотки в одинаковых объемах (чаще по 0,25 или 0,2 мл); к каждому разведению добавляют такие же объемы гомологичного вируса в титре 4 ГАЕ; смеси выдерживают определенное время при определенной температуре, ко всем смесям добавляют равные объемы 1-% суспензии отмытых эритроцитов; после экспозиции оценивают гемагглютинацию в каждой смеси в крестах.
53.Эталонная серологическая реакция в диагностике вирусных болезней: принципы, задачи, компоненты, учет результатов, достоинства и недостатки. Эталон при оценке других серологических реакций. Принцип: при взаимодействии антигена (вируса) с гомологичными антителами образуется комплекс АГ+АТ, в результате нейтрализуется инфекционность вируса. Индикатором свободного (не связавшегося с антителами) вируса является живая система: животные, КЭ, КК. Метод: в пробирке смешивают равные объемы вируса и сыворотки, выдерживают при t (4 или 22 или 37 гр) 1 час или 16-18 ч (зависит от вируса и условий). Затем смесью заражают чувствительную к вирусу живую систему, наблюдают за состоянием объектов и через соответ срок ( в зависимости от вируса) учитывают результат нейтрализации вируса по отсутствию: 1) гибели, развития клинкартины болезни и патизменений в органах и тканях лаб животных. 2) гибели и пат изменений в оболочках и тканях зародыша и отсутствию гемагглютининов в жидкостях КЭ.3) цитопатического действия или бляшкообразования КК. Любая серологическая реакция сопровождается контролем. Задачи: 1)обнаружить и определить титр вируснейтрализующих антител с помощью известного вируса.2)идентифицировать неизвестный (выделенный) вирус путем исследования его с различными заведомо известными сыворотками (антителами). Достоинства: универсальность и высокая специфичность, недостатки – большая трудоемкость, стерильность материалов, посуди и инструментов, высокая стоимость живых систем, математические расчеты.
54. Определение индекса нейтрализации в РН: цель, принцип, компоненты, учет и статистическая обработка результатов. Эталон при оценке других серологических реакций. Принцип: при взаимодействии антигена (вируса) с гомологичными антителами образуется комплекс АГ+АТ, в результате нейтрализуется инфекционность вируса. Индикатором свободного (не связавшегося с антителами) вируса является живая система: животные, КЭ, КК. Метод: в пробирке смешивают равные объемы вируса и сыворотки, выдерживают при t (4 или 22 или 37 гр) 1 час или 16-18 ч (зависит от вируса и условий). Затем смесью заражают чувствительную к вирусу живую систему, наблюдают за состоянием объектов и через соответ срок ( в зависимости от вируса) учитывают результат нейтрализации вируса по отсутствию: 1) гибели, развития клинкартины болезни и патизменений в органах и тканях лаб животных. 2) гибели и пат изменений в оболочках и тканях зародыша и отсутствию гемагглютининов в жидкостях КЭ.3) цитопатического действия или бляшкообразования КК. Любая серологическая реакция сопровождается контролем. Задачи: 1)обнаружить и определить титр вируснейтрализующих антител с помощью известного вируса.2)идентифицировать неизвестный (выделенный) вирус путем исследования его с различными заведомо известными сыворотками (антителами). Достоинства: универсальность и высокая специфичность, недостатки – большая трудоемкость, стерильность материалов, посуди и инструментов, высокая стоимость живых систем, математические расчеты.
