практикум по иммунологии Ковальчук, 2010


Иммунология : практикум : учеб. пособие / [Ковальчук Л. В. и др.] - 2010. - 176 с. : ил.
Иммунологии вскоре предстоит занять весьма важное место в структуре фундаментального медико-биологического образования. Мы не знаем ни одного даже самого узкого медицинского специалиста, способного обойтись без иммунологии: она нужна либо для понимания патогенеза болезней, либо для проведения иммуноанализов, а чаще и для того, и для другого. Но хотя в практике клинических и биологических исследований иммунологические методы лидируют, в программе шестилетнего высшего врачебного образования почти не предусмотрено их профессиональное изучение. Не зная технологий современных иммуноанализов, врач не в состоянии самостоятельно понять, что факт наличия той или иной инфекции в крови пациента (положим, ВИЧ) можно надежно установить с вероятностью 100% (пусть для этого надо будет выполнить не одно, а несколько разных исследований), а вот факт отсутствия инфекции нельзя надежно установить никакими методами.
Цель данного учебного пособия - познакомить студентов и врачей на профессиональном уровне с современными методами исследования, используемыми в экспериментальной и клинической иммунологии с аллергологией. Приведены основные характеристики и этапы использования разнообразных иммунологических методов, часть которых легко воспроизвести в рамках практических занятий на кафедре иммунологии и на смежных кафедрах медицинских и биологических вузов.
Иммунологические методы, применяемые как в экспериментальных, так и в клинических исследованиях, делятся по крайней мере на 8 групп.
I. Методы определения или детекции тех или иных веществ, характеризующихся наличием уже полученных специфичных антител против них. Эти методы принято называть в международной специальной литературе методами иммуноанализа. В соответствии с применяемыми технологиями визуализации взаимодействия антитела и антигена иммуноанализ подразделяется на:
а) методы агглютинации корпускулярных антигенов (непосредственная агглютинация антигена, гемагглютинация, латексагглютинация, нефелометрия);
б) методы с использованием технологии гемолиза (тесты фиксации комплемента, торможения фиксации комплемента, метод подсчета антителообразующих клеток по Йерне);
в) методы преципитации комплексов «антиген-антитело» в гелях (методы Оухтерлони, Элека, Манчини и др.);
г) иммуноферментный анализ, радиоиммунный анализ, иммунофлюоресцентный анализ - наиболее высокочувствительные и наиболее употребимые в настоящее время виды иммуноанализа.
II. Методы фракционирования - физическое разделение растворимых молекул или клеток иммунной системы:
а) выделение иммуноглобулинов высаливанием солями серной кислоты;
б) методы хроматографии (высокоэффективная; аффинная и др.);
в) центрифугирование в средах с градиентами плавучей плотности (выделение мононуклеарных клеток центрифугированием на фиколл-гепаке; выделение нейтрофилов седиментацией на растворе желатина, декстрана и др.);
г) электрофорез;
д) проточная цитофлюорометрия, в том числе с использованием тетрамерных комплексов.
III. Иммуногистохимические методы (иммунофлюоресцентная микроскопия; микроскопия препаратов тканей или клеток с фиксированными антителами, меченными ферментной меткой).
IV. Методы молекулярной биологии (полимеразная цепная реакция; иммуноблоттинг: Western-блот определяет белок, Southern-блот определяет ДНК, Northern-блот определяет РНК).
V. Генетические методы:
а) методы направленного мутагенеза - «нокаут» и «нокин»;
б) методы изучения экспрессии генов и методы картирования и исследования конкретных мутаций (технологии микроэрреев).
VI. Методы биотехнологии - клонирования молекул, ПЦР, методы получения рекомбинантных белков, клеток (гибридомные технологии), создание линий инбредных животных, биотехнологические методы получения и оценки вакцин.
VII. Методы изучения свойств нативных клеток иммунной системы в культурах in vitro (методы биологического тестирования цитокинов; методы оценки пролиферации клеток; методы исследования факторов транскрипции и др.).
VIII. Методы исследования функций и взаимодействия клеток in vivo (радиационные химеры; сканирование меченых клеток in vivo и
др.).
Проводится наиболее детальное описание некоторых тестов, подходящих для практических занятий со студентами (обозначения: «Лабораторная работа 1-1» и т.д.).
Особое внимание в книге уделяется проблеме цитокинов. В соответствующем разделе не только представлены конкретные методы их идентификации, но и сформулирован подход к оценке системы цитокинов в целом, что очень способствует формированию суждения о комплексности этой важнейшей для организма системы межклеточных медиаторов. Особо подчеркнем: сейчас в клинической медицине отмечается рост числа патологических процессов, обусловленных избыточной или недостаточной продукцией цитокинов.
1.1. ИНБРЕДНЫЕ ЖИВОТНЫЕ
Для проведения фундаментальных исследований в иммунологии лучший объект - инбредные мыши. Инбредные животные - это животные, полученные путем инбридинга (in breed - выводить породу, разводить), т.е. последовательных близкородственных скрещиваний с целью получения гомозиготного и генетически идентичного потомства. Среди потомков для дальнейших скрещиваний сначала отбирают особей по признакам внешнего сходства, в последующих поколениях уже тестируют на совпадение групп крови и приживление кожных лоскутов. Через 20 поколений и более такой селекции получают мышей с весьма высокой степенью гомозиготности, обозначаемых как чистая линия, в пределах которой все животные генетически почти идентичны (например, как однояйцевые близнецы у человека).
Главная цель выведения чистых линий мышей и исследований на них - получение возможности многократного повторения экспериментов на генетически одинаковых организмах, т.е. обеспечение воспроизводимости результатов исследований в высоком смысле этого понятия, что полностью исключено при решении многих иммунологических задач с использованием беспородных животных. Подобные проблемы существуют при оценке результатов иммунных процессов у человека.
Мыши стали исключительными экспериментальным животными в иммунологии в силу ряда причин, главные из которых следующие:
1) короткий срок беременности (21 сут) и множественное потомство от каждой самки (5-8 детенышей в одни роды) позволяют весьма быстро вывести чистые линии, что важно по вышеназванным причинам;
2) себестоимость содержания мышей по сравнению с таковой других млекопитающих наименьшая;
3) структура и функция иммунной системы мыши и человека во многом сходны;
4) выведение чистых линий мышей показало, что, например, некоторые из них (несмотря на гомозиготность) весьма крепкие и здоровые, т.е. не всякий инбридинг приводит к вырождению.
Кроме того, путем целенаправленного отбора тех или иных свойств созданы многочисленные линии мышей с точно заданными характеристиками, и это позволяет выбирать особей, необходимых для достижения конкретных научных целей. Характеристики животных разных линий занесены в соответствующие документы; на них ориентируются питомники по разведению чистолинейных мышей, имеющиеся во всех странах, где успешно занимаются проблемами экспериментальной иммунологии. Из наиболее прославленных питомников хотим упомянуть Джексоновскую лабораторию (The Jackson Laboratory) в США. Ежегодно она поставляет в университеты, медицинские институты и научно-исследовательские лаборатории всего мира приблизительно 2 млн животных 2500 разных линий, стоков и животных-моделей. Около 97% этих животных можно приобрести только в Джексоновской лаборатории. В каждом питомнике разводимые и поддерживаемые линии мышей имеют паспорт, систематизированы в соответствующих базах данных и доступны для широкого применения. Известен гаплотип (Н-2) мышей разных линий, их окрас, поведенческие характеристики, особенности функционирования иммунной системы и прочие свойства, необходимые не только для иммунологических исследований, но и исследований в других областях биологии и медицины (онкология, фармакология, экология и т.д.).
Мы приводим характеристику некоторых наиболее известных линий мышей, которые экспериментаторы выбирают с теми или иными определенными целями (табл. 1.1).
Таблица 1.1. Линии инбредных мышей, наиболее часто применяемые в исследованиях (Кондратьева И.А., Ярилин А.А., 2004)
Продолжение табл. 1.1
Продолжение табл. 1.1
Окончание табл. 1.1
СВА/J (рис. 1.1, см. также цв. вклейку) и гибриды первого поколения (CBA/J ×C57Bl.6)F1 - серо-бурые здоровые выносливые мыши, которые хорошо переносят облучение в кроветворных летальных дозах, и по этой причине их часто используют в радиационных моделях.
Рис. 1.1. Мышь линии СВА/J
C57B1/6 (рис. 1.2, см. также цв. вклейку) - черного цвета мыши, подвижные, агрессивного поведения.
Balb/c (рис. 1.3) - белые мыши с хрупким здоровьем. Однако это самая востребованная линия для гибридомной биотехнологии, потому что линии миелом, на основе которых получают гибридомы, ведут свою «родословную» от перевивной линии лейкозных клеток МОРС- 21, происходящей от мышей Balb/c. Гибридомы хорошо растут в брюшной полости живых сингенных мышей в виде асцитных опухолей.
Кроме собственно чистых линий мышей, генетики научились выводить так называемых конгенных мышей. Так называют линии, отличающиеся друг от друга небольшой областью генома (иногда одним геном).
Рис. 1.2. Мышь линии C57B1/6
Рис. 1.3. Мышь линии Balb/c
В основе выведения конгенных линий мышей лежит генетический прием возвратного скрещивания - получение потомства в ряду поколений от скрещивания гетерозиготы (потомков гомозиготных родителей, генетически отличающихся между собой) с одним из исходных гомозиготных родителей. Смысл подобного скрещивания - внедрить комплекс Н-2 донорской линии А в генотип основной линии В. На рисунке 1.4 представлены донорская маркирующая линия А и основная линия В. От скрещивания гомозиготных особей этих двух линий получают гибриды первого поколения F1, (a/b; генерация 1). При дальнейшем скрещивании гибридов F1 с особями основной линии В получают потомство, состоящее как из гомозигот (b/b), так и гетерозигот (а/b) по комплексу Н-2. В последующих скрещиваниях отбираются только гетерозиготные особи, имеющие признак «а» (Н-2а), который определяется по приживлению кожного трансплантата от маркирующей линии A и положительной серологической реакции клеток
крови с анти-А-сывороткой. По мере продолжения скрещиваний а-положительных особей с особями основной линии В доля генома линии А постоянно снижается, но при этом для дальнейшего размножения из потомства отбирают только тех особей, которые сохраняют признак «а» (H-2a). К двенадцатому поколению (генерация ? 12) практически весь геном отбираемых после гибридизации мышей представлен основной линией В, за исключением признака «а», по которому шел отбор. Дальнейшая задача состоит в переводе признака «а» в гомозиготное состояние. Для этой цели гетерозигот (а/b) скрещивают между собой и отбирают для дальнейшего размножения только тех особей из потомства, которые отторгают кожный трансплантат, взятый от особей линии В, и не дают реакции с анти-В-сывороткой. Подобный отбор выявляет особей с отсутствием признака «b» (H-2b) и гомозиготность по признаку «а» (H-2a). Таким образом, в результате применения данной схемы скрещивания в геном основной линии В внедряется комплекс Н-2 маркирующей линии А (рис. 1.4). С момента перевода комплекса H-2a в гомозиготное состояние констатируется получение новой конгенной (по отношению к основной) линии В (Klein J., 1975).
1.2. ЛИНИИ МЫШЕЙ С ГЕНЕТИЧЕСКИМИ ДЕФЕКТАМИ, ЗАТРАГИВАЮЩИМИ ИММУННУЮ
СИСТЕМУ
SCID (англ. severe combined immunodeficiency) - мыши, страдающие тяжелым иммунодефицитом в результате мутации в генах RAG, ответственных за перегруппировку генов иммуноглобулинов и Т-клеточного рецептора. Животные практически лишены Т- и В-лимфоцитов и могут жить в безмикробных условиях, но необязательно - в полностью стерильных. Эти мыши не отторгают ксеногенные ткани, в частности им можно вводить с расчетом на приживление самые разнообразные клетки человека.
В 1959 г. Расселом и соавт. описаны определенные частично инбредные мыши - спонтанные мутанты-самцы, которые вскоре после рождения покрывались чешуйчатой перхотью (рис. 1.5), заметно отставали в росте, страдали от тяжелой диареи и умирали в возрасте около 3 нед. При морфологическом исследовании у мышей наблюдали массивную лимфоаденопатию, спленомегалию, аномаль-
Рис. 1.4. Схема получения конгенных линий (Галактионов В.Г., 1986)
ную инфильтрацию лимфоцитами кожи, печени, легких, эндокринных желез. Мутантных самцов назвали «скуpфи» (англ. scurfy - покрытые перхотью). Только в 2001 г. M.E. Brunkow и соавт. показали: мутация scurfy затронула ген фактора транскрипции FoxP3 (вставка двух пар оснований в 8-й экзон этого гена), локализованного на Х-хромосоме. В том же 2001 г. несколько исследователей (C. Bennett,
R. Wildin) показали: у детей с синдромом IPEX поврежден тот же ген (Xp11.23-Xq13.3), что и у мышей scurfy - FoxP3. В 2003-2005 гг. Джейсон Фонтенот и Александр Руденский показали: экспрессия гена FoxP3 является существенным и определяющим моментом в дифференцировке в тимусе Т-регуляторных клеток (Treg), открытых Сакагучи в 1995-1996 гг. и ответственных за поддержание иммунологической толерантности к нормальным тканям своего организма и гомеостаза в иммунной системе, а также за контроль аутоиммунных и опухолевых заболеваний.
Рис. 1.5. Мышь линии Scurfy («покрытые перхотью»)
Nude (лишенные волосяного покрова) - замеченные и отобранные в 1960 г. мыши со спонтанной мутацией, в результате которой у мышей-гомозигот по данной мутации (nu/nu) отсутствуют тимус и волосяной покров (рис. 1.6, см. также цв. вклейку). Мутантный ген поддерживают при размножении мышей в гетерозиготном состоянии; он перенесен мышам нескольких других линий, например Balb/c, CBA/Ca, C57Bl/10ScSn и пр.
Рис. 1.6. Мышь линии Nude
C57Bl/6-bg/bg (англ. beige - бежевый) - мыши-мутанты бежевого окраса из исходно черной линии. Характеризуются существенно сниженной активностью NK-клеток и фагоцитов с повреждением лизосомальных структур.
AKR - белые мыши (рис. 1.7, см. также цв. вклейку). У 90% особей обоего пола к возрасту 6-8 мес развиваются «спонтанные» тимомы и лейкоз.
Рис. 1.7. Мышь линии AKR/J
W/Wv - мыши с существенным дефицитом тучных клеток в слизистых оболочках.
1.3. ЛИНИИ МЫШЕЙ С АУТОИММУННОЙ
ПАТОЛОГИЕЙ
NZB (New Zeland Black) - новозеландские черные мыши с аутоиммунной гемолитической анемией. Сывороточные антиэритроцитарные антитела мышей связывают эритроциты, но не агглютинируют их.
(NZB χ NZW)F1 - гибриды первого поколения черных и белых новозеландских мышей. У них «спонтанно» развивается синдром, напоминающий красную волчанку человека с гломерулонефритом. В крови содержится много антител к ДНК.
MRL/Mp-lpr/lpr - мыши с СКВ и ревматоидным артритом, с синдромом повышенной лимфопролиферации, увеличенными лимфоузлами. В крови у них увеличено содержание антител против иммуноглобулинов и против ДНК. Мутация идентифицирована в гене Fas, т.е. у этих мышей имеется недостаточность процессов апоптоза лимфоцитов.
MRL/Mp- +/+0 - мыши с хроническим гломерулонефритом, антителами к ДНК, но без лимфоаденопатии.
C57B\/KS-db/db - склонные к быстрому ожирению мыши, у которых к возрасту 4 мес развиваются существенное повреждение выработки инсулина и тяжелый диабет.
NOD (non-obese diabetic mouse) - мыши с диабетом, но без ожирения. Модель с болезнью, наиболее близкой к диабету I типа у человека.
EAGM (experimental autoimmune myasthenia gravis) - мыши с аутоиммунной миастенией гравис.
EAE (experimental autoimmune encephalitis) - мыши с аутоиммунным энцефалитом.
EAT (experimental autoimmune thyroiditis) - мыши с аутоиммунным тиреоидитом.
1.4. БИОЛОГИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ
ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЙ
Для исследования иммунной системы используются следующие биологические материалы.
1. Цельная периферическая кровь.
2. Сыворотка крови - жидкая фракция крови, освобожденная от фибриногена.
3. Плазма крови - жидкая фракция крови, содержащая фибриноген, следовательно, способная к образованию сгустков фибрина.
4. Клетки крови, отделенные от жидкой фракции.
5. Цереброспинальная жидкость.
6. Синовиальная жидкость.
7. Бронхоальвеолярный лаваж.
8. Выделения слизистых секретов половых органов (из канала шейки матки, влагалища, семенная жидкость).
9. Выделения из носа (смывы или адсорбция на пористые материалы).
10. Моча.
11. Супернатанты, полученные от культивируемых in vitro клеток
12. Гомогенаты тканей (биопсия или post mortem).
13. Цитоплазматические и ядерные компоненты клеток. Биологический материал разного происхождения отличается по
биохимическому составу, ионной силе, вязкости. Все эти параметры имеют существенное значение для реализации связывания
антител с антигенами, используемыми для тестирования. Поэтому каждая конкретная тест-система разработана строго для конкретного вида биоматериала и в 99% случаев - для сыворотки крови. Тест-системы для анализа компонентов сыворотки не могут быть использованы в опытах с другими биологическими жидкостям из-за высокой вероятности получения ложных результатов. Тест-системы, предназначенные для человека (за некоторыми исключениями), нельзя примененять на лабораторных животных и наоборот. Исключение составляют перекрестно-реагирующие агенты, например цитокин - трансформирующий фактор роста человека и свиньи.
Приведем несколько примеров технических приемов получения биоматериалов.
Сыворотка крови
Как правило, у человека или животных берут венозную кровь в чистую сухую пробирку. Оставляют при комнатной температуре на 20-30 мин для образования первичного сгустка фибрина. Затем пробирки центрифугируют на цитоцентрифугах при 1000-2000 об/мин в течение 10 мин. Супернатант и есть сыворотка крови. Если анализ выполняют не в тот же день и час, то сыворотку разливают по аликвотам в плотно закрываемые криопробирки (полипропиленовые) и замораживают. Для краткосрочного хранения можно заморозить до -18-20 °С, для более продолжительного хранения лучше использовать морозильные камеры с температурой -70-80 °С. Повторные оттаивания-замораживания нежелательны или недопустимы (в зависимости от конкретного вида анализа). Нежелательно или недопустимо также использовать в работе сыворотки с признаками гемолиза и липидемии.
Существуют приемы так называемого осветления мутного биоматериала, в частности центрифугирование при 14 000 об/мин в течение 10 мин. Однако следует иметь в виду: при этой процедуре возможна потеря искомого биопродукта. И все же данную процедуру принято применять для осветления проб мочи, цереброспинальной жидкости, бронхоальвеолярного лаважа, синовиальной жидкости.
Плазма крови
Для получения плазмы крови следует позаботиться о том, чтобы не образовался сгусток фибриногена. Добиваются этой цели двумя способами: либо работают как можно быстрее, свежевзятую кровь
безотлагательно центрифугируют при 2000 g в течение 10 мин с охлаждением, супернатант быстро разливают по аликвотам в охлажденные полипропиленовые пробирки и морозят; либо кровь берут в пробирки с антикоагулянтами (гепарином, цитратом натрия или этилендиаминтетраацетатом - ЭДТА). Но в последнем случае следует учитывать, что присутствие антикоагулянта в биоматериале не повлияет на результаты иммуноанализа. В большинстве случаев антикоагулянты влияют на взаимодействие антител с антигенами, большинство тест-систем рассчитано на работу с сывороткой крови, а не с плазмой.
Слизистые секреты, сорбированные на пористые губки
Губки, предназначенные для сорбции выделений (из канала шейки матки, со слизистой рта, зубодесневых карманов, полостей носа и т.п.), имеют стандартные размеры и массу. По окончании процедуры сорбции губки помещают в пробирки с экстрагирующим буфером и оставляют, как правило, на ночь в холодильнике при 4 °С, после чего центрифугируют при 13 000 об/мин в течение 10 мин и супернатант используют в качестве материала для иммуноанализа.
Состав экстрагирующего буфера: 50 мМ HEPES, pH 7,5; 150 мМ NaCl; 1 mM ЭДТА; 25 mM EGTA; 1 mM Na3VO4; 1 mM NaF; 0,1% Tween 20; 10% глицерол.
1.5. МЕТОДИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ РАБОТЫ
С ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫМИ КЛЕТКАМИ
Для выявления отдельных популяций клеток, оценки количественных закономерностей их появления и накопления, изучения маркеров и рецепторов различных популяций лимфоцитов необходимо овладеть методами работы с клетками иммунной системы.
Лабораторная работа 1-1
Выделение органов и тканей иммунной системы
Животное забивают, взвешивают (вес тела животного необходимо знать при вычислении селезеночного индекса), делают разрез по средней линии брюшка, кожу отпрепаровывают и оттягивают на иглах. Находят паховые и подмышечные лимфатические узлы.
Делают разрез мышц брюшины и извлекают брыжеечные лимфатические узлы. Из брюшной полости извлекают селезенку. Вскрывают грудную полость и за грудиной находят тимус. Вырезают бедренные и большие берцовые кости. Выделенные ткани и органы помещают в среду 199 и хранят при температуре тающего льда (0-2 °С). Приготовление клеточных суспензий идет при температуре тающего льда в чашках Петри или бюксах в стерильных условиях.
Получение клеточных суспензий из костного мозга
Для получения клеточной суспензии из костного мозга можно использовать бедренные, большие берцовые и плечевые кости. Кости очищают от прилегающих тканей при помощи пинцета и скальпеля, остатки тканей счищают марлей, срезают эпифизы и при помощи шприца с иглой соответствующего диаметра вымывают костный мозг 2-3 мл среды 199 (охлажденной до 0-2 °С) в центрифужную пробирку. Осторожно, избегая образования пены, клетки суспензируют, пропуская взвесь небольшими порциями через шприц. Полученную суспензию клеток дважды отмывают средой 199 при центрифугировании (250-500 об/мин 10 мин). Hадосадочную жидкость сливают (отбирают), клетки ресуспензируют в свежей среде 199. В полученной суспензии подсчитывают общее количество ядросодержащих клеток и определяют их жизнеспособность (см. ниже).
