Шпоры вирусология


64. Особливості початкового етапу інфекційного процессу вірусів.
Адсорбция – у в. жив – ых и ч-ка есть специфические рецепторы,к-рые позволяют адсорбироваться к поверхностым рецепторам кл. хоз. Начальные процессы адсорбции имеют специфический характер, в основе электростатистические взаимодействия «+» и «_»заряженных группировок на поверхности в.частичек кл. хоз. Узнавание в. частичками приводит к прикреплению. Рецептор для в. Гриппа и сем. Парамиксовирусов – сиаловая кислота, для сем. Рабдо в и Рео в. – углеводные компоненты оболочки Кл. хоз. Для сем. Пикорно в. И адено в. – белковые компоненты оболочки Кл. хоз.
Две фазы неспечифическая и специфическая адсорбция. Неспецифическая – образование единичных связей. специфическая – рецеторы играют роль не только для прикрепления к поверхности а также внутриклеточный транспорт и доставка к определенным участкам клетки.чтобы наступило необратимое (специфическое) адсорбция – множество связей (мультивалентные прикрепления, до 3000) – это возможно благодаря свободному перемещению молекул рецептора в липидном бислое (текучисть мембран). Увеличение текучисти липидов является ранним и важным событием для взаимодействия в.частицы с рецепторами кл. хоз. Следствие: формирование
рецепторных полей (стабильное необратимое прикрепление).
Кол-во рецепторов 10*4, 10*5 на 1 кл. от типа в.
На этом этапе определенную роль играют прикрепительные белки – входя в состав фибров Аденовируса и входят в состав шипов сложных в. У простоорганизованных фагов белки – на поверхности капсидной оболочки.
Проникновение (пенитрация) два альтернативных механизма:
- путем виропексии (эндоцитоз). Термин виропексис в 1948г. Предложил Десантро – в.частичка попадает в цитоплазму Кл. хоз. В результате инвагинации участка плазматической мембраны, образуется вакуоля содержащяя в. частицу (наз. рецепторный эндоцитоз)- происходит в специальных участках клетки где имеются специальные ямки покрытые со стороны цитоплазмы особым белком клатрин( высокая М). на дне ямки специальные рецепторы обеспечивающие быструю инвагинацию и образование покрытых клотрином внутри клеточных вакуолей. Кол – во образования вакуолей в 1 минуту до 2000. в дальнейшем вакуоль сливается с более крупными цитоплазматическими вакуолями – образуется рецептосомы. В дальнейшем рецептосомы сливаются с лизосомами. Таким механизмом порникает многие оболочечные и безоболочные вирусы. В дальнейшем в. частица может освобождаться в цитоплазме (цитоплазматические в.) или в ядре (ядерные в.). Схема:окаймленная ямка-пузырек-эндосома (рецептосома)-лизосома-слияние мембран в. и мембраны кл хоз-выход
- слияние мембраны клетки хозяина с вирусной оболочкой. Этот механизм обусловлен взаимодействием вирусного белка – слияний с липидами клеточной оболочки.вирусная липопротеидная оболочка встраивается в клеточную мембрану а нуклеокапсид попадает внутрь. Белки – слияния специфичны для каждого в. Отличия: 1. в эндоцитозе вирусная частичка пассивный пассажир, а при слиянии она активный участник процесса. 2. слияние мембран при кислых значениях рН = 5- 5,75 если подщелочить до рн = 6 слияние не происходит – это обусловлено конформационными изменениями вирусных белков слияния.
Раздевание – вирусная частичка должна сбросить белковую оболочку для начала инфекционного процесса – освобождение генома. В результате распада вирусные частицы исчезает инфекционная активность, появляется чувствительность к неклеазам, возникает устойчивость к действию антител, теряется фаго чувствительность. Конесным продуктом разлевания – образование серцевины нуклеокапсида или нуклеиновой кислоты связанной с внутренним белком.. раздевание порисходит в специальных участках клетки (на лизосомных структур, аппарат Гольджи, околоядерных пор). Раздевание и внутриклеточный транспорт взаимосвязанные процессы, т.е. процесс раздевания начинается после прикрепления вирусной частицы к клеточным рецепторам и продолжается в эндоцитозных вакуолях при слиянии их с лизосомами при участии протеолитических ферментов. При нарушении процесса раздевания вирусная частичка может попасть в лизосому и в ней разрушится. Поэтому высвобождение компонентов вириона происходит до того как оно сливается с лизосомой. Однако некоторые вирусы н.: сем. Риовирусы используют гидролазы для деградации лизосомы. Т.о. процесс раздевания многоступенчатый, в результате чего образуется промежуточные формы, Н.: у Пикорновирусов промежуточные субклеточные частицы размер которых постепенно уменьшается от 156S до 12S; Аденовирусы- субъединица в. частицы – сердцерина – ДНК+внутренний терминальный белок.
66.Загальна та специфічна трансдукція та фагова конверсія.
