Гематология (практика)

Изучение и проведение противоэпидемических мероприятний санэпидрежима при проведении гем. исследований. Подготовка рабочего места для забора капиллярной крови. Забор капиллярной крови

Медперсонал должен неукоснительно соблюдать меры индивидуальной защиты:
Взятие крови у пациентов необходимо производить в латексных перчатках, при повышенной опасности заражения в двух парах перчаток.
Использовать маски, очки, экраны.
Осторожно обращаться с острым медицинским инструментарием.
Для дезинфекции острых инструментов использовать твердые контейнеры.
Собирать упавшие на пол иглы магнитом, щеткой и совком.
Микротравмы на руках закрывать лейкопластырем.
До и во время работы следует проверять, не пропускают ли перчатки влагу, нет ли в них повреждений.
Поврежденные перчатки немедленно заменять.
После снятия перчаток замочить их в дезрастворе на 1 час, руки вымыть с мылом в вытереть индивидуальным полотенцем.
Снимать перчатки осторожно, чтобы не загрязнить руки
Никогда не принимать пищу на рабочем месте, где может оказаться кровь или отделяемое пациента
Сделать прививку против гепатита В
Для защиты слизистых оболочек ротовой полости и носа применять маску

Использовать барьерные средства защиты необходимо не только при работе и инфицированными пациентами, каждый пациент считается потенциально опасным в отношении инфекционных заболеваний.

Рабочий стол:
Емкость «Отходы класса А»
Емкость «Сброс использованных скарификаторов» Отходы класса Б
Емкость «Сброс ваты» Отходы класса Б
Емкость «Все остальное» Отходы класса Б
Емкость «Для стекол» Отходы класса Б
Емкость «Для использованных перчаток» Отходы класса Б
Емкость «Для использованной посуды» Отходы класса Б
Писчие принадлежности (ручка, маркер, карандаш)
Пробирки микроветы
Спиртовые ватные шарики (70%)
Сухие стерильные ватные шарики
Штатив для пробирок
Скарификаторы
Чистые (стерильные) стекла для мазков крови
Шлифованные стекла для приготовления мазков крови
Штатив с пробирками и капиллярами для СОЭ
Запасные перчатки
Нашатырный спирт

Взятие капиллярной крови

Оснащение: дезраствор, средства индивидуальной защиты, спиртовые ватные шарики, сухие стерильные ватные шарики, скарификаторы, пробирки микроветы для забора капиллярной крови с К3ЭДТА, бланки общего анализа крови.
Реактивы: 70% этанол.
Алгоритм действий:
Надеть перчатки и протереть их стерильным тампоном, смоченным 70% этанолом.
Зафиксировать палец пациента, взяв его за крайнюю фалангу большим и указательным пальцем левой руки.
Место прокола протереть стерильным тампоном, смоченным 70% этанолом 2 раза.
Место прокола протереть стерильным сухим тампоном насухо.
Скарификатор плотно зажать между большим и указательным пальцем правой руки.
Слегка сдавить ногтевую фалангу пальца больного.
Четким и резким движением сделать прокол перпендикулярно рисунку кожных линий пальца.
Первую каплю крови удалить стерильным сухим ватным тампоном.
Взять кровь капилляром
Заполнить капилляр до конца
Перенести кровь в пробирку
Удалить капилляр
Закрыть пробирку крышкой
Тщательно перемешать
К месту прокола приложить ватный тампон, смоченный 70% этиловым спиртом, а обследуемому предложить прижать палец к ладони, чтобы остановить кровотечение (удалить вату можно через 5 минут).
Протереть перчатки стерильным ватным тампоном, смоченным 70% этанолом.

Взятие капиллярной крови самотеком:

Надеть перчатки и протереть их стерильным тампоном, смоченным 70% этанолом.
Зафиксировать палец пациента, взяв его за крайнюю фалангу большим и указательным пальцем левой руки.
Место прокола протереть стерильным тампоном, смоченным 70% этанолом 2 раза.
Место прокола протереть стерильным сухим тампоном насухо.
Скарификатор плотно зажать между большим и указательным пальцем правой руки.
Слегка сдавить ногтевую фалангу пальца больного.
Четким и резким движением сделать прокол перпендикулярно рисунку кожных линий пальца.
Первую каплю крови удалить стерильным сухим ватным тампоном
Снять крышку и переместить ее на донышко.
Взять кровь, через кромку, до метки
Закрыть пробирку крышкой.
Тщательно перемешать.
К месту прокола приложить ватный тампон, смоченный 70% этиловым спиртом, а обследуемому предложить прижать палец к ладони, чтобы остановить кровотечение (удалить вату можно через 5 минут).
Протереть перчатки стерильным тампоном, смоченным 70% этанолом.




Подготовка рабочего места для проведения общего анализа крови
Определение гемоглобина
Подсчет эритроцитов

Определение гемоглобина крови гемиглобинцианидным методом

Оснащение: дезраствор, средства индивидуальной защиты, ФЭК, «Микролаб-540», дозаторы на 0,02 мл и на 5 мл, пробирки, мерная колба на 1 л, исследуемый материал, бланки общего анализа крови.
Реактивы: Трансформирующий раствор: ацетонциангидрин 0,5 мл, калий железосинеродистый (красная кровяная соль) 200 мг, натрий двууглекислый (бикарбонат натрия) 1 г, дистиллированная вода до 1 л. Стабилен при хранении в посуде из темного стекла при комнатной температуре в течение нескольких месяцев.
Калибровочный раствор гемиглобинцианида. В качестве калибровочного раствора могут применяться стандартные растворы гемиглобинцианида или сухие навески гемоглобина. В последнем случае калибровочный раствор готовят по инструкции.
В настоящее время клинико-диагностические лаборатории для определения концентрации гемоглобина пользуются готовыми наборами реагентов.

Алгоритм действий:
Вариант 1: измерение на ФЭКе
В сухие чистые пробирки отмерить 5,0 мл трансформирующего раствора. Опытная и холостая пробы.
Внести в опытную пробирку с трансформирующим раствором 0,02 мл крови.
Содержимое опытной пробы тщательно перемешать.
Оставить стоять при комнатной температуре 10 минут.
Произвести измерение на ФЭКе, при длине волны 500-560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 1 см против холостой пробы.
Измерить стандартный раствор, при тех же условиях.
Расчет содержания гемоглобина произвести по формуле

Hb = Eопх С х К х 0.01 (г/л)
Eст
где, Еоп экстинкция опытной пробы, Ест экстинкция стандартного раствора, С концентрация гемиглобинцианида в стандартном растворе, К коэффициент разведения крови (251), 0,01 коэффициент пересчета мг % в г/л.
Полученный результат занести в бланк исследования.

Вариант 2: измерение на «Микролаб-540»
В сухие чистые пробирки отмерить 5,0 мл трансформирущего раствора. Опытная и холостая пробы.
Внести в опытную пробирку с трансформирующим раствором 0,02 мл крови.
Содержимое опытной пробы тщательно перемешать
Оставить стоять при комнатной температуре 10 минут.
Включить прибор.
Выбрать нужное измерение.
Произвести измерение холостой пробы.
Произвести измерение опытной пробы.
Полученный результат занести в бланк исследования.

Подсчет количества эритроцитов в счетной камере

Принцип метода. В строго определенном объеме камеры подсчитывают под микроскопом клеточные элементы, а затем производят пересчет полученного результата на 1 л крови.
Оснащение: дезраствор, средства индивидуальной защиты, микроскоп, камера Горяева, пробирки, дозаторы на 4,0 мл и 0,02 мл, исследуемый материал, бланки общего анализа крови.
Реактивы: 9 г/л (0,9%) раствор хлорида натрия.
Алгоритм действий:
В сухую чистую пробирку отмерить 4 мл изотонического раствора хлорида натрия.
Внести в опытную пробирку с изотоническим раствором хлорида натрия 0,02 мл крови.
Содержимое пробирки перемешать и оставить стоять до момента счета.
Подготовить камеру Горяева для подсчета эритроцитов.
Перед заполнением камеры содержимое пробирки еще раз перемешать.
Пастеровской пипеткой или дозатором нанести каплю разведенной крови на среднюю пластинку камеры у края покровного стекла. Проверить равномерность растекания капли, отсутствие пузырьков воздуха.
Положить камеру на стол на 1-2 мин, пока движение жидкости в ней не прекратится, и эритроциты не осядут.
Включить микроскоп.
Посчитать эритроциты при малом увеличении микроскопа (объектив 8, окуляр 10 или 15, конденсор опущен, диафрагма прикрыта) в 5 больших расчерченных квадратах, расположенных по диагонали.
Расчет количества эритроцитов одном мкл крови произвести по формуле:
Х = а * 4 000 * 200
80
где Х количество эритроцитов в 1 мкл крови, а сумма сосчитанных эритроцитов, 4000 множитель, приводящий результат к 1 мкл крови, так как объем малого квадрата равен 1/4000 мкл, 200 разведение крови.
После проведения арифметического действия формула упрощается:
Х = а * 10 000.
Таким образом, количество эритроцитов в одном литре крови:
Х = а * 10 000 * 106 = а * 1012/л

Определение количества лейкоцитов

Алгоритм определения лейкоцитов крови в камере горяева:
В сухую чистую пробирку отмеряют 0,4 мл 3% уксусной кислоты, подкрашенной метиленовым синим или генцианвиолеттом.
Дозатором набирают 0,02 мл крови.
Вносят данную кровь на дно пробирки с 0,4 мл 3% уксусной кислоты (разведение в 20 раз).
Содержимое пробирки перемешивают и оставляют стоять до момента счета.
Готовят камеру Горяева, притирая шлифованное стекло до радужных колец.
Перед заполнением содержимое пробирки перемешивают несколько раз, вращая пробирку между ладонями.
Концом круглой стеклянной палочки или пастеровской пипеткой наносят каплю разведенной крови на среднюю пластинку камеры у края покровного стекла.
Проверяют равномерность растекания капли, отсутствие пузырьков воздуха.
Перед подсчетом камера лежит на столе 1-2 минуты, пока движение жидкости в ней не прекратится, и лейкоциты не осядут.
Подсчитывают лейкоциты при малом увеличении микроскопа (объектив 8, окуляр 10 или 15, конденсор опущен, диафрагма прикрыта) в 100 больших квадратах, сгруппированных по четыре.
Расчет общего количества лейкоцитов проводят по формуле:
Х = а * 20/100 * b,
где Х число лейкоцитов в 1 мл крови
a число посчитанных лейкоцитов
b объем одного большого квадрата (4,0 х 10-3 мкл)
20 разведение крови
100 число больших квадратов, в которых производится счет.
Введя в эту формулу значения объема одного большого квадрата, получим:
Х = а * 20 / 100 * (4 * 10-3) и а * 20 / 400 * 10-3 = а * 50 / мкл.
Таким образом, количество лейкоцитов в 1 мкл равно числу клеток, посчитанных в 100 больших квадратах, умноженному на 50:
Х = а * 50 / мкл
Отсюда количество лейкоцитов в одном литре крови:
Х = а * 50 * 106 / л
Полученные результаты заносят в бланк исследования.