Получение клеточной суспензии из лимфатических узлов, тимуса и селезенки
Лимфатические узлы (подмышечные, паховые, брыжеечные и др.), тимус или селезенку очищают от жира и соединительной ткани. Очищенные лимфатические узлы, тимус или селезенку переносят в чашку Петри или бюкс с небольшим количеством среды 199 (0,5 мл) и фрагментируют ножницами (можно осторожно ворсить скальпелем, разрывать препаровальными иглами или раздавливать в гомогенизаторе) до получения однородной клеточной взвеси. К полученной взвеси добавляют еще 2,5 мл среды 199 и фильтруют ее через капроновую сетку в центрифужную пробирку. Дважды отмывают средой 199 при центрифугировании в течение 5 мин при 1000 об/мин. Супернатант удаляют, а к осадку добавляют свежей среды 199 и ресуспензируют пастеровской пипеткой, шприцем с иглой или автоматическим дозатором. В полученной клеточной суспензии подсчитывают
число ядросодержащих клеток в 1 мл и определяют их жизнеспособность (см. ниже).
Подсчет числа ядросодержащих клеток в суспензии
Взвесь клеток тщательно перемешивают шприцем с иглой или автоматическим дозатором. В лунке круглодонного планшета смешивают 20 мкл взвеси клеток и 180 мкл 5% раствора уксусной кислоты. Таким образом, первоначальная взвесь клеток разводится в 10 раз (эритроциты под влиянием уксусной кислоты лизируются, у ядросодержащих клеток разрушается оболочка, но ядра сохраняются). Полученную смесь опять тщательно перемешивают и затем заполняют ею камеру Горяева. Под микроскопом в сетке камеры Горяева подсчитывают число клеток в 100 больших квадратах (25 «окон»). Подсчет производят в 2 сетках камеры и выводят среднее число клеток.
Принцип подсчета числа клеток в 1 мл суспензии
Полученное число клеток соответствует объему в 100 больших квадратах, т.е. 0,4 мм3 (площадь квадрата 1/25 мм2, высота камеры 0,1 мм). Следовательно, если в камере насчитали 100 клеток, т.е. в 0,4 мм3 находится 100 клеток, то в 1000 мм3 - 250 000 клеток, а с учетом разведения клеток в 10 раз общее число ядросодержащих клеток в 1 мл составит 50х106. По упрощенной схеме подсчета полученное среднее число клеток делят на 4 и умножают на 105. Для определения общего числа ядросодержащих клеток в органе количество клеток в 1 мл умножают на количество среды, в которой был суспензирован орган или ткань.
Х = А / 4 × 105,
где Х - количество клеток в 1 мл клеточной суспензии; А - количество клеток в 25 квадратах.
Для определения общего числа ядросодержащих клеток в органе количество клеток в 1 мл умножают на количество среды, в которой были суспендированы орган или ткань.
Определение жизнеспособности клеток
Определение жизнеспособности клеток производится методом суправитальной окраски 0,1% раствором трипановой сини.
Hа предметное стекло наносят каплю взвеси клеток и 1 каплю 0,1% раствора трипановой сини. Через 30-60 с окрашенную каплю взвеси покрывают покровным стеклом. Избыток суспензии удаляют промакиванием фильтровальной бумагой и под микроскопом подсчитывают число живых (неокрашенных) и погибших (синих) клеток на 100 кариоцитов. Выводят процент гибели клеток.
Раствор трипановой сини готовят заранее. Порошок растворяют в бидистиллированной воде из расчета получения 0,2% раствора, который фильтруют. Это маточный раствор. Рабочий раствор приготовляют перед опытом: маточный раствор разбавляют 4,25% раствором хлористого натрия до нужной концентрации (1 капля гипотонического физиологического раствора + 3 капли трипановой сини).
Вопросы и задания
1. Дайте определение инбредных животных.
2. Опишите принцип получения конгенных линий мышей.
3. Какие биологические материалы используются для исследования иммунной системы?
4. Перечислите основные этапы получения клеток костного мозга у мышей.
5. Перечислите основные этапы выделения клеток из периферических органов мышей.
6. Как подсчитать количество клеток в 1 мл клеточной суспензии и определить жизнеспособность клеток?
Глава 2 Методы разделения клеток периферической крови человека
Для изучения функциональной активности лимфоцитов и других клеток крови необходимы эффективные способы их разделения (рис. 2.1). Идеальные методы разделения характеризуются незначительной степенью потерь клеток при высокой степени очистки, сохранением физиологической активности выделенных клеток. В основе методов выделения клеток лежат два главных принципа.
1. Разделение клеток по их физическим свойствам, например по размерам, плотности или заряду.
2. Разделение клеток по поверхностным антигенам.
Рис. 2.1. Основные методы разделения клеток
Среди разнообразных способов разделения клеток крови наибольшее распространение получили гравитационные, основанные на различной удельной плотности клеток крови, которые различаются между собой следующим образом: эритроциты > нейтрофилы и эозинофилы > лимфоциты и моноциты > тромбоциты.
2.1. ВЫДЕЛЕНИЕ ЛЕЙКОЦИТОВ
Принцип метода. Для осаждения эритроцитов из периферической крови применяют растворы декстрана, желатины и др. Гепаринизированную кровь смешивают с 6% раствором декстрана или 0,3% раствором желатины в соотношении 1:5. Смесь в пробирке отстаивают 30-40 мин под углом 45° в термостате при температуре 37 °С до осаждения эритроцитов. Плазму, обогащенную лейкоцитами, отбирают, примесь эритроцитов лизируют. Выделенные клетки отмывают центрифугированием в растворе Хенкса или культуральной среде 199 при 1000 об/мин в течение 5 мин.
2.2. ВЫДЕЛЕНИЕ МОНОНУКЛЕАРНЫХ КЛЕТОК
Мононуклеарные клетки выделяют (рис. 2.2, см. также цв. вклейку) из периферической крови человека по методу Boyum (1968), основанному на седиментации в одноступенчатом градиенте плотности фиколл-урографина. Фиколл в данной смеси выступает как агент, агрегирующий эритроциты, а изопак (или урографин) нужен для создания изотоничности и плотности 1,077 г/см3.
Принцип метода. Гепаринизированную кровь разводят в 3 раза культуральной средой и аккуратно наслаивают на градиент фиколлурографина. Кровь задерживается над фиколлом и не смешивается с ним. Постепенно эритроциты склеиваются фиколлом и опускаются на дно пробирки. Гранулоциты, имеющие плотность большую, чем седиментирующий раствор, оседают вместе с эритроцитами. Лимфоциты вместе с моноцитами остаются в интерфазе, их собирают, переносят в другую пробирку и отмывают центрифугированием.
Метод не дает выхода более 90% клеток.
Рис. 2.2. Выделение мононуклеарных клеток в одноступенчатом градиенте плотности фиколл-урографина
Лабораторная работа 2-1
1. 10 мл гепаринизированной крови человека (20-25 ЕД гепарина на 1 мл крови) разводят в 3 раза (1 часть крови и 2 части питательной среды 199).
2. Разведенную кровь наслаивают на раствор фиколл-урографина (плотность 1,077 г/см3) в соотношении 1:3 (1 часть фиколла и 3 части разведенной крови). Кровь остается над раствором фиколла и не смешивается с ним.
3. Проводят центрифугирование при комнатной температуре в течение 45 мин на центрифуге с горизонтальным ротором при 400 g.
Следует иметь в виду, что для определения необходимого числа оборотов в конкретных условиях центрифугирования или получения соответствующего центробежного ускорения одну из необходимых величин (ускорение или число оборотов) находят по формуле:
где g - центробежное ускорение; n - число оборотов в минуту; r - радиус от центра оси до границы разделяемых сред.
4. После центрифугирования собирают интерфазное кольцо, содержащее мононуклеарные клетки, в отдельную пробирку. Эритроциты склеиваются фиколлом и оседают на дно пробирки вместе с гранулоцитами (см. рис. 2.2).
5. Суспензию мононуклеарных клеток трижды отмывают средой 199, центрифугируя по 10 мин при 200 g.
6. Клетки ресуспендируют в 1 мл культуральной среды. Подсчет клеток осуществляют в камере Горяева. Жизнеспособность клеток определяют с помощью 0,1% раствора трипанового синего. Необходимо подсчитать процент выхода жизнеспособности клеток (более 90%). Для этого подсчитывают начальное количество клеток и количество выделенных клеток.
2.3. ВЫДЕЛЕНИЕ МОНОЦИТОВ
Лабораторные методы выделения моноцитов разнообразны, но основные методические приемы преимущественно связаны с фракционированием моноцитов по способности прилипать к стеклу или пластиковой поверхности или по способности при центрифугировании к локализации в определенных зонах ступенчатого градиента.
Выделение моноцитов по способности прилипать к стеклу или пластику
Принцип метода. Моноциты периферической крови человека получают выделением мононуклеарных клеток по методу Воуит с последующим их фракционированием на прилипающие (ПК) и неприлипающие клетки (НПК). Для получения моноцитов мононуклеарные клетки, выделенные в одноступенчатом градиенте фиколлурографина, разделяют на ПК и НПК, используя способность клеток моноцитарно-макрофагального ряда прилипать к стеклу и пластику. Для этого суспензию мононуклеаров в концентрации 2χ106 кл/мл культивируют в среде 199, содержащей 20% сыворотку эмбриона коровы (СЭК), при 37 °С в пластиковых чашках Петри. Через 40 мин собирают НПК, а ПК снимают со дна чашки охлажденным (4-6 °С) раствором Версена, который заливают по 1 мл в чашку сразу после удаления надосадочной жидкости. Через 1-2 мин собирают ПК, помещают в силиконированные центрифужные пробирки и центрифугируют при 200 g в течение 10 мин. Удаляют надосадочную жидкость и ПК ресуспендируют в среде 199 с 10% СЭК.
Метод Рекалде
Принцип метода. Данный метод выделения моноцитов основан на центрифугировании лейкоцитов в гипертоническом градиенте плотности фиколл-урографина (Recalde Н., 1984).
Лабораторная работа 2-2
Постановка метода Рекалде
1. Кровь осторожно перемешивают с 6% раствором декстрана Т-500 («Pharmacia», Швеция), приготовленном на физиологическом растворе из расчета: 1 объем декстрана на 5 объемов крови.
2. Кровь отстаивается в течение 30 мин (15 мин при 37 °С, затем 15 мин при комнатной температуре).
3. Осторожно собирают плазму, обогащенную лейкоцитами (лейкомасса). К полученной лейкомассе трехкратно добавляют раствор NaС1 по следующей схеме:
•  0 мин - добавляют 9% NaС1 из расчета 5 мкл на 1 мл лейкомассы, инкубация 10 мин при 37 °С;
•  11-я минута - добавляют 9% NaС1 из расчета 10 мкл на 1 мл лейкомассы, инкубация 10 мин при 37° С;
•  21-я минута - добавляют 9% ?С1 из расчета 10 мкл на 1 мл лейкомассы, инкубация 10 мин при 37 °С.
Общее время инкубации составляет 30 мин.
4. К лейкомассе добавляют равный объем раствора Хенкса, соответствующей осмомолярности, полученный путем добавления 25 мкл 9% раствора NaС1 на каждый миллилитр стандартного раствора Хенкса.
5. Немедленно проводят выделение моноцитов на гипертоническом градиенте плотности. Для этого в стандартный раствор фиколлурографина добавляют кристаллический NaС1 из расчета 2,8 мг на каждый миллилитр раствора фиколл-урографина (удельная плотность 1,078 г/см3). Конечная плотность раствора составляет 1,080 г/см3. В силиконированные пробирки на один объем гипертонического градиента осторожно наслаивают 3 объема подготовленной лейкомассы.
6. Пробирки центрифугируют в течение 25 мин при 400 g при комнатной температуре в центрифуге с горизонтальным ротором. После центрифугирования моноциты концентрируются в интерфазном кольце.
7. Моноциты из интерфазы переносят в силиконированные пробирки и дважды отмывают средой 199, содержащей 5% СЭК. Режим центрифугирования - 10 мин при 200 g.
8. Клетки ресуспендируют в питательной среде RPMI-1640, содержащей 1% L-глютамина, 40 мкг/мл гентамицина и 10% СЭК. Количество моноцитов определяют подсчетом в камере Горяева. Жизнеспособность клеток оценивают с помощью 0,1% раствора трипанового синего.
2.4. ВЫДЕЛЕНИЕ НЕЙТРОФИЛОВ
Для выделения нейтрофилов из периферической крови можно использовать несколько методов.
Выделение нейтрофилов в двойном градиенте плотности фиколл-урографина
Принцип метода. Для предотвращения активации нейтрофилов во время выделения рекомендуется проводить все манипуляции при 4 °C. Используют фиколл-урографин ρ = 1,077 г/см3 и ρ = 1,119 г/см3. Вначале создают двойной градиент фиколл-урографина: первым в пробирку вносят раствор фиколл-урографина, имеющий плотность ρ = 1,119 г/см3, затем на него аккуратно наслаивают раствор фиколла с плотностью ρ = 1,077 г/см3. Гепаринизированную кровь наслаивают на двойной градиент фиколл-урографина, центрифугируют 45 мин при 400 g. После центрифугирования получают кольца мононуклеарных клеток (верхнее) и нейтрофилов (нижнее), а в осадке находятся эритроциты. Полученное кольцо мононуклеарных клеток в зависимости от характера эксперимента удаляют или отбирают в чистую центрифужную пробирку и отмывают культуральной средой. Нейтрофильное кольцо отбирают и переносят в чистую пробирку, содержащую среду, свободную от ионов Ca2+ и Mg2+. Клетки дважды отмывают, центрифугируя 10 мин при 200 g. Присутствующие эритроциты можно лизировать. Для уменьшения примеси эритроцитов и повышения доли нейтрофилов нужно вначале проинкубировать гепаринизированую кровь с 6% раствором декстрана и затем полученную взвесь клеток наслоить на двойной градиент фиколл-урографина (получают два кольца клеток, см. выше) или на одинарный градиент плотности фиколл-урографина (ρ = 1,077 г/см3). В последнем случае нейтрофилы присутствуют в осадке вместе с эритроцитами, которые впоследствии лизируют. При использовании обоих вариантов метода содержание нейтрофилов в полученной клеточной суспензии составляет около 95% (рис. 2.3, см. также цв. вклейку).
Выделение нейтрофилов в градиенте плотности перколла
Перколл представляет собой взвесь коллоидных частиц двуокиси кремния, покрытых поливинилпирролидоном, что делает частицы нетоксичными. Обычно коммерческий препарат перколла разбавляют культуральной средой для сохранения изотоничности раствора.
Используют растворы перколла разной концентрации. Вначале на 63% раствор перколла наслаивают 72% раствор перколла, а затем - гепаринизированную кровь. После центрифугирования, кроме кольца мононуклеарных клеток, получают кольцо гранулоцитов и осадок эритроцитов. Кольцо, содержащее гранулоциты, переносят в другую пробирку, клетки отмывают и подсчитывают их число.
Рис. 2.3. Выделение нейтрофилов в двухступенчатом градиенте плотности фиколл-урографина
2.5. АНАЛИТИЧЕСКАЯ И ПРЕПАРАТИВНАЯ ЦИТОФЛУОРИМЕТРИЯ
Метод проточной цитофлуориметрии, предложенный в начале 1970-х годов, широко используется в медико-биологических и клинических исследованиях. Востребованность цитометрии объясняется быстротой, точностью и надежностью метода. Определение фенотипа каждой клетки в сочетании с анализом большого количества событий дает максимально полную информацию в кратчайшие сроки.
Принцип метода. Используются проточные цитометры разных фирм. При проведении исследования клетки, окрашенные тем или иным флуоресцентным красителем, вводят с потоком буферного раствора в вибрирующую проточную камеру с форсункой. В каждой капле жидкости, выходящей из форсунки, содержится одна клетка. Источник света (чаще всего лазер) освещает отдельные клетки в проходящей через световой пучок тонкой струе жидкости. Исходный световой луч рассеивается клеткой. Это рассеяние измеряется с помощью фотоэлектронного умножителя (ФЭУ). Рассеяние света под малыми углами (переднее рассеяние - forward scatter) может быть использовано для определения размеров клетки. На основе данного параме-
тра можно отличить жизнеспособные ядерные клетки от мертвых и эритроцитов. Рассеяние света под углом 90° (боковое рассеяние - side scatter) позволяет судить о соотношении размеров ядра и цитоплазмы и наличии гранул в клетке. Полученные характеристики позволяют разделить анализируемые лейкоциты на лимфоциты, моноциты, нейтрофилы. Одновременно можно проводить анализ поверхностных и внутриклеточных антигенов клеток с помощью моноклональных антител к ним, конъюгированных с различными флуоресцентными метками. Если анализируемая клетка содержит флуорохром, то он испускает излучение соответствующих параметров, при этом интенсивность флуоресценции коррелирует с плотностью антигена на клеточной поверхности, а уровень флуоресценции измеряется с помощью ФЭУ (рис. 2.4, см. также цв. вклейку).
В практике широко используются два флуоресцентных красителя - флуоресцеин-5-изотиоционат (ФИТЦ) и R-фикоэритрин (ФЭ). Они возбуждаются аргоновым лазером с длиной волны 488 нм и излучают флуоресценцию в разных диапазонах волн: ФИТЦ излучает свет в «зеленом» спектре, а ФЭ - в «оранжево-красном». Красители различаются как по специфичности их молекулярного связывания, так и по оптическим характеристикам, таким, как спектр поглощения, возбуждение флуоресценции и др. В настоящее время спектр используемых флуорохромов расширился (табл. 2.1).
Таблица 2.1. Основные используемые флуорохромы
Окончание табл. 2.1
Проточный цитометр включает три основных блока:
1) оптический, где производится измерение;
2) блок обработки сигналов, где сигналы усиливаются и преобразуются в электрические;
3) блок сбора и обработки данных (см. рис. 2.4).
Оптические системы
Источником света обычно служит лазер. Он способен направить на клетку интенсивный световой сигнал и создать чувствительную систему детекции.
Световой сигнал проходит через соответствующие линзы и зеркала и попадает на ФЭУ. На этой стадии передачи сигнала используются
оптические фильтры для выделения света с определенной длиной волны, благодаря чему на каждый детектор попадает только избранный тип светового сигнала, например зеленое или красное излучение клеток при флуоресценции или рассеянный свет. Оптический блок предназначен для измерения рассеяния света и флуоресценции. Современные цитометры оборудованы несколькими фотоэлектронными умножителями, что позволяет одновременно регистрировать несколько типов флуоресценции.
Рис. 2.4. Устройство проточного цитометра
Система сбора и обработки данных
Сигналы, поступающие от детекторов, усиливаются, их амплитуды измеряются и анализируются в цифровой форме для каждой клетки отдельно. Ограничения, накладываемые на регистрируемый параметр, называются окнами («gate»). Окна выделяются автоматически или вручную (рис. 2.5, см. также цв. вклейку). Результаты анализа используются для построения распределений исследованных клеток по их характеристикам. Эти распределения называют гистограммами.
Рис. 2.5. Выделение окон лимфоцитов, моноцитов, нейтрофилов по светорассеянию
Применение метода проточной цитометрии
Рис. 2.6. Проточный цитофлуориметр
Современные проточные цитометры обладают высокой чувствительностью, высоким уровнем автоматизации, просты в эксплуатации, имеют небольшие размеры (рис. 2.6, см. также цв. вклейку). Проточная цитометрия стала незаменимым методом диагностики различных иммунопатологических состояний в клинической практике: успешно используется в гематологических лабораториях, для оценки иммунного статуса, в онкологии. Метод позволяет:
•  проводить иммунофенотипирование клеток: дифференцировать популяции лейкоцитов, определять субпопуляционный состав лимфоцитов;
•  оценивать функциональную активность клеток;
•  проводить анализ клеточного цикла и плоидности клеток;
•  проводить анализ программируемой клеточной гибели (апоптоза);
•  определять внутриклеточные и растворимые формы цитокинов;
•  оценивать фагоцитарную активность клеток;
•  проводить анализ биологических жидкостей (секреты, слюна и др.);
•  проводить количественное и качественное исследование pH, концентрации свободных ионов кальция, уровня окислительных процессов;
•  осуществлять мониторинг иммунодефицитных состояний, проводить онкогематологические исследования.
Количественное определение субпопуляций лимфоцитов с помощью проточной лазерной цитометрии с использованием моноклональных антител
Фенотипирование лимфоцитов широко применяется в клинической иммунологии. В основе метода лежит взаимодействие моноклональных антител, меченных флуоресцентной меткой, с поверхностными антигенами лимфоцитов и последующий анализ образцов на проточном цитометре. Возможно использование одного моноклонального антитела, меченного флуорохромом, или двух различающихся по специфичности моноклональных антител, меченных разными флуорохромами (рис. 2.7). Определяют процент клеток, несущих на своей поверхности искомый антиген, и среднюю интенсивность свечения, которая характеризует выраженность экспрессии исследуемого антигена. Для проведения исследования можно использовать как цельную кровь, так и предварительно выделенные
из периферической крови обследуемого лейкоциты или мононуклеарные клетки. Разработаны многоцветовые цитометры.
Рис. 2.7. Дот-анализ: двойное окрашивание по CD3 и CD4
Лабораторная работа 2-3
1. Получают гепаринизированную периферическую венозную кровь (20-25 ЕД гепарина на 1 мл крови) в объеме 5 мл.
2. Лейкоциты выделяют из периферической крови. Для этого добавляют в пробирку 0,3% раствор желатины, перемешивают и инкубируют в термостате 30 мин при 37 °С для осаждения эритроцитов. Собирают лейкомассу. Клетки отмывают полной культуральной средой, центрифугируя при 1000 об/мин в течение 10 мин. Процедуру отмывки проводят дважды.
3. К клеточному осадку добавляют 50 мкл полной культуральной среды. Затем в каждую пробирку вносят по 50 мкл предварительно разведенного образца нужных моноклональных антител (монАТ), меченных флуорохромами. Одна пробирка (контроль) содержит только клетки и полную культуральную среду.В остальные пробирки добавляют монАТ - CD3, CD4, CD8, CD19 и другие в зависимости от цели эксперимента.
4. Пробирки инкубируют 30 мин при 4 °С.
5. Клетки отмывают от излишних монАТ в полной культуральной среде центрифугированием при 1000 об/мин в течение 5 мин.