Обратный процесс лизогении – индукция вегетативного фага. – требует снятия репрессии и высвобождения ДНК фагового происхождения. (обработка митомицином С, УФ, радиаций).
Иногда в результате индукции происходит проявление дефектных фагов – в результате «ошибки» высвобождения (часть исходной фаговой ДНК оказывается потерянной, образуется пробел компенсируется таким же участком генома клетки хозяина). Присутствие дефектных фагов выявляется по тому, что клетка сохраняет свою иммунность к супер инфекции коиммунных фагов.
Общая трансдукция и лизогения представляют собой два родственных явления.
В дальнейшем было показано, что некоторые умеренные фаги не имеют определенного места включения в геном кл. Хоз., а в любой участок (фаг Р1). Способность фагов полученных из лизогенных клеток, специфически переносить из одной клетки в другую бактерий гены расположенные рядом с местом включения профага называется специфической трансдукции. Для фагов Р1 и Р2 хар-но включения в любой участок хромосомы – общая трансдукция.
Специфическая трансдукция – кол –во ДНК кл. Хоз., к-рая может быть упакована в фаговую частицу довольно ограниченно. Частицы трансдуцирующих фагов всегда дефектно, так как ген Галактозы может включиться, но ген Биотина никогда.
При специфической трансдукции фрагмент ДНК хоз. Не большой и ковалентно связан с крупным фрагментом фаговой ДНК. При общей трансдукции фрагмент фага не большой, а геном бактерий упакован в капсид. Поэтому лизат, полученный при общей трансдукции содержит частицы двух типов, большая часть профаговая ДНК, а вторая небольшая часть хозяйской ДНК.
ФАГОВАЯ КОНВЕРСИЯ
Некоторые свойства бактериальных клеток, определяется только фаговыми генами, именно они проявляются в лизогенных или заряженных фагами бактериях и некогда не проявляются в штаммах свободных от фагов. Н.: клетки коринобактериум дифтерия образуют токсин только при заражении определёнными штаммами фага. Без фага токсин не образуется и клетка не может приобрести это свойство даже в результате мутаций. Некоторые типы сальмонелл образуют определенные антигенные компоненты только при заражении и их определенными фагами.
Приобретение нового свойство исключительно в результате фаговой инфекции наз. Фаговая конверсия.
Она отличается от специфической трансдукции, поскольку фаг переносит ген к-рый в норме обнаруживается в бактериальной хромосоме. Частицы фага вызывающие конверсию совершенно нормальны, т.е. Содержат все нужные гены способны осуществить все необходимые фаговые функции. При специфической трансдукции фаги обычно дефектны по н-рым функциям поскольку они утрачивают часть своего генома.
Способность генов фагов заменяться генами бактерий имея тесное филогенетическоесродство.
62. Структурні білки вібріонів. Основні властивості.
К белкам вирусов относятся белки состовляющие капсид (белковая оболочка вируса) назыв. капсомеры. Они могут быть представлены 1 либо несколькими видами белков (Пр: вирус табачной мазайки имеет 1 вид, а вирус герписа около 40). Капсомеры выполняют ф-ции:
1. Защита генома вируса,
2. Распознование рецепторных структур на поверхности кл. хозяина,
3. Слияние с мембраной кл. хозяина.
Структурные вирусные белки обозначаются Vp1,Vp2,Vp3и т.д.
Также у вибрионов есть и служебные белки, обладающие определенными функциями:
1. Ферментативная
2. работа в качестве факторов транскрипции
3. Праймирование при репликации нуклеиновой к-ты
4. Вмешательство в иммугнную р-цию хозяина.
Геномные белки также можно отнести к служебным. Они участвуют в компактизации генома. В основном эти белки имеют место у вирусов со сферическим и конусовидным типом семетрии. Обычно эти белки представлены «веретеном» вокруг которого компактизируется геномная нукл. к-та.
71.Сучасні уявлення про механізм трансформації клітин вірусом.
Вирус-генетическая теория происхождения опухолей – Зильбер 1946-60-е: вирус принимает определенное участие в трансформации кл.
Гипотезы:
1.гипотеза запуска – определяет роль в.в начальных этапах, а потом не участвует
2.теория присутствия – в. должен постоянно присутствовать для сохранения трансформации: в. геном может включиться в кл изанять определнное положение; не в геном, а продукт функционирования в., непосредственно отвечает за возникновение и поддержание трансформаций.
Вирус-индуцируемую трансформацию можно рассматривать как следствие хронической интегрированной инфекции.
Было показано, что определенную роль ирают кл факторы т определные в. несут онкогены, кл происхождения.