2 способ:
Автоматические гематологические анализаторы. Лейкоциты (WBC White Blood Cells, белые кровяные клетки).

Нормы лейкоцитов в периферической крови. Клинико-диагностическое значение.

В крови взрослого человека лейкоцитов содержится в 1000 раз меньше, чем эритроцитов и в среднем их количество составляет 4-9*109/л. У детей в возрасте 1-3 лет количество лейкоцитов в крови колеблется в пределах 6,0-17,0*109/л, а в 6-10 лет в пределах 6,0-11,0*109/л.
Поскольку число лейкоцитов в крови отражает состояние защитных сил организма, этот показатель интересует врачей всех специальностей. У здорового человека число лейкоцитов в крови непостоянно. После тяжелой физической работы, приема горячей ванны, у женщин в период беременности, в процессе родов и перед началом менструации оно увеличивается. Это же происходит после приема пищи. Поэтому, чтобы результаты анализа были объективными, его нужно сдавать натощак, утром, не завтракать, можно выпить только стакан воды.
Увеличение общего абсолютного количества лейкоцитов в единице объема выше верхней границы нормы называется абсолютным лейкоцитозом, а уменьшение ее ниже нижней границы абсолютная лейкопения.

Индексы красной крови. Цветовой показатель (ЦП) и содержание гемоглобина в одном эритроците (СГЕ). Расчет. Нормы. Диагностическое значение изменения ЦП и СГЕ.

Цветовой показатель (ЦП) отражает относительное содержание гемоглобина в эритроцитах. Этот индекс вычисляют по формуле:
ЦП = Hb в г/л * 0,3
две первые цифры числа эритроцитов в миллионах

Пример расчета. Концентрация гемоглобина 120 г/л, количество эритроцитов 3,6-1012 /л (3,6 миллионов в 1 мкл).
ЦП = 120 * 0,3 = 1,0
36

Нормальная величина цветового показателя: от 0,9 до 1,1.
ЦП менее 0,85 свидетельствует о гипохромии, 0,9-1,1 нормохромии, более 1,15 гиперхромии.
В мазках периферической крови эритроциты при окраске в большей степени воспринимают кислые красители. Поэтому под микроскопом эти клетки воспроизводят оттенки розового цвета, что и обозначается термином нормохромия. Вместе с тем, в одном и том же мазке крови можно увидеть эритроциты разной окраски анизохромия. Уменьшение интенсивности цвета большей части клеток в поле зрения микроскопа называется гипохромией, а увеличение гиперхромией. Первый вариант анизохромии, т. е. гипохромия, связан с уменьшением содержания гемоглобина в эритроците, второй, гиперхромия с увеличением содержания гемоглобина в эритроците.
Снижение величины ЦП ниже нормы может быть выявлено при хронической постгеморрагической и железодефицитной анемиях. Повышенные значения отмечаются, главным образом, при мегалобластных анемиях.
В последнее время, наряду с ЦП расчитывают более достоверную величину среднее содержание гемоглобина в одном эритроците СГЕ. Выражается в пикограммах (пг). 1 грамм равен 1012 пг. Этот показатель вычисляется путем деления концентрации гемоглобина в 1 литре на число эритроцитов в том же объеме крови.

Пример. Концентрация гемоглобна 150 г/л, количество эритроцитов 5-1012/л. 150 г/л = 150-1012 пг/л. Среднее содержание гемоглобина в одном эритроците равно:
150 * 1012 = 150 = 30 пг
5 * 1012 5
Практически среднее содержание гемоглобина в одном эритроците рассчитывают по формуле:
гемоглобин г/л
число эритроцитов в литре
В норме среднее содержание гемоглобина в одном эритроците у взрослых колеблется от 27 до 33,3 пг.
Изменение данного показателя наблюдается параллельно с изменением цветового показателя. Величина ниже нормы (гипохромия) свидетельствует о нарушении синтеза гемоглобина в организме. Увеличение его зависит исключительно от увеличения объема эритроцитов, а не от повышенного насыщения их гемоглобином.

Скорость оседания эритроцитов

Тесть СОЭ является неспецифическим, так как на его величину влияет очень много факторов. Главными из них являются качественные и количественные изменения белков крови:
Увеличение содержания крупнодисперсных белков (фибриногена, глобулинов) ведет к повышению СОЭ
Уменьшение их содержания, увеличение содержания мелкодисперсных белков (альбуминов) к ее снижению.

Определение скорости оседания эритроцитов по методу Панченкова

Оснащение: дезраствор, средства индивидуальной защиты, пробирки, резиновая груша, аппарат Панченкова, состоящий из штатива и специальных капилляров, исследуемый материал, бланки общего анализа крови.
Реактивы: 50 г/л водный раствор трехзамещенного цитрата натрия.
Алгоритм действий:
Капилляр Панченкова промыть раствором цитрата натрия.
Набрать раствор цитрата до метки «Р» и выдуть на дно пробирки.
Тем же капилляром набирать 2 раза кровь из пальца сплошным столбиком, без пузырьков воздуха до метки «К» и внести ее в пробирку с отмеренным раствором цитрата натрия (разведение 1:4).
Тщательно перемешать кровь с цитратом натрия.
Набирать смесь до метки «О» без пузырьков воздуха.
Капилляр установить в штатив в вертикальном положении.
Отметить время установки капилляра.
Величину оседания, определить по столбику плазмы над осевшими эритроцитами через 1 час.
Ответ записать как величину СОЭ в миллиметрах в час (мм/ч) в бланк исследования.

Обработка предметных стекол для приготовления мазка крови

Стекла, бывшие в употреблении замачивают в 2% растворе хозяйственного мыла или стирального порошка (20 г порошка растворяют в 975 мл воды и добавляют 20 мл пергидроля) в эмалированной посуде на 8-10 ч. Старый мазок удаляют ватным тампоном и кипятят стекла в этом же растворе 5-10 минут. Кипячение более 10 минут и использование алюминиевой посуды приводят к помутнению стекол. Затем стекла промывают в проточной воде, насухо вытирают и выборочно проверяют полноту отмывки от щелочных добавок, моющих средств с помощью спиртового раствора фенолфталеина (1 г/л) путем нанесения 2-3 капель на стекло (розовое окрашивание не должно появляться). Отмытые стекла помещают на 30-60 минут в смесь Никифорова (этиловый спирт 96% и диэтиловый эфир в соотношении 1:1), по мере необходимости стекла извлекают пинцетом и протирают тряпочкой (шелковым трикотажем) насухо.
Новые стекла промывают проточной водой, затем на 2-3 дня помещают в банку со смесью Никифорова.

Техника приготовления мазка крови для подсчета лейкоцитарной формулы

Мазки крови приготовляют на чистых обезжиренных стеклах, пользуясь шлифованными предметными или покровными стеклами. Край этих стекол должен быть уже поверхности предметного стекла, на котором готовят мазки.
Взяв предметное стекло, с находящейся на расстоянии 1-1,5 с от края стекла каплей крови (1), в левую руку, располагают его между I пальцем с одной стороны и II и III пальцами с другой так, чтобы капля крови оказалась сверху и справа.
Шлифованное предметное или покровное стекло располагают слева от капли под углом 45 градусов, держа его I и II пальцами правой руки так, чтобы кончики пальцев касались его длинных ребер.
Продвигают стекло вправо до соприкосновения с каплей крови и тем самым способствуют распределению крови между стеклами.
Когда вся кровь распределится между стеклами, достаточно быстро, спокойно и не надавливая продвигают стекло влево до тех пор, пока капля крови не будет исчерпана. Правильно сделанный мазок имеет равномерную толщину, желтоватый цвет, просвечивает и на конце заканчивается «метелочкой». Он занимает не более ѕ и не менее Ѕ длины предметного стекла. Это достигается распределением капли крови, размер которой в диаметре 2-3 мм.
Приготовленный мазок подсушивают на воздухе.
После высыхания на поверхности мазка, ближе к началу, углом предметного стекла или простым карандашом надписывают фамилию больного или его регистрационный номер и дату.
Из крови каждого больного готовят не менее двух мазков.

Фиксация мазков

Фиксация мазков предохраняет форменные элементы крови от воздействия содержащейся в красках воды, под влиянием которой в нефиксированных препаратах происходит гемолиз эритроцитов и изменяется морфология лейкоцитов. Фиксатор также вызывает коагуляцию белков и закрепляет мазок на стекле.
Наилучшими фиксаторами является раствор эозинметиленового синего по Маю-Грюнвальду. При его отсутствии используют этиловый спирт 96% (время фиксации 30 минут), смесь Никифорова (20 минут).
Сухие мазки опускают в широкогорлую банку с фиксатором на необходимое для фиксации время. Затем извлекают пинцетом и высушивают на воздухе. При этом необходимо следить, чтобы поверхности стекол с мазками не соприкасались друг с другом. Фиксацию мазков можно проводить и в специальных контейнерах, опуская их в кювету с фиксатором.

Окраска по Романовскому-Гимзе

Для окраски мазков крови всегда используют свежеприготовленный рабочий раствор краски. Для разведения лучше всего пользоваться фосфатным буфером. Фиксированные сухие мазки помещают в контейнер, который опускают в кювету с рабочим раствором красителя и выдерживают в нем строго определенное время, подобранное для каждой партии, краски, - от 20 до 40 минут. Затем контейнер переносят в кювету с водопроводной водой, после чего мазки ставят вертикально в штатив для сушки. При отсутствии штатива-контейнера высушенные мазки красят на «рельсах», заливая мазок рабочим раствором красителя возможно более высоким слоем (3-4 мл на мазок).

Критерии правильности окраски мазка крови при использовании любого метода окрашивания: эозинофильные гранулы розово-оранжевого цвета, эритроциты светло-розовые, нейтрофильная зернистость мелкая фиолетовая.
В последние годы широко используется автоматическая окраска мазков крови и костного мозга с помощи специальных аппаратов («Нематек» фирмы «Амес» США и др.). Автоматическое дозирование красителей и буферных растворов обеспечивает стандартную и равномерную окраску.