55. Методы индикации и идентификации гемадсорбирующих вирусов. РГАд, РТГАд: принцип, задачи, компоненты, учет результатов. РГАд- Гемадсорбцией называют прилипание эритроцитов к поверхности клеток, зараженных вирусом (чаще гемагглютинирующим). Приобретение способности к гемадсорбции связано со встраиванием в мембрану заражённых вирусом клеток вирусспецифических белков – гемагглютининов, к которым эритроциты имеют комплементарные рецепторы и поэтому адсорбируются на поверхности заражённых клеток. 1)из контрольных и зараженных матрасов с КК удаляют поддерживающую среду. 2)вносят 0,5% суспензию эритроцитов на 5-10 мин. 3) суспензию эритроцитов удаляют, монослой отмывают солевым раствором) учитывают результат методом световой микроскопии. ). Если в КК идет репродукция вируса, то под микроскопом можно видеть адсорбировавшие эритроциты, а в контроле таковые отсутствуют. РТГАд- основана на торможении гемадсорбции, если зареженную вирусом КК предварительно обработать специфической сывороткой (содержащей антитела к этому вирусу). На 3-7 день после заражения КК удаляют питательную среду, промывают раствором Хенкса и вносят в каждые 4 пробирки по 0.5 мл специфической к вирусу сыворотки в разведении 1:10. Пробирки в наклонном положении оставляют при комнатной температуре на 30 мин ( для контакта клеток с антителами), во все пробирки вносят по 1 мл 1,5% взвеси эритроцитов. Через 30 мин учет результатов. Отсутствие гемадс в пробирках со специфической сывороткой и проявление ее в пробирках с зараженной КК, но не обработанной спец сывороткой, свидетельствует о наличии вируса в КК. Применяют для идентификации вируса и редко для индикации и титрования антител.
56. РТГА: принцип, задачи, компоненты и их подготовка. Определение титра антител в РТГА. Одной из простейших серологических реакции является реакция торможения гемаглютинации. Она основана на том, что АТ при встрече с гомологичным АГ нейтрализуют не только его инфекционную, но и гемагглютинирующую активность, т.к. блокируют рецепторы вирионов, ответственные за гемагглютинацию, образуя с ними комплекс «АГ+АТ». Принцип РТГА состоит в том, что в пробирке смешивают равные объемы сыворотки крови и суспензии вируса и после экспозиции определяют, сохранился ли в смеси вирус, путем добавления суспензии эритроцитов. Агглютинация эритроцитов указывает на наличие, а отсутствие гемагглютинации – на отсутствие вируса в смеси. Исчезновение вируса из смеси вирус + сыворотка расценивается как признак взаимодействия АТ сыворотки и вируса. РТГА позволяет решать следующие задачи: определять титр АТ к гемагглютинирующему вирусу в сыворотке; идентифицировать неизвестный гемагглютинирующий вирус по известным сывороткам; установить степень АГ родства двух вирусов. Достоинства РТГА: простота техники, быстрота, не требуется стерильной работы, специфичность, дешевизна. Недостаток РТГА: возможна только с гемагглютинирующими вирусами. Принцип титрования АТ в РТГА состоит в следующем: готовят ряд последовательных (обычно 2-х кратных) разведений исследуемой сыворотки в одинаковых объемах (чаще по 0,25 или 0,2 мл); к каждому разведению добавляют такие же объемы гомологичного вируса в титре 4 ГАЕ; смеси выдерживают определенное время при определенной температуре, ко всем смесям добавляют равные объемы 1-% суспензии отмытых эритроцитов; после экспозиции оценивают гемагглютинацию в каждой смеси в крестах.