При онковирусной инфекции происходит не разрушение, а онкогенная трансформация, которая обусловлена онкогенными геномами кл хоз и онкогенами в. в процессе интеграции, и в дальнейшем при вырезании ДНК –провирона. Роль в. заключается в транспортировке клеточного онкогена, в такие участки клеточного генома, где он уходит из под контроля кл хоз. Происходит превращение нормальных кл в опухолевые. Включение онкогена в в. геном не только не требуется для репродукции вирусов, а даже в., содержащие онкоген явл дефектными - не способны к репродукции, не способны индуцировать опухли. Онкогены в большинстве консервативны (одинаковые последовательности). Одни и те же онковирусы могут содержать различные онкогены, в зависимости от того в какую ткань они проникли. Один и тот же онкоген вызывает трансформацию разных тканей. Эта теория объясняет полиэтиологическую природу онкогенеза, кот возникает под воздействием раз факторов. В основе онкогенеза: онкоген-онкобелок-трансформация клеток-туморогенез (образование опухоли).
Любая нормальная кл содержит латентные раковые гены – протоонкогены, они могут превращаться в онкогены. Гипотезы превращения:
1.качественные превращения – активация онкогена может происходить в результате точечной мутации в протоонкогене, Н: замена глицина на Валин
2.количественныные изменения протоонкогена – если он оказался сопряжен с сильным промоутером (участок гена, который непосредственно связан с ДНК-полимеразой), то начинается амплификация, т. е. усиленная транскрипция протоонкогена.
Стадии канцерогенеза:
1.Амплификация гена может возникнуть либо в результате его перемещения, либо в результате встраивания в соседние области сильного промоутера (промоутер как в. так и кл происхождения)
2.При взаимодействии интегрированного провируса, в. ген может захватить протоонкоген кл хоз и вместе с ним интегрировать в область клеточного генома, где происходит амплификация онкогена. Это происходит благодаря в. промоутера или сильного кл промоутера.
Транслокация протонкогена может также осуществиться и без вируса и благодаря особым генетическим структурам транспазонам – «прыгающие гены», наличие длинных концевых повторов, что позволяет им образовывать кольцевые формы – это повышает интеграцию в клеточный геном. Транспазоны – функционально важные для клетки структуры, кот перемещаясь внутри генома могут переносить нужные гены из заблокированных участков, и одновременно захват транспазонами и перенос под сильный промоутер протоонкогеных, может иметь катастрофические последствия для клетки.
Злокачественная трасформация –ошибка в деятельности транспозонов. К онкогенным в. относятся ВИЧ, Паповир, в. герпеса, аденовир.
65.Послідовність процесів, які відбуваються при вірусній інфекції.
1. Адсорбция является высокоспецифичным процессом на межмолекулярной основе (лиганд - рецепторное взаимодействие). Вирус распознаёт только определённые клеточные структуры, адсорбция только на определённых рецепторах, отсюда а) различная клиническая картина, б) выбор способа лечения - блокирование специфических рецепторов
2. Этап проникновения вируса в клетку - процесс эндоцитоза у простых вирусов, у сложных (оболочечных) продесс слияния мембран, затем формируется внутриклеточная вакуоль - рецептосома.
3. В фазе "раздевания" - депротеинизации высвобождается нуклеиновая кислота вируса. ,В цитоплазме клетки хозяина рецептосома сливается с лизосомами (там много гидролаз), эти ферменты атакуют вирионный капсид и он разрушается. Данный процесс сложный, активный - при слиянии вирионных ободочек и клеточных мембран со стороны вируса участвуют особые вирусные компоненты F-белки (белки слияния). Эти белки обеспечивают слияние вирионных оболочек и клеточных мембран, их разрушение и выход чистой нуклеиновой кислоты. Эти белки (F-белки) действуют только в кислой среде. Данный материал применительно к вопросу терапии вирусных инфекций (если на этом этапе начинать лечить, то можно защелачивать среду и дальше процесс не будет происходить - так действует римантодин). Биологический смысл депротеинизации - высвобождение генетической матрицы (генома) вируса для последующего функционирования, то есть для транскрипции и репликации. Депротеинизация может происходить в ядре (ядерные вирусы) и в цитоплазме клетки (неядерные вирусы).
4. Вирусы обладают уникальным способом размножения - дисъюнктивным - это раздельный синтез вирионных белков и нуклеиновых кислот, разобщение процессов в пространстве (ядро - цитоплазма) и во времени. Процесс "размножения" - репликации геномных молекул идёт в ядре (размножаются все ДНК-вирусы, кроме вируса натуральной оспы), в цитоплазме (все РНК-вирусы, за исключением ортомиксовирусов). Синтез вирионных белков (капсомеров) происходит в цитоплазме, формируются капсиды
5. Сборка нуклеокапсидов (сборка простых вирусов) происходит на определённых территориях (пояснить: образование виропласта, который виден в электронный микроскол, и появление внутриклеточных включений (тельца Гварниери, тельца Негри), диагносцируемых при микроскопировании поражённых клеток в световой микроскоп. (Виропласт - это те участки клетки, где происходят процессы размножения вирусов - ядро, цитоплазма). Это своеобразная "вирусная фабрика", которая локализуется в цитоплазие или ядре и включает системы, обеспечивающие синтез специфических вирусных белков и нуклеиновых кислот. Визуально им соответствуют внутриклеточные включения, видимые в световой микроскол.