Подсчет лейкоцитарной формулы

Окрашенный мазок крови микроскопируют с иммерсионной системой (используют окуляр 7 или 10 и объектив 90, конденсор поднимают до упора, диафрагму открывают, на мазок наносят каплю иммерсионного масла, объектив погружают в него до соприкосновения с препаратом).
Под контролем глаза медленным осторожным движением макровинта поднимают тубус до получения с препаратом.
Четкости его добиваются с помощью микровинта.
Считают все встречающиеся лейкоциты, дифференцируя их по видам. Всего сосчитывают 200 клеток (регистрация лейкоцитов во время подсчета производится с помощью счетчика лабораторного; за суммой лаборант может не следить, так как, когда будет подсчитано 100 и 200 клеток раздастся звонок).
Наиболее употребительный метод подсчета:
по верхнему и нижнему краю мазка сосчитывают по 100 клеток, двигая его по ломаной линии «МЕАНДРА»
просмотрев 5-6 полей зрения по краю, мазок передвигают на 5-6 полей зрения к середине стекла, а затем в сторону на столько же и возвращаются к краю.
Снова просматривают край и т. д.
Второй способ подсчета:
считают клетки в начале мазка от края до края поперек него
затем 5-6 полей зрения по краю
снова поперек мазка
затем по противоположному краю и т. д.
После подсчета (подсчитывают число лейкоцитов каждого вида и делят на 2, чтобы получить количество их относительно 100 клеток, т. е. процентное соотношение), записывают в бланк исследования.
Сравнивают полученный результат с нормальными показателями лейкоцитарной формулы.
Для подсчета следующей лейкоцитарной формулы, цифры на счетчике надо сбросить до появления во всех смотровых окнах нулей.

Принцип морфологической дифференциации клеток крови в окрашенных препаратах

При дифференциации кровяных клеток в окрашенных препаратах имеют значение следующие морфологические признаки:
Величина и форма клетки
Ядерно-цитоплазматическое отношение
Форма и хроматиновое строение ядра
Наличие или отсутствие нуклеол в ядре, их число и величина
Цвет и структура цитоплазмы
Наличие в цитоплазме зернистости (величина, форма, цвет), вакуолей и фагоцитированных элементов.

Величина кровяных клеток подвергается значительным индивидуальным колебаниям. Молодые клетки преимущественно крупнее зрелых. Форма клеток чаще круглая, реже неправильная. Изменения формы в ряде случаев имеют диагностическое значение, например изменения формы эритроцитов (пойкилоцитоз, сфероцитоз, овалоцитоз и т. д.).
Отношение ядро-цитоплазма обычно тем больше, чем моложе клетка. Особенно показательно увеличение ядерно-цитоплазматического отношения в бластных клетках.
Форма ядра молодых клеток круглая или слегка вогнутая, у большинства зрелых лейкоцитов (гранулоциты, моноциты) отмечается склонность к ядерному полиморфизму.

Цвета пробирок и вакуумтейнеров

Сиреневая крышка напыление ЭДТА для общего анализа крови.
Красная крышка напыление активатор свертываемости для биохимических и иммунологических исследований.
Желтая крышка фибрин для иммунологических исследований (получение сыворотки).
Голубая крышка цитрат натрия для коагулограммы (получение плазмы).
Зеленая крышка гепарин (получение гепаринизированной плазмы).
Серая крышка напыление для исследований глюкозы и лактата.




Накрытие рабочего стола для подсчета тромбоцитов. Забор крови для подсчета тромбоцитов. Методы подсчета количества тромбоцитов.

Мегакариоцитопоэз: стволовая клетка мегакариобласт промегакариоцит мегакариоцит тромбоцит.
Доказано, что тромбоциты происходят из цитоплазмы мегакариоцитов (отшнуровка тромбоцитов). Мегакариобласты обнаруживаются в желточном мешке на пятой неделе эмбрионального развития. Мегакариоциты в сосудах на восьмой неделе. Тромбоциты отмечаются в мазках крови на 16 и 21 неделе эмбрионального развития.
Уже на ранней стадии вызревания тромбоцитов электронная микроскопия выявляет признаки дифференциации цитоплазмы. Преобразование мегакариобласта в мегакариоцит длится около 25 часов. Различают как оксифильные (гранулярные), так и базофильные мегакариоциты. Дифференцировка цитоплазмы продолжается и в более зрелых клетках и заканчивается тромобоцитообразованием. Каждый мегакариоцит одномоментно дает от 2000 до 8000 тромбоцитов.
Форма тромбоцитов дисковидная, диаметр от 2 до 5 мкм, толщина до 0,75 мкм. Вне кровяного русла распластываются и выпускают отростки. Норма 180-320*109 в литре. Для анализаторов 200-400*109 в литре.
Исследования циркулирующих тромбоцитов показывают, что размер, плотность, метаболитические, функциональные и биохимические свойства этих клеток заметно отличаются. Эти различия возникают в результате старения клеток в процессе циркуляции. Многообразие тромбоцитов не связано с их старением, а отражает полиморфизм мегакариоцитарного состава костного мозга и вызвано различным соотношением скоростей созревания цитоплазмы.
Среди тромбоцитов принято выделять пять морфологических групп. В основу выделения взяты следующие параметры:
1. Размер пластинок
2. Количественное соотношение между светлой частью пластинок (гиаломером) и темной частью (грануломером).
3. Качественная характеристика грануломера.
4. Качественная характеристика гиаломера.
Группы тромбоцитов:
1. Юные 3,2%. Диаметр от 3 до 5 мкм, округлая или несколько вытянутая форма, голубовато-сиреневый, яркий гиаломер, светлая зернистость равномерно распределена по всей клетке.
2. Зрелые 87%. Диаметр от 1,5 до 3 мкм, округлой, реже неправильной формы с псевдоподиями. Гиаломер чаще окрашен в голубой цвет, структура грануломера разнообразна, от отдельных, хорошо различимых гранул, сдвинутых к центру, до единой зернистой массы.
3. Старые 4,5%. Диаметр от 0,5 до 1,5 мкм. Интенсивно окрашенный, плотный грануломер в виде спаянной темной массы. Гиаломер не виден.
4. Макроформы 2,8%. Диаметр более 5 мкм, редко до 12 мкм. Вытянутой или округлой формы, чаще с отростками. Голубоватый гиаломер, гранулы равномерно рассеяны по центральной части клетки и не заходят в свободные края.
5. Формы раздражения 2,5%. Сильно варьируются по размерам, округлой формы. Светлый или почти бесцветный гиаломер с единичными гранулами, сдвинутыми к центру, или вообще не содержат гранул («голубые пластинки»).

Средний объем тромбоцита от 7,4 до 10,4 фенталитров. С возрастом человека объем увеличивается. Светлые тромбоциты функционально более полноценны.
Период созревания тромбоцитов около 8 суток, средняя продолжительность пребывания в кровотоке 9-11 суток. Во время циркуляции в крови тромбоциты занимают центральное или пристеночное положение. В циркулирующей крови находится примерно 67% от всех тромбоцитов и ежедневно разрушается 30-40% и только 5% вследствие старения.

Подсчет количества тромбоцитов

Тромбоциты, или кровяные пластинки, представляют собой наряду с эритроцитами и лейкоцитами третий форменный элемент крови, являясь цитоплазматическими осколками гигантских клеток костного мозга мегакариоцитов. Кровяные пластинки выполняют в организме важные биологические функции, главным образом в процессах гемостаза. Их физиологическая активность связана с содержанием большого количества ферментов. Описан ряд пластиночных факторов, определяющих фибрино-, тромбопластическое, антигепариновое, адгезивное, ретрактильное, сосудосуживающее и другие свойства тромбоцитов, благодаря которым они занимают видное место в свертывающей системе крови.
Срок пребывания тромбоцитов в периферической крови составляет 5-8 дней; ежедневно обновляется 12-20% общей массы кровяных пластинок. Определение количества тромбоцитов приобретает особенно большое значение при различных видах кровоточивости.
Функции тромбоцитов:
1. Участие в остановке кровотечения:
а) вызывают спазм поврежденного сосуда, содержат серотонин и гистамин
б) участие в образовании первичного тромба (процессы адгезии и агрегации)
в) запуск системы свертывания (тромбоциты содержат факторы свертывания)
г) обеспечение ретракции кровяного сгустка
2. Укрепление кровеносных сосудов (питание для эндотелия, выработка факторов роста эндотелия)
3. Участие в иммунитете организма:
а) эффекторы иммунитета; перенос молекул иммуноглобулинов.
б) поглощают чужеродные микрочастицы и вирусы (вирусы в тромбоцитах погибают, т. к. тромбоциты не содержат ядра).
в) участие в аллергических реакциях, способны к антителзависимой цитотоксичности (могут разрушать бактерии, опухолевые клетки).

Определение количества тромбоцитов крови в камере Горяева

Оснащение: дезраствор, средства индивидуальной защиты, микроскоп, камера Горяева, пробирки, дозаторы на 4,0 и 0,02 мл, фазово-контрастное устройство, влажная камера (чашка Петри с уложенной на дно фильтровальной бумагой, смоченной водой), исследуемый материал, бланки общего анализа крови.
Реактивы: раствор оксалата аммония (10 г/л).
Алгоритм действий:
1. В сухую чистую пробирку налить 4,0 мл раствора оксалата аммония (10 г/л)
2. В эту же пробирку внести 0,02 мл крови
3. Содержимое пробирки хорошо перемешать
4. Оставить на 30 мин при комнатой температуре
5. Подготовить камеру Горяева и влажную камеру
6. Через 30 мин содержимое пробирки перемешать
7. Немедленно заполнить камеру Горяева
8. Заполненную камеру Горяева поместить на 5 мин во влажную камеру (за это время имеющиеся тромбоциты осядут на поверхность сетки счетной камеры).
9. Подсчитать тромбоциты с помощью фазово-контрастного устройства при увеличении окуляр 10х, объектив 40х, в 25 больших квадратах, каждый из которых разделен на 16 малых квадратов.
10. Количество тромбоцитов в 1 мкл крови определить по формуле:

Х = а*200*4000
400

где, а количество подсчитанных тромбоцитов.
11. Практически, для определения количества тромбоцитов в 1 л крови, используют формулу:
Х = а*2*109/л
12. Полученные результаты занести в бланк исследования.

Определение количества тромбоцитов крови по Фонио

Оснащение: обезжиренные предметные и шлифовальные стекла; пробирки для забора капиллярной крови с ЭДТА; скарификаторы; спиртовые салфетки; простой карандаш; контейнер для фиксации мазков; лоток с «рельсами» для окраски мазков; микроскоп.
Реактивы: краска Романовского; фиксатор Май-Грюнвальда; масло иммерсионное.
Алгоритм действий:
1. Взять капиллярную кровь в пробирку с ЭДТА
2. Из смеси крови с реактивом сделать не слишком тонкие мазки.
3. Подписать мазки простым карандашом
4. Зафиксировать мазки
5. Окрасить мазки по Романовскому. Окраска продолжается 1,5 часа.
6. Смыть и просушить мазки.
7. В тонкой части мазка подсчитать 1000 эритроцитов, одновременно учитывайте встречающиеся тромбоциты. Полученная цифра тромбоцитов относительная величина, записывается в промилле.
8. Для расчета содержания тромбоцитов в 1 л крови необходимо знать количество эритроцитов в 1 л крови.
9. Расчитть тромбоциты по формуле:
Тромбоциты = количество подсчитанных тромбоцитов*количество эритроцитов в литре
10. Полученные результаты занести в бланк исследованиях

Меньшее распространение получили методы определение количества тромбоцитов с помощью фазовоконтрастной и люминисцентной микроскопии.
В настоящее время наиболее перспективен метод подсчета с использованием гематологических анализаторов.