6. Оставшиеся в пробе эритроциты лизируют, добавляя к клеточному осадку лизирующий раствор, состоящий из 0,8% раствора NH4Cl, 0,1% раствора NaHCO3, 0,0037% натриевой соли ЭДТА (рН = 7,2-7,4).
7. Проводят встряхивание проб на шейкере 1 мин.
8. Образцы центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин. Надосадочную жидкость сливают, добавляют полную культуральную среду и повторяют центрифугирование в том же режиме.
9. Для фиксации меченых клеток в каждую пробу добавляют по 100 мкл 2% параформальдегида и инкубируют 30 мин при 4 °С.
10. Анализ образцов проводят на проточном цитометре. Содержание основных субпопуляций лимфоцитов в периферической крови здоровых людей представлено в табл. 2.2.
Выделение клеток методом проточной цитометрии
На основе параметров, измеряемых с помощью проточной цитометрии, можно проводить сепарацию клеток. Проанализированные клетки перемещаются в каплю, которой придается положительный/ отрицательный заряд, или в нейтральную каплю (процесс контро-
лируется компьютерной программой). Капли с флуоресцирующими клетками заряжаются положительно, а с нефлуоресцирующими - отрицательно. Капля проходит между противоположно заряженными электродами и отклоняется вправо или влево в зависимости от своего заряда. Уровень чистоты клеточных фракций, разделенных с помощью клеточного сортера, доходит до 99%.
Таблица 2.2. Содержание основных субпопуляций лимфоцитов в периферической крови здоровых людей разного возраста
2.6. ИММУНОМАГНИТНАЯ СЕПАРАЦИЯ КЛЕТОК
Магнитная сепарация клеток становится стандартным и широко используемым методом, дающим надежные и воспроизводимые результаты, применяемым как для научных исследований, так и в клинической лабораторной практике.
Принцип метода. Магнитная сепарация клеток основана на использовании парамагнитных бус (микросфер), покрытых монАТ против поверхностного антигена, специфичного для интересующих клеток. Магнитные бусы имеют диаметр около 50 нм, невидимы при световой микроскопии, подвергаются биодеградации и не травмируют клетки. Поскольку размер микросфер чрезвычайно мал, то для удержания меченых клеток необходимо наличие высокоградиентного магнит-
ного поля. Для успешного разделения клеток чрезвычайно важно, чтобы микробусы после воздействия магнитного поля не проявляли остаточной намагниченности. Использование однородных по размеру и форме микробус обеспечивает: быстрое и эффективное связывание клеток; минимизацию неспецифического связывания; хорошо воспроизводимые результаты.
Метод позволяет осуществлять выделение интересующей популяции клеток из цельной крови, образцов клеток костного мозга или мононуклеарной суспензии, что обеспечивает быстрый и прямой доступ к максимальному числу целевых клеток. Частицы добавляют непосредственно к образцу биологической жидкости. После 10- 20-минутной инкубации пробирка с образцом помещается в магнитный сепаратор, где клетки интересующей популяции, связанные с магнитными частицами, улавливаются, а в супернатанте остаются не связавшиеся с микробусами клетки. При этом поддерживаются оптимальные условия жизнеспособности и функционирования клеток. Выделенные целевые клетки ресуспендируют в солевом буферном растворе и анализируют согласно протоколу исследования. При необходимости магнитные частицы впоследствии отделяются от исследуемых клеток (рис. 2.8, см. также цв. вклейку).
Метод магнитной сепарации предоставляет неограниченные возможности по выделению любой интересующей клеточной популяции. Иммуномагнитные микробусы позволяют осуществить либо положительную, либо отрицательную селекцию нужных клеток (как из клеточной суспензии, так и из цельной крови). При положительной селекции выделяемые клетки связываются с бусами, покрытыми монАТ, поверхностными маркерами данного типа клеток, а лишние клетки удаляются. При отрицательной селекции с магнитными микробусами, нагруженными монАТ, связываются клетки, которые нужно удалить. Выделяемая популяция клеток остается в клеточной суспензии. Оба типа селекции можно провести двумя способами.
1. Прямой метод - клетки инкубируют с микробусами, нагруженными моноклональными антителами к клеточным антигенам.
2. Непрямой метод - клетки на первом этапе инкубируют с первичными антителами к клеточным антигенам, которые бывают:
а) немечеными;
б) конъюгированы с биотином;
в) конъюгированы с флюорохромом.
Рис. 2.8. Иммуномагнитная сепарация: а - основные этапы; б - магнитные бусы; в - пример магнитного штатива
• На втором этапе клетки инкубируют с вторичными антителами к иммуноглобулину (в случае использования неконъюгированных первичных антител), антителами к биотину или микробусами, конъюгированными со стрептавидином (в случае использования первичных антител, конъюгированных с биотином) или антителами к флюорохрому (в случае использования первичных антител, конъюгированных с флюорохромом). Существует несколько типов парамагнитных бус: частицы, конъюгированные с первичными антителами, - это готовые к использованию микробусы, связанные с моноклональными антителами, высокоспецифичными к определенным поверхностным маркерам клеток человека и мыши;
•  частицы, конъюгированные с вторичными антителами, - это частицы, связанные с очищенными вторичными антителами, позволяющие использовать любые мышиные, крысиные или кроличьи первичные антитела для выделения целевой популяции клеток;
•  неконъюгированные бусы - частицы для прямого ковалентного связывания специфических антител и лигандов.
Метод позволяет получить высокоочищенные фракции как меченых, так и немеченых клеток с гарантированным оптимальным выходом. При этом клетки по параметрам жизнеспособности готовы для последующих экспериментов. Очистка клеточной суспензии занимает сравнительно мало времени (30-40 мин). Полученные клетки можно исследовать с помощью микроскопии, метода проточной цитометрии, культивирования in vitro и использовать для других методов иммунного анализа.
Вопросы и задания
1. На каких свойствах основано разделение клеток периферической крови?
2. Приведите последовательность этапов получения мононуклеарных клеток.
3. Как можно выделить популяцию моноцитов из периферической крови человека?
4. Каким образом одновременно можно разделить мононуклеарные клетки, нейтрофилы, тромбоциты и эритроциты?
5. Представьте последовательность этапов выделения нейтрофилов из периферической крови и оценки их фагоцитарной активности.

Глава 3. Методы изучения функциональной активности клеток иммунной системы in vitro и in vivo
3.1. ОЦЕНКА ПРОЛИФЕРАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ ЛИМФОЦИТОВ
Лимфоциты - единственный тип клеток крови, для которых пролиферация в периферических тканях является физиологической нормой и обязательным этапом в развитии иммунного ответа. Поэтому количественная оценка пролиферативной активности лимфоцитов в спланированных экспериментальных условиях может служить мерой реактивности лимфоцитов на тот или иной внешний стимул. Если такой внешний стимул - специфический антиген, то уровень пролиферативного ответа лимфоцитов допустимо расценить как показатель иммуногенности препарата, содержащего антиген (способности вызывать на себя иммунный ответ), или численности клона(ов), реагирующих на данный антиген лимфоцитов.
Существуют вещества, которые называют митогенами за их способность вызывать деление клеток. Митогены обусловливают поликлональную или олигоклональную пролиферацию лимфоцитов. Первым случайно обнаруженным в процессе рутинных работ в банке крови по гемагглютинации эритроцитов митогеном лимфоцитов стал лектин фитогемагглютинин (ФГА) из обыкновенной фасоли Phaseolus vulgaris, способный агглютинировать эритроциты только определенного серологического типа. ФГА - сильный митоген, индуцирующий переход клеток из стадии G2 в митоз. Впервые ФГА выделен из фасоли П. Новеллом в 1960 г. С тех пор появился новый метод оценки пролиферативной активности лимфоцитов человека и экспериментальных животных, получивший название бласттрансформация. Оказалось, ФГА вызывает митотическое деление преимущественно Т-лимфоцитов. Также преимущественное митогенное действие в отношении Т-лимфоцитов оказывает лектин конканавалин А, выделенный из растений семейства бобовых
Canavalia ensiforme. В последнее время получили широкое распространение моноклональные антитела (монАТ) против CD3 или CD28 антигенов (как наиболее мощные поликлональные стимуляторы Т-лимфоцитов).
Митоген (pokeweed mitogen) из корня растения лаконоса Phytolacca americana стимулирует пролиферацию и В- и Т-лимфоцитов, а кроме того вызывает поликлональную продукцию иммуноглобулинов В-лимфоцитами. Пролиферацию преимущественно В-лимфоцитов вызывают препараты липополисахаридов (ЛПС) эндотоксинов из грамотрицательных бактерий.
Методы оценки пролиферативной активности лимфоцитов в культуре in vitro рассчитаны на выявление и измерение уникального для клеточного деления процесса - удвоения ДНК в S-фазе митоза.
Методов существует несколько.
1. Исторически первый метод - микроскопический (морфологический). Клетки, прошедшие S-фазу, но еще не прошедшие митоз, имеют двойное количество ДНК и остальных компонентов хромосом. Соответственно вся клетка больше по размеру, чем неделящиеся клетки, что хорошо видно на препаратах мазков или даже в живой культуре под световым микроскопом. Микроскопический метод детекции клеток в S-фазе называют «реакцией бласттрансформации» и в настоящее время используют по крайней мере для демонстрации бластных и других форм лимфоцитов. Помимо поликлональной активации Т- и В-лимфоцитов, достаточно широко используются методы, основанные на стимуляции антиген/аллерген- специфических клонов Т- и В-клеток. Естественно, что в последнем случае число трансформированных клеток может быть мало. Для их подсчета морфологический метод не пригоден.
В лабораторной генетике реакцию бласттрансформации лимфоцитов применяют с целью визуализации хромосом и анализа кариотипа человека. Для остановки клеточного цикла на стадии митоза используют колхицин.
2. Колорометрический метод. Он основан на использовании внутриклеточных прижизненных красителей, включаемых в цепи ДНК. Это, например, MTT - 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил тетразолиум бромид.
3. Микроцитофлуорометрический метод (FACS). Он основан на использовании флюоресцентных красителей, включаемых в цепи ДНК, с оценкой на проточном цитометре.
4. Радиоизотопный метод. Он основан на использовании меченых нуклеотидов, включаемых в состав только ДНК, в частности тимидина (3H-Td) - β-излучатель, уридина 14C-Td - γ-излучатель или 131I-дезоксиуридина - γ-излучатель.
«Золотым стандартом» для оценки пролиферации является последний метод - радиоизотопный, поскольку с его помощью подсчитывают не только клетки, находящиеся в данный момент в S-фазе, но и уже поделившиеся дочерние клетки, которые другие названные методы уже «не видят». Опишем кратко метод оценки пролиферации по включению 3Н-тимидина.
A. Создают экспериментальную систему стимуляции лимфоцитов in vitro: это может быть внесение антигена, митогена или других стимулирующих агентов (цитокины, антитела против поверхностных антигенов и др.). Время культивирования лимфоцитов зависит от стимулятора: для митогенов - обычно 72 ч, для антигена - до 6- 7 сут.
Б. За 4-24 ч до остановки эксперимента in vitro вводят меченый тимидин. Чаще всего используют метил-3Н-тимидин. Удельная радиоактивность препарата - около 1-2 Кю/мкмоль. Если удельная активность коммерческого препарата выше, то его разводят «холодным» (т.е. нерадиоактивным) тимидином до заданной величины, чтобы избежать «тимидинового самоубийства» живых клеток. Готовят матричный раствор тимидина в культуральной среде: как правило, его концентрация составляет 20 мкКю/мл. Если эксперимент проводят in vitro в лунках с объемом 200 мкл, то в каждую лунку вносят по 25 мкл матричного раствора 3Н-тимидина, что создает его рабочую концентрацию 0,5 мкКю на лунку. Количество клеток в лунке при этом, как правило, составляет 1-5×105.
B. По завершении культивирования в присутствии 3Н-тимидина клетки удаляют из лунок прибором харвестером на непроницаемые для клеток микропористые фильтры, геометрически соответствующие формату лунок культуральных плашек. Фильтры промывают от невключившегося в клеточную ДНК 3Н-тимидина, после чего сушат при 60-80 °С под инфракрасной лампой или феном.
Г. Каждый фильтр помещают в индивидуальный флакон с сцинтилляционной жидкостью и в специальном счетчике β-частиц просчитывают число импульсов в минуту (срт) и определяют индекс стимуляции. Его значение и является количественным показателем уровня пролиферации исследуемых клеток. Показатели эксперимен-
тальных лунок сравнивают с контрольными и рассчитывают статистическую достоверность различий.
3.2. ОЦЕНКА КЛЕТОЧНОЙ ЦИТОТОКСИЧНОСТИ
Классический феномен цитотоксичности - способность Т-лимфоцитов распознавать клеточные элементы, несущие признаки генетической чужеродности (в частности, клетки, модифицированные вирусом, опухолевые клетки, аллогенные и ксеногенные клетки), и уничтожать их. NK-клетки, в отличие от Т-лимфоцитов, распознают как чужеродные клетки организма, утратившие антигены главного комплекса гистосовместимости (молекулы МНС). Другие клетки (например, В-лимфоциты, моноцитарно-макрофагальные клетки, эозинофилы, нейтрофилы и т.п.) также способны к цитотоксичности, но эта функция связана с привлечением антител против клеткимишени - КМ (антителозависимая клеточная цитотоксичность), цитокинов (ФНОа) и иных агентов. В физиологических условиях, т.е. в норме, цитотоксичность клеток иммунной системы направлена на разрушение и элиминацию стареющих и поврежденных клеток, таким образом обеспечивая клиренс многоклеточного организма от отживших клеток и продуктов их распада.
Основные клетки, обладающие цитотоксичностью, - антигенспецифические цитотоксические лимфоциты (ЦТЛ), NK (естественные киллеры), а также клетки миелоидного ряда (макрофаги, нейтрофилы).
Цитотоксическая активность клеток-киллеров реализуется при непосредственном синаптическом контакте лимфоцита (клеткиэффектора - КЭ) с КМ. При этом в КМ индуцируется апоптоз.
В зрелом дифференцированном цитотоксическом лимфоците формируются гранулы, содержащие перфорин и гранзимы. После образования синапса между КЭ и КМ гранулы концентрируются в области контакта и затем освобождаются в направлении КМ. Перфорин при контакте с мембраной КМ полимеризуется и встраивается в мембрану, формируя в ней пору диаметром около 100 Ǻ. В эту пору проникают гранзимы - ферменты, инициирующие апоптоз КМ.
Индукция апоптоза в КМ также может происходить через CD95 молекулы (другое название Fas), содержащие домен смерти. Лигандом CD95 служит молекула FasL (CD178), экспрессируемая на ЦТЛ, NK-клетках. В некоторых случаях КЭ сами становятся «жертвой» Fas-опосредованного апоптоза. Экспрессируя Fas-молекулы,
они могут проконтактировать с клетками, несущими Fas-лиганд, например, при потытке преодолеть гематоэнцефалический барьер. Повышенная экспрессия Fas (CD95) молекул на активированных лимфоцитах демонстрирует их способность к апоптозу при несостоявшихся физиологических процессах пролиферации и дифференцировки после активации. Считается, что такой процесс может привести к феномену, обозначенному как иммунодефицит, вызванный активацией (Ковальчук Л.В., Чередеев А.Н.).
В системе in vitro степень разрушения КМ приближается к лизису. Методов оценки функциональной активности ЦТЛ существует несколько, однако «золотым стандартом» до сих пор считается «хромовый тест». Под «хромом» имеют в виду соль хромата натрия, содержащую радиоактивный изотоп хрома - Na251CrO4, которую используют для мечения КМ. Такую метку подобрали опытным путем как относительно удовлетворяющую следующим критериям: свободно проникать в живые клетки и не выходить оттуда, пока клетка жива. Метка не вступает в прочные соединения с внутриклеточными структурами и имеет возможность выйти во внеклеточную среду из погибающей КМ.
Выбор КМ - отдельная творческая задача, которую экспериментально решают в соответствии с целями конкретного исследования. Чаще всего в качестве КМ используют опухолевые или зараженные вирусом клетки. Когда КМ выбраны, дальнейшая схема эксперимента кратко представляет собой следующее.
Лабораторная работа 3-1
1. 1х106 КМ инкубируют в среде, содержащей изотоп Na251CrO4 (37×105 Bq или 100 мкКю, специфическая активность 5 мкКю/моль), при 37 °С в течение 1-1,5 ч, после чего тщательно отмывают от не вошедшего в клетки изотопа.
2. КМ подсчитывают и раскапывают в подобранной дозе в лунки культуральных круглодонных микропланшетов.
3. В те же лунки вносят КЭ. Соотношение КМ и КЭ обычно составляет от 1:10 до 1:500 в пользу КЭ.
4. Плашки подвергают мягкому центрифугированию - 150 g в течение 1 мин, после чего помещают в СО2-инкубатор при 37 °С на 4-6 ч.
5. По завершении культивирования плашки центрифугируют при 250 g в течение 5 мин для плотного осаждения клеток.
6. Супернатанты собирают в специальные пробирки, в которых радиоактивность подсчитывают в γ-счетчике.
7. В качестве контроля используют:
а) лунки с КМ, в которые не вносят КЭ, - это контроль спонтанного выхода метки;
б) лунки с КМ, в которые вместо КЭ вносят детергент Triton X-100 1% (v/v), - это контроль максимально возможного высвобождения метки из КМ.
Цитотоксичность в опытных лунках рассчитывают обычно по следующей формуле:
где CPM - это число импульсов в минуту соответственно в экспериментальных лунках (СРМn), в лунках со спонтанным высвобождением метки (СРМспонтанно) и в лунках с максимально возможным высвобождением метки (CPMmax).
Оценка цитотоксической активности с использованием проточной цитометрии
Кроме описанного «хромового» теста, существуют методики оценки клеточной цитотоксичности с использованием проточного цитофлуориметра. В данном случае для мечения клеток используют два реагента. Сначала метят КМ флуорохромом, который проникает в клетки, не повреждая их, и флуоресцирует, возбужденный лазерным излучением. Затем к КМ добавляют КЭ, инкубируют их совместно, чтобы дать возможность реализоваться киллерной атаке, и добавляют к смеси второй реагент, превращающийся во флуорохром только в живых клетках под действием их ферментов-эстераз. В результате в итоговой картине КЭ станут светиться одним цветом «живого флуорохрома», живые КМ будут двухцветными, погибшие КМ - одноцветными по первому флуорохрому.
Известен метод оценки антителозависимой клеточной цитотоксичности с использованием в качестве КМ эритроцитов (например, барана), покрытых IgG- антителами к ним. КЭ, несущие Fc-рецепторы к IgG, разрушают (лизируют) КМ, и по уровню освобождаемого в культуральную среду гемоглобина судят об активности таких киллеров (NK, В-клетки, моноциты, макрофаги и др.).
Определение перфорина методом ELISPOT
Белок перфорин является необходимым компонентом лизиса, осуществляемого ЦТЛ и NK-клетками для уничтожения КМ. Метод ELISPOT (см. гл. 4) широко применяется для определения выработки цитокинов антигенспецифическими Т-клетками. Метод ELISPOT достаточно чувствителен для выявления перфорина после активации ЦТЛ соответствующими антигенными эпитопами, например вирусными (потенциально годен для использования любой эпитоп). При выполнении данного метода на дне лунки пластикового планшета фиксируются монАТ к перфорину. Недостаток метода - отсутствие возможности определить фенотип клеток, секретирующей перфорин, что частично компенсируется обогащением фракции ЦТЛ магнитной сепарацией. В экспериментах с использованием иммуномагнитной сепарации показано: основную популяцию клеток, образующих «пятна», составляют CD8+
Т-лимфоциты (80-90%).
Связывание с тетрамерными структурами MHC класса I
Конструирование тетрамерных комплексов MHC класса I обеспечило создание быстрого, специфичного и высокочувствительного метода выявления и подсчета антигенспецифических CD8+ Т-клеток с помощью проточной цитофлуориметрии. Тетрамер состоит из молекул MHC класса I, нагруженных специфическим антигенным пептидом, связанных с биотином, которые затем прикрепляются к стрептавидину, меченному флуорохромом - ФИТЦ, ФЭ и др. (рис. 3.1, см. также цв. вклейку). Тетрамеры MHC класса I связываются с CD8+ субпопуляцией Т-лимфоцитов. Созданы тетрамеры MHC класса II, связывающиеся с CD4+ Т-лимфоцитами. Тетрамерные структуры характеризуются сниженной способностью связывания с молекулой CD8. Однако сохраняют способность специфически связываться с TКР, обеспечивая точное узнавание антигенспецифических Т-клеток. Количество выявляемых данным методом антигенспецифических клеток составляет менее 1% от всех CD8+-клеток.
Отдельное использование тетрамерного связывания не дает информации о фенотипе клеток или функции ЦТЛ, поэтому целесообразно параллельно проводить определение внутриклеточного содержания цитокинов, хемокинов и цитотоксических эффекторных молекул (перфорина, гранзимов), фенотипа специфических CD8+ Т-лимфоцитов.
Рис. 3.1. Тетрамерные структуры: а - строение тетрамерной структуры; б - связывание тетрамера ЦТЛ; в - пример результатов, полученных при анализе тетрамерных структур на проточном цитофлуориметре; ФИТЦ - флуоресцеин-5-изотиоционат; ФЭ - фикоэритрин
Использование методов цитофлуориметрического определения цитотоксической активности в комбинации с тетрамерным методом и иммунофенотипированием позволяет полно охарактеризовать популяции КЭ (ЦТЛ) и КМ. Данные методы - мощный инструмент для изучения кинетики киллерной активности ЦТЛ, они дают представление о фенотипе клеток и позволяют отслеживать физиологические изменения в КЭ и КМ
Определение каспаз методом проточной цитофлуорометрии
В результате запуска апоптоза, опосредованного перфорин/гран- зимовым и Fas/FasL механизмами, в КМ активируются каспазы. Данным методом определяют внутриклеточную активацию каспаз в КМ, используя белки, содержащие меченные флуорофором участки, подверженные расщеплению каспазами. Нерасщепленный флуорофор образует «молчащий» димер, после расщепления каспазами мономеры флуоресцируют.