6. Выход вновь синтезированных вирионов из клетки. При выходе простых вирусов клетки хозяина могут погибать, потому что клетки не воспроизводят себя, а метаболические процессы в них изменены. При выходе сложных вирусов происходит образование суперкапсида (структура вириона, состоящая из клеточных мембран - вирусспецифические белки соединены с углеводами и липидами клетки хозяина). Механизм образования: почкование нуклеокапсида через участки клеточных мембран, в которые предварительно встроены вирусспецифические белки. В цитоплазматической мембране образуются дефекты, цитоплазма вытекает, клетка хозяина погибает.
63. Будова неповністю сформованих вірусних часток. Віроїди, пріони.
Вироиды – наиболее мелкие содержащие геном вирусподобные элементы. Количество нуклеотидов в геноме 240-400. Вмроиды состоят из 1 цепи РНК с высокой степенью образования вторичной структуры. Состоит только из нуклеиновых к-т.
Первым был открыт вироид веретеновидности клубней картофеля (PSTVd) (d-указывает что это вироид). Детали их репликации до конца не выяснены, предпорложительно реплицируются по типу натяженного кольца, после чего ген копии разделяется автоматически. Вироиды некодируют структурных белков и ферменты. Общая ф-ция вироидов это сохранение постоянства в центр. области их генома (эта область считается осн. участком репликации и ответсвенна за рибозимную активность). Не известно каким образом вироид вызывает проявления симптомов и почему именно таких. Предпологают, что вироиды случайным образом выбирают кл. для репликации. Его размножение способно влиять на метаболизм кл. хозяина. Предпологают, что они имеют структурное подобие с рРНК большой субъединицей и мяРНК, что приводит к их вмешательству в процессы синтеза кл. белков и обработки ядерного генома. Также предпологают, что вироиды могут активировать различные фермены кл. Хозяина инициируя патологические проявления. Происхождение вироидов не известно, предпологают что это наиболее примитивные РНК-геномы, сохр. с времен РНК-мира. Вторая гипотеза говорит о том, что вироиды-это относительно молодой тип паразитов, возникшие в результате воздействия мутационных ферментов внешн среды.
Прионы - это инфекционные агенты состоящие только из одного сиалогликопротеина PrP 27-30. Они не содержат нуклеиновой кислоты. 
Прионные инфекции– это заболевания вызванные белками и поражающие нервную с-му с неизменно фатальным исходом. Патогенез этих заболеваний напоминает болезнь Альцгеймера. К проявлению заболевания относятся: энцефалопатия, скрепи у овец, куру у аборегенов Полинейзии, болезнь Кройтцфельдта-Якоба.
Прионный белок, обладающий аномальной трёхмерной структурой, способен прямо катализировать структурное превращение гомологичного ему нормального клеточного белка в себе подобный (прионный), присоединяясь к белку-мишени и изменяя его конформацию. Как правило, прионное состояние белка характеризуется переходом α-спиралей белка в β-складчатый лист, при накоплении таких структур в кл. они агригируются и занимают все кл. пространство, что делает невозможным передвижение кл. молекул и органоид. В конечном счете кл. гибнет, прионы распростр с 1 кл на др вызывая сущ. поражение тканей. Прионы — единственные инфекционные агенты, размножение которых происходит без участия нуклеиновых кислот.
Репликация в чистом виде отсутствует. К увеличению к-ва копий прионного белка кл. приводит присоединение PrPSc к PrPС . Объединение двухз форм приводит к сцеплению и первичной агрегации в свою очередь эти измененные формы присоед след 2 молекулы PrPС модифицируя их и агрегат насчитывает уже 4 субъединицы. В дальнейшем каждая из субъед снова взаимодейств с норм. формой агрегации продолжая расти. Согласно второй гипотезе они всегда сущ в мономерной форме, как фибриллярный белок. Соед с концами двумя молекулами норм. белка, они преабразуются в норм форму, после чего с-ма расщепл. и кажд из трех мономеров преобраз по 2 след молекул. 73.Методи мікроскопії у вивченні цтопатогенної дії вірусів.
1.может проявляться в виде равномер мелкозернистой деструкции кл (папиовирусы, в. коксаки)
2.очаговая, мелкозернистая дегенерация кл (в. гриппа, клещ энцефалит)
3.крупнозернистая равномерная деструкция кл (в. герпеса)
4.гроздевидная дегенерация кл (аденовирусы)
5.симпластообразование или слияние и нарастание кл (респират в., в. кори)
Вирус в зараженных культурах (индикация вирусов) определяют по развитию специфической дегенерации клеток, т.е. по цитопатогенному действию, обнаружению внутриклеточных включений, на основе положительных реакций гемадсорб-ции, гемагглютинации. Цитопатогенное действие вирусов и наличие внутриклеточных включений определяют при микроскопии, регистрируя соответственно морфологические изменения клеток в результате внутриклеточной репродукции вируса или скопления вирионов или отдельных их компонентов в цитоплазме и ядре клеток при специальном окрашивании. При выращивании вирусов в культуре клеток под агаровым покрытием регистрируют образование бляшек, или «негативных колоний», — светлых, по сравнению с окрашенным газоном живых клеток, пятен на месте погибших. Идентификацию вирусов проводят на основе выявления специфического антигена с помощью иммунологических методов [реакции торможения гемагглютина-ции (РТГА), связывания комплемента (РСК), нейтрализации (РН), преципитации в геле, иммунофлюоресценции] и выявления специфических фрагментов генома методом ПЦР.