Клиническое значение

В норме количество тромбоцитов колеблется от 180 до 320*109 в 1 литре крови. Эти колебания, отмечаемые у одного и того же человека, зависят от состояния вегетативной нервной системы и сосудистого тонуса.
Увеличение количества тромбоцитов тромбоцитоз может быть связано с повышением образованием пластинок в костном мозге, а также с перераспределением их в кровяном русле.
Тромбоцитоз наблюдается в физиологических условиях при возбуждении симпатической нервной системы, после физических упражнений - «тренинг-тромбоцитоз» спортсменов и т. д. (указанные сдвиги относятся к распределительным и возникают в связи с выбросом в периферическую кровь пластинок из депо селезенки).
В патологии увеличение количества тромбоцитов отмечается:
1. При травмах с размозжением мышц - «миогенный» тромбоцитоз преимущественно перераспределенного характера.
2. При асфиксиях, ожогах, гемолитических кризах, после кровотечений, в период выздоровления от инфекционных болезней подобные тромбоцитозы возникают в связи с реактивным возбуждением тромбоцитопоэза.
3. После удаления селезнки «аспленический» тромбоцитоз бывает более длительным, если спленэктомия производилась у лиц с какой-либо патологией крови, и сравнительно недолгим от нескольких недель до нескольких месяцев после спленэктомии у здоровых лиц, например, по поводу травматического разрыва. Тромбоцитотемия в этих случаях рассматривается как следствие прекращения тормозящей костный мозг функции селезенки.
4. Как вторичные, вследствие острого ревматизма, ревматоидного артрита, язвенного колита, туберкулеза, цирроза печени, остеомиелита, амилоидоза, острого кровотечения.
5. При некоторых лейкозах хроническом миелолейкозе, эритремии, остеомиелофиброзе. Указанные состояния характеризуются особенно высоким тромбоцитозом до 4 000 000 5 000 000 в 1 мкл крови, что сочетается с гипермегакариоцитозом костного мозга.

Снижение количества тромбоцитов тромбоцитопения может быть связано с перераспределением их по сосудистому руслу, с множественным образованием тромбоцитарных тромбов, повышенным распадом тромбоцитов тромбоцитолизом, а также с пониженным их образованием мегакариоцитами костного мозга. Уменьшение количества кровяных пластинок ниже критического уровня менее 50 000 в 1 мл крови обычно сопровождается развитием геморрагического синдрома.
Тромобцитопения в физиологических наблюдается при усилении парасимпатических влияний в связи с менструальным циклом у женщин, после парентерального введения гистамина и других средств (такие реакции носят перераспределительный характер).

В патологии тромбоцитопения отмечается при:
1. Идиопатической тромбоцитопенической пурпуре, болезни Верльгофа тромоцитопения является следствием замедленного вызревания и пониженного распада гигантских клеток костного мозга. В настоящее время выделены формы болезни Верльгфа, в основе которых лежит аутоимунный механизм, связанный с образованием антитромбоцитных антител, влияние которых распространяется не только на периферические тромбоциты, но и на процессы отшнуровывания пластинок мегакариоцитами костного мозга. Такой же генез имеет тромбоцитопения при системной красной волчанке и других заболеваниях аутоимунной природа.
2. Токсических (экзогенных интоксикация бензолом, золотом, лучевая радиация, эндогенных уремия, тяжелые поражения печени); инфекционно-токсических (сепсис, особенно менингококковый, тяжелые формы скарлатины, дифтерии, брюшного тифа, милиарного туберкулеза и др.); токсико-аллергических (действие лекарственных средств хини, новарсенол, стрептомицин, сульфаниламиды и др., иногда пищевые аллергены) состояниях. В возникновении тромбоцитопении имеет значение распад пластинок в периферическом русле, а также торможение из созревания и выплывания из костного мозга под влиянием токсических и аллергических факторов. Подобные тромбоцитопении относятся к симптоматическим, носят обычно острый характер и заканчиваются выздоровлением при условии устранения основной причины. В некоторых случаях, однако, тромбоцитопения приобретает рецидивирующий затяжной харктер.
3. Гиперспленических состояниях - при паразитарных и инфекционных заболеваниях, некоторых интоксикациях, портальной гипертензии, гемобластах, гемолитических анемиях и др. Этот вид тромбоцитопения возникает как следствие тормозящего влияния селезенки на костный мозг гиперспленизма.
4. Гипопластических и апластических состояниях костномозгового кроветворения идеопатические формы, при лучевой болезни, бензольной интоксикации, осложнениях цитостатической терапии как проявление органического поражения костного мозга и его гигантоклеточного аппарата.
5. Остром лейкозе, нередко миеломной болезни тромбоцитопения развивается в связи с опухолево-пролиферативным процессом в костном мозге. Немаловажное значение имеет также аутоимунный механизм образование антител к собственным тромбоцитам.

Пациент (мужчина тридцати лет), находится в стационаре, после спленэктомии. Количество тромбоцитов в анализе крови 600*109.

1. Назовите нормальное количество тромбоцитов в крови взрослого человека.
2. Может ли быть связано увеличение количества тромбоцитов с проведенной операцией?
3. Назовите возможную причину тромбоцитоза.
4. Назовите возможные физиологические причины тромбоцитоза.

Приготовление, фиксация и окраска мазка для подсчета тромбоцитов.
Подсчет тромбоцитов.
Оценка результатов с позиции норма/патология

При подсчете тромбоцитов по Фонио в мазке на 1000 эритроцитов было подсчитано 50 тромбоцитов. Общее количество эритроцитов в одном литре крови 4,7*1012/л.
Сколько тромбоцитов у пациента в одном литре крови? (235*109/л).
Дайте оценку результату. Норма тромбоцитов 180-320*109/л. Результат соответствует норме.
Какие методы определения тромбоцитов вам известны? По Фонио, в камере Горяева, на анализаторе.
Какие методы исследования гемостаза применяются в клинической лаборатории? Подсчет тромбоцитов, время свертываемости крови (ВСК), длительность кровотечения (ДК).

Пациент были подсчитаны тромбоциты по Фонио на 1000 эритроцитов подсчитано 90 тромбоцитов. Количество эритроцитов 5,5*1012/л.
Сколько тромбоцитов у пациента в одном литре крови (495*109/л).
Оцените результат. Норма тромбоцитов 180-320*109/л. Результат превышает норму. Тромбоцитоз.
Когда наблюдается повышение тромбоцитов? Физиологически при физической нагрузке, возбуждение симпатической нервной системы. Патологически при разможжении мышц, ожогах, обезвоживании, после спленэктомии, некоторые лейкозы.
Перечислите пять классов тромбоцитов: юные, зрелые, старые, макроформы, формы раздражения.

Определение времени кровотечения
Определение скорости свертывания крови
Клинико-диагностическое значение определения ВСК и ДК

Определение времени свертывания капиллярной крови по методу Сухарева:
Оснащение: дезраствор, средства индивидуальной защиты, капилляры Панченкова, секундомер, вата, скарификаторы, бланки общего анализа крови.
Реактивы: 70-градусный этанол.
Алгоритм:
1. Набрать из пальца столбик крови высотой 25-30 мм в стерильный капилляр от аппарата Панченкова.
2. Перевести столбик крови в середину капиллярной трубки.
3. Включить секундомер.
4. Каждые 30 секунд наклонять капилляр вправо и влево под углом 30-45 градусов.
5. По секундомеру отметить моменты начала и конца свертывания крови (с началом свертывания ее движение замедляется, а в момент полного свертывания кровь перестает двигаться).
6. Занести результат в бланк исследования.

Определение длительности кровотечения по методу Дуке

Оснащение: дезраствор, средства индивидуальной защиты, секундомер, фильтровальная бумага, вата, скарификаторы, бланки общего анализа крови.
Реактивы: 70-градусный этанол.
Алгоритм:
1. После прокола пальца пациента включить секундомер.
2. К первой же выступившей капле прикоснуться полоской фильтровальной бумаги, которая впитывает кровь.
3. Далее фильтровальной бумагой снимать вновь выступающие капли через каждые 30 секунд.
4. Продолжать эту манипуляцию до тех пор, пока на фильтровальной бумаге перестанут оставаться следы крови.
5. Выключить секундомер. Снять с него показания.
6. Результат записать в бланк исследования.

Определение времени свертываемости крови по способу Бюркера

Оборудование и реактивы:
1. Часовое стекло.
2. Чашка Петри с влажной фильтровальной бумагой на дне.
3. Тонкая стеклянная палочки или игла.
4. Игла Франка или скарификатор.
5. Дистиллированная вода.
6. Секундомер.

Ход исследования:
1. На часовое стекло нанести одну каплю стерильной дистиллированной воды или жидкого глицерина.
2. Сделать прокол пальца
3. Первую каплю крови снять, а вторую нанести на часовое стекло.
4. Помешать тонкой стеклянной палочкой или скарификатором.
5. Время взятия крови отметить по секундомеру.
6. Часовое стекло поместить в чашку Петри.
7. Каждые пол-минуты тонкой стеклянной палочкой или скарификатором прикасаться к капле крови от центра к периферии до тех пор, пока за палочкой не потянутся первые ниточки фибрина.
8. Отметить время появления нитей.
9. Результат записать в бланк исследования.

Оценка полученных данных:
У здоровых людей время свертываемости по методу Бюркера равно 5-6 минутам.