Определение цитотоксической активности NK-клеток
NK составляют около 10-15% лимфоцитов периферической крови человека. NK - клетки врожденного иммунитета, в них не происходит перегруппировки генов I-клеточного рецептора (ТКР), кодирующих антигенраспознающие рецепторы. Функция NK - распознавание и уничтожение в организме клеток, пораженных вирусом, опухолевых клеток, лишенных МНС хозяина. NK проявляют функциональную активность без предварительной сенсибилизации и обладают так называемой естественной цитотоксичностью. Кроме того, NK способны уничтожать КМ, покрытые IgG антителами, вовлекая рецептор для IgG - FcγRIII (CD16). Такой тип цитотоксичности получил название антителозависимой клеточной цитотоксичности.
Функциональная активность NK оценивается по способности убивать КМ (например, клетки эритромиелоидной линии К562 человека, меченные радиоактивными изотопами 51Cr или 3Н-уридином).
Лабораторная работа 3-2
КМ К-562 метят изотопом 3Н-уридином (1 мкКи/мл) и инкубируют 1 ч при 37 °С. Затем клетки трижды отмывают культуральной средой, содержащей 10% СЭК. Отмытые КМ выдерживают в культуральной среде 2 ч при 37 °С и отмывают еще раз с целью удаления 3Н-уридина, не включившегося в РНК КМ. Готовят рабочую суспензию меченых КМ с таким расчетом, чтобы в 1 мл содержалось 1×106 КМ и 5 мкг панкреатической РНК-азы.
Цитотоксическую реакцию проводят в круглодонных 96-луночных микропланшетах. В каждую ячейку помещают по 100 мкл рабочей суспензии меченых КМ с РНК-азой и 100 мкл суспензии мононуклеарных клеток (рабочая концентрация - 1х107/мл). Используют различные соотношения КЭ:КМ - 100:1; 50:1; 25:1; 12,5:1. Клетки каждого разведения помещают как минимум в 3 лунки. В контрольных пробах меченые КМ инкубируют без мононуклеарных клеток.
Культуры инкубируют 14 ч при 37 °С и с 5% содержанием СО2. После инкубации содержимое лунок переносят на фильтры с помощью собирателя клеток - харвестра. Фильтры высушивают, помещают в сцинтилляционную жидкость, проводят учет реакции с помощью β-счетчика. Показатель функциональной активности естественных киллеров выражают в виде индекса цитотоксичности (ИЦ), который определяют по формуле:
Оценка функциональной активности NK-клеток с использованием проточной цитометрии
В качестве метки для КМ применяют флуоресцентный краситель 5-, 6-карбоксифлуоресцеин диацетатсукцинилмидиловый эфир (КФДЭ), который образует прочную ковалентную связь с внутриклеточными белками и в используемой концентрации не влияет на жизнеспособность клетки.
Первоначально нефлуоресцирующий КФДЭ проникает через клеточную мембрану. Карбоксифлуоресцеины связываются с внутриклеточными молекулами, формируя конъюгаты, обеспечивая стойкое флуоресцентное окрашивание клетки. Окрашенные таким образом КМ К-562 смешивают с КЭ и инкубируют в течение нескольких часов. После окончания культивирования клетки окрашивают пропидий йодидом для определения убитых в ходе реакции КМ. По количеству убитых К-562 определяют активность NK-клеток. Анализ проводят на проточном цитофлуориметре и определяют количество КМ, включивших КФДЭ (зеленое свечение), и количество убитых клеток, включивших пропидий йодид (красное свечение).
Антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность
In vivo случается чаще всего в патологических условиях и направлена на безъядерные клетки - эритроциты и тромбоциты, реже на ядросодержащие клетки крови, например нейтрофилы. Проявляются эти процессы в форме гемолитических анемий, тромбоцитопений, нейтропений. Этиология, как правило, либо инфекционная, либо лекарственная.
Комплементзависимая цитотоксичность
Микролимфоцитотоксический тест. Этот вариант иммунной цитотоксичности используют в качестве лабораторного теста в трансплантологии для оценки возможного наличия в крови реципиента антител к клеточным антигенам предполагаемого донора.
Тест проводят следующим образом.
1. У реципиента берут периферическую кровь, получают сыворотку и раскапывают, например, двукратные разведения этой сыворотки в лунки планшета.
2. У донора берут периферическую кровь, выделяют из нее лейкоциты или фракцию мононуклеаров (что лучше) и аликвоты клеток, например по 2×105 на лунку, раскапывают в лунки с разведениями сыворотки реципиента.
3. Планшеты инкубируют в СО2-инкубаторе при 37 °С в течение 45-60 мин.
4. Затем в лунки добавляют комплемент (заранее оттитрованную сыворотку кролика или морской свинки).
5. Продолжают инкубацию еще 30-45 мин.
6. Поврежденные клетки выявляют по включению суправитального красителя - трипанового синего, для чего из каждой лунки берут аликвоту клеток, добавляют к этой аликвоте 0,5% раствор трипанового синего и в камере Горяева подсчитывают число прокрашенных (поврежденных) и непрокрашенных (живых) клеток.
В случае если процент поврежденных клеток достоверно превышает таковой в контроле (т.е. в лунках, в которые не вносили сыворотку реципиента), то данный донор получает отвод.
После внедрения в клиническую практику трансплантологии этого теста трансплантологи значительно реже сталкиваются со случаями сверхострого отторжения трансплантатов.
В другом варианте микролимфоцитотоксический тест применяют для серологического типирования HLA специфичностей. Основные этапы теста указаны на рис. 3.2 (см. также цв. вклейку). В качестве КМ используют выделенные из крови пациента мононуклеарные клетки серотипирования HLA специфичностей класса I или очищенную фракцию В-клеток, например на колонке со стеклянной ватой, для тестирования специфичностей HLA класса II. Клетки инкубируют с панелью стандартных типирующих сывороток и после добавлениия комплемента определяют количество убитых и выживших клеток.
Рис. 3.2. Микролимфоцитотоксический тест (серотипирование HLA класса I)
3.3. ОЦЕНКА ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ
ФАГОЦИТОВ
Фагоцитарные клетки - основная группа клеток системы врожденного иммунитета. Они имеют миелоидное происхождение и обладают способностью к фагоцитозу. По морфологии и функции их разделяют на мононуклеарные клетки (моноциты/макрофаги) и нейтрофилы, что соответствует предложенному И.И. Мечниковым разделению на макро- и микрофаги. Роль фагоцитов в иммунном ответе крайне многообразна. Они выполняют ряд ключевых функций как во врожденном, так и в адаптивном иммунитете. Активация фагоцитов запускается через многие поверхностные рецепторы. Ведущая роль в активации фагоцитов отводится паттернраспознающим рецепторам врожденного иммунитета, таким, как Toll-подобные рецепторы, NOD-рецепторы, манозные рецепторы, рецепторы-«мусорщики», рецепторы комплемента и многие другие. Ответная реакция развивается быстро, не требует пролиферации и дифференцировки клеток.
Процесс активации обычно подразделяется на два этапа: прайминг и собственно активация. Суть прайминга заключается в том,
что предварительная обработка клеток небольшим количеством стимулятора (1-й сигнал), действие которого не вызывает прямую активацию, сопровождается увеличением ответа фагоцитов на второй сигнал. В результате активированные фагоциты выполняют следующие функции:
•  выработка активных форм кислорода (АФК);
•  генерация окиси азота;
•  хемотаксис;
•  фагоцитоз;
•  синтез и секреция цитокинов и других биологически активных медиаторных молекул (метаболитов арахидоновой кислоты, компонентов комплемента, факторов свертывания крови, белков матрикса, ферментов, противомикробных пептидов, гормонов и др.);
•  бактерицидная активность;
•  процессинг и презентация антигена («профессиональными» антигенпредставляющими клетками: дендритными, мононуклеарными фагоцитами).
Лабораторная работа 3-3
Определение фагоцитарной активности нейтрофилов и макрофагов
1. Для получения нейтрофилов мышам вводят внутрибрюшинно 3-4 мл 2-3% раствора пептона и через 2 ч животных умерщвляют с помощью хлороформа. Их вскрывают в асептических условиях. Из брюшной полости с помощью шприца или пастеровской пипетки отсасывают жидкость, переносят ее в силиконизированные центрифужные пробирки.
2. После центрифугирования пробирок в течение 10 мин при 1000 об/мин осадок ресуспендируют в среде 199, подсчитывают число клеток в камере Горяева и доводят до концентрации 1-2х106/мл.
3. К клеткам добавляют равный объем бактерий (чаще всего Staphylococcus aureus, не содержащий белка А) или опсонизированного зимозана в соотношении 1:10 и инкубируют при 37 °С в течение 30 мин.
4. Бактерии предварительно должны быть опсонизированы мышиной сывороткой. Опсонизацию проводят в течение 10 мин при температуре 37 °С с последующим отмыванием.
5. После инкубации готовят мазок на предметном стекле, фиксируют его метанолом 20 мин и красят краской Романовского-Гимзы в течение 30-40 мин.
6. Учет результатов осуществляется микроскопически. В мазке при увеличении х90 с иммерсионной системой подсчитывают фагоцитарный индекс (процент фагоцитирующих нейтрофилов) и фагоцитарное число (количество поглощенных бактерии на 1 нейтрофил).
Для изучения фагоцитарной активности макрофагов на 3-4-е сутки после введения раствора пептона мышей умерщвляют (в соответствии с современными нормами биоэтики), вскрывают в асептических условиях и вводят внутрибрюшинно 5-8 мл среды 199, содержащей 10% сыворотки эмбриона коровы. После легкого массажа брюшной полости жидкость отсасывают. Полость можно промывать средой 199 несколько раз, объединяя в одну все полученные порции. Далее исследование ведется так же, как опыты с нейтрофилами (рис. 3.3, см. также цв. вклейку).
Рис. 3.3. Фагоцитоз зимозана макрофагом (конфокальная микроскопия и лазерная сканирующая конфокальная микроскопия): а - интактный макрофаг; б - макрофаг, захвативший зимозан (красный)
Лабораторная работа 3-4
Оценка фагоцитарной активности лейкоцитов человека
Последовательность выполнения операций:
• кровь из пальца (или из венозной крови до контакта с антикоагулянтом) в количестве 0,1 мл помещают на тщательно вымытое обезжиренное покровное стекло;
•  покровное стекло выдерживают во влажной камере при 37 °С 45 мин, после чего образовавшийся сгусток осторожно удаляют пинцетом;
•  покровное стекло с прикрепленными нейтрофилами промывают в растворе Хенкса;
•  на покровное стекло наносят фагоцитируемую взвесь и снова выдерживают во влажной камере (клетками вверх) при 37 °С в течение 30 мин (в качестве объекта фагоцитоза могут быть использованы частицы латекса, опсонизированный зимозан, S. aureus). На покровное стекло осторожно наносят 0,2 мл суточной культуры лабораторного штамма S. aureus в концентрации 108 бактерий на 1 мл;
•  после инкубации в течение 60 мин стекло промывают в растворе Хенкса для удаления непоглощенных частиц и высушивают;
•  высушенный препарат фиксируют 5 мин в метаноле. Окрашивают гематоксилином Караччи (4 мин) с докраской эозином (30 с);
•  после проведения через гистологическую батарею спирт-ксилол препарат заключают в канадский бальзам;
•  учет фагоцитарной активности осуществляют, определяя процент нейтрофилов с фагоцитированным материалом (фагоцитарное число) и количество поглощенных частиц из расчета на один нейтрофил (фагоцитарный индекс). На каждом стекле для этой цели исследуют не менее 200 клеток.
Метод оценки хемотаксиса нейтрофилов с использованием камеры Бойдена
Наиболее широко применяется для оценки хемотаксической активности нейтрофилов метод с использованием камеры Бойдена.
Основная идея, заложенная в конструкцию камеры, заключается в разделении пористым фильтром в растворе двух реагирующих компонентов: лейкоцитов и факторов, обладающих хемотаксической активностью. В зависимости от исследуемых популяций клеток диаметр пор фильтров составляет от 3 до 8 мкм. Факторы с хемотаксической активностью помещаются в нижнюю камеру и довольно быстро создают концентрационный градиент, распространяющийся через толщу фильтра. Помещенные в верхнюю камеру лейкоциты начинают активную миграцию вдоль градиента и собираются на нижней поверхности фильтра, где можно подсчитать их количество.
Подсчет клеток на нижней поверхности фильтра проводится микроскопически; выявляется число клеток, видимых в одном поле при большом увеличении.
Более надежен радиометрический метод оценки миграционной активности лейкоцитов, когда используются лейкоциты, меченные изотопами 51Сг или 90Тс. После постановки реакции измеряют радиоактивность фильтров. Однако такой метод требует дополнительного оборудования.
Одна из модификаций метода основана на применении двойного фильтра. Суть ее в следующем. Ниже обычного фильтра помещают целлюлозонитратный фильтр. В результате миграции клетки, прошедшие через верхний пористый фильтр, падают на целлюлозонитратную мембрану. Трудности учета падающих с нижней поверхности фильтров клетки успешно преодолеваются путем использования одиночных поликарбонатных фильтров.
В качестве фильтров апробированы самые разнообразные материалы, включая целлюлозонитраты, целлюлозные эфиры и поликарбонаты. Впервые поликарбонаты использовались для изучения хемотаксиса клеток перитонеального экссудата у морских свинок, а затем были предложены для измерения хемотаксиса моноцитов крови человека. С тех пор фильтры из этого материала получили широкое распространение при постановке реакций по оценке хемотаксической активности моноцитов крови человека. Преимущество поликарбонатных фильтров состоит прежде всего в одинаковом размере пор. Кроме того, при использовании таких фильтров значительно облегчается подсчет клеточных элементов, поскольку у мигрирующих клеток не наблюдается изменений морфологических характеристик, что отнюдь не редкость при применении фильтров из других материалов.
Особенности постановки методов оценки хемотаксиса in vitro
Хотя метод довольно прост, необходимо остановиться на некоторых технических особенностях, способных существенным образом повлиять на миграционную активность и количество клеток, помещаемых в камеру.
Так как хемотаксис связан с высокой метаболической активностью клеток, необходимо соблюдать определенный температурный режим. Максимальный хемотаксис наблюдается при 37 °С. В интервале тем-
пературы от 33 до 43 °С значительных различий результатов миграции не наблюдается. Однако при экспериментальной гипотермии у свинок при температуре 29 °С отмечено снижение миграционной активности моноцитов.
Состав среды, используемой при постановке метода, не требует каких-либо специальных добавок за исключением небольшого количества белка, облегчающего миграцию клеток. Наиболее оптимальный рН среды - 7,0, хотя в некоторых случаях предпочтение отдается некоторому смещению рН в кислую сторону, что обычно характерно для воспалительной реакции in vivo. Как указывалось выше, моноциты, проходящие сквозь фильтры, могут попадать в раствор нижней камеры, и поэтому их не учитывают. Важное значение имеет время проведения реакции. При использовании поликарбонатных фильтров оптимальные сроки инкубации клеток при 37 °С - 90 мин.
Следует избегать добавления в систему нативных сывороток. Например, сыворотка человека порой содержит факторы как способствующие хемотаксу, так и его ингибирующие.
Важна также криоконсервация выделенных моноцитов. В отличие от всех других функций клеток хемотаксис у размороженных моноцитов снижен. Присутствие лимфоцитов в клеточной суспензии, загружаемой в камеру, обычно не влияет на хемотаксис моноцитов.
При соблюдении стандартных условий постановки реакции техническая вариабельность результатов составляет около 20%, что вполне допустимо. Воспроизводимость метода весьма высокая. Рекомендуется подсчитывать при микроскопии как минимум 10 случайных полей миграции на 2 идентичных фильтрах. Если перед помещением на фильтры камеры моноциты были хорошо суспендированы, разбросы подсчета клеток в отдельных полях зрения под микроскопом невелики и связаны обычно только с ошибками при самом подсчете.
В следующем разделе мы уделяем внимание ряду методических приемов оценки активности фагоцитарных клеток в генерации многочисленных медиаторных молекул (в первую очередь цитокинов и активных форм кислорода и азота). Все эти факторы врожденного иммунитета крайне важны для нормального функционирования иммунной системы, а особенно - для выявления патологических состояний, характеризующихся сниженной или повышенной выработкой подобных медиаторов.
Лабораторная работа 3-5
Получение супернатанта, содержащего цитокины и другие биологически активные молекулы из моноцитов периферической крови человека
1. Мононуклеарные клетки (МНК) выделяют из периферической крови путем центрифугирования в градиенте плотности фиколлверографина. Затем клетки ресуспендируют в среде RРМI 1640, содержащей 2-меркаптоэтанол (5×10-5 М), с конечной концентрацией 1 х106 клеток в 1 мл.
2. В каждую лунку 24-луночного планшета помещают 1 мл клеточной взвеси МНК и инкубируют в течение 60 мин при 37 °С для получения фракции прилипающих моноцитов. Надосадочную жидкость, содержащую лимфоциты, удаляют.
3. В опытные лунки с прилипшими моноцитами добавляют ЛПС (E. coli), растворенный в RРМI 1640 до конечной концентрации 10 мкг/мл, а в контрольные лунки - равный объем среды RРМI
1640.
4. Через 24 ч культивирования при 37 °С в атмосфере 5% СО2 проводят центрифугирование при 400 g в течение 8 мин при комнатной температуре; надосадочную жидкость, содержащую цитокины, собирают, стерилизуют фильтрованием (0,2 мкм) и хранят при -20 °С.
5. Супернатант, полученный таким способом, можно использовать для определения концентрации различных цитокинов (провоспалительных, противовоспалительных, колониестимулирующих факторов (КСФ) и др.), секретируемых МНК. Оценку цитокинов проводят методами биологического тестирования (см. гл. 7) или ИФА (см. гл. 4). Кроме того, можно определять содержание оксида азота, противомикробных пептидов и других биологически активных молекул.
Определение выработки активных форм кислорода и оксида азота
Исключительно важную роль как в процессах активации фагоцитов, так и в реализации их кислородзависимой бактерицидной функции играют активные формы кислорода (АФК) и оксида азота, образующиеся в процессе кислородного или дыхательного взрыва.
В основе дыхательного взрыва лежит усиление потребления глюкозы и ее расщепление с участием NADPH+ (по механизму гексозомонофосфатного шунта), сопровождающиеся накоплением NADPH. Взаимодействие NADPH с молекулой кислорода при участии NADPH-оксидазы приводит к генерации супероксид аниона (О2-), из которого с участием ионов водорода образуются потенциально токсичные для бактерий гидроксильные радикалы (ОН), перекись водорода (Н2О2) и синглетный кислород (1О2). Этот процесс начинается спонтанно, после образования фагосомы и перед ее слиянием с лизосомой. Наиболее выраженный бактерицидный эффект реализуется в фаголизосомах. Образование Н2О2 происходит спонтанно и при участии супероксиддисмутазы. Фермент миелопероксидаза обеспечивает образование гипохлорида из Н2О2 с участием ионов галогенов. Оксид азота (NO) образуется в результате расщепления аргинина до цитруллина и катализируется NO-синтазой (рис. 3.4).
Рис. 3.4. Схема выработки бактерицидных субстанций фагоцитов (активных форм кислорода и оксида азота)
Продукцию АФК фагоцитарными клетками определяют методом хемилюминесценции (ХЛ). Как известно, ХЛ-сверхслабое свечение усиливается люминофорами: люминолом и люцигенином. Люминол позволяет идентифицировать образование перекиси водорода и гипохлорной кислоты, люцигенин - супероксидного радикала. При взаимодействии с АФК люминофоры переходят в возбужденное состояние и при возвращении в исходное испускают квант света, который регистрируется хемилюминометром. Имеются данные о корреляции между выработкой АФК и киллингом бактерий фагоцитами.
Описание метода люминолзависимой хемилюминесценции
В качестве объекта исследования можно использовать суспензию лейкоцитов, мононуклеарных клеток или макрофагов перитонеального экссудата экспериментальных животных. Оптимальное количество клеток для регистрации люминолзависимой ХЛ подобрано экспериментально и составляет 1 млн/мл макрофагов и мононуклеарных клеток крови и 2×105/мл лейкоцитов. Для регистрации хемилюминесценции в термостатируемую кювету хемилюминометра ХЛМ-3 помещают: 1 млн клеток; 2,8 мл раствора Хенкса; 2×10-5 М люминола («Serva», Германия). Через 3-5 мин регистрируют спонтанную ХЛ. Затем в кювету добавляют 1,43 мкг/мл опсонизированного сывороткой крови человека зимозана («Sigma», США) и регистрируют индуцированную ХЛ.
Затем оценивают интенсивность ХЛ в милливольтах (или в относительных единицах). Спонтанная ХЛ показывает уровень выработки АФК клетками в организме. Индуцированная различными стимуляторами ХЛ отражает потенциальную, резервную способность клеток отвечать на стимул. Снижение индуцированной ХЛ может служить одним из признаков нарушения бактерицидной функции фагоцитов. Это демонстрируют результаты кинетики ХЛ-ответа нейтрофилов у больных с генитальным герпесом (рис. 3.5).
Так, у больных с генитальным герпесом спонтанная выработка АФК выше, чем у здоровых доноров. Действие опсонизированного зимозана не стимулирует выработку АФК, она остается на уровне спонтанной выработки и значительно ниже показателей таковой у здоровых доноров, что свидетельствует о снижении противовирусного действия нейтрофилов при генитальном герпесе.
Рис. 3.5. Кинетика ХЛ-ответа нейтрофилов здоровых доноров (черная кривая) и больных с генитальным герпесом (зеленая кривая)
Определение содержания NO в супернатантах культуры фагоцитов in vitro
Оксид азота (NO) участвует во многих физиологических и патологических процессах на уровне как клеток, так и организма в целом, выполняя защитное, регуляторное и повреждающее действия.
Регуляторное действие NO проявляется в поддержании тонуса и проницаемости сосудов, в подавлении адгезии тромбоцитов, в модуляции клеточной адгезии, нейротрансмиссии и бронходилатации, а также некоторых функций почек и иммунной системы.