67.68 Культивування вірусів у курячому ембріоні.
В вирусологии куриный эмбрион используют в основном для выделения вирусов из клинического и секционного материала, культивирования лабораторных штаммов возбудителей, приготовления диагностических препаратов и первично-трипсинизированных культуры клеток, для получения вакцин. Для выделения вирусов используют куриные эмбрионы от 5 до 12-14 дневные. Возраст, способ заражения и сроки получения максимальн. количества вирусов зависят от биологич. особенностей культивированных вирусов. Перед роботой куриные эмбрионы выдерживают в термостате при 37С и 60-70% влажности. Для пассирования лаб.штамов придерживаются изготовленной эмперично оптимальной дозы возбудителя. Перед заражением яйцо овоскопируют. Роботу проводят в стерильных условиях. Объем исследуемого материала вводимого в эмбрион 0,1-0,2 мл. Используют не меньше 4 яиц.
Заражение полости аллантоиса. Это орган выделения эмбриона, заполненный изотонической жидкостью. Макс. объем на 11-13 день. В центре тупого конца вертикально размещенного яйца над воздушным мешком прокалывают скарлупу, вводят иголку на 2-3 мм ниже граници воздушного мешка и вводят материал. Второй способ – материал вводят в боковую часть эмбриона. При этом шкарлупу прокалывают дважды. Заражение полости амниона: в ней находится тело эмбриона и вируссодержащий материал попадает в его дыхательные пути. 1 способ заражения «открытый»: над воздушной камерой прорезают оконце 1х1 см и пинцетом снимают часть хорионалантоисной оболочки над телом эмбриона. Потом глазным пинцетом подтягивают амнион и туберкулиновым шприцом вводят материал. Отверстие закрывают стерильной полиэтиленовой пленкой или часовым стеклом. 2-й способ «закрытый». Заражение проводят под контролем овоскопа. Иголку направляют на «темный глаз» глаз эмбриона, отклоняясь от центра оси яйца.
Заражение хорионалантоисной оболочки:1-й способ, над воздушным мешком вырезают кусочек шкарлупы, отслаивают оболочку из под скарлупы, на нее наносят исследуемый материал. Отверстие закрывают.2-й способ: создание искусственного воздушного мешка на боковой поверхности яйца. В указанном месте шкарлупы выпиливают щель 6-8 мм шириной- 2 мм, что бы оболочка подшкарлупой оставалась невредимой, а на тупом конце делают прокол. На оголенную оболочку наносят каплю изотонического раствора и через нее делают разрыв. На хорионалантоисную оболочку воздушного мешка наносят исследуемый материал. Отверстие заклеивают.
Заражение желточного мешка: яйцо кладут горизонтально,что бы тело было внизу а желточный мешок над ним. Иголкой делают прокол в области воздушного мешка по центральной оси, вводят материал. После заражения эмбрионы инкубируют в термостате, размещая тупым концом вверх.
70. Интерферон. Химичесике свойства и механизм действия. Клетки зараженные вирусом вырабатывают вещество которое тормозит размножение вирусов. Это вещество называется интерферон. Интерфероны – это белки с молекулярной массой от 22*10*3 до 94 * 10 * 3. Они могут вырабатываться всеми клетками организма позвоночных животных, но наиболее активно его производят клетки белой крови. При заражении клетки вирус начинает размножаться. Клетка-хозяин начинает продукцию интерферона, который выходит из клетки. Интерферон не обладает прямым противовирусным действием, он способен вызывать такие изменения в клетках, которые препятствуют размножению вируса, формированию вирусных частиц и дальнейшему его распространению. Он оказывает влияние на клетки, соседние с инфицированной, запуская в них реакции, приводящие к подавлению синтеза вирусных белков и в некоторых случаях сборки и выхода вирусных частиц. Интерферон лимитирует распространение вирусных частиц путём активации белка p53, это ведёт к апоптотической смерти инфицированной клетки. Вторым направлением действия интерферонов является стимуляция иммунной системы для борьбы с вирусами. Интерферон повышает синтез молекул главного комплекса гистосовместимости I и II классов. Некоторые виды интерферонов, например интерферон-γ, могут прямо стимулировать клетки иммунной системы, такие как макрофаги и натуральные киллеры. Для запуска их синтеза в организме необходима индукция вирусами, бактериальными токсинами, бактериальными и грибными экстрактами, синтетическими веществами. Наиболее эффективные индукторы интерферона – одноцепочечные РНК 69.Механізм розмноження вірусів, що містять плюс-ланцюг РНК.