Определение ретракции кровяного сгустка (метод Макферлейна)

В градуированную центрифужную пробирку помещают 5 мл венозной крови. В нее погружают стеклянную палочку с шероховатой поверхностью, укрепленную вертикально при помощи пробки, закрывающей пробирку. Пробирку устанавливают на водяную баню при 37 градусах Цельсия. Через час после свертывания стеклянную палочку удаляют вместе со сгустком. Определяют объем оставшейся сыворотки и выражают его в процентах.
У здорового человека ретракция кровяного сгустка составляет 44-46%, индекс ретракции (отношение объема отделившейся сыворотки к общему объему крови) 0,3-0,5. Ретракция кровяного сгустка недостаточна или отсутствует при тромбоцитопениях и тромбоцитопатиях.
Из проб на резистентность капилляров при тромбоцитопениях и тромбоцитопатиях пользуются чаще «симптом щипка» - на месте щипка через несколько минут появляется кровоизлияние, которое увеличивается неадекватно нанесенной капиллярам травме или «симптом жгута» - симптом считается положительным, если при наложении на плечо жгута или манжетки тонометра на 3 минуты при давлении 50 мм рт.ст. Возникают петехии в количестве не менее одной на 1 см2.
В последние годы при диагностике тромбоцитопатий (качественных изменений тромбоцитов) стали применять методы, позволяющие изучить адгезию, агрегацию, реакцию освобождения тромбоцитов.
Из способов изучения адгезии тромбоцитов наиболее информативными являются закрытые методы, при которых кровь прямо из вены пропускаются через колонку со стеклянными бусами (диам
·етр 0,5 мм) с соблюдением времени контакта. По разнице количества тромбоцитов в крови до и после прохождения через колонку судят о количестве тромбоцитов, подвергшихся адгезии к стеклу.
Агрегацию тромбоцитов исследуют в обогащенной тромбоцитами плазме крови с помощью ФЭКа или специальных фотометров (агрегометров), либо микроскопически путем подсчета тромбоцитарных агрегатов и свободно лежащих тромбоцитов.
Кроме этих методов применяют электронно-микроскопические (изучение ультраструктуры тромбоцитов), радиоизотопные (определение продолжительности жизни тромбоцитов), гистологические (исследование мегакариоцитов в срезах костного мозга), иммунологические (определение антитромбоцитраных антител) методы исследования.

Причины увеличения и уменьшения времени свертывания крови и длительности кровотечения

Время свертывания крови ориентировочный показатель многоступенчатого энзиматического процесса, в результате которого растворимый фибриноген переходит в нерастворимый фибрин. Данный показатель характеризует процесс свертывания в целом и не дает возможности выявить механизмы, ведущие к его нарушению.
Заболевания и состояния, сопровождающиеся изменением времени свертывания крови:
Увеличение времени свертывания
Уменьшение времени свертывания

Значительный дефицит плазменных факторов (IX, VIII, XII, I, факторов, входящих в протромбиновый комплекс).
Наследственные коагулопатии
Нарушения образования фибриногена
Заболевания печени
Лечение гепарином
Циркулирующие антикоагулянты
Гиперкоагуляция после массивных кровотечений, в послеоперационный и послеродовой периоды.
I стадия (гиперкоагуляционная) ДВС-синдрома
Побочное действие пероральных контрацептивов


Референтные величины длительности кровотечения по Дуке составляют 2-3 минуты. Время кровотечения характеризует эластичность кровеносных сосудов и их способность к сокращению при травме, а также состояние тромбоцитарной системы (способность к адгезии и агрегации). Практическое значение имеет удлинение времени кровотечения. Оно отражает нарушение первичного гемостаза вследствие тромбоцитопений, тромбоцитопатий, нарушения сосудистой стенки или сочетания этих факторов. В таблице приведены причины патологических изменений длительности кровотечения по Дуке:
Увеличение времени свертывания
Укорочение времени свертывания

Тромбопеническая пурпура
Антромбопеническая пурпура Скорбут
Отравление фосфором
Геморрагический диатез
Лейкозы
Спленомегалический цирроз печени
Длительный прием некоторых ЛС (ацетилсалициловая кислота)
Кровотечения с гипофибриногенемией
Пороки сосудов с недоразвитием сокращения прекапилляров (микроангиопатии)
ДВС-синдром
Чаще следствие технической ошибки при проведении теста или свидетельствует о повышенной спасической способности капилляров.


Определение протромбинового времени в капиллярной крови.

Получение капиллярной крови для исследования:
1. Капилляр Панченкова промыть 3,8% раствором цитрата натрия
2. Стандартная обработка пальца перед проколом
3. В капилляр набрать раствора цитрата натрия до отметки «80» и не выливая этот цитрат добрать в него крови до отметки «0».
4. Выдуть полученную кровь в пробирку и набрать еще один целый капилляр крови.
5. В пробирке смешать обе порции крови. Получается разведение 9:1. Данная кровь может стоять до начала исследования при комнатной температуре не более 30 минут.

Алгоритм подготовки и проверки реактивов и оборудования:
1. В кювету коагулометра или в пробирку внести 0,1 мл контрольной плазмы
2. Инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия 1 минуту.
3. Добавить в прогретую плазму 0,2 мл разведенного техпластина имеющего температуру 37 градусов Цельсия.
4. Сразу же включить секундомер
5. Начать отсчет времени свертывания до образования фибрина.
6. Проба обязательно дублируется!
7. Рассчитать средний результат. В норме протромбиновое время, измеренное на коагулометре 13-18 секунд, в пробирке 13-19 секунд.

Алгоритм:
1. В кювету коагулометра или в пробирку внести 0,1 мл крови
2. Инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия 1 минуту.
3. Добавить в прогретую кровь 0,1 мл разведенного техпластина имеющего температуру 37 градусов Цельсия.
4. Сразу же включить секундомер
5. Начать отсчет времени свертывания до образования сгустка.
6. Проба обязательно дублируется!
7. Рассчитать средний результат.

Протромбиновое отношение (ПО) рассчитывают по формуле:
ПВ пациента / ПВ контрольной плазмы
В норме протромбиновое отношение составляет 0,9-1,3.

Пациент, женщина 42 года, поступила в ОРИТ после массивной кровопотери в результате автомобильной аварии. Наблюдается гиперкоагуляция (время свертывания по Бюркеру 3 м 30 с).
1. Оцените результат с позиции норма-патология
2. Алгоритм определения времени свертывания по Бюркеру
3. Назовите причины патологических изменений времени свертывания крови.

Особенности забора крови на ретиулоциты

Окраска ретикулоцитов должна происходить в момент взятия крови, т. е. еще при жизни клетки суправитально. В погибших клетках нитчато-сетчатая субстанция не воспринимает окраску.

Подсчет ретикулоцитов. Окраска ретикулоцитов по Алексееву.

Краска Алексеева: азур II, хлористый натрий, лимоннокислый натрий, дистиллированная вода.
Все навески должны в колбе хорошо раствориться. Краску закрывают пробкой и ставят в термостат при 37 градусах Цельсия на сутки для вызревания, периодически помешивая ее стеклянной палочкой. Созревшую краску фильтруют в пузырек из темного стекла. Срок хранения краски в темном месте 3-4 недели. Краска может созревать и при комнатной температуре, но дольше: в течение 4-х дней. Для ускорения растворения краски колбу можно подогреть в течение 15-20 минут (не до кипячения!); краску охлаждают и фильтруют.
Ход определения: пользуются капилляром от аппарата Панченкова краску набирают ј капилляра и до метки «0» набирают кровь.
После этого кровь с краской тщательно перемешивают и оставляют на 40-60 минут. Пробирку необходимо закрыть пробкой.
По истечении времени окраски небольшие капли покрашенной крови помещают на предметные стекла и шлифовальным стеклом делают тонкие мазки, которые быстро высыхают на воздухе.
Подписывают мазки простым карандашом в более толстой части капли.
Фиксация мазков исключается.

Окраска ретикулоцитов краской бриллианткрезилблау

Реактив: насыщенный раствор бриллианткрезилблау в абсолютно спирте (1,2 г краски на 100 мл спирта). Бриллианткрезилблау можно заменить таким же количеством краски азур II или азур I.
Ход определения: каплю краски наносят стеклянной палочкой на хорошо вымытые обезжиренные теплые предметные стекла, шлифовальным стеклом делают тонкие мазки. Поверхностные стекла, где размазана краска, отмечают стеклографом. Такие стекла можно заготовить впрок.
На подготовленные таким образом стекла наносят каплю крови, делают тонкие мазки поверх краски и помещают стекла с мазками во влажную камеру на 3-5 минут. Затем мазки высушивают на воздухе. В зависимости от количества краски длительность экспозиции мазков во влажной камере удлиняется до 8-10 минут.
При окраске ретикулоцитов указанными методами эритроциты окрашиваются в желтовато-зеленый тон, а нитчато-сетчатая субстанция в синий цвет.

Техника подсчета количества ретикулоцитов

Окашенный мазок микроскопируют с иммерсионной системой в тонкой его части. Ретикулоциты учитываются в числе подсчитанных 1000 эритроцитов при суженном поле зрения (через «окошечко»). Таким образом определяют, сколько незрелых клеток встречается на 1000 эритроцитов.
Количество ретикулоцитов выражают на 1000 эритроцитов в промилле и на 100 эритроцитов в процентах.
Норма ретикулоцитов: 5-8% или 0,5-0,8 промилле.
Некоторые авторы отмечают, что у женщин количество ретикулоцитов несколько больше, чем у мужчин. У детей в первые дни жизни количество ретикулоцитов по разным данным может достигать 5-10 %, а затем уменьшается.

1. 100 мкл крови, стабилизированной ЭДТА, поместить в эпиндорф с краской, перемешать.
2. Инкубировать 15-30 минут, перемешать.
3. Сделать тонкий мазок, высушить.
4. Микроскопировать

Увеличение ретикулоцитов в периферической крови (ретикулоцитоз) отмечается:
1. При гемолитических анемиях (число ретикулоцитов может доходить до 60% и более (особенно сильно увеличиваясь при гемолитических кризах).
2. При острых кровопотерях (на 3-5 сутки после кровопотери возникает ретикулоцитарный криз), в том числе, увеличение ретикулоцитов позволяет заподозрить скрытое кровотечение (например, у больных язвенной болезнью желудочно-кишечного тракта, брюшным тифом).
3. При малярии
4. При полицитемии
5. При лечении железом железодефицитных анемий (через несколько дней 3-10) после начала антианемического лечения пернициозной анемии.
6. При остром недостатке кислорода
7. При метастазах опухолей в костный мозг

Истинный ретикулоцитоз: увеличение количества ретикулоцитов в периферической крови с одновременным увеличением количества ретикулоцитов в костном мозге.
Ложный реткулоцитоз: отсутствие повышенного количества ретикулоцитов в костном мозге при повышении их количества в периферической крови (что говорит об усилении вымывания ретикулоцитов из костного мозга в периферическую кровь).

Фактором, приводящим к увеличению значения процентного содержания ретикулоцитов могут быть прием следующих препаратов: кортикотропин, противомалярийные лекарственные средства, жаропонижающие препараты, фуразолидона (у маленьких детей), леводопы.

Возможной ошибкой при подсчете ретикулоцитов может быть их ложное завышение из-за наличия:
1. Включений в эритроцитах (тельца Жолли, малярийные паразиты)
2. Высокого лейкоцитоза
3. Аномальной формы гемоглобина
4. Гипертромбоцитоза
5. Гигантских тромбоцитов.