57. ПЦР: принцип, задачи, компоненты, достоинства и недостатки, учет результатов. Не серолог. р-ция, 1) Выделение НК в малом объеме (100 мкл), удаление ингибиторов ПЦР(гемоглобин, гепарин, иммуноглобулин, билирубин, желч кислоты, гормоны, ферменты) и получение очищенного препараты НК. Лизис клинич материала с раствором GиТС-----сорбация НК на частицы селикагеля (SiO2) ------отмывка GиТСот белка и полисахаридов ---- отмывка от солей 70% этанолом-----отмывка от воды ацетоном(для РНК) -----подсушивание при 60-65гр----элюция РНК/ДНК. 2)Амплификация (ПЦР)- это многократное копирование специфического фрагмента ДНК в присутствии фермента ДНК-полимеразы в условиях ин витро (в пробирках). Главный элемент ПЦР- это многократный тепловой цикл, при котором образец ДНК подвергается воздействию трех различных температур. Представляет собой трехступенчатый циклический процесс, который повторяется заданное количество раз. Компоненты: буферный р-р, Магний (++), праймеры, дНТФ, ДНК-полимераза, исследуемый препаратДНК. Объем реакционной смеси 25мкл. Праймеры – основа специфичности ПЦР- это искусственно синтезированные молекулы ДНК (20-30 нуклеотидов, олигонуклеотиды) комплементарные 3”концу специфического участка НК. ДНК-полимераза – это фермент способный наращивать короткие цепочки ДНК (праймеры), если эти короткие цепочки связаны с более длинной «матричной» цепью ДНК. Циклы ПЦР: 1) денатурация (95гр. 30 сек-5 мин).2) отжиг праймеров (56-62 гр 20-30 сек). 3) элонгация (72 гр 30 сек -5 мин). 3) Детекция продуктов амплификации. Горизонтальный электроворез – разделение фрагментов ДНК по размеру под действием электрического тока. Основная проблема при использовании ПЦР в лабораторной диагностике – высокий риск контаминации реагентов продуктами ПЦР и получение ложноположительных результатов. Решение проблемы – использование метода гибридизационно-флуоресцентной детекции. Но она очень дорогой. Достоинства: прямой метод, возможность выявления искомого участка ДНК в сложной смеси молекул, а также при наличии в пробе единичных молекул возбудителя, нет необходимости в живом возбудителе, исследование любого материала, исключение возможности инфицирования персонала, простота, быстрота исполнения, возможность полной автоматизации процесса, возможность количественного определения копий возбудителя в пробе. Недостатки: лодноположительный результат (контаминация от пробы к пробе продуктами амплификации, низкая специфичность тест системы), ложноотрицательный результат ( низкая чувствительность тест системы, потеря НК на этапе выделения, наличие ингибиторов ПЦР).
58. Этапы ПЦР анализа: цель, методика и компоненты каждого этапа. 1) Выделение НК в малом объеме (100 мкл), удаление ингибиторов ПЦР(гемоглобин, гепарин, иммуноглобулин, билирубин, желч кислоты, гормоны, ферменты) и получение очищенного препараты НК. Лизис клинич материала с раствором GиТС-----сорбация НК на частицы селикагеля (SiO2) ------отмывка GиТСот белка и полисахаридов ---- отмывка от солей 70% этанолом-----отмывка от воды ацетоном(для РНК) -----подсушивание при 60-65гр----элюция РНК/ДНК. 2)Амплификация (ПЦР)- это многократное копирование специфического фрагмента ДНК в присутствии фермента ДНК-полимеразы в условиях ин витро (в пробирках). Главный элемент ПЦР- это многократный тепловой цикл, при котором образец ДНК подвергается воздействию трех различных температур. Представляет собой трехступенчатый циклический процесс, который повторяется заданное количество раз. Компоненты: буферный р-р, Магний (++), праймеры, дНТФ, ДНК-полимераза, исследуемый препаратДНК. Объем реакционной смеси 25мкл. Праймеры – основа специфичности ПЦР- это искусственно синтезированные молекулы ДНК (20-30 нуклеотидов, олигонуклеотиды) комплементарные 3”концу специфического участка НК. ДНК-полимераза – это фермент способный наращивать короткие цепочки ДНК (праймеры), если эти короткие цепочки связаны с более длинной «матричной» цепью ДНК. Циклы ПЦР: 1) денатурация (95гр. 30 сек-5 мин).2) отжиг праймеров (56-62 гр 20-30 сек). 3) элонгация (72 гр 30 сек -5 мин). 3) Детекция продуктов амплификации. Горизонтальный электроворез – разделение фрагментов ДНК по размеру под действием электрического тока. Основная проблема при использовании ПЦР в лабораторной диагностике – высокий риск контаминации реагентов продуктами ПЦР и получение ложноположительных результатов. Решение проблемы – использование метода гибридизационно-флуоресцентной детекции. Но она очень дорогой.