Репликация РНК вируса табачной мозаики(+РНК) осуществляется ферментом, называемым РНК-зависимой РНК-полимеразой , закодированной в геноме вируса. Сначала этот фермент строит комплементарную цепь РНК, так называемую минус-цепь (она не кодирует белки в отличие от вирусной РНК, кодирующей белки и поэтому называемой плюс-цепью), а затем по ней, как по матрице, синтезирует множество вирусных РНК.
Пикорна-, калици-, астро-, тога- и флавивирусы реплицируются наиболее коротким путем: их (+)РНК геном функционирует непосредственно как мРНК.
Геномы пикорна- и флавивирусов функционируют как единая полицистронная мРНК, транслирующаяся прямо в единый полипротеин, который впоследствии расщепляется с образованием индивидуальных структурных и неструктурных белков. Одним из них является РНК-зависимая РНК-полимераза, которая реплицирует вирусный геном. Вирусная (+)РНК транскрибируется в комплиментарную (—)РНК-копию, которая служит матрицей для синтеза новых цепей (+)РНК (рис. 6), или может использоваться в качестве мРНК-матриц для синтеза новых минус-цепей и геномной РНК вирусного потомства.
Тога-, корона- и калицивирусы отличаются от пикорнавирусов тем, что на начальном этапе инфекции экспрессируется лишь часть геномной РНК с образованием белков. Последние осуществляют синтез минус-цепи, являющейся матрицей для синтеза различных по размеру классов молекул плюс-РНК. Полипротеины, образующиеся на коротких молекулах мРНК, расщепляются на структурные вирионные белки. Полноразмерные плюс-РНК упаковываются в вирионы.
У тогавирусов транслируется только около 2/3 вирусной РНК (5' -конец); образующийся полипротеин расщепляется на неструктурные белки, которые необходимы для транскрипции и репликации РНК. Вирусная РНК-полимераза синтезирует полноразмерную (—)РНК, на которой затем синтезируются два вида (+)РНК: полноразмерная вирионная РНК, предназначенная для включения в вирионы, и РНК, длина которой равна 1/3, и которая является колинеарной с 3'-концом вирусной РНК и транслируется в полипротеин, который расщепляется на структурные белки. У калицивирусов образуются полигеномные и субгеномные мРНК.
Корона- и артеривирусы демонстрируют необычную стратегию транскрипции: первоначально часть вирионной (+) РНК функционирует как мРНК и транслируется с образованием РНК-полимеразы, которая затем синтезирует полногеномную (—)РНК. На этой (—)РНК транскрибируется гнездо субгеномных мРНК с общими 3'-концами. Транслируются только 5'-концевые последовательности каждого члена этого гнезда транскриптов.
Главным отличием вирусов с позитивным геномом является их способность синтезировать ферменты, ответственные за репликацию вирусного генома. Поэтому РНК, выделенная из таких вирусов, инфекционна. Второе отличие состоит в монолитности вирусного генома. Поэтому первичный продукт трансляции обеих РНК (геномной и мРНК) представляет собой единый белок, который в дальнейшем расщепляется на индивидуальные вирусные белки (в том числе структурные).
72. Некоторые фаги используют для выживания только одну линию поведения. Инфицируя чувствительную бактерию, они нарушают ее функции, с тем чтобы обеспечить образование большого числа фаговых частиц-потомков. В результате такой литической инфекции бактерия-хозяин погибает. В процессе типичного литического цикла фаговая ДНК (или РНК) проникает в клетку бактерии-хозяина, ее гены транскрибируются в установленном
порядке, генетический материал фага реплицируется, и в результате образуются белковые компоненты фаговых частиц. В конечном счете бактериальная клетка разрушается (лизируется), освобождая зрелые частицы фагового потомства.
Однако есть и такие фаги, для которых характерны две формы существования. Они способны воспроизводить себя путем такого же литического цикла, с помощью
которого обеспечивается быстрое образование большого числа копий фаговых частиц. Однако развитие этих фагов может пойти и по другому пути. В этом случае фаговый геном находится в бактериальной клетке в латентной форме, называемой профагом. Такое состояние получило название лизогения. В лизогенных бактериях профаг интегрирован с бактериальным геномом и наследуется, как любая другая его часть, тем же способом, как и бактериальные гены. Благодаря наличию профага лизогенная бактерия обладает иммунитетом против инфицирования другими фаговыми частицами того же типа. Поэтому в бактериальном геноме обычно содержится только одна копия профага любого определенного типа.
Переходы между лизогенным и литическим способами существования могут происходить в любом направлении. Если фаг, образованный в литическом цикле, проникает в клетку новой бактерии-хозяина, он может либо повторить литический цикл, либо перейти в лизогенное состояние. Выбор зависит от условий инфекции и генотипов фага и бактерии. Профаг может быть выведен из лизогенного состояния с помощью процесса, названного индукцией. В этом случае он исключается из бактериального генома и образует свободную фаговую ДНК, которая затем прохбдит через литический путь развития.