Снижение количества или отсутствие ретикулоцитов (ретикулоцитопения) наблюдается:
1. При арегенераторных апластических и гипопластических анемиях.
2. При анемиях, вызванных недостаточностью содержания железа, витамина В12, фолиевой кислоты (микроцитарно-гипохромные и мегалобластные анемии);
3. При талассемии
4. При сидеробластной анемии
5. При метастазах рака в кость
6. При лучевой болезни и лучевой терапии
7. При лечении цитостатиками
8. При аутоимунных заболеваниях системы кроветворения
9. При заболеваниях почек
10. При алкоголизме
11. При рецидиве анемии Аддисона -Бирмера
12. При микседеме

Факторы, искажающие результат лабораторного исследования процентного содержания ретикулоцитов:
1. Неправильный выбор антикоагулянта или недостаточное перемешивание крови с антикоагулянтом
2. Длительное сдавливание руки жгутом
3. Прием сульфаниламидов (возможны как заниженные, так и завышенные результаты)
4. Переливание крови незадолго до исследованиям
5. Гемолиз пробы крови

Показания к назначению анализа на ретикулоциты:
1. Оценка активности эритропоэза при состояниях, сопровождающихся гемолизом или кровопотерей.
2. Оценка способности костного мозга к регенерации после цитотоксической терапии и трансплантации костного мозга.
3. Оценка восстановления синтеза эритропоэтина после трансплантации почки
4. Допинговый контроль у спортсменов (прием эритропоэтина)
5. Диагностика неэффективного гемопоэза или снижения продукции эритроцитов
6. Дифференциальная диагностика анемий
7. Детекция нарушения регенераторной способности косного мозга при дефиците железа, витаминов В12, В6, фолатов, меди и мониторинга соответствующей терапии
8. Оценка реакции на терапию эритропоэтином, эритросупрессорами.

Малярия

Возбудители малярии относятся к типу Sporozoa, классу Coccidea, отряду Haemosporida, семейству Plasmodiidae. Известно четыре вида плазмодиев возбудителей трех клинических форм малярии человека: Plasmodium vivax возбудитель трехдневной малярии, P. malariae возбудитель четырехдневной малярии, P. falciparum возбудитель тропической малярии, P. ovale возбудитель ovale-малярии (типа трехдневной).
Цикл развития малярийных паразитов совершается со сменой хозяев. Бесполое размножение, или шизогония, протекает в клетках печени больного малярией (проэритроцитарная шизогония) и в эрироцитах (эритроцитарная шизогония). Высказано предположение о наличии параэритроцитарного цикла у P.vivax и P.ovale. Половое размножение с последующей спорогонией происходит в организме в организме комара рода Anopheles.
Для обнаружения малярийных плазмодиев готовят мазки и толстые капли крови обследуемых. Паразиты обнаруживаются в крови как на высоте приступов болезни, так и в промежутках между ними.

Лабораторная диагностики малярии. Исследование тонкого мазка крови

Оснащение: дезраствор, одноразовые перчатки, пипетки или дозаторы, предметные стекла, шлифовальное стекло или шпатель, ватные шарики, скарификаторы, карандаш, контейнер для окрашивания, микроскоп.
Реактивы 3-5% водный раствор краски Романовского-Гимзы, буферная вода, 70% этиловый спирт, 96% этиловый или метиловый спирт.
Приготовление реактива:
1. Для приготовления 100 мл 3-5% раствора краски Романовского-Гимзы в мерную колбу на 100 мл наливают 3-5мл маточного ее раствора и доливают буферной водой (pH 7,0-7,2).
2. Для приготовления 1 л буферной воды (pH 7,0) нужно в мерный цилиндр налить 63 мл раствора Na2HPO4, затем 37 мл раствора KH2PO4 и 900 мл дистиллированной воды.

Алгоритм действий:
1. Капиллярная кровь из пальца забирается в комплекте, тонкий мазок и толстая капля.
2. На предметное стекло с правой стороны, отступив от края на 1-1,5 см, наносят маленькую капельку крови. Стекло кладут на горизонтальную поверхность и фиксируют его левой рукой.
3. В правую руку берут шлифовальное стекло, ставят перед каплей крови под углом 45 градусов, продвигают вперед со соприкосновения с последней и, когда кровь равномерно распределится между обоими стеклами, быстрым движением делают мазок.
4. Тонкий мазок на воздухе высыхает очень быстро. После высыхания его маркируют карандашом (пишут по мазку на толстом краю).
5. После маркировки мазок фиксируют в 96% этиловом спирте в течение 20-30 минут или в метиловом 3-5 минут.
6. После фиксации мазок высушивают и окрашивают 3-5% водным раствором краски Романовского-Гимзы.
7. По окончании окраски, препараты тщательно промывают, подставляя контейнер под слабую струю воды, а затем просушивают в вертикальном положении.
8. После просушивания препарат исследуют под микроскопом с масляной иммерсией (объектив х90 или х100, окуляр х7).
9. Просматривают не менее 100 полей зрения и подсчитывают численность паразитов.

Исследование толстой капли крови

Оснащение: дезраствор, одноразовые перчатки, пипетки или дозаторы, капилляр, предметные стекла, ватные шарики, скарификаторы, карандаш, контейнер для окрашивания, микроскоп.
Реактивы: 3-5% водный раствор краски Романовского-Гимзы, буферная вода, 70% этиловый спирт.
Приготовление реактива:
1. Для приготовления 100 мл 3-5% раствора краски Романовского-Гимзы в мерную колбу на 100 мл наливают 3-5 мл маточного ее раствора и доливают буферной водой (pH 7.0-7.2).
2. Для приготовления 1 л буферной воды (pH 7,0) нужно в мерный цилиндр налить 63 мл раствора Na2HPO4, затем 37 мл раствора KH2PO4 и 900 мл дистиллированной воды.

Алгоритм действий:
1. Капиллярная кровь из пальца забирается в комплекте, тонкий мазок и толстая капля.
2. Две толстые капли наносятся на мокрый тонкий мазок (лучше капилляром), между которыми после высыхания подписывается карандашом фамилия и дата взятия.
3. Капли высушивают на воздухе в горизонтальном положении, оберегая их от насекомых, пыли, прямого солнечного света.
4. Затем, без предварительной фиксации, окрашивают 3-5% водным раствором краски Романовского-Гимзы в специальных контейнерах, в которых стекла помещаются вертикально, в течение 15-30 минут.
5. По окончании окраски, препараты тщательно промывают, подставляя контейнер под слабую струю воды, а затем просушивают в вертикальном положении.
6. После просушивания препарат исследуют под микроскопом с масляной иммерсией (объектив х90 или х100, окуляр х7).
7. Просматривают не менее 100 полей зрения и подсчитывают численность паразитов.

Плазмодии малярии в мазке крови

Микроскопия препаратов крови для выявления плазмодиев проводится при большом увеличении с иммерсионным объективом 90х и окуляром 7-10х при ярком освещении. Каплю иммерсионного масла наносят на тонкое место мазка.
Plasmodium vivax
1. В начале развития в эритроците имеет вид кольца, т. к. большая, центральная часть его занята крупной вакуолью, которая оттесняет ядро и цитоплазму к периферии клетки. В цитоплазме плазмодия пигмент отсутствует. На этой возрастной стадии плазмодий занимает около 1/3 объема эритроцита. Нередко встречаются 2-3 кольца в одном эритроците. Вследствие разрушения целостности ядра плазмодия во время подсыхания мазка крови иногда в кольце видны как бы два ядра, расположенные рядом или на некотором расстоянии одно от другого.
2.Вслед за стадией кольца следует стадия собственно шизонта, которая длится около 30-32 часов. Шизонты условно подразделяются на малые (юные), средние (амебовидные) и крупные (зрелые). В юном шизонте, в отличие от кольца, ободок цитоплазмы утолщен на стороне, противоположной ядру. В цитоплазме содержатся мелкие зерна пигмента. Средние шизонты обычно имеют неправильную амебовидную форму с одной или несколькими вакуолями. Размер их равен Ѕ 2/3 диаметра эритроцита. По всей цитоплазме шизонта разбросан темно-бурый или золотисто-бурый пигмент. Зрелые шизонты занимают почти весь эритроцит. Они имеют круглую или овальную форму, без псеводоподий; цитоплазма без вакуоли. Пигмент у зрелых шизонтов собирается в кучки (35-40 отдельных зернышек).
3. После созревания шизонтов наступает стадия их деления. Делящийся шизонт имеет несколько ядер. Их число после окончания деления варьирует от 14 до 22 (обычно бывает 16-18 ядер). Иногда, если деление началось раньше, чем шизонт достиг своего предельного размера, образуется всего 10-12 ядер.
4. После деления ядра паразит распадается на мерозоиты; образуется морула. Пигмент к этому времени собирается в 1-2 кучки. Затем оболочка эритроцита разрывается, мерозоиты выходят в плазму крови (меруляция) и вновь внедряются в эритроциты. Стадия деления продолжается около 6-8 часов.
В одном эритроците могут находится сразу два плазмодия на одной или различных стадиях развития. Весь цикл бесполого развития плазмодия занимает 48 часов.
5. После нескольких циклов шизогонии из некоторых мерозоитов развиваются мужские и женские половые клетки гаметоциты. Вполне сформировавшийся женский гаметоцит (макрогаметоцит) крупнее мужского и, как правило, занимает весь объем увеличенного эритроцита. Он имеет сравнительно небольшое, интенсивно окрашенное в рубиновый цвет, компактное ядро, расположенное на периферии клетки. В темно-голубой протоплазме равномерно рассеяны почти черные палочковидные частицы пигмента. Макрогаметоцит весьма похож на крупный шизонт, от которого его не всегда легко отличить. Иногда в одном эритроците обнаруживаются два макрогаметоцита. Мужской гаметоцит, или микрокаметоцит, имеет крупное, рыхлое, светло-розовое, центрально расположенное ядро. Бледно-голубая цитоплазма с обильно рассеянным в ней коричневатым пигментом окружает ядро узкой каемкой. Двойные инвазии микрогаметоцитами одного эритроцита встречаются реже, чем макрогаметоцитами. Число гаметоцитов Plasmodium vivax в крови обычно невелико. Появляются они на второй-третий день заболевания, но обнаруживаются обычно лишь на 13-14 день, когда их количество значительно возрастает.

Эритроциты, пораженные Plasmodium vivax, увеличиваются в размерах по сравнению с нормальными почти в 1,5 раза. В них появляется красновато-фиолетовая зернистость (зернистость Шюффнера). Она бывает особенно четко выражен в перекрашенных препаратах, что затрудняет выявления паразита. Сам инвазированный эритроцит постепенно обесцвечивается и бледнеет.