Повреждающее действие оксида азота реализуется через ингибирование ферментативных функций, индукцию процессов перекисного окисления липидов и повреждения ДНК клетки, повышение чувствительности клетки к воздействию радиации, алкилирующих агентов и токсических металлов, а также через истощение антиокислительных возможностей клетки. Непрямое цитотоксическое действие N0 осуществляется за счет модуляции цитокинового равновесия и опосредованной (через ИЛ-12) активации NK-клеток и цитотоксических лимфоцитов. Сам по себе NO не является мощным
цитотоксическим агентом, но может усиливать чувствительность клеток к действию других цитотоксических агентов. Наиболее выраженной антимикробной активностью обладают соединения, образовавшиеся при взаимодействии АФК и NО в случае их совместной генерации. В результате взаимодействия NO с АФК и с некоторыми другими соединениями образуются цитотоксические агенты, в том числе пероксинитрит (ONOO), S-нитрозотиолы (RSNO), нитрогендиоксид (МЭ2), динитрогентриоксид (N2O3), динитроген-тетраоксид (N2O4) и железодинитрозильные комплексы (DNIC). Однако NО может снижать эффективность окислительного взрыва за счет формирования железонитрильных комплексов, что уменьшает способность железа катализировать прооксидантные реакции.
Эффекты NO принято разделять на основные и опосредованные. Основные включают те реакции, в которых он непосредственно взаимодействует со специфическими биологическими молекулами, например с гуанилатциклазой, цитохромом Р450 и др. Опосредованные эффекты связаны не с самим NO, а с реактивными формами азота, образующимися при взаимодействии NO с кислородом или с супероксидным анионом-радикалом.
Основные эффекты NO имеют место при низких концентрациях NO (менее 1 мкM), тогда как побочные (включая образование радикалов) становятся возможными при более высоких концентрациях NO (более 1мкМ).
Оксид азота in vivo образуется с участием NO-синтазы (NOS), которая у млекопитающих существует в трех изоформах: nNOS - нейтральная (тип 1); iNOS - индуцибельная (тип 2); ecNO-синтаза - эндотелиальная (тип 3).
В макрофагальных клетках функционирует iNOS, экспрессию которой стимулируют некоторые цитокины и микробные продукты, часто действующие в синергизме. NOS типов 1 и 3 называют также cNOS - избирательная, которая присутствует в клетках и может быть активирована притоком кальция с последующим его связыванием с кальмодулином. В присутствии iNOS оксид азота вырабатывается в больших количествах и часто дает побочные эффекты, такие, как перекисное окисление липидов и гидроксилирование, образование нитрозаминов и нитротирозина.
Активированный на цитохроме р450 кислород включается в реакцию образования NW-OH-L-аргинина и является участником одного из наиболее важных этапов в зависимой от NOS-реакции -
окислении гуанидинового азота. Затем гидроксилированная форма L-аргинина при участии супероксидных анион-радикалов и гема превращается в L-цитруллин с одновременным образованием NO.
Для оценки продукции NO перитонеальными макрофагами животных или моноцитами периферической крови человека определяют содержание нитрит-аниона (NO2-) в супернатанте культивируемых клеток (см. Лабораторную работу 3-5) спектрофотометрическим методом с использованием реактива Грисса. Для этого 150 мкл культуральной среды переносят из лунки планшета в пробирку и добавляют последовательно 75 мкл 1,5% раствора сульфаниламида и 1N HCl и 75 мкл 0,15% раствора нафтилэтилендиамминдихлорида в дистиллированной воде (компоненты реактива Грисса). Затем доводят объем раствора до 1 мл. После инкубации в течение 10 мин анализируют оптическую плотность раствора на спектрофотометре (например, на СФ-46) при 540 нм, используя в качестве контроля полную среду культивирования с добавлением раствора Грисса. Продукцию NO выражают в микромолях при помощи калибровочного графика.
Оценка киллинга фагоцитов
Наиболее надежный метод оценки завершенности фагоцитоза - микробиологический, заключающийся в измерении числа бактерий, выживших в лейкоцитах после фагоцитоза.
Принцип метода. Для постановки метода готовят взвесь лейкоцитов и опсонизированных микроорганизмов в соответствующих соотношениях. Через определенные промежутки времени лейкоциты разрушают, делают посевы на питательный агар и через сутки подсчитывают число выросших колоний. Лейкоциты здоровых доноров убивают до 80% бактерий за 20-30 мин (Czuprynski, 1983).
Определение активности миелопероксидазы в лейкоцитах периферической крови
Миелопероксидаза - один из ключевых ферментов фагоцитов, определяющих бактерицидность этих клеток. Сущность метода заключается в добавлении к лизату клеток периферической крови субстрата фермента ортофенилендиамина и перекиси водорода. Развившаяся цветная реакция оценивается по изменению оптической плотности при 492 нм на фотометре.
Снижение уровня миелопероксидазы коррелирует с уменьшением бактерицидности нейтрофилов в отношении стафиллококков.
Особенно снижен уровень этого фермента при хроническом лимфогранулематозе.
Количественная оценка антителообразующих клеток (метод Йерне)
Метод идентификации отдельных антителообразующих (АОК), разработанный и предложенный в 1963 г. Нобелевским лауреатом Н. Йерне и А. Нордином, дает возможность анализировать популяции лимфоидных клеток с точным учетом абсолютного числа АОК. Несмотря на то что прошло более 45 лет со дня сообщения о новом методе, он до сих пор используется при иммунологических исследованиях. Появились новые, получающие все большее распространение способы оценки АОК, но метод Н. Йерне, или, как его еще называют, метод локального гемолиза, или бляшкообразования в агаре, благодаря своей информативности и доступности остается в практике экспериментальной иммунологии, в частности при изучении действия различных факторов (физических, фармацевтических, токсических и др.) на антителообразование у экспериментальных животных. Доступен метод и для иммунологического практикума.
Основной принцип метода локального гемолиза состоит в том, что определенное число клеток лимфоидных тканей (селезенка, лимфатические узлы) мышей, иммунизированных эритроцитами барана, смешивают in vitro с эритроцитами барана и расплавленным, но не влияющим на жизнеспособность клеток агаром. Смесь помещают на чашку Петри и после инкубации при 37 °С в присутствии комплемента визуально подсчитывают число зон гемолиза («бляшек») в агаровой пластинке. В центре каждой «бляшки» находится АОК, представляющая собой плазматическую или лимфобластную клетку. Зная взятое для посева на агар число лимфоидных клеток, можно высчитать количество АОК на фиксированное число кариоцитов (например, на 1 млн или 10 млн) или на целый орган (селезенка).
Прямой способ (принцип описан выше) выявляет АОК, продуцирующие IgM антитела, лизирующие эритроциты в присутствии комплемента.
С помощью непрямого способа (рис. 3.6, см. также цв. вклейку) представляется возможность выявить АОК, продуцирующие IgG антитела (АТ). Для этих целей суспензию клеток дополнительно обрабатывают кроличьей антисывороткой, содержащей АТ против IgG мышей, на пике выработки IgM-АТ. Антисыворотка, содержа-
щая IgM-АТ против IgG мышей, взаимодействует in vitro в агаре с IgG-АТ против эритроцитов барана с присоединением комплемента. Этот комплекс способен лизировать эритроциты. Таким образом, при непрямом методе выявляется сумма АОК, продуцирующих IgM и IgG антитела.
Рис. 3.6. Непрямой метод Йерне: а - схема постановки метода; б - зона гемолиза, в центре АОК
Использование эритроцитов барана, конъюгированных с растворимыми антигенами, дает возможность изучить динамику образования АОК к некорпускулярным антигенам. Метод локального гемолиза в модификации может быть применен для анализа АОК у разных видов животных, а также у человека.
Впервые метод Н. Йерне позволил выявить количественные закономерности динамики антителообразования при первичной и вторичной иммунизации животных. Перечислим указанные закономерности.
1. При первичной иммунизации мышей эритроцитами барана вначале возрастает число АОК, продуцирующих IgM-АТ (пик образования АОК в среднем у мышей - 4-5 сут), а затем, через 1-2 дня, увеличивается число АОК, продуцирующих IgG-АТ.
2. При вторичной иммунизации иммунный ответ осуществляется преимущественно за счет АОК, вырабатывающих IgG.
3. После иммунизации число АОК возрастает за несколько дней до 50-500 млн клеток. Накопление АОК в лимфоидной ткани предшествует выявлению циркулирующих в крови АТ.
4. В небольшом количестве (1 на 10 млн кариоцитов) АОК предсуществуют в лимфоидных тканях (фоновые АОК).
5. Нарастание числа АОК после иммунизации происходит постепенно, по кривой, близкой к экспоненциальной, т.е. в результате размножения изначально небольшого числа клеток-предшественников.
6. АОК после иммунизации выявляются в основном в селезенке, лимфатических узлах, в костном мозгу и отсутствуют в других тканях (печень, легкие, почки, мозг).
Постановка реакции выявления АОК (метод Н. Йерне)
Предварительная подготовка занятия (для группы из 10-12 человек)
1. Иммунизация мышей эритроцитами барана. Мышей (4 особи) иммунизируют внутривенно 0,5 мл 2% суспензии отмытых эритроцитов барана за 4-5 дней до опыта.
2. Приготовление агара (1,4% раствор). 7 г сухого агара Дифко помещают в колбу с 500 мл дистиллированной воды и расплавляют на водяной бане, постоянно помешивая. Жидкий агар разливают в лотки. После того как агар застынет, его разрезают на кубики 1x1 см, которые завертывают в марлю и промывают проточной водой в течение 5-7 дней.
3. Перед занятием (перед опытом) готовят 0,7% раствор агара. Для этого 10 мл предварительно расплавленного агара (1,4%) смешивают с 8 мл дистиллированной воды и добавляют 2 мл 10-кратного раствора Хэнкса и 2 капли 7,5% раствора бикарбоната натрия (рН 7,0-7,2). Получают 8-10 чашек агара.
4. Агар разливают по пробиркам по 2 мл и хранят в водяной бане при 45 °С (за час до опыта).
5. Чашки Петри помещают в сушильный шкаф (80-90 °С).
6. Готовят 10% взвесь эритроцитов барана (предварительно отмыв их 3 раза физиологическим раствором).
Непосредственная постановка реакции
1. Забивают мышей и фиксируют их на столике.
2. Выделяют селезенку.
3. Готовят суспензию клеток в 3 мл среды 199 и подсчитывают число ядросодержащих клеток в суспензии.
4. Готовят разведение клеток с концентрацией 50x106 и 10x106 в 1 мл.
5. Готовят смесь агара, эритроцитов барана и клеток селезенки. Для этого в пробирки с 2 мл агара, находящиеся в водяной бане при 45 °С, добавляют 0,1 мл 10% суспензии эритроцитов барана и 0,1 мл суспензии клеток (конечная концентрация клеток - 5x106 и 1x106).
6. Разливают смесь в чашки Петри. Смесь из пробирок выливают на теплые чашки Петри. Быстрыми круговыми движениями смесь равномерно распределяют по дну чашки. Чашки ставят на горизонтальный столик. Дают агару застыть.
7. Инкубируют чашки Петри в термостате при 37 °С в течение 60 мин.
8. Разведение комплемента: сухой комплемент морских свинок разводят средой 199 (на 1 ампулу 5 мл среды, получают 20% раствор).
9. В каждую чашку Петри аккуратно добавляют по 3 мл комплемента.
10. Инкубируют чашки Петри в течение 30 мин при 37 °С.
11. Оценивают реакцию.
12. Подсчитывают число бляшкообразующих клеток на чашку и пересчитывают на 1 млн клеток и на всю селезенку.
13. Микроскопия бляшек: находят бляшку с лизированным участком и бляшкообразующей клеткой в центре.
14. Для улучшения контрастирования бляшек производят окраску препаратов (состав красителя: 10 мл 2% раствора бензидина в ледяной уксусной кислоте, 10 мл 5% H2O2, 80 мл дистиллированной воды).
15. Для сохранения бляшек чашку Петри заливают 10% раствором формалина.
3.5. КУЛЬТУРА КЛЕТОК IN VIVO
Метод колониеобразования кроветворных клеток в селезенке облученных мышей
После атомной бомбежки авиацией США японских городов Хиросимы и Нагасаки 6 августа 1945 г. перед мировой медициной встали проблемы защиты человека от лучевой болезни. Начала интенсивно развиваться новая наука - радиобиология. Во всех странах, в том числе в СССР, исследователи вскоре выяснили основные патологические проявления, вызванные проникающим лучевым поражением экспериментальных животных, и начали интенсивный поиск методов предупреждения и лечения лучевой болезни. Экспериментальные исследования показали: наиболее радиочувствительны гемопоэтические стволовые клетки, лимфоциты и клетки других кроветворных ростков. Облучение в 850-1000 Рад (≈10 Gy в современных единицах измерения) определили как «кроветворные летальные дозы». После такого облучения регенерация кроветворной ткани невозможна, но в течение ближайших дней (максимум 2 нед) экспериментальные мыши способны выживать за счет функционирования зрелых гемопоэтических клеток. При облучении в дозах выше 10 Gy наступает так называемая кишечная смерть за 1-3 сут, при еще более высоких дозах радиации возможна «смерть под лучом».
Единственным более или менее надежным средством спасения экспериментальных животных при облучении в «кроветворной летальной дозе» оказалась трансплантация клеток костного мозга от сингенных доноров. С тех пор облученные в «кроветворной летальной дозе» и сохранившие жизнеспособность в течение определенного срока мыши обозначаются лабораторным термином «живые пробирки». Трансплантация внутривенно таким мышам сингенных или аллогенных донорских костно-мозговых, селезеночных либо других лимфоидных клеток дает возможность в течение достаточного количества дней исследовать не только процессы приживления или неприживления вводимых клеток, но и явления взаимодействия разных типов клеток между собой. Более точно «живые пробирки» стали определять как «культуру клеток in vivo». Именно использование культуры клеток in vivo (рис. 3.7, см. также цв. вклейку) позволило сделать целый ряд открытий, актуальных до настоящего времени (взаимодействие Т- и В- лимфоцитов, роль В-клеток в антителообразовании, способность гемопоэтических клеток-предшественников к колониеобразованию in vivo и др.). Благодаря полученным данным
позже появился термин «Т-лимфоциты хелперы» (англ. to help - помогать). Т-лимфоциты рассматривали как необходимые помощники В-лимфоцитов в антителопродукции.
Рис. 3.7. Схема культуры клеток in vivo
Следует отметить: подавление гемопоэза и иммунопоэза вызывается не только лучевым поражением, но и введением в высоких дозах химиопрепаратов со свойствами цитостатиков и иммунодепрессантов (метотрексат, 6-меркаптоэтанол, циклофосфамид и др.).
Сведения о закономерностях поведения гемопоэтических и иммунокомпетентных клеток в условиях экспериментальных моделей in vivo оказались актуальными для современной медицины. В последние годы все большее распространение получают методы клеточной биотехнологии в лечении многих заболеваний человека. Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток нашла достаточно широкое применение не только в лечении лучевой болезни, но и целого ряда заболеваний, в первую очередь генетически опосредованных первичных иммунодефицитов, различных форм лейкозов.
В 1961 г. появилась публикация канадских ученых J.E. Till и E.A. McCulloch, в которой был представлен новый метод изучения кроветворных клеток-предшественников. Летально облученным (850-950 Рад) мышам-реципиентам трансплантировали внутривенно донорские клетки костного мозга. Через 7-10 сут на поверхности селезенки возникали видимые невооруженным глазом узелки-колонии (рис. 3.8), которые, как показал гистологический анализ, состояли из дифференцированных кроветворных клеток эритроидного, миелоидного или мегакариоцитарного ростков. Некоторые колонии отличались смешанным типом, но никогда не образовывались лимфоидные колонии. Авторы продемонстрировали прямую зависимость между числом трансплантированных донорских кроветворных клеток в
определенном диапазоне доз и числом сформировавшихся в селезенке реципиентов колоний.
Рис. 3.8. Колониеобразующие единицы (КОЕс) в селезенке мышей
Метод Тилла и MакКуллоча получил распространение как количественный способ клонирования кроветворных клеток в селезенке летально облученных мышей. В течение ряда лет клетки, дающие начало колониям, считали стволовыми кроветворными клетками (СКК). Но позже авторы и вслед за ними другие исследователи осторожно обозначили эти клетки как колониеобразующие (КОЕс). Скорее всего КОЕс - мультипотентные клетки-предшественники, отстоящие на несколько этапов дифференцировки от СКК.
Метод Тилла и MакКуллоча использовали и до сих пор используют многие исследователи во многих лабораториях мира для изучения закономерностей приживления донорских кроветворных тканей в организме облученных реципиентов.
Р.В. Петров и Л.С. Сеславина, применяя данную экспериментальную систему, в 1967 г. обнаружили и в 1977 г. зарегистрировали как открытие явление взаимодействия между СКК и лимфоцитами. Суть открытия заключалась в том, что аллогенные лимфоциты инактивировали стволовые клетки. Не исключено, что инактивирующее или тормозящее действие лимфоцитов распространяется и на другие
несингенные активно пролиферирующие клетки (раковые, эпителиальные и др.), способные обеспечить за счет размножения самоподдерживающуюся популяцию. Данный феномен может являться одним из главных механизмов иммунологического надзора и элиминации соматических мутаций (Петров Р.В., 1987).
Вопросы и задания
1. Какими методами можно оценить фагоцитоз и его завершенность?
2. Перечислите типы клеточной цитотоксичности.
3. Как оценить функциональную активность NK?
4. Как оценить цитотоксические Т-клетки?
5. Опишите основные принципы иммуномагнитной сепарации.
6. Приведите принцип работы и устройство проточного цитофлуориметра.
7. Что отражает спонтанная и индуцированная хемилюминесценция?
8. Дайте определение и приведите основные этапы культуры клеток in vivo.
9. Какие основные иммунологические феномены были изучены с помощью культуры клеток in vivo?
10. Назовите методы, выявляющие АОК.
11. Каковы особенности метода Н. Йерне?
12. Опишите закономерности антителообразования.
13. Каковы постановка реакции и методы оценки?

Глава 4 Иммуноанализы
Термин «иммуноанализ» в международной литературе применяют не к любым методам исследований, используемым в иммунологии, а только к тем, в которых ключевыми взаимодействующими субстанциями являются исходно растворимые «антиген» (или лиганд) и «антитело». В более чем 99% современных тест-систем иммуноанализов один из компонентов (либо антиген, либо антитело) сорбирован на твердой фазе, но сорбированы они из исходно растворимого состояния.
Область применения иммуноанализов широка, но чаще их используют с диагностическими целями практически во всех отраслях медицины, а также в ветеринарии и биологии. Нередко иммуноанализы находят совершенно необычное применение. Например, итальянские виноделы для осветления вина марки «мерло» используют пшеничную муку. Полученный винный продукт может содержать пшеничный глютен, опасный для больных целиакией. Иммуноанализы позволяют выявить присутствие глютена и забраковать такое вино.
В 20-30 гг. ХХ века (после работ Ф. Обермейера, Е.П. Пика, К. Ландштейнера и других ученых, получавших антитела к искусственно синтезированным антигенам) к антителам стали относиться как к высокоспецифическим реагентам, избирательно связывающим то или иное вещество, способное быть антигеном при иммунизации животных.
Чтобы лучше понять суть методов иммуноанализов, полезно осознать их отличие от иных исследований, применяемых в современной иммунологии. В фундаментальных исследованиях по иммунологии используют фактически все известные в биологических науках методы. Самые современные - методы молекулярной биологии и молекулярной генетики. В прикладной клинической иммунологии методическая база не столь широка. По сути иммунологическими называют такие методы, в которых так или иначе визуализируются реакции «антиген-антитело».
Антитела - растворимые молекулы белков. Антигены бывают разные (корпускулярные, растворимые, нерастворимые), но далеко не все видны невооруженным глазом (как, например, эритроциты в реакциях
гемолиза или агглютинации). Связывание двух растворимых молекул часто приводит к образованию также растворимого иммунного комплекса, следовательно, невидимого глазом. Поэтому с технической стороны разные тест-системы иммуноанализа различаются между собой средствами визуализации факта связывания антитела с антигеном. С 1948 г. и до конца 1960-х гг. методы визуализации комплексов антиген-антитело представляли собой преципитацию в геле (методы Оухтерлони, Манчини, варианты иммуноэлектрофореза в геле), т.е. выпадение этих комплексов в осадок, а также гемолиз или гемагглютинацию с использованием хорошо видимых эритроцитов, на поверхность которых сорбировали либо антиген, либо (реже) антитела.
4.1. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРЕЦИПИТАТОВ АНТИТЕЛ С АНТИГЕНАМИ В ГЕЛЕ
Встречная иммунодиффузия по Оухтерлони и Элеку
В 1948 г. Орьян Оухтерлони (Orjan Ouchterlony) и независимо от него Стефан Элек (Stephen Elek) опубликовали разработанную ими методику двойной, или встречной, иммунодиффузии, т.е. диффузии антител и антигенов навстречу друг другу в геле. Эти исследователи обнаружили и использовали физико-химические свойства агарового геля, поры которого имеют размеры, достаточные, чтобы пропустить (дать возможность диффундировать) молекулы свободных антител и многих растворимых антигенов, но задерживающие более крупные по размеру комплексы антител с антигенами. В результате в месте встречи антител с антигенами выпадает осадок; в геле он виден невооруженным глазом как полоса преципитации. Оухтерлони и Элек подобрали концентрацию агар-агара - 1,25-1,5%.
Порядок постановки реакции следующий.
1. Агар растворяют в физиологическом растворе при 56 °С (температура расплавления агара).
2. В виде золя агар выливают на плоское стекло. При охлаждении до комнатной температуры агар застывает в гель.
3. В застывшем геле пробивают трубочкой-пробойником правильные круглые отверстия (лунки) небольшого диаметра (~2-3 мм).
4. В эти лунки вносят образцы антисыворотки и растворы антигенов.
5. Оставляют на диффузию в течение 16-24 ч, по истечении которых можно наблюдать полосы преципитации, если в исследуемых образцах присутствовали комплементарные друг другу лиганды.
Метод Оухтерлони и Элека иллюстрирует рис. 4.1. (см. также цв. вклейку).
Рис. 4.1. Метод Оухтерлони и Элека: а - линии преципитации, при диффузии двух одинаковых антигенов (АГ) навстречу антителам (АТ), плавно сливающиеся друг с другом; б - линии преципитации, при диффузии двух разных антигенов навстречу антителам, не сливающиеся, а пересекающиеся между собой, «не замечающие» друг друга
Радиальная иммунодиффузия по Манчини
В 1965 г. Джульетта Манчини и соавт., а независимо от них - Д.Л. Фэй и Э.М. МакКелви разработали методику радиальной иммунодиффузии (РИД) в том же агаровом геле для количественного определения содержания в крови (в сыворотке) иммуноглобулинов классов А, G и М.