Другой тип существования в бактериальной клетке представлен плазмидами. Это автономные элементы, геномы которых существуют в клетке как внехромосомные единицы. Плазмиды-это самореплицирующиеся кольцевые молекулы ДНК, которые сохраняются в клетке стабильно и в характерном для каждого типа плазмид числе копий; иными словами, число их остается постоянным из поколения в поколение.
76. Культивування вірусів в первинно-трипсонізованих культурах.
Первично трисонизированные культуры - получают из эмбриональной ткани (куриных эмбрионов),из кл. печени и почек обезьян и т.д.
Измельченную ткань 2—3 раза отмывают раствором Хенкса от слизи и кровяных элементов до получения прозрачных сливных вод и переносят в колбу для трипсинизации. В колбу наливают 0,15%-ный раствор трипсина, подогретого до 35-37 0С (соотношение ткани и трипсина 1:3), вносят стерильный магнитик и ставят на магнитную мешалку.
Трипсинизацию проводят дробно, т. е. через каждые 3—5 мин отделившиеся клетки вместе с трипсином сливают в центрифужные флаконы и помещают на лед или в холодильник для прекращения действия трипсина на клетки. К оставшемуся в колбе содержимому добавляют новую порцию трипсина. Скорость вращения на магнитной мешалке регулируют так, чтобы не было пены. Процесс повторяют несколько раз (3-5) до полного истощения ткани. После трипсинизации суспензию клеток в растворе трипсина центрифугируют при  1000 мин-1 10 мин, надосадочную жидкость сливают (выбрасывают), а осадок клеток ресуспендируют в теплой (37 °С) питательной  среде (в заведомо известном объеме) и фильтруют через 3-слойный марлевый фильтр.  После тщательного перемешивания клеток берут 1 мл для подсчета клеток. 
Успех культивирования клеток в значительной степени зависит от посевной дозы. При малом количестве клеток не наблюдается образование монослоя даже при длительном культивировании. При слишком большой дозе клеток происходит интенсивная их пролиферация, и образованный слой клеток значительно раньше подвергается старению и неспецифической дегенерации.
71. Сучасні уявлення про механізм трансформації клітин вірусом.
Трансформуючий ефект вірусу залежить від його виду, виду
клітин і умов культивування. В нормальних
клітинах цей процес контролюється двома класами генів,
мутації яких знаходяться в основі пухлинного переродження. До
них належать гени, які стимулюють клітинний поділ;
гіперактивність цих генів може викликати злоякісну
трансформацію. Проте в клітинах існують гени, які пригнічують
клітинний поділ; ≪виключення≫ цих генів теж може призвести
до злоякісної трансформації. Віруси здатні індукувати
утворення пухлин шляхом порушення нормального
функціонування цих генів.
Наслідок цього на клітинному рівні - це не лише
прискорення проліферації, але й порушення соціальної
поведінки. Трансформовані клітини звичайно не розпластовуються на
субстраті, а сполучаються з ним лише відростками. На відміну
від нормальних клітин, вони здатні ділитися без будь-якого
контакту з твердим субстратом. Відповідно субстрат і клітинне
оточення втрачають своє лімітуюче значення. Для позначення
цього явища вживають термін - втрата контактного
гальмування.
Ділянка вірусного геному, що зумовлює злоякісну
трансформацію називається онкоген. Дослідження вірусних онкогенів
показало, що у всіх клітинах є їх гомологи (так звані
проонкогени), які зазвичай знаходяться в інактивованому стані.
Доведено, що онкогени ретровірусів походять із клітинних
протоонкогенів у результаті їхнього випадкового входження до
вірусного геному; вони не потрібні цим вірусам для їх
існування. Онкогени ДНК-вмісних вірусів також, очевидно, походять із
клітинних генів, що мають відношення до регуляції клітинного
поділу, але перетворились у дійсні вірусні гени в процесі
еволюції. Перший онкоген був виявлений у геномі вірусу Рауса і позначений як v-src. Пізніше онкогени були знайдені й у
багатьох інших онкогенних вірусів, здатних трансформувати клітини в культурі - у папілома-, поліома-, адено- і ретровірусів. На противагу цим генам у клітинах є гени-супресори. Це
гени, продукти яких беруть участь у негативному контролі
клітинного поділу, чим перешкоджають пухлинній
трансформації клітин. На сьогодні відомо близько десятка таких генів. Найбільш вивчені гени білка р53 і Rb (ген
ретинобластоми). Існують також віруси, які можуть використовуватися з метою
інактивації онкогенного потенціалу деяких вірусів. У 2005 році учені з медичного коледжу Пенсільванського університету під час дослідження аденоасоційованого вірусу типу 2 (AAV-2), який міститься в організмі у 80 % людей, виявили здатність цього вірусу викликати загибель різних типів ракових клітин.
75. Особливості будови спірального капсида вірусов.