Plasmodium malariae

На стадии кольца не отличается от соответствующей формы Plasmodium vivax. В эритроците встречается не более одного кольца. Шизонты имеют правильную, чаще всего округлую форму, нередко встречаются и лентовидные шизонты, которые обнаруживаются обычно в тонких участках мазка, где кровь подсыхает быстрее. В протоплазе шизонтов разбросан обильный пигмент в виде грубых округлых темно-бурых глыбок. Морула состоит из 6-12 (чаще из 8) мерозоитов, расположенных вокруг кучки пигмента как лепестки цветка.
Гаметоциты по форме сходны с гаметоцитами Plasmodium vivax, но более мелкие. Довольно обильный пигмент представлен грубыми, круглыми зернышками. У микрогаметоцита они коричневые, у макрогаметоцита темно-коричневые, почти черные. Гаметоциты в крови больных обнаруживаются в незначительном количестве не ранее второй-третьей недели от начала заболевания.
Эритроциты, пораженные Plasmodium malariae, не увеличиваются в размерах, поэтому плазмодии этого вида в них более мелкие, чем Plasmodium vivax.
Длительность эритроцитарной стадии шизогонии при четырехдневной малярии составляет 72 часа.

Plasmodium falciparum

В периферической крови находится, как правило, на стадии кольца. Диаметр колец в начале их развития не более 1/5 диаметра эритроцита, что имеет диагностическое значение, т. к. кольца остальных видов плазмодиев в этот период значительно крупнее. При дальнейшем развитии размеры колец Plasmodium falciparum увеличиваются и отличить их от соответствующей стадии других видов плазмодиев становится труднее. Однако следует иметь в виду, что в одном эритроците часто находятся 2-3 кольца Plasmodium falciparum, а кольцо Plasmodium malariae бывает только одно. Эритроциты же с двумя или тремя кольцами Plasmodium vivax обычно уже увеличены, обесцвечены и содержат зернистость Шюффнера, тогда как величина эритроцитов, инвазированных Plasmodium falciparum остается прежней и зернистость в их цитоплазме отсутствует. Иногда встречаются незамкнутые кольца Plasmodium falciparum.
При обычном течении тропической малярии в мазках обнаруживаются только кольца, т. к. дальнейшее развитие Plasmodium falciparum проходит в капиллярах внутренних органов. Лишь в очень тяжелых случаях заболевания шизонты и делящиеся формы встречаются, хотя и в небольшом количестве, в периферической крови. Шизонты мелкие, заполняют не более 2/3 эритроцита, по форме сходны с шизонтами четырехдневной малярии. Для них характерно быстное исчезновение вакуолей и раннее скучивание глыбок темного пигмента. Морула состоит из 12-14 мелких мерозоитов, которые располагаются беспорядочно вокруг кучки пигмента.
Сформировавшиеся гаметоциты имеют полулунную форму или напоминают банан. Макрогаметоциты более узкие, вытянутые, окрашиваются в голубой, синевато-серый цвет. В центре находится компактное, окрашенное в красный цвет ядро, прикрытое черными, неправильной формы грубыми глыбками пигмента, вследствие чего оно кажется темным. Микрогаметоциты более короткие (особенно молодые). Цитоплазма их розовато-серая или сиреневая, ядро бледно-розовое, крупное, нечетко ограниченное от цитоплазмы. Зерна пигмента немногочисленные, грубые, коричневые, рассеяны по всей клетке паразита, несколько концентрируясь в средней ее части.
Гаметоциты полностью заполняют и растягивают эритроциты (в длину их размер может достигать двух диаметров эритроцитов), поэтому бывает видна только узкая пленка эритроцита на вогнутой стороне полулуния.
В крови больных тропической малярией могут встречаются только одни гаметоциты, что наблюдается после проведенного курса лечения шизонтоцидными препаратами, к которым гаметоциты весьма устойчивы. Эритроцитарная стадия шизогонии при тропической малярии продолжается 48 часов.

Plasmodium ovale

На различных стадиях эритроцитарного цикла развития имеет сходство с соответствующми стадиями Plasmodium vivax или Plasmodium malariae. Пораженные плазмодием эритроциты увеличиваются в размерах и принимают угловатю или овальную форму (отсюда название паразита); некоторые из них с фестончатыми краями. Эритроциты обесцвечиваются и в их цитоплазме появляется обычно хорошо выраженная зернистость Джеймса, похожая на зернистость Шюффнера в эритроцитах, инвазированных Plasmodium vivax. В мазке встречаются кольца и шизонты Plasmodium ovale, похожие на такие же стадии Plasmodium malariae, но с более крупными ядрами. Пигмент в виде темно-бурых глыбок разбросан по всех цитоплазме шизонта. При меруляции собранные в кучку глыбки пигмента лежат не в центре эритроцита, как у Plasmodium malariae, а сбоку, между беспорядочно расположенными мерозоитами. Паразит делится на 6-12 мерозоитов (чаще на 8), весь цикл развития в эритроцитах занимает 48 часов. Гаметоциты сходны с гаметоцитами Plasmodium vivax.

Плазмодии малярии в толстой капле

В толстой капле слой крови во много раз толще, чем в тонком мазке, поэтому число малярийных паразитов в поле зрения при просмотре капли значительно увеличивается. Одно поле зрения толстой капли соответствует примерно 60-80 полям зрения тонкого мазка, благодаря чему сокращается время просмотра.
Окрашиваются плазмодии в толстой капле так же, как и в мазке: ядро имеет различные оттенки красного, а цитоплазма голубого или серовато-синего цвета.

Plasmodium vivax на стадии кольца редко сохраняет свойственную этому возрасту форму. Кольца, как правило, разорваны. Возле обычно отдельно расположенного небольшого красного ядра находится комочек округлившейся цитоплазмы. Часто цитоплазма вместе с ядром образуют фигуры, напоминающие восклицатльный знак, запятую или пропеллер.
Цитоплазма амебовидных шизонтов обычно разорвана на отдельные части, среди которых находится ядро, лежащее или отдельно, или в одном из комочков цитоплазмы, в более крупных обрывках цитоплазмы видны зернышки пигмента. Такие разорванные шизонты часто могут служить диагностическим признаком Plasmodium vivax, т. к. стадия амебовидного шизонта наиболее продолжительная и взятие крови поэтому чаще происходит в этот период. Хорошо сохраняются в толстой капле крупные шизонты, делящиеся их формы и морулы, которые имеют примерно тот же вид, что и в мазке. Макрогаметоциты обычно сохраняют круглую или овальную форму, но иногда принимают неправильные очертания вледствие надрыва цитоплазмы. Микрогаметоциты повреждаются чаще. Нередко ядра их располагаются отдельно от бледно окрашенных (иногда почти не различимых) обрывков цитоплазмы, содержащих пигмент. О наличии гаметоцитов можно судить лишь при обнаружении микрогаметоцитов, т. к. макрогаметоциты практически не отличимы от крупных шизонтов. В хорошо окрашенных и особенно отчетливо в перекрашенных препаратах нередко можно видеть, что плазмодии лежат на полупрозрачных розоватых дисках строме эритроцитов, в которых они находились. Чаще эти диски можно обнаружить в более тонком слое крови по краям препарата. Наличие таких «теней» эритроцитов важный диагностический признак Plasmodium vivax.

Plasmodium malariae в толстой капле значительно менее изменен, чем Plasmodium vivax. Кольца этих видов сходны между собой, но в препаратах Plasmodium malariae колец обычно бывает больше. Шизонты мелкие, круглой или овальной формы, без вакуоли, с глыбками темного пигмента по периферии цитоплазмы. Морула состоит из 6-12 мерозоитов, сохраняющих форму «розетки» или разбросанных в беспорядке вокруг кучки пигмента. Гаметоциты имеют такой же вид, как и в мазке, сходны с гаметоцитами Plasmodium vivax, но мельче их.

Plasmodium falciparum в начале болезни представлен лишь стадией кольца. В более поздний период обнаруживаются также гаметоциты. В толстой капле, как и в мазке, шизонты выявляются обычно лишь в тяжелых случаях, но и при обычном течении болезни при тщательном микроскопировании в толстой капле, как правило, можно найти отдельные шизонты или делящиеся плазмодии. Кольца Plasmodium falciparum часто сохраняют свою обычную форму, но иногда деформируются и разрываются. В этих случаях видна красная точка (ядро) и лежащий рядом маленький комочек цитоплазмы. Если в препарате колец мало или они недостаточно окрашены, что затрудняет диагностику, рекомендуется поторить исследование крови через 12-24 часа. В этом случае при тропической малярии вновь будут обнаружены кольца, а при трехдневной и четырехдневной ее форме шизонты соответствующих стадий. Гаметоциты, как правило, сохраняют ту же характерную форму, что и в мазке; лишь те их них, которые видны в поперечном сечении или под углом, имеют овальную или округлую форму. Однако наличие грубых коричневых зерен пигмента, собранных в кучку, и ободка цитоплазмы вокруг них позволяет и в этих случаях распознать макрогаметоцит. У микрогаметоцита пигмент представлен единичными грубыми зернами и диагностировать его труднее.

Plasmodium ovale в препаратах капли на стадиях кольца и собственно шизонта сходны с Plasmodium malariae и отличаются от них практически лишь тем, что нередко лежат на фоне слабо окрашенных в бледно-розовый цвет дисках стромы эритроцитов с глыбками зернистости, которая более заметна в краевой, быстрее высыхающей зоне препарата, где гемолиз прекращается быстрее.
При массовых исследованиях крови на малярийные плазмодии в первую очередь изучают препараты толстой капли. В каждом препарате необходимо просмотреть не менее 100 полей зрения. При необходимости уточнить вид или стадии развития плазмодиев исследуются тонкие мазки.
При оформлении результатов исследования крови указываются виды найденных плазмодиев, а в случае выявления Plasmodium falciparum перечисляются также обнаруженные возрастные стадии его развития.

Серологическая диагностика малярии

Большинство серологических методов диагностики малярии (пассивная гемагглютинация, преципитация в геле, связывание комплемента и др.) не получили широкого распространения вследствие сложной методики их постановки, необходимости специальной подготовки персонала, наличия особого лабораторного оснащения и стандартизированных антигенов, а также из-за недостаточной специфичности результатов. Даже наилучший из этих методов метод непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ), играет в лабораторной диагностике лишь второстепенную роль.
Во всех случаях диагностики малярии основной является паразитологическая диагностика путем приготовления и изучения препаратов толстой капли и тонкого мазка.

Задача №1

При подсчете тромбоцитов по Фонио в мазке на 1000 эритроцитов было подсчитано 50 тромбоцитов. Общее количество эритроцитов в 1 литре крове 4,7*1012/л.

1. Сколько тромбоцитов у пациента в 1 литре крови? 4,7*50 = 235*109/л
2. Дайте оценку результату. Норма. (180-320*109/л)
3. Какие методы определения тромбоцитов вам известны? В камере Горяева, по Фонио, на анализаторе.
4. Какие методы исследования гемостаза применяются в клинической лаборатории? Подсчет тромбоцитов: в камере Горяева, по Фонио, на анализаторе. Длительность кровотечения по Дуке. Свертываемость по Сухареву, по Бюркеру. Ретракция кровяного сгустка. Скрининговые тесты. Индуцированная агрегация тромбоцитов.