Для этого потребовалось получить моноспецифические антисыворотки лабораторных животных против очищенных иммуноглобулинов классов М, А и G человека. Моноклональных антител в те годы еще не было.
Манчини, Фэй и МакКелви воспользовались тем физикохимическим свойством агар-агара, что температура его плавления недалека от физиологических температур теплокровных животных, и белки (по крайней мере иммуноглобулины) не претерпевают калечащую денатурацию при температуре плавления агара. Это позволило авторам ввести в состав золя агара, т.е. в жидкую фазу, антисыворотки против иммуноглобулинов разных изотипов, тщательно перемешать раствор перед заливанием на стеклянную пластину. Таким образом, в слое агарового геля оказываются заплавленными антииммуноглобулиновые антиизотипические антитела. В таком геле пробивают круглые луночки, в которые вносят так называемые стандарты (или калибраторы, т.е. растворы иммуноглобулинов с известной концентрацией для построения калибровочной кривой) и пробы испытуемых сывороток и оставляют на свободную диффузию на 16-24 ч.
По истечении этого времени вокруг луночек образуются видимые невооруженным глазом кольца преципитатов. Опыт показал: диаметр колец преципитатов тем больше, чем выше концентрация данного изотипа иммуноглобулинов в исследуемой биопробе. Калибраторы - препараты иммуноглобулинов заданного изотипа с известной весовой концентрацией (мг/мл) - позволяют построить калибровочную кривую и с ее помощью определить концентрации иммуноглобулинов в испытуемых пробах сывороток. Последнее возможно только на прямом отрезке кривой. Для спрямления калибровочной кривой прибегают к несложным математическим действиям, например откладывают на осях координат не диаметр колец преципитации, а квадрат этой величины, и/или не концентрацию изотипа иммуноглобулинов, а логарифм концентрации по основанию 2 или 10. Какой подход окажется приемлемым, подбирают опытным путем в каждой лаборатории.
Хотя метод РИД разработан полвека назад, его нередко используют в лабораториях клинической иммунологии до настоящего времени в силу простоты исполнения, относительно невысокой стоимости реагентов и независимости от приборов.
Метод РИД применим только для названных изотипов иммуноглобулинов (М, А и G), ибо их физиологические концентрации в сыворотках крови попадают в пределы чувствительности метода (мг/мл).
Изотипы IgD и IgE присутствуют в нормальных сыворотках в таких низких концентрациях, которые метод РИД не «видит». Концентрации IgE определяют с помощью высокочувствительных вариантов иммуноферментного анализа - ИФА (см. ниже):
1) общий IgE - ловушечным ИФА, в котором первым слоем на твердой фазе сорбированы моноклональные антиизотипические анти-ε-антитела;
2) для определения антигенспецифичных IgE антигены сорбируют на пористой твердой фазе, где площадь сорбции существенно превосходит дно планшета при одном и том же реакционном объеме; чувствительность определения соответственно существенно выше.
IgD в норме присутствует в сыворотках в следовых количествах, и задача его измерения встает крайне редко (вероятно, только в случаях IgD-продуцирующих плазмоцитом).
В табл. 4.1 и 4.2 приведены нормальные концентрации иммуноглобулинов разных изотипов у людей разного возраста (по данным более современного нефелометрического определения с использованием антиизотипических моноклональных антител и прибора нефелометра).
Таблица 4.1. Концентрации иммуноглобулинов классов М, А и G в сыворотке крови человека в норме
Окончание табл. 4.1
Таблица 4.2. Концентрация изотипов IgG (1, 2, 3, 4), IgA (1, 2) и IgE в сыворотке крови взрослого человека в норме
Поскольку IgE в норме в крови присутствует в низкой концентрации, то для снижения вероятности ошибок при записывании нулей по международной договоренности значения IgE выражают в так называемых международных единицах - МЕ/мл или кМЕ/л (IU/ml, kIU/l). 1 МЕ равна 2,43 нг IgE.
Лабораторная работа 4-1
Определение уровня IgМ, IgA и IgG в сыворотке человека методом радиальной иммунодиффузии
1. Готовят 1,25-1,5% раствор агар-агара (или синтетической агарозы) в 0,1 М веронал-мединаловом буфере с рН 8,6 (на 1 л воды берут 0,8 г веронала и 4,5 г мединала). Навеску агара (агарозы) заливают буфером и нагревают на водяной бане при 56 °С до полного растворения полимера.
2. В раствор агара добавляют рассчитанное количество (расчет производят, исходя из данных, приведенных в листовке-вкладыше к коммерческим реагентам) антиизотипической антисыворотки,
быстро и тщательно перемешивают. Каждый вариант антиизотипической антисыворотки добавляют в отдельную пробирку с раствором агара (агарозы).
3. Раствор смеси агара (агарозы) с антиизотипической сывороткой быстро выливают на подготовленные обезжиренные стеклянные пластины и кладут их на горизонтальный предметный столик для ровного затвердевания агара/агарозы в гель. Гель прозрачен и бесцветен. На стандартное предметное стекло для микроскопических препаратов (площадью 1875 мм2) требуется примерно 3,2 мл смеси раствора агара с антисывороткой.
4. В геле, подложив под стекло с гелем трафарет, специальной трубочкой-пробойником диаметром 2-3 мм делают два (или больше, что зависит от размеров стекол и количества испытуемых биопроб) ряда лунок. Расстояния между центрами лунок - порядка 1,5 см.
5. Заранее рассчитывают и подготавливают растворы калибровочных иммуноглобулинов (иногда называемые стандартами) в трех известных концентрациях.
6. В три лунки (диаметром 2 мм) заливают автоматической пипеткой (дозатором) по 5 мкл калибровочных растворов иммуноглобулинов, в остальные лунки - также по 5 мкл - заливают испытуемые сыворотки.
7. Стекла помещают во влажную, плотно закрываемую посуду и выдерживают в холодильнике при +4 °С 24-48 ч. За это время происходит спонтанная диффузия белков из лунок в гель и образование преципитатов между иммуноглобулинами, содержащимися в испытуемых сыворотках, и антиглобулиновыми антиизотипическими антителами, содержащимися в агаровом геле. Поскольку диффузия свободно идет во всех направлениях, преципитаты имеют форму правильных колец. Преципитаты видны невооруженным глазом, и диаметры колец измеряют в миллиметрах.
8. Для снижения фона образования неспецифических преципитатов пластины можно отмывать раствором с высокой ионной силой - 5% NaCl: в течение 48-72 ч промывочный раствор меняют несколько раз.
9. Если задачи работы требуют долгосрочного хранения препаратов, то гель на стеклах с преципитатами фиксируют и красят анилиновыми красителями, прокрашивающими белки, например кумасси-голубым (на 1 г сухого красителя - 50 мл ледяной уксусной кислоты и 150 мл воды).
Окрашенные препараты с кольцами преципитатов промывают и высушивают.
Внешний вид стекол с результатами РИД и калибровочная кривая показаны на рис. 4.2 (см. также цв. вклейку).
Рис. 4.2. Внешний вид стекол с результатами РИД и калибровочная кривая
Иммуноэлектрофорез
В те же 40-е гг. XX в. биохимики научились проводить электрофоретическое разделение белков в гелевых средах. В 1953 г. П. Грабар и К. Уиллиамс (P. Grabar, C.S. Williams) предложили методику иммуноэлектрофореза, которая фактически представляет собой комбинацию электрофоретического разделения белковых смесей и метода Оухтерлони и Элека. В геле с одного края пластины пробивают ряд из несколько лунок, в которые вносят исследуемые на содержание тех или иных интересующих белков растворы или сыворотки пациентов. К пластине с гелем прикладывают электрическое поле и проводят электрофорез. По завершении электрофореза в геле в центре пластины вырезают канавку, параллельную направлению движения белков в электрическом поле. В эту канавку вносят антисыворотку или смесь антител против искомых белков и оставляют на 16-24 ч
для диффузии, после чего регистрируют образующиеся полосы преципитации. Число полос преципитации показывает, к какому количеству компонентов, находящихся в биопробе, в антисыворотке есть комплементарные антитела. Если при электрофорезе использовать калибраторы, т.е. известные белки в достаточных концентрациях, то сравнение полос преципитации материала из биопроб с полосами преципитации с калибровочными белками может стать доказательством наличия в испытуемом материале конкретного белка(ов).
Существует множество модификаций метода иммуноэлектрофореза. На рис. 4.3 проиллюстрировн наиболее простой и употребляемый вариант.
Рис. 4.3. Схема иммуноэлектрофореза по Грабару и Уиллиамсу: а - схема установки; б - результаты электрофореза
В стартовые лунки для электрофореза внесены сыворотки крови двух пациентов - 1 и 2, в канавку в центре пластины по завершении электрофореза проб сывороток внесена смесь антисывороток против основных фракций сывороточных белков - альбуминов, α-, β- и γ-глобулинов. После диффузии сыворотки-1 видны дуги преципитации со всеми основными фракциями сывороточных белков, в том числе с иммуноглобулинами. В сыворотке пациента 2 гамма-глобулины отсутствуют. На основании данных электрофореза пациенту 2 поставлен диагноз агаммаглобулинемии.
«Ракетный» иммуноэлектрофорез
Если к гелю на стеклах, полностью подготовленных для выполнения метода радиальной иммунодиффузии, приложить электрическое поле, то движение компонентов сывороток, в том числе иммуноглобулинов, из лунок в толщу геля будет происходить не в режиме спонтанной диффузии, а в принудительном режиме по силовым линиям электрического поля, что существенно ускоряет процесс. В результате преципитаты станут видны уже примерно через 1 ч, но будут иметь форму не колец, а вытянутых пиков, напоминающих летательные аппараты - ракеты. Такую модификацию метода иммунодиффузии называют «ракетным» иммуноэлектрофорезом. Внешний вид результатов «ракетного» иммуноэлектрофореза показан на рис. 4.4.
Рис. 4.4. «Ракетный» иммуноэлектрофорез: 1 - пациент с агаммаглобулинемией; 2, 3, 4 - калибровочные растворы иммуноглобулинов; 5 - пациент с гипергаммаглобулинемией (возможна миеломная болезнь)
В настоящее время во многих лабораториях изотипы иммуноглобулинов определяют нефелометрическим методом. Специфическими реагентами служат моноклональные антиизотипические антитела. Количество иммунных комплексов оценивают на приборе нефелометре. Калибровку и расчет результатов осуществляют с помощью программного обеспечения.
4.2. ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ И РАДИОИММУННЫЙ
АНАЛИЗЫ
В основе самых распространенных на сегодня методов иммуноанализов, базирующихся на количественном определении растворимых веществ, лежит взаимодействие антигена с антителом (т.е. иммунологическое распознавание), которое детектируется (визуализуется) с помощью специальной метки, заранее конъюгированной либо с антителом, либо с антигеном. В качестве меток используют вещества, которые при определенных условиях тот или иной прибор может «увидеть» (зарегистрировать) и измерить количество метки. Физико-химическая чувствительность таких анализов обычно составляет нанограммы на миллиметр, но, применяя конкретные тест-системы, нередко выявляют пико- и фемтомоли определяемого вещества.
Варианты меток и материалов для твердой фазы
Метки
1. Радионуклид используется при радиоиммунном анализе (РИА).
2. Ферменты, катализирующие превращение бесцветного субстрата в цветной или флюоресцирующий продукт. В данном случае исследование называют иммуноферментным анализом (ИФА), его разновидность - анализ иммуноферментно-флюоресцентный.
3. Флюоресцирующие, люминесцирующие вещества и др.
В случае РИА результат измеряют на счетчиках радиоактивности в зависимости от того, какие частицы/кванты излучает конкретная метка-радионуклид. Результаты РИА нельзя зарегистрировать без соответствующих приборов. В случае ИФА при образовании цветного продукта результат реакции определяют с помощью спектрофотометра, измеряющего оптическую плотность. Без прибора, на
глаз, реакцию можно оценить приблизительно как положительную или отрицательную.
При использовании в качестве метки фермента, катализирующего образование флюоресцирующего продукта, результат реакции определяют на флюориметре, измеряющем излучение в определенном диапазоне длин волн. Без прибора в данном случае не обойтись.
Впервые методы РИА были разработаны в 1958 г. С. Берсоном и Р. Ялоу. Последняя удостоена в 1977 г. Нобелевской премии за РИА, позволившего впервые в мире определять нанограммовые концентрации пептидных гормонов в крови человека.
Менее чем через год после описания РИА в качестве метки стали использовать ферменты с бесцветными субстратами, но окрашенными продуктами. Метод назвали ИФА. По чувствительности и специфичности РИА и ИФА одинаковы, так как их показатели определяются в большей мере аффинностью взаимодействия антитела и антигена, а не типом метки. Однако ИФА применяют много чаще, чем РИА, ибо реагенты для ИФА существенно дольше остаются стабильными, а следовательно, технологию ИФА проще стандартизировать. В РИА используют непрерывно излучающие радионуклиды, и величина их удельной радиоактивности непрерывно же изменяется. Для мечения белков применяют радионуклиды йода (131I или 125I; γ-излучение), у которых период полураспада весьма короток, и реагенты необходимо обновлять примерно раз в месяц.
Сначала иммуноанализы разрабатывали в так называемых гомогенных вариантах (без разделения компонентов в растворе). Но вскоре в технологии иммуноанализов начали использовать твердую фазу, на которой методом спонтанной сорбции из раствора фиксируется антиген или антитело. Анализы стали называть твердофазными, или иммуносорбентными (англ. ELISA - Enzyme linked immunosorbent assay). Технологически твердофазные анализы несравнимо удобнее гомогенных тестов. В настоящее время твердофазные варианты ИФА применяют в 99,9% тест-систем.
В качестве «твердой фазы» используют следующие материалы:
1) пластмассу (полистирол, поливинилхлорид и др.) в виде стандартно штампованных микроплашек с 96 или 60 лунками (или шарики, колпачки и прочее - для постановки единичных проб);
2) пористые материалы типа нитроцеллюлозы в виде наполнителей в объеме или в виде плоских листов или полосок стрипов
(англ. strip); стрипы используют в методиках типа иммуноблота и иммунохроматографии; в пористых материалах существенно больше площадь, на которой сорбирован один из участников взаимодействия; другие реагенты диффундируют по порам.
Принцип иммуносорбентных анализов заключается в том, что на материале твердой фазы в соответствии с физико-химическими свойствами сорбируется антиген или антитело.
Белки хорошо сорбируются на подобранных для ИФА/РИА пластмассовых материалах. Если заданный антиген в силу своей химической природы (липид, углевод, липоили гликопроизводные белков) плохо сорбируется на выбранной твердой фазе, то подбирают вещество-«подложку», которое с одной стороны хорошо свяжется с твердой фазой, с другой стороны - с антигеном. Однако потребность в «подложке» возникает крайне редко.
Все остальные реагенты тест-систем используют в виде растворов. Их добавляют к твердой фазе поочередно, инкубируют, после чего несвязавшиеся реагенты легко удаляют промывкой твердой фазы. В этом главное технологическое преимущество твердофазного иммуноанализа. Результат реакции «остается» на твердой фазе и регистрируется количественно.
Существует много вариантов конструкций тест-систем для иммуноанализов. Мы разберем несколько базисных и более подробно объясним значения терминов.
Прямые иммуноанализы
Прямыми называют анализы, в которых метку присоединяют непосредственно либо к заданному антигену, либо к антителу, специфичному против искомого антигена.
Прямой вариант используют в гомогенных системах и некоторых гетерогенных: в конкурентном, ингибиторном, сэндвич-ИФА и иммуноферменто-метрическом анализе (рис. 4.5).
Ингибиторный иммуноферментный анализ
В ингибиторном ИФА (рис. 4.6) на твердой фазе иммобилизуют антиген. Растворимые антитела как реагент конъюгированы с ферментом. Определяемый антиген в испытуемой пробе конкурирует с иммобилизованным на твердой фазе антигеном за растворимые антитела. В итоге ферментативная активность, измеряемая на твердой фазе, обратно пропорциональна концентрации определяемого вещества в пробе.
Результаты ИФА показаны на рис. 4.7 (см. также цв. вклейку).
Рис. 4.5. Схема постановки прямого метода ИФА: а - для выявления антител; б - для выявления антигена; АГ - антигены; АТ - антитела.
«Сэндвич»-ИФА
«Сэндвич»-ИФА (рис. 4.8) разработан для антигенов, на которых есть не менее двух неперекрывающихся эпитопов. Против обоих эпитопов получают в качестве реагентов специфичные антитела. Антитела к одному из эпитопов сорбируют на твердой фазе. Испытуемую пробу добавляют к твердой фазе, инкубируют, отмывают. После отмывки вносят конъюгат антител ко второму эпитопу с ферментом. Ферментативная активность, остающаяся на твердой фазе, прямо пропорциональна содержанию антигена в пробе.
«Сэндвич»-ИФА не требует препаратов очищенных антигенов, что выгодно отличает его от конкурентных и ингибиторных методик, поскольку чистые антигены всегда труднодоступны и дороги. Чувствительность «сэндвич»-ИФА потенциально выше, чем конку-
Рис. 4.6. Принцип конкурентного (а) и ингибиторного (б) ИФА
Рис. 4.7. Планшет с результатами ИФА
рентных и ингибиторных. Аналогичная технология применима и с использованием одного антитела (и на твердой фазе, и в составе конъюгата с ферментом) в случаях наличия на заданном антигене повторяющихся эпитопов. В современных модификациях ту же технологию называют ловушечным ИФА (capture IA) - антитела на твердой фазе «ловят» свой антиген из смеси веществ в биопробе.
Рис. 4.8. Принцип «сэндвич»-ИФА
Иммунометрический анализ
При иммунометрическом анализе (рис. 4.9) в пробирку с испытуемой пробой, предположительно содержащей определяемый антиген, вносят заведомый избыток меченых антител. Затем к этой смеси добавляют также заведомый избыток иммобилизованного на мелкодисперсной твердой фазе антигена. После инкубации центрифугированием отделяют растворимую фракцию (супернатант) и в ней измеряют ферментативную активность (если метка - фермент).
Ферментативная активность супернатанта прямо пропорциональна содержанию антигена в испытуемой биопробе. Благодаря использованию избытка реагентов этот метод более чувствителен, чем конкурентный ИФА, и его аналитические возможности приближаются к предельным.
Рис. 4.9. Принцип иммунометрических анализов: 1 - пробирка с биопробой (сывороткой крови или др.); 2 - в пробирку с биопробой вносят заведомый избыток чистого антигена, сорбированного на мелкодисперсном твердофазном носителе; 3 - затем в ту же пробирку вносят заведомый избыток меченых антител; 4 - материал инкубируют (чтобы реагенты успели связаться), центрифугируют и в супернатанте измеряют количество метки. Величина сигнала в супернатанте прямо пропорциональна содержанию искомого вещества (антигена) в испытуемой пробе. OD - optical density - величина оптической плотности, измеренная спектрофотометром; АГ - концентрация искомого антигена в биопробах
Непрямые иммуноанализы
Непрямые методики (рис. 4.10) применяют чаще, чем прямые.
Непрямым иммуноанализом называют анализ, в котором метку присоединяют не к целевому антигену и не к антителу против целевого антигена, а к так называемым вторым антителам - антивидовым антииммуноглобулиновым антителам, т.е. антителам к иммуноглобулинам того вида животных или человека, с биологическим материалом которого работают.
Рис. 4.10. Принцип непрямых иммуноанализов
Таким образом, один и тот же препарат конъюгата антиглобулиновых антител с ферментом используют в качестве проявляющего стандартного реагента в разных тест-системах для определения различных конкретных антигенов или антител.
Вместо антивидовых антиглобулиновых антител для конъюгации с ферментом может быть использован, например, протеин А стафилококка, который по своей природе с высокой аффинностью связывается с иммуноглобулинами класса G некоторых видов млекопитающих, включая человека. Все описанные схемы постановки прямого варианта ИФА (конкурентный, ингибиторный, «сэндвич», иммунометрический) применяют и в непрямом варианте.
Непрямые варианты ИФА не требуют очистки искомых антигенов или антител. Чистым должен быть только препарат антивидовых антииммуноглобулиновых антител.
В качестве ферментов-меток в ИФА используются следующие ферменты и субстраты для них.
1. Пероксидаза из корней хрена, субстраты:
• орто-фенилендиамин (продукт желто-коричневый, растворимый, поглощает при 492 нм);
•  3,3'-диаминобензидин (продукт коричневый, нерастворимый);
•  3-амино-9-этилкарбазол (продукт красный; нерастворимый);
•  5-аминосалициловая кислота (продукт коричневый, растворимый, поглощает при 405 нм);
•  2,2'-азино-бис(3-этилбензтиазолин)-6-сульфоновая кислота (продукт зеленый, растворимый, поглощает при 405 нм);
•  4-хлоро-1-нафтол(продуктголубой,нерастворим);3,3'-диметокси- бензидин (продукт желто-оранжевый, растворимый, поглощает при 405 нм);
•  3,3',5,5'-тетраметилбензидин (продукт голубой, растворимый, поглощает при 450 нм);
•  ABTS - 2,2'-азино-ди(3-этилбензтиазолин)-6-сульфоновая кислота.
2. β-Галактозидаза (субстраты - дериваты β-галактозида, например 4-метилумбелиферил-β-D-галактозин).
3. Щелочная фосфатаза (субстраты: 5-бромо-4-хлоро-3-индолил фосфат в комбинации с голубым тетразолиевым, продукт голубой, нерастворимый; р-нитрофенил фосфат, продукт желтый, растворимый, поглощает при 405 нм).
4. Уреаза (субстрат - мочевина в комбинации с бромкрезолом пурпурным, продукт образуется очень быстро, пурпурного цвета, растворимый, поглощает при 590 нм).
Нерастворимые продукты ферментативных реакций используют в методах иммуногистохимии и иммуноблота, растворимые - в иммуноферментных анализах, в которых результат регистрируют количественно спектрофотометрически.
Встречаются оригинальные разработки с использованием других (кроме вышеперечисленных) ферментов-меток.