Капсид-белковая оболочка защищ. вирусный геном. Дополнит ф-ция: распознование хозяина. Выделяют 5 типов симметрии капсидов: икосаэдрический, палочковидный, конусовидный, спиральный и сложный.
Капсид со спиральным типом второй по распространенности типов среди вирусов, характерен для РНК-содерж. вирусов, чаще с одноцепочечным геном. Капсомеры представлены единым видом белка. Связи между белковыми молоекулами очень слабые, они стабилизируются связью с геномной нукл. к-той. Размер капсомера зависит от размера генома. чаще геном представлен одной нить и капсид следовательно один. Если геном сегментирован то и капсид кратен сегментам. Внутри капсида сформирована незаполненная полость.
61. Идентификация вирусов в живой системе. Методы идентификации вирусов можно сгруппировать в 4 группы: выявление вирионов, вирусной инфекционности, вирусных антигенов и вирусных н.к. Виявлення віріонів проводять з використанням електронної
мікроскопії. Цей метод дає можливість виявити віріони, проте він
недостатньо специфічний, оскільки багато вірусів мають
подібну морфологію, а мінімальна концентрація віріонів,
необхідна для виявлення, повинна складати не менше 10б/мл. Для виявлення інфекційності вірусів досліджувані зразки
інокулюють у культуру клітин чи організм, які можуть
підтримувати реплікацію визначеного вірусу. Після інкубації
культури її досліджують
методом світлової мікроскопії для виявлення змін, які б
свідчили про пошкодження. Зміни називаються ЦПЕ або ЦПД віруса і можуть проявлятися у
вигляді таких змін:
деструкція клітин; дегенерація клітин; утворення включень всередині клітини нехарактерних для
нормальної життєдіяльності клітин. Активність вірусу визначають шляхом визначення кількості
вірусовмісного матеріалу, який потрібен, щоб викликати
специфічну реакцію. Кількісне вираження активності називають
титруванням.
Інфекційною одиницею (ІО) називають найменшу кількість
вірусу, яка здатна викликати специфічну клітинну відповідь.
Часто ознаки присутності
вірусу в організмі бувають малоснецифічними, тобто видно, що
вірус є (можна провести індикацію вірусу), але не можна зробити
висновок про те, який саме це вірус (не можна провести
ідентифікацію збудника).
Вірусні антигени можуть бути виявлені, використовуючи
вірусоспецифічні антисироватки або моноклональні антитіла.
Для виявлення у досліджуваному матеріалі як специфічних
антитіл, так і вірусних агентів можуть бути використані усі
відомі серологічні реакції: реакція зв’язування комплементу; реакція пасивної гемаглютинації; реакція гальмування гемаглютинації;реакція гемаглютинації імунного прилипання (комплекс
антиген+антитіло в присутності комплементу адсорбується
на еритроцитах); реакція преципітації у гелі; реакції нейтралізації вірусів; радіоімунний метод;
методи имуноферментного аналізу;
Метод шуноферментного аналізу (ІФЛ),
відрізняється високою специфічністю та зручністю у
використанні. Наприклад, для ідентифікації ВІЛ використовують імуно-
ферментний аналіз, який заснований на
специфічній реакції
Иммунофнрментный анализ – основан на взаимодействии специфических противовирусных Ат из сыворотки с диагностическими компанентами тест-системы. При специфическом взаимодействии Ат с Аг происходит их необратимое связывание, после этого проводят отмывание с-мы. Далее добавляют Ат с меткой и активными центрами против Fc-ферментов сывороточных Ат необратимо связываются, проводят еще одно отмывание. На последнем этапе вносят хромоген. Если Ат сыворотки не были специфичны к Аг то связывание не произойдет и цветная р-ция не будет.
Метод иммунофлуоресценции во многом подобин иммуноферментному, но меткой служат ФИТЦ (флюоресентизотиоционат) Флюорохром начинает светится при взаимодействии с УФ-светом.
Идщентификация Аг еще осущ.с помощью иммуноблотинга, коорый проводится по результатам предварительного фракционирования вирусных белков, методом электрофореза. Этот метод используется для проверки +результатов ИФА или иммунофлюорисцентного анализа. Метод молекулярной гибридизации проводят для определения вирнусоспецифических н.к. он позволяет определить лаже еденичные копии геномов и отдельных генов. ДНК метится радиоактивными метками. В случае если в системе обнаружена комплиментарная вирусная последовательность то происходит гибрнидизация цепи. Для выявления н.к. используется засвечивание фотопленки, что позволяет определить степень гибридизации цепей. Обычно, исследованные ДНК адсорбируют на каком-либо носителе.
Полимеразная цепная р-ция (ПЦР)- суть в том, что бы накопить большое к-во вирусных геномов, а потом определить их соответствие к опред образцу. Недостатком явл, то, что он давольно однородный, рассчитан на ДНК-содерж вирусы, а РНК вирусы должны быть переписаны в ДНК форму.

Приложенные файлы

  • docx 8853070
    Размер файла: 45 kB Загрузок: 0

Добавить комментарий