59. Амплификция: принцип компоненты, оборудование. . 1) Выделение НК в малом объеме (100 мкл), удаление ингибиторов ПЦР(гемоглобин, гепарин, иммуноглобулин, билирубин, желч кислоты, гормоны, ферменты) и получение очищенного препараты НК. Лизис клинич материала с раствором GиТС-----сорбация НК на частицы селикагеля (SiO2) ------отмывка GиТСот белка и полисахаридов ---- отмывка от солей 70% этанолом-----отмывка от воды ацетоном(для РНК) -----подсушивание при 60-65гр----элюция РНК/ДНК. 2)Амплификация (ПЦР)- это многократное копирование специфического фрагмента ДНК в присутствии фермента ДНК-полимеразы в условиях ин витро (в пробирках). Главный элемент ПЦР- это многократный тепловой цикл, при котором образец ДНК подвергается воздействию трех различных температур. Представляет собой трехступенчатый циклический процесс, который повторяется заданное количество раз. Компоненты: буферный р-р, Магний (++), праймеры, дНТФ, ДНК-полимераза, исследуемый препаратДНК. Объем реакционной смеси 25мкл. Праймеры – основа специфичности ПЦР- это искусственно синтезированные молекулы ДНК (20-30 нуклеотидов, олигонуклеотиды) комплементарные 3”концу специфического участка НК. ДНК-полимераза – это фермент способный наращивать короткие цепочки ДНК (праймеры), если эти короткие цепочки связаны с более длинной «матричной» цепью ДНК. Циклы ПЦР: 1) денатурация (95гр. 30 сек-5 мин).2) отжиг праймеров (56-62 гр 20-30 сек). 3) элонгация (72 гр 30 сек -5 мин). 3) Детекция продуктов амплификации. Горизонтальный электроворез – разделение фрагментов ДНК по размеру под действием электрического тока. Основная проблема при использовании ПЦР в лабораторной диагностике – высокий риск контаминации реагентов продуктами ПЦР и получение ложноположительных результатов. Решение проблемы – использование метода гибридизационно-флуоресцентной детекции. Но она очень дорогой.
60. Серологические реакции и их использование в вирусологии. Экспресс и не экспресс методы. Примеры. Серологические реакции. 1)РИФ(экспресс) – реакция иммунофлюорисценции. АГ + АТ меченные флюорохромом. Дают контакт 30 минут при 37 С, затем производят тщательный отмыв в физрастворе. Метод обнаружения – флюоресцентное свечение под микроскопом. 2)ИФА(экспресс) – иммуно-ферментный анализ. АГ + АТ с ферментом. Контакт, отмыв, затем добавляют субстрат, который при контакте с АТ-ферментным комплексом дает цветную реакцию. 3)РСК – реакция связывания комплемента. АГ + АТ + комплемент. Контакт. Затем добавляют гем-систему (гемолизин + эритроциты барана). Контакт. Если гемолиза не происходит, значит АГ и АТ связали комплемент. Задержка гемолиза – реакция положительная. Если произошел гемолиз, значит комплемент связан гем-системой – реакция отрицательная.4)РДП(экспресс) - реакция диффузной преципитиции. АГ + АТ (диффузия в агаровом геле). Метод обнаружения – образование контура преципитации. 5)РНГА (экспресс)– реакция непрямой гемаглютинации. Эритроциты нагружают АГ и при образовании комплекса АГ-АТ происходит агглютинация эритроцитов. 6)РТГА(экспресс) – реакция торможения гамаглютинации 7)РТГАд(экспресс) – реакция торможения гемадсорбции 8)РН(не экспресс ) – реакция нейтрализации.Вирус + АТ. Контакт. Ввод в чувствительную к вирусу систему. Метод обнаружения – нейтрализация инфекционной активности вируса.
61. Основные направления борьбы с вирусными болезнями. Современные подходы к предупреждению возникновения и распространения вирусных болезней. Профилактика: 1)специфическая: активная (вакцинация), пассивная (серопрофилактика), 2) неспецифическая: 1)ветсанмероприятия (карантин, дезбарьер), 2) зоотехнические (уход, кормление, содержание). Диагностика: 1) предварительный диагноз, 2) эпизоотологические данные,3) клинические проявления, 4) патанатомические изменения, 5)отбор пат материала, 6) лабораторные исследования, 7) окончательный диагноз.



Приложенные файлы

  • docx 8853027
    Размер файла: 98 kB Загрузок: 0

Добавить комментарий