Если по тем или иным биохимическим причинам заданный антиген или интересующее антитело не удается конъюгировать с меткой без существенных потерь в аффинности их связывания, то в конструкцию тест-системы пробуют вводить дополнительные компоненты. Например, нередко используют так называемое «авидинбиотиновое» взаимодействие. Авидин - белок, выделяемый из «белка» куриных яиц, биотин - витамин Н (он же кофермент R). Авидин по своей природе с высокой аффинностью (Kd ~ 10-15 M) связывает биотин. Биотин легко конъюгируется с флюоресцеином. Кроме того, и против авидина, и против биотина получены высокоаффинные моноклональные антитела (существуют коммерческие
препараты). Соответственно все эти дополнительные компоненты используют при необходимости в конструкциях тест-систем, предназначенных для детекции того или иного заданного вещества. Сходным по аффинности сродством к биотину обладает также белок стрептавидин, выделяемый из грибов Streptomyces avidinii.
В конкретных вариантах тест-систем используют разные буферные растворы, соответствующие свойствам конкретных антигенов, ферментов и их субстратов. Для примера мы опишем последовательность действий и используемые реагенты при выполнении непрямого твердофазного иммуноанализа, его простой и часто встречающийся вариант, подходящий, в частности, для определения специфических противовирусных антител как маркера наличия в организме той или иной вирусной инфекции (специфическую лабораторную диагностику вирусных инфекций применяют для выявления инфицированности ВИЧ, вирусами гепатитов, герпеса, цитомегаловирусами и др.).
Лабораторная работа 4-2
Твердофазный непрямой иммуноферментный анализ
1. На твердую фазу стандартных 96-луночных планшетов сорбируют заданные антигены. В большинстве тест-систем используют в качестве антигенов либо рекомбинантные белки, либо синтетические пептиды, реже - компоненты лизата натуральных вирусов. Антигены растворяют до конечной концентрации 1-10 мкг/мл или опытным путем подбирают более подходящие концентрации, чаще всего в 0,05 М карбонат-бикарбонатном буфере при рН 9,6.
Для приготовления 1 л буферного раствора берут 0,015 М (1,59 г) Na2CO3 и 0,035 M, 94 г NaHCO3 и растворяют в воде.
Раствор АГ вносят в лунки планшетов в объеме 50-100 мкл.
Существуют другие варианты посадочных буферов, например фосфатно-солевой буфер, рН 7,2 (PBS).
Для приготовления 1 л раствора PBS берут 0,0025 М дигидрофосфата натрия (0,345 г NaH2PO4 × H2O, MW 137,99); 0,0075 М гидрофосфата натрия (2,68 г Na2HPO4 × 12 H2O, MW 358,14) и 0,145 М хлористого натрия (8,474 г NaCl, MW 58,44).
Время, отводимое на сорбцию, подбирают опытным путем. Как правило, достаточно 12-16 ч при комнатной температуре или при +4 °С.
2. Лунки планшета тщательно промывают фосфатно-солевым буфером или водой с детергентом (0,1% Tween-20) 5-10 раз. В современных лабораториях процедуры отмывки осуществляют в аппаратах типа «вошер» (англ. to wash - мыть).
3. В некоторых случаях на следующем этапе в лунки вносят 1% раствор бычьего сывороточного альбумина (БСА) или иного консервативного белка, например казеина, для так называемой «забивки» не покрытых антигеном площадей на дне лунок. Инкубируют 30-60 мин, после чего отмывают.
4. В лунки вносят исследуемые образцы биопроб в тех или иных разведениях. Для каждого разведения используют 2-3 лунки («параллели»). В качестве разводящей жидкости применяют PBS. В некоторых случаях в него добавляют 1% БСА. Инкубируют 1 ч и дольше. Время либо подбирают опытным путем, либо следуют инструкции к коммерческой тест-системе.
5. Отмывают (как описано выше).
6. Вносят конъюгат антииммуноглобулиновых антител с ферментом в заранее подобранном рабочем разведении или по инструкции к тест-системе. Инкубируют 1 ч.
7. Отмывают (как описано выше).
8. Вносят в лунки раствор субстрата того фермента, который входит в состав антииммуноглобулинового конъюгата. Если фермент - пероксидаза хрена, то субстратами могут быть ортофенилендиамин и перекись водорода. Эти субстраты растворяют в 0,1 М цитрат-фосфатном буфере, рН 5: цитрат χ H2O 0,0347 M (7,3 г/л, MW 210,14); гидрофосфат натрия 0,0667 M (Na2HPO4 × 12 H2O 23,87 г/л, MW 358,14).
На один планшет требуется 10 мл раствора. C небольшим запасом к 12 мл субстратного буфера добавляют 8 мг ортофенилендиамина и 5 мкл 30% перекиси водорода, быстро растворяют и раскапывают по лункам.
9. Через 15-30 мин в лунках, где произошла реакция «антиген- антитело», появится желто-коричневая окраска. Другие лунки останутся бесцветными. Для остановки ферментативной реакции в лунки вносят по 50 мкл 1 М раствора серной кислоты (55,5 мл 96 серной кислоты на 900 мл воды; строго добавлять кислоту в воду, а не наоборот!!!).
10. Интенсивность ферментативной реакции измеряют в единицах величины оптической плотности на спектрофотометрах, приспособленных для планшетов («мультисканах»). Для ортофенилендиамина
длина волны проходящего света должна быть 492 нм (для тетраметилбензидина - 450нм). В связи с этим в мультискане устанавливают соответствующий светофильтр.
11. Современные спектрофотометры оснащены программным обеспечением, в котором предусмотрен автоматический расчет средних значений между параллелями и сравнение опытных показателей с показателями в контрольных лунках. Если такого обеспечения нет, то результаты анализируют «вручную».
Оптическую плотность (OD - optical density) в контрольных лунках принимают за некий «фон». Эти показатели умножают на 2; такую величину условно принимают за «линию раздела» - границу (cut off) между положительными и отрицательными значениями OD: значения ниже «cut off» считают отрицательными, значения выше «cut off» - положительными, значения, близкие к «cut off», - неопределенными, или «серой зоной».
Метод иммуноблота
Метод иммуноблоттинга (первоначальное название Western blot, WB1) был разработан главным образом в целях обнаружения в сыворотках пациентов антител, реагирующих с отдельными белками возбудителей инфекционных заболеваний, чаще всего вирусов.
Метод представляет собой следующее.
1. В культурах клеток in vitro (в настоящее время, как правило, в промышленных масштабах) выращивают препаративные количества реплицирующихся вирусов.
2. Клетки разрушают (ультразвуком или иначе), вирусную массу выделяют из культуральной смеси методами ультрацентрифугирования.
3. Вирусные частицы диссоциируют на отдельные белки детергентами и подвергают электрофорезу в геле. В результате каждый вирусный белок в соответствии со своей молекулярной массой и электрическим зарядом занимает определенную позицию в геле. Без применения красок и специальных проявляющих реагентов фракционированные электрофорезом белки в геле не видимы глазу.
1 Впервые блестящая методическая идея «блоттинга» (переноса на «промокашку»; blot по-английски - пятно на промокашке) пришла в голову и была реализована применительно к электрофоретическому анализу ДНК биохимиком E.M. Southern в 1975 г. Из уважения к автору коллеги-биохимики воспользовались лингвистической особенностью фамилии Southern (южный) и тот же метод, примененный к РНК, назвали Northern blot (северный), а к белкам - Western blot (западный).
4. В целях существенной экономии дорогостоящих реагентов в дальнейшем фракционированные белки из геля «промокают», перенося таким образом на плоский пористый материал - нитроцеллюлозу. В производственных масштабах перенос продуктов электрофоретического разделения в геле на нитроцеллюлозу осуществляют также электрофорезом.
5. Лист нитроцеллюлозы с перенесенными на нее электрофоретически разделенными белками вируса нарезают на тонкие полоскистрипы (strip), соответствующие по формату специальным выпускаемым промышленностью пластмассовым «корытцам», в которых стрипы обрабатывают испытуемыми сыворотками и проявляющими реагентами.
6. Стрип заливают испытуемой неразведенной и разведенной 1:10 (или подбирают иные разведения) сывороткой, инкубируют 1 ч или более, тщательно промывают фосфатным солевым буфером с детергентом (0,1% Tween-20), заливают раствором конъюгата антииммуноглобулиновых антител с ферментом (например, пероксидазой хрена), инкубируют 1 ч, тщательно промывают, вносят раствор субстрата (например, ортофенилендиамина с перекисью водорода), после чего наблюдают, не проявятся ли окрашенные полосы в зонах расположения фракционированных вирусных белков.
В случае, если у человека в крови нет противовирусных антител, стрип остается неокрашенным (имеет место лишь неспецифический легкий фон по всей площади стрипа). Это отрицательный результат. Если окрашенными оказываются все полосы вирусных белков, результат квалифицируют как положительный. Если окрашиваются не все, а 1-2 полосы, результат рассматривают как неопределенный.
Ложноотрицательные результаты в иммуноблоте крайне маловероятны. Поэтому по международным соглашениям сертифицированные для клинической диагностики промышленно выпускаемые иммуноблоттинговые тест-системы приняты в качестве подтверждающих по отношению к планшетным и прочим скрининговым иммуноанализам. На рис. 4.11. представлена схема «сэндвича», приготовленного для блоттинга.
Рис. 4.11. Схема «сэндвича», приготовленного для блоттинга
4.3. ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ, СПЕЦИФИЧНОСТЬ, ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ТЕСТ-СИСТЕМ ИММУНОАНАЛИЗОВ
Чувствительность иммуноанализов
Термин «чувствительность» применительно к иммуноанализам имеет два разных смысла.
1. Чувствительность в физико-химическом понимании - это определяемая данным анализом минимальная концентрация искомого вещества в пробе. Как правило, для большинства ИФА-тест-систем такая чувствительность составляет нанограммы в миллилитре.
2. Второе понимание термина «чувствительность» - популяционное и относится к диагностическим тест-системам, предназначенным для выявления тех или иных маркеров заболеваний, чаще всего инфекционных.
При разработке любой тест-системы пользуются биологическим материалом, скажем, пробами крови людей, заведомо больных данным заболеванием (эти пробы называют истинно позитивными), и людей, заведомо не больных данным заболеванием (эти пробы называют истинно отрицательными).
Параметры рассчитывают по приведенным ниже формулам, где N - число тех или иных результатов конкретных анализов на биологическом материале от пациентов с достоверно известными диагнозами.
Чувствительность иммуноанализа в данном случае - это параметр, всегда привязанный к конкретной тест-системе, а не только к принципу метода. Чувствительность зависит от аффинности и авидности взаимодействия используемых (или искомых) антител с искомым (или используемым) антигеном, от других реагентов, включенных в систему, от времени и температуры инкубаций.
Поскольку связывание антител с антигенами не подчиняется линейным зависимостям, то в целях попадания в «зоны эквивалентности» практически во всех вариантах иммуноанализов принято так называемое титрование сывороток или растворов антигенов, т.е. сыворотки (или растворы антигенов) разводят известным образом (двукратные, пятикратные, десятикратные или иные разведения) и каждое из разведений пускают в иммуноанализ. Для того чтобы установить нижнюю границу достоверных признаков связывания антител с антигеном (cut-off - граница отличия отрицательных результатов от положительных), в каждой постановке иммуноанализов обязательно применение заведомо отрицательных и заведомо положительных контрольных сывороток. Если целью анализа является определение не титров сывороток, а численных концентраций искомых антител или антигенов, то прибегают к калибровке. Для этого тест-система должна располагать калибровочными растворами (от 3 до 10 точек), содержащими известные нарастающие концентрации искомого вещества, а система регистрации результатов тоже должна быть «оцифрована», например в единицах оптической плотности, измеряемых спектрофотометрически, или в единицах флюоресцентного излучения, измеряемого флюориметрами, или в единицах числа импульсов в минуту, измеряемых счетчиками радиоактивности (в случае радиоиммуноанализов). В диапазонах прямолинейности калибровочной кривой возможно определение искомых концентраций в испытуемых биопробах.
Учитывая сказанное, мы приведем лишь порядок концентраций, выявляемых с помощью различных технологий иммуноанализов. При этом конкретные тест-системы в пределах одной технологии могут по чувствительности отличаться друг от друга также на порядки.
Методы преципитации, агглютинации и иммунодиффузии работоспособны при концентрациях искомых веществ порядка миллиграммов на миллилитр. Как правило, калибровочные растворы имеют диапазон концентраций от 1 до 0,1 мг/мл.
Твердофазные радиоиммуноанализы и иммуноферментные анализы работают в большинстве тест-систем в нанограммовых диапазонах концентраций (нанограммы на миллилитр). Однако ловушечные конструкции тест-систем, а также иммунометрические тест-системы могут иметь существенно более высокую чувствительность, например 10-12-15 г/мл.
Специфичность иммуноанализов
Специфичность диагностической тест-системы - параметр, характеризующий ее распознавательные возможности в отношении именно данного заболевания, которое она «не путает» с другими.
Диагностическая эффективность тест-систем
Диагностическая эффективность - это параметр, характеризующий возможности данной тест-системы одновременно правильно определять позитивные пробы как позитивные, а негативные пробы - как негативные.
Положительная и отрицательная предсказательная значимость тестсистем.
Есть еще и такие характеристики диагностических тест-систем, как положительная предсказательная значимость (ППЗ) и отрицательная предсказательная значимость (ОПЗ). Чтобы пользоваться данными характеристиками (и это отличает их от приведенных выше
чувствительности и специфичности), необходимо знание реальной распространенности данного инфекционного заболевания в обследуемых популяциях населения.
ППЗ рассчитывают как частоту встречаемости инфицированных людей среди всех индивидуумов, определенных данной тест-системой как позитивные:
ОПЗ тест-системы рассчитывают как частоту неинфицированных людей среди всех индивидуумов, определенных данной тест-системой как отрицательные:
4.4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА КЛЕТОК, СЕКРЕТИРУЮЩИХ ТОТ ИЛИ ИНОЙ ПРОДУКТ, - МЕТОД ELISPOT
Метод ELISPOT (Enzyme-linked immunospot, spot - пятно) был разработан в 1983 г. двумя группами авторов (Sedgwick J.D., Holt P.G., Czerkinsky C.C. et al.) для подсчета числа антителообразующих клеток. ELISPOT пришел на смену знаменитому методу локального гемолиза в агаре Н. Йерне.
Идея метода ELISPOT состоит в использовании культуры клеток in vitro при проведении ловушечного твердофазного иммуноанализа на пористой поверхности (рис. 4.12, см. также цв. вклейку). В настоящее время промышленность выпускает планшеты для культивирования (чаще всего 96-луночные, той же стандартной формы, что и планшеты для ИФА), дно которых покрыто нитроцеллюлозной мембраной. На нитроцеллюлозе сорбируют интересующий антиген, после чего в лунки помещают лимфоциты в полноценной культуральной среде и культивируют их в оптимальных для живых клеток условиях (СО2-инкубатор, оптимальная плотность посадки клеток, все необходимые метаболические добавки и т.д.). Через несколько часов или
Рис. 4.12. Общий принцип метода ELISPOT для определения количества клеток, секретирующих цитокины
1, 2, 3 сут (условия подбирают опытным путем) клетки тщательно вымывают из лунок в проточной системе физраствором или водой с детергентом (например, 0,1% Tween-20 или др.).
Если какие-то клетки секретировали антитела против антигена, сорбированного на дне, то на этом дне фиксируются иммунные комплексы «антиген-антитело». Затем добавляют антииммуноглобулиновый конъюгат с ферментом, инкубируют, промывают, добавляют бесцветный субстрат. Фермент, остающийся после промывок только в точках, в которых лежали во время культивирования антителообразующие клетки (пористая поверхность не позволяет клеткам «кататься» по дну лунок), катализирует образование цветного продукта. В результате на дне лунок образуются окрашенные пятна в тех точках, над которыми лежали антителообразующие клетки (АОК). Первоначально пятна пытались подсчитывать визуально. Получали нечеткие субъективные результаты. Вскоре разработали несложное приборное оборудование, состоящее из миниатюрной видеокамеры, которая фиксирует изображение каждой лунки планшета и в цифровом виде отправляет эту информацию в компьютер. С помощью специально созданного программного обеспечения (самый дорогостоящий компонент метода) стали проводить анализ данных, сравнивая опытные лунки с контрольными и определяя количество искомых клеток на (например) 106 общего числа клеток в исследуемой суспензии.
Вскоре стало очевидно: метод ELISPOT весьма универсален и пригоден для под-
счета, скажем, клеток, продуцирующих тот или иной цитокин. В данном случае первым слоем на дно специальных планшетов для ELISPOT сорбируют моноклональные антитела против интересующего цитокина. Затем помещают в лунки культуру исследуемых клеток. Специфическим и творческим моментом в данном случае является добавление в культуру стимуляторов продукции заданного цитокина. Дальнейшие этапы выполнения метода те же, что при подсчете АОК.
Метод ELISPOT, несмотря на весьма высокие цены на реагенты и приборы, включен в международные протоколы обязательных исследований при разработках и клинических испытаниях вакцин. Мы приведем в качестве примера более подробный протокол методики с применением для повышения чувствительности авидин-биотиновой системы. Методика в целом включает два этапа:
1-й - стерильное культивирование живых и функционирующих
клеток;
2-й - иммуноанализ в тех же планшетах, но уже в нестерильных условиях.
Стерильные условия работы
1. Антицитокиновое антитело-1 сорбируют на пористой твердой фазе культурального планшета (это антитело - ловушка для секретируемого цитокина).
2. В планшет помещают исследуемые клетки (суспензию в различных концентрациях - от 105 до 2х106 в 1 мл).
3. К клеткам добавляют стимулятор в различных концентрациях.
4. Систему культивируют в оптимальных условиях в течение 2-24 ч или больше (подбирают оптимум).
Нестерильные условия работы
1. Лунки тщательно промывают сначала водой с целью удаления клеток, затем отмывочным буфером с детергентом (0,1% Tween-20), чтобы смыть все, что плохо связалось.
2. В лунки вносят конъюгат проявляющего антитела-2 с биотином, инкубируют 2 ч.
3. Промывают и вносят конъюгат «авидин-пероксидаза», инкубируют 1 ч.
4. Промывают и вносят субстратную смесь - АЕС [3-амино-9- этилкарбазол, растворенный исходно в N,N-диметилформамиде (100 мг АЕС на 10 мл DMF) и разбавленный до конечной концентрации в 0,1 М ацетатном буфере, рН 5 и плюс перекись водорода; рецепт
субстратной смеси: 333,3 мкл матричного раствора АЕС + 10 мл ацетатного буфера + 5 мкл 30% перекиси водорода].
5. Реакцию останавливают под визуальным контролем через 5-50 мин путем промывки плэйтов водой.
6. Плэйты сушат при комнатной температуре в темноте в течение 2 ч.
7. Регистрируют результат, т.е. подсчитывают пятна: либо «вручную», под соответствующим микроскопом (результаты получают в «двоичной системе» - «много» или «мало»), либо в специальном аппарате, считывающем картину дна лунок видеокамерой и соответствующей компьютерной программой анализа пятен (получают цифровой результат).
Результаты, получаемые в ELISPOT, отражены на рис. 4.13 (см. также цв. вклейку).
Рис. 4.13. Примеры результатов ELISPOT: увеличенное изображение двух лунок: лунки с положительным результатом (а), с четко различимыми «пятнами», подлежащими подсчету; лунки с отрицательным результатом (б)
4.5. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКИХ И ЯДЕРНЫХ БЕЛКОВ - ФАКТОРОВ ТРАНСКРИПЦИИ, СИГНАЛЬНЫХ МОЛЕКУЛ И ДРУГИХ
Методы твердофазных иммуноанализов типа ELISA используют и для изучения молекулярных процессов проведения сигналов от мембранных рецепторов внутрь клетки. Эксперименты такого типа состоят из двух этапов.
Творческий поисковый этап - создание модели активации определенных живых клеток in vivo или в культуре in vitro.
Технический этап:
а) лизис клеток без денатурации макромолекул;
б) детекция искомых молекул передачи сигналов методом ловушечного ИФА.
В качестве «ловушки» на твердой фазе используют высокоспецифичные антитела к определенным эпитопам, характерным для активированного состояния молекул, например сайтам фосфорилирования конкретных белков, участвующих в проведении сигнала. В этой связи коммерческие тест-системы такого назначения получили название «phosphoELISA».
Внутриклеточные белки исследуют в целях анализа конкретных молекулярных путей проведения сигналов в клетке (англ. pathways - путь), определяя конкретные киназы, фосфатазы, адаптерные белки, факторы транскрипции и др.
Для исследования внутриклеточных цитоплазматических белков и их производных интересующие клетки тщательно отмывают от внеклеточных субстанций 2-3-кратным центрифугированием (800 g, 5-6 мин) в фосфатном солевом буферном растворе, после чего лизируют буфером следующего состава (одного из возможных): 50 mM Tris, pH 7,4; 250 mM NaCl; 5 mM EDTA (этилендиаминтетраацетат); 1% NP40 (Nonidet P40); 50 mM NaF; 1mM Na3VO4; 1 mM PMSF (ингибитор сериновых протеаз - трипсина и химотрипсина - фенилметан-сульфонил флюорид, матричный 0,3 М раствор в ДМСО, добавляют ex temporo); смесь ингибиторов протеаз (AEBSF, пепстатин А, Е-64, бестатин, лейпептин, апротинин или других, добавляют ex temporo).
Осадок отмытых фосфатным буфером клеток ресуспендируют в лизирующем буфере и оставляют на 15 мин в условиях мягкого перемешивания. Затем лизат центрифугируют при 14 000 об/мин в течение 10 мин, разливают по аликвотам, определяют в нем общую концентрацию белков (чаще всего - методом Bradford). Наиболее приемлемы для дальнейших анализов концентрации белков 200- 400 мкг/мл.
В дальнейшем выполняют обычный ловушечный вариант ELISA (см. выше). Весьма важен как можно более многосторонний контроль (как минимум заведомо положительный контроль, заведомо отрицательный контроль, а также лизат одноименных, но неактивированных клеток, лизат клеток, обработанных «посторонним» биохимически родственным активатору веществом и др.).
Определение факторов транскрипции во внутриядерном содержимом
Процедура получения фракции ядер интересующих клеток может быть следующей.
1. 5х106-2х107 клеток помещают в коническую пробирку объемом 15 мл, дважды отмывают в 10 мл фосфатно-солевого буфера (ФСБ) при 800 g 5-6 мин.
2. Супернатант удаляют и к осадку клеток добавляют гипотонический лизирующий буфер из расчета 0,5 мл буфера на 5х106 клеток. Ex temporo (не ранее, чем за 10 мин до добавления к клеткам) на 0,5 мл гипотонического буфера добавляют 5 мкл ингибиторов фосфатаз, 5 мкл ингибиторов протеаз, 5 мкл DTT (дитиотреитол), 0,5 мкл
PMSF.