Задача №2

При подсчете количества ретикулоцитов был получен результат 25

1. Что такое ретикулоциты? Незрелые эритроциты.
2. Дайте оценку полученному результату. Намного выше нормы (5-8)
3. Что могло явится причиной подобного результата? Гемолитическая анемия, острая кровопотеря, малярия, полицитемия, лечение железом железодефицитной анемии, острая гипоксия, метастазы опухолей в костный мозг.
4. Назовите один из методов окраски ретикулоцитов и его принцип.
Бриллианткрезилблау сначала на стекло наносится краска, потом делается мазок крови.

Задача №3

У пациента с высокой температурой и ознобом подозрение на приступ малярии. Назначено исследование крови на наличие марярийного плазмодия.

1. Какова технология взятия крови на наличие малярийного плазмодия? Капиллярная кровь, тонкий мазок, толстая капля, 5-10 стекол.
2. Опишите методику окраски препаратов на выявление малярийного плазмодия?
3. Какие стадии развития и где проходит малярийный плазмодий?
4. Опишите микроскопическую картину в препаратах.

Определение групп крови человека АВ0 при помощи Цоликлонов анти-А и анти-В

Цоликлоны анти-А и анти-В предназначены для определения групп кроуи человека системы АВ0, взамен стандартных изогемагглютинирующих сывороток.
Определение групп крови системы АВ0 включает выявление антигенов А и В в эритроцитах стандартными антителами и выявление агглютининов альфа и бетта в сыворотке или плазме исследуемой крови стандартными эритроцитами.

Характеристика и основные свойства цоликлонов анти-А и анти-В

Цоликлоны анти-А и анти-В являются продуктом гибридомных клеточных линий, полученных в результате слияния мышиных антителобразующих В-лимфоцитов с клетками мышиной миеломы. Индивидуальные гибридомные линии продуцируют гомогенные антитела только одного класса иммуноглобулинов, полностью идентичные по структуре и биологической активности. Антитела, продуцируемые клетками одного клона (потомство одной клетки), являются моноклональными.
Цоликлоны не являются продуктами клеток человека и поэтому исключены контаминация препаратов вирусами гепатита и СПИДа.

Техника определения групп крови человека системы АВ0

Определение группы крови АВ0 производится в нативной крови, стабилизированной с помощью применяемых консервантов (глюгицир, цитроглюкофосфат, гепарин и др.), и крови, взятой из пальца (без консерванта).
Наиболее четкая реакция агглютинации наблюдается при использовании высокой концентрации эритроцитов.
Определение группы крови производится в помещении с хорошим освещением при температуре от +15 до +25 градусов Цельсия.
Реагенты не должны хранится открытыми, так как при высыхании активность антител снижается. Не следует пользоваться реагентами, если в них имеются нерастворимые хлопья или помутнение. Для каждого реагента используют свою маркированную («анти-А» или «анти-В») пипетку.
Для каждого определения группы крови достаточно применять по одной серии реагентов анти-А и анти-В. На планшет или пластину Цоликлоны анти-А и анти-В наносят по одной большой капле (0,1 мл) по соответствующими надписями: анти-А и анти-В. Рядом с каплями антител наносят исследуемую кровь по одной маленькой капле, приблизительно в 10 раз меньше капли антител (0,01 мл). В случае определения группы крови, взятой из пальца или взятой без консерванта, необходимо обеспечить достаточно большое количество эритроцитов, т. е. надо брать первые капли из пальца (без сильного выдавливания) или свободные эритроциты из осадка свернувшейся крови (без избытка сыворотки).
При определении группы крови на планшете антитела и крови смешивают тщательно вымытым сухим шариком, покачивая планшет; при определении на пластинке стеклянной палочкой, которую промывают и досуха вытирают перед размешиванием каждой капли.
Наблюдение за ходом реакции с Цоликлонами проводят при легком покачивании пластинки или планшета в течение не более 2,5 минут.
Результат реакции в каждой капле может быть положительным или отрицательным.
Положительный результат выражается в агглютинации (склеивании) эритроцитов. Агглютинаты видны невооруженным глазом в виде мелких красных агрегатов, быстро сливающихся и образующих крупные хлопья вплоть до одного большого агглютината.
При отрицательной реакции капля остается равномерно окрашенной в красный цвет, агглютинаты в ней не обнаруживаются.
Агглютинация с Цоликлонами анти-А и анти-В обычно наступает в первые 3-5 секунд. Наблюдение следует вести 2,5 минуты ввиду возможности более позднего наступления агглютинации с эритроцитами, содержащими слабые разновидности антигенов А или В.
Оценка результатов реакции агглютинации с Цоликлонами анти-А и анти-В представлены в таблице, в которую также включены результаты определения агглютинатов в сыворотке (плазме) доноров с помощью стандартных эритроцитов.


Реакция исследуемых эритроцитов с Цоликлоном
Реакция исследуемой сыворотки (плазмы) со стандартными эритроцитами группы
Исследуемая кровь принадлежит к группе


Анти-А
Анти-В
А(II)
B(III)


1
-
-
+
+
0 (I)

2
+
-
-
+
A (II)

3
-
+
+
-
B (III)

4
+
+
-
-
AB (IV)


1. Агглютинации нет ни с Цоликлоном анти-А, ни с Цоликлоном анти-В. Следовательно, исследуемые эритроциты не содержат антигенов А и В, и кровь принадлежит к группе 0 (I). Это подтверждается наличием агглютининов альфа и бета в исследуемой сыворотке (плазме) по результатам положительной реакции агглютинации со стандартными эритроцитами групп А (II) и B (III).
2. Агглютинация наблюдается только с Цоликлоном анти-А. Следовательно, исследуемые эритроциты содержат только антиген А, и кровь принадлежит к группе А(II). Это подтверждается наличием агглютининов бета в исследуемой сыворотке (плазме) по результатам положительной реакции агглютинации со стандартными эритроцитами группы В (III).
3. Агглютинация наблюдается только с Цоликлоном анти-В. Следовательно, исследуемые эритроциты содержат только антиген В, и кровь принадлежит к группе В (III). Это подтверждается наличием агглютининов В (III) в исследуемой сыворотке (плазме) по результатам положительной реакции агглютинации со стандартными эритроцитами группы А (II).
4. Агглютинация наблюдается как с Цоликлоном анти-А, так и с Цоликлоном анти-В. Следовательно, исследуемые эритроциты содержат оба антигена (А и В), и кровь принадлежит к группе АВ (IV). Это подтверждается отсутствием агглютининов альфа и бета в исследуемой сыворотке (плазме) по результатам отрицательной реакции агглютинации со стандартными эритроцитами групп А (II) и В (III).

Определение резус-фактора с помощью Цоликлона анти-D

Цоликлон анти-D предназначен для выявления D антигена системы резус в эритроцитах человека и применяется в серологических тестах взамен или параллельно с изоиммунной анти-D сывороткой.
Известно, что IgM антитела не вызывают агглютинации некоторых образцов эритроцитов со слабо выраженным D антигеном (Du). Поэтому образцы, которые при исследовании моноклональным анти-D реагентом были определены как D-отрицательные, необходимо дополнительно тестировать в желатиновом тесте или непрямой реакции Кумбса с помощью анти-D реагентов, содержащих IgG антитела (поликлональной сывороткой или моноклональным анти-D IgG реагентом).


Характеристика и основные свойства Цоликлона анти-D супер

Действующим началом Цоликлона анти-D являются моноклональные человеческие анти-D антитела, которые продуцируются гетерогибридомой, полученной в результате слияния человеческой лимфобластоидной линии с миеломной клеточной линией мыши. Моноклональные антитела принадлежат к одному классу иммуноглобулинов, полностью идентичны по структуре и биологической активности.
Поскольку линия клеток человека, использованная для слияния с мышиной миеломой, была получена из лимфоцитов здорового донора, исключена контаминация реагента патогенными вирусами (гепатит, СПИД и др.). Однако с исследуемыми образцами крови следует работать в перчатках во избежание заражения патогенными вирусами, передающимися через кровь.
Анти-D антитела, принадлежащие к иммуноглобулинам класса М, вызывают прямую агглютинацию эритроцитов, содержащих D антиген. Анти-D IgM моноклональные антитела могут быть использованы для выявления D-антигена в любых модификациях прямой реакции агглютинации: на плоскости, в пробирках, в микропрепарате. Результаты испытаний показали надежность и специфичность моноклональных анти-D антител в определении D-антигена системы резус.

Определение D-антигена системы резус

Определение D-антигена производится в нативной крови, стабилизированной с помощью применяемых консервантов; в крови, взятой без консерванта; в крови взятой из пальца. Наиболее четкая реакция агглютинации наблюдается при использовании высокой концентрации эритроцитов. Заключение о присутствии D-антигена в исследуемых эритроцитах делают по наличию положительной реакции агглютинации.

Реакция агглютинации на плоскости

На пластинку со смачиваемой поверхностью наносят большую каплю (0,1 мл) реагента. Рядом помещают маленькую каплю (0,01-0,05 мл) исследуемой крови и смешивают кровь с реагентом стеклянной палочкой. Реакция агглютинации начинает развиваться через 10-15 секунд, четко выраженная агглютинация наступает через 30-60 секунд. Результаты агглютинации следует учитывать через 3 минуты, поскольку с эритроцитами, несущими слабый D-антиген, реакция происходит медленнее. Пластинку после смешивания реагента с кровью рекомендуется покачивать не сразу, а через 20-30 секунд, что позволяет за это время развиться более полной, крупнолепестковой реакции агглютинации.

Ошибки пр определении группы крови

1. Биологические:
1.1. Поздняя агглютинация (>5 мин). Причина подвиды антигенов A2, A3, A4, B2... Устранение моноспецифические а/с.
1.2. Неспецифическая агглютинация. Причина немоноспецифические сыворотки. Устранение цоликлоны. Причина панагглютинация (при патологии: опухоли, ожоговая болезнь, новорожденные, миелома). Устранение дополнительное отмывании эритроцитов.

2. Методические:
2.1. Отсутствие агглютинации. Причина гемолиз. Устранение использовать не гемолизированную сыворотку. Причина нарушение соотношения при постановке. Устранение переделать реакцию. Причина слабый титр а/с. Устранение использовать другие а/с, цоликлоны.
2.2. Ложная агглютинация. Причина монетные столбики. Устранение переделать реакцию, используя другой антикоагулянт. Причина бактериальная (загрязнение посуды, сыворотки). Устранение переделать реакцию, используя чистую посуду. Причина - холодовая (<15 градусов Цельсия). Устранение поместить кровь на 5 минут в термостат, переделать тест. Причина краевая (подсыхание капли). Устранение соблюдение времени теста.

3. Техническая: перепутывание пробирок.

15

Приложенные файлы

  • doc 8863076
    Размер файла: 264 kB Загрузок: 0

Добавить комментарий