3. Клетки аккуратно перемешивают в гипотоническом буфере, переносят в чистую пробирку объемом 1,5 мл и оставляют на льду в течение 10 мин.
4. Добавляют 25 мкл на 0,5 мл рабочего материала раствора детергента (0,1% SDS; 1% Triton X-100; 0,1% Tween 20) и перемешивают в течение 5 с.
5. Центрифугируют при 800 g 5-6 мин, 4 °С.
6. Супернатант отделяют (он содержит цитоплазматические белки и может представлять интерес для отдельного анализа), а осадок ядер ресуспендируют в 1 мл полного буфера для отмывки ядер (к буферу добавляют ex temporo 10 мкл ингибиторов фосфатаз, 10 мкл ингибиторов протеаз, 10 мкл раствора DTT, 1 мкл раствора PMSF).
7. Ядра дважды отмывают центрифугированием при 800 g 5-6 мин, 4 °С.
8. Осадок ядер по объему примерно равен 25 мкл. К этому осадку добавляют равный объем специальных экстрагирующих буферов и аккуратно перемешивают в течение 2 с.
9. Смесь инкубируют на льду в течение 30 мин, перемешивая каждые 10 мин.
10. Осветляют ядерный экстракт центрифугированием при 14 000 g 30 мин при 4 °С.
11. Супернатант содержит искомые вещества (факторы транскрипции). Его переносят в чистые охлажденные пробирки.
12. Определяют концентрацию белков по Bredford. Как правило, из 5х106 клеток удается получить 25-100 мкг ядерных белков.
13. Полученные образцы можно морозить при -80 °С в ожидании анализа, но только однократно.
Существуют технологии одновременного определения в одном биоматериале нескольких искомых факторов транскрипции (или цитокинов, или киназ и др.). Подобные методы в настоящее время осуществимы главным образом с применением высокотехнологичных коммерческих тест-систем. В качестве примера мы приведем описание процедур для тест-системы «Luminex 100» (Invitrogen. www.invitrogen.com). В данной технологии в качестве твердой фазы для ключевых реагентов используют микрошарики. Оценка результатов возможна только на уникальном приборе (большинство подобных тест-систем - так называемые закрытые, т.е. используют только свои приборы, свои реагенты, свои компьютерные программы).
Факторы транскрипции по своей природе реагируют, т.е. специфически связываются с определенными последовательностями нуклеотидов в двуспиральной ДНК.
Поэтому специфическими реагентами на факторы транскрипции являются строго определенные олигонуклеотиды ДНК, меченные биотином.
Второй олигонуклеотидный реагент конструируют из двух частей. Первая - последовательность нуклеотидов, комплементарная меченному биотином олигонуклеотиду. В виде двойной спирали они составляют сайт связывания искомого фактора транскрипции. Вторая часть этого олигонуклеотида - «ловушечная» последовательность, комплементарная последовательности нуклеотидов, фиксированной на твердой фазе (микрошариках).
Пробы раскапывают в лунки микропланшет, предназначенных для проведения ПЦР, чтобы использовать для инкубаций в качестве термостата термоциклер.
Минимальный набор анализируемых образцов включает:
•  заведомо позитивный контроль;
•  заведомо негативный контроль;
•  пробу в виде постороннего белка;
•  ядерный экстракт из нестимулированных клеток;
•  ядерный экстракт из одноименных стимулированных клеток. Такой планшет инкубируют в течение 20 мин при 25 °С (можно в
ПЦР-термоциклере, который в данном случае используют как удобный динамичный термостат).
Затем в лунки с позитивным контрольным реагентом добавляют только буфер, тогда как в остальные лунки вносят буфер с нуклеазой, расщепляющей не связанную с белками ДНК. Инкубируют 20 мин при 37 °С. Только те ДНК-пробы, с которыми связались факторы транскрипции, не расщепляются нуклеазой, так как факторы транскрипции защищают последовательность нуклеотидов от атаки нуклеазы. Таким образом, количество биотиновой метки на молекулах ДНК прямо коррелирует с количеством того или иного фактора транскрипции в биопробе.
Стадия гибридизации с твердой фазой: в лунки вносят реагентные микрошарики и инкубируют 45 мин при комнатной температуре под светонепроницаемой крышкой, например, из алюминиевой фольги (рис. 4.14).
Рис. 4.14. Связывание с твердой фазой (шариками)
На следующей стадии (отмывке) применяют специальные планшеты из фильтрующего материала: содержимое лунок первоначальных планшет переносят в лунки планшет из фильтрующего материала и промывают трижды промывочным буфером с использованием вакуумной аспирации; растворимые компоненты вымываются, микрошарики остаются на дне лунок фильтровальных планшет.
Добавляют проявляющий реагент - конъюгат стрептавидина с люминофором, инкубируют 5 мин в темноте (рис. 4.15). Промывают и регистрируют люминесценцию на специальном приборе (например, Luminex 100).
Результаты считывают и обрабатывают специальной компьютерной программой (Luminex IS и др.).
В каждой биопробе за один цикл анализа, т.е. одновременно, можно количественно определить до 10 факторов транскрипции и более.
Рис. 4.15. Проявка
Вопросы и задания
1. Дайте определение термина «иммуноанализы».
2. Назовите варианты меток.
3. Назовите технологические варианты иммуноанализов.
4. Что такое «прямые» иммуноанализы?
5. Что такое «непрямые» иммуноанализы?
6. Какие вам известны варианты конструкций тест-систем?
7. Какие ферменты используют в иммуноферментных анализах?
8. Что такое иммунохроматография?
9. Что такое иммуноблот?
10. Дайте определение чувствительности и специфичности тестсистем.
11. Тест-системы с какими чувствительностью и специфичностью (высокой/низкой) следует применять в скрининговых (первичных) обследованиях?
12. Как зависит величина сигнала от концентрации определяемого вещества в биопробе в:
а) ловушечном;
б) конкурентном;
в) ингибиторном;
г) «сэндвич»;
д) иммунометрическом вариантах иммуноанализов.
13. Нарисуйте схему иммунометрической тест-системы.
14. Что означает вывод о «ложнопозитивном» результате иммуноанализа?
15. Что означает вывод о «ложнонегативном» результате иммуноанализа?
16. Какие варианты регистрирующих приборов применяют в иммуноанализах?
17. Какова в среднем чувствительность иммуноанализов (относительно концентраций определяемых веществ)?

Глава 5
Гибридомная технология. Моноклональные антитела.
В конце 60-х - начале 70-х годов XX в. были разработаны лабораторные методы клонирования клеток in vitro. Для этого понадобилось создать питательные среды, материалы для лабораторной посуды и термостаты-инкубаторы, позволившие имитировать условия внутренней среды организма для сохранения жизнеспособности клеток млекопитающих. В течение 10-12 лет удавалось клонировать только опухолевые клетки, поскольку их собственным свойством является способность неограниченно (в благоприятных для них внешних условиях) делиться митозом. Г. Келлер и Ц. Мильштейн в 1974-1975 гг. применили метод получения гибридных соматических клеток, который использовали цитогенетики для изучения локализации генов, контролирующих тот или иной признак в той или иной хромосоме (гибридные клетки выбрасывают большую часть хромосом, но не все), к лимфоцитам, но с иными целями. Г. Келлер и Ц. Мильштейн получили гибридные клетки из лимфоидной опухоли (миелома) и нормального лимфоцита. Гибридные клетки имели часть хромосом (а следовательно, и свойств) нормального лимфоцита (другая часть хромосом выбрасывалась из клеток в течение первых делений, пока геном не стабилизировался) и часть - от опухоли. Размножались только клетки, унаследовавшие от миеломы способность к неограниченному делению. Параллельно в них шел биосинтез тех или иных продуктов нормального лимфоцита, например антител; последние и требовались Г. Келлеру и Ц. Мильштейну. Неограниченно делящиеся клетки «позволяют» себя клонировать, т.е. физически «рассадить» по одной (каждую в отдельную посуду) и получить клоны клеток - потомков одной клетки. Такие клетки назвали гибридомами.
Лимфоциты для гибридизации получают из селезенки или лимфоузлов, предварительно иммунизированных целевым антигеном мышей (чаще всего - линии Balb/c). В качестве опухолевых клетокпартнеров используют специально выведенные для получения гибридом мутантные клетки мышиной миеломы (иногда ее же называют плазмоцитомой, что в данном случае одно и то же), полученные из перевивной линии миеломных клеток МОРС-21 от мышей Balb/c,
поддерживаемой в культуре in vitro с 1921 г. Келлер и Мильштейн использовали мутантные миеломные клетки, выведенные цитогенетиками ранее также для получения гибридных клеток млекопитающих, но в иных целях: поскольку гибридные клетки выкидывают большую часть хромосом, по оставшимся цитогенетики устанавливали локализацию тех или иных признаккодирующих генов в конкретных хромосомах.
«Мутантность» миеломных клеток необходима для метаболической селекции клеток гибридом от неслившихся с лимфоцитами клеток миеломы. Эта «мутантность» состоит в отсутствии в миеломных клетках действующего гена, кодирующего фермент ГГФРТ. Данный фермент катализирует синтез гуанина (одного из 4 азотистых оснований, входящих в состав ДНК) из гипоксантина. Вскоре после первой публикации Келлера и Мильштейна в распоряжении «гибридомщиков» во всем мире оказались две удобные линии мутантных миелом - P3/X63-Ag8-653 и SP2/0-Ag14, которые быстро пролиферируют и сами не продуцируют никаких частей иммуноглобулинов.
Суспензию лимфоидных клеток от иммунных мышей смешивают в одной пробирке в минимальном объеме среды с суспензией миеломных клеток и на 1-2 мин добавляют сливающий агент. У Келлера и Мильштейна сначала этим агентом был, как и у цитогенетиков, вирус Сендай, но через несколько месяцев уже все «гибридомщики» в качестве сливающего агента использовали синтетические полимеры - полиэтиленгликоли с молекулярными массами от 1540 до 6000 D. По прошествии 1-2 мин суспензию клеток, содержащую смесь неслившихся лимфоидных клеток, неслившихся клеток миеломы и гибридных клеток 3 вариантов («лимфоцит-лимфоцит», «миелома-миелома», «лимфоцит-миелома»; из них искомыми клетками являются только гибриды «лимфоцит-миелома»), отмывают и разводят в рассчитанном объеме селективной среды НАТ. НАТ означает «Hypoxanthine-Aminopterin Thymidine». Указанные 3 компонента в известных концентрациях вводят в полную культуральную среду. В течение первых 7-10 дней культивирования названной смеси клеток в культуре происходит следующее:
1) неслившиеся лимфоциты и гибриды «лимфоцит-лимфоцит» погибают в силу своей природной недолговечности;
2) неслившиеся клетки миеломы и гибриды «миелома-миелома» погибают от невозможности осуществлять биосинтез своей ДНК в присутствии аминоптерина - метаболического яда,
избирательно блокирующего ферменты биосинтеза пиримидиновых оснований de novo из N5N10-метилен-тетрагидрофолата; биосинтез пуриновых оснований из гипоксантина в этих клетках также невозможен в связи с отсутствием ГГФРТ; 3) единственные клетки, имеющие возможность выжить в среде НАТ, это искомые гибридные клетки «лимфоцит-миелома»: биосинтез пуриновых оснований у них обеспечен ГГФРТ, ген которой получен из нормального лимфоцита, и средовым гипоксантином, а биосинтез пиримидиновых оснований осуществляется из средового тимидина с участием тимидинкиназы. Основные этапы гибридомной технологии показаны на рис. 5.1. От клеток миеломы данные гибридные клетки наследуют свойство неограниченной пролиферации. От нормальных иммунных В-лимфоцитов - биосинтез иммуноглобулинов.
Пролиферация «non-stop» позволяет клонировать гибридные клетки, т.е. рассеять по 1 в лунку и подождать, когда из этой одной клетки при благоприятных условиях культивирования вырастет клон, т.е. много одинаковых клеток (с точностью до спонтанных мутаций). Какие из получившихся «лимфоцит-миеломных» гибридных клеток продуцируют заданные антитела, выясняют, отбирая из лунок пробы супернатанта на соответствующий иммуноанализ. В дальнейшем избранные гибридомы неоднократно реклонируют и выводят в массовые культуры - реакторы in vitro или асцитные опухоли у сингенных мышей. Из культуральных супернатантов или асцитных жидкостей выделяют гибридомные моноклональные антитела в очищенном виде.
Если клон клеток гибридомы синтезирует антитела, то эти антитела называют моноклональными. Как показал опыт, все клетки клонированной гибридомы синтезируют одинаковые антитела - и по специфичности активного центра, и по изотипу тяжелой цепи, т.е. моноклональные антитела - не только продукт моноклона, но и препарат одинаковых иммуноглобулинов. В конце 1970-х годов научились выращивать in vitro и клонировать Т-лимфоциты, не скрещенные с опухолевой линией клеток. Это стало возможным только после открытия фактора роста Т-лимфоцитов, позже названного ИЛ-2. Именно клонирование Т-лимфоцитов позволило открыть субпопуляции CD4+ Т-лимфоцитов и сделать множество других открытий, в том числе идентифицировать ВИЧ (достаточные для исследования количества генов и белков вируса смогли наработать
Рис. 5.1. Основные этапы получения гибридом
только на Т-лимфоцитах, культивируемых in vitro в присутствии факторов роста). В-лимфоциты без превращения их в гибридомы можно заставить делиться (что позволяет их клонировать), если инфицировать их вирусом Эпштейна-Барр (он трансформирует нормальные В-лимфоциты в опухоль из В-лимфоцитов).
Таким образом, моноклональные антитела, продуцируемые одним клоном, являются:
•  высокоспецифичными, направленными к заданной антигенной детерминанте;
•  идентичными по изотипу, аллотипу и идиотипу, а также по аффинитету и физико-химическим характеристикам.
Стабильные культуры гибридом способны продуцировать в неограниченном количестве моноклональные антитела.
Моноклональные антитела в настоящее время широко применяют в различных областях медицины. В основе применения монАТ в различных областях лежит возможность получения больших количеств высокоаффинных антител, специфичных по отношению:
1) к иммуногенным антигенам, определяющим гистосовместимость и дифференцировку;
2) дифференцировочным, опухолевым и другим антигенам клеточной поверхности, которые лишены полиморфизма и неиммуногенны в аллогенных системах, но распознаются при ксеногенной иммунизации;
3) вирусным и бактериальным антигенам;
4) единичным антигенным детерминантам разнообразных белков, нуклеиновых кислот и сахаров.
Применение монАТ позволяет определять и разделять субпопуляции клеток, различать отдельные стадии развития клеток, более точно типировать ткани, более точно идентифицировать микроорганизмы, а также более надежно определять иммунологическими методами биологически важные макромолекулы.
В медицине на основе монАТ разработано большое количество систем диагностирования различных заболеваний (инфекционных, онкологических и др.). Активно разрабатываются и лекарственные препараты на основе монАТ, например противоопухолевые препараты, антицитокиновые антитела (препарат ремикейт и др.) Однако было показано, что применение мышиных монАТ для иммунотерапии опухолевых заболеваний приводит к появлению различных побочных эффектов и отличается слабой эффективностью действия.
Модификация мышиных монАТ (гуманизированные антитела и различные конъюгаты монАТ - с радионуклидами, лекарствами, токсинами и пр.) открывает новые возможности в диагностике и лечении опухолевых и других заболеваний.

Глава 6. Генетическая методы исследования в иммунологии.
6.1. ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - экспериментальный метод молекулярной биологии, который представляет собой специфическую амплификацию нуклеиновых кислот, индуцируемую синтетическими олигонуклеотидными праймерами in vitro.
Идея разработки метода ПЦР принадлежит американскому исследователю Kary Mullis, который в 1983 г. создал метод, позволивший амплифицировать ДНК в ходе циклических удвоений с помощью фермента ДНК-полимеразы в искусственных условиях. Через несколько лет после опубликования этой идеи, в 1993 г., К. Mullis получил за нее Нобелевскую премию.
В начале использования метода после каждого цикла нагревания- охлаждения приходилось добавлять в реакционную смесь ДНК-полимеразу, так как она быстро инактивировалась при высокой температуре. Процедура была очень неэффективной, требовала много времени и фермента. В 1986 г. ее существенно модифицировали за счет использования ДНК-полимеразы из термофильных бактерий. Эти ферменты способны выдерживать множество циклов реакции, что позволяет автоматизировать проведение ПЦР. Одна из наиболее часто использовавшихся термостабильных ДНК-полимераз была выделена из бактерий Thermus aquaticus и названа Taq-ДНК-полимеразой.
Суть метода. Метод основан на многократном избирательном копировании определенного участка ДНК при помощи фермента Taq- ДНК-полимеразы. Полимеразная цепная реакция позволяет получить амплификаты длиной до нескольких тысяч пар нуклеотидов. Для увеличения длины ПЦР-продукта до 20-40 тыс. пар нуклеотидов применяют смесь различных полимераз, но все равно это значительно меньше длины хромосомной ДНК эукаротической клетки.
Реакция проводится в программируемом термостате (амплификаторе) - приборе, который может проводить достаточно быстро
охлаждение и нагревание пробирок (обычно с точностью не менее 0,1 °С). Амплификаторы позволяют задавать сложные программы, в том числе с возможностью «горячего старта» и последующего хранения. Для ПЦР в режиме реального времени выпускают приборы, оборудованные флуоресцентным детектором. Существуют также приборы с автоматической крышкой и отделением для микропланшет, что позволяет встраивать их в автоматизированные системы.
Обычно при проведении ПЦР выполняется 20-45 циклов, каждый из которых состоит из трех стадий: денатурации, отжига праймеров, элонгации (рис. 6.1 и 6.2). На рис. 6.1 представлена динамика изменения температуры в пробирке при проведении цикла ПЦР.
Рис. 6.1. График изменения температуры в пробирке в течение одного цикла полимеразной цепной реакции
Денатурация ДНК-матрицы проводится с помощью нагревания реакционной смеси до 94-96 °С на 5-90 с, чтобы цепи ДНК разошлись. Следует отметить, что перед первым циклом осуществляют предварительный прогрев реакционной смеси в течение 2-5 мин для полной денатурации исходной матрицы, что позволяет снизить количество неспецифичных продуктов реакции.
Рис. 6.2. Схема первого цикла полимеразной цепной реакции
Стадия отжига праймеров. При плавном снижении температуры праймеры комплементарно связываются с матрицей. Температура отжига зависит от состава праймеров и обычно она на 4-5° ниже расчетной температуры плавления. Длительность стадии - 5-60 с.
Во время следующей стадии - элонгации - происходит синтез дочерней цепи ДНК на матрице материнской. Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые ДНК-полимеразы Taq и Pfu наиболее активны при 72 °С. Время элонгации, в основном зависящее от длины ПЦР-продукта, обычно составляет 1 мин на каждую тысячу пар оснований.
После проведения ПЦР проба инкубируется при температуре 72 °С в течение 10 мин. Количество специфического продукта реакции (ограниченного праймерами) при 100% эффективности теоретически возрастает в геометрической прогрессии по формуле Р = 2n, где Р - количество специфического продукта, а η - число циклов реакции. Практически эффективность ПЦР меньше 100%, поэтому в действительности P = (1 + E)n, где P - количество продукта; Е - средняя эффективность цикла; а n - число циклов реакции.
При большем, чем указано, количестве циклов реакции происходит накопление неспецифических продуктов последней. Рост требуемого продукта в геометрической прогрессии ограничен числом реагентов, присутствием ингибиторов и побочных продуктов реакции. На последних циклах рост замедляется, это называют «эффектом плато» (рис. 6.3). Кинетика ПЦР имеет экспоненциальный характер только на начальном этапе, после чего начинается выход на плато в силу истощений в реакции компонентов (dNTP, праймеров) и нарастающего температурного повреждения Таq-ДНК-полимеразы, конкуренции за фермент амплификонов.
Компоненты полимеразной цепной реакции. Компоненты, используемые в ПЦР, следующие: Taq-ДНК-полимераза, дезоксирибонуклеотидтрифосфаты, буферный раствор, «прямой» и «обратный» праймеры, а также ДНК-матрица.
Фермент Taq-ДНК-полимераза. При оптимальных условиях в реакционной смеси ПЦР (50-100 мкл) фермент содержится в количестве 0,5-2 единиц на пробу. Taq-ДНК-полимераза синтезирует цепь ДНК до 1000 пар оснований в минуту. Увеличивая время полимеризации и подбирая новые разновидности ДНК-полимеразы, обладающие и экзонуклеазной (редактирующей) активностью, вырезающей ошибочные (некомплементарные) нуклеотиды, удалось получить очень
длинные амплифицированные ДНК - до 42 тыс. пар оснований (Лонг-ПЦР). Избыток Таq-ДНК-полимеразы увеличивает образование неспецифических продуктов ПЦР.
Рис. 6.3. Динамика накопления продукта при полимеразной цепной реакции
dNTP. Дезоксирибонуклеотидтрифосфаты (dNTP), используемые в ПЦР, следующие: dATP, dGTP, gTTP, dCTP. dNTP содержатся в реакционной смеси в эквивалентных концентрациях от 200 до 500 мкм, так как избыток какого-либо из них увеличивает ложное спаривание нуклеотидов в ПЦР.
Праймеры. Специфичность ПЦР основана на образовании комплементарных комплексов между матрицей и праймерами, каждый из последних комплементарен одной из цепей двухцепочечной матрицы, обрамляет начало и конец амплифицируемого участка (рис. 6.4).
Поскольку праймеры каждый раз встраиваются в амплифицируемые фрагменты ДНК-матрицы (амплификоны), то они должны в реакционной смеси ПЦР присутствовать в избытке, и концентрация их составляет 0,5-1 мкМ. Специфичность получаемого продукта
ПЦР в значительной степени определяется так называемой температурой отжига праймеров, при которой они взаимодействуют с комплементарными участками ДНК-матрицы, образуя двухцепочечные структуры.
Рис. 6.4. Пример «прямого» и «обратного» праймеров
Буферная система. 10-кратный буфер для ПЦР чаще всего имеет состав: 0,5 М KCl; 0,2 М Трис-HCl, pH 8,4; 25 мМ MgCl2; 1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА) - пример стандартной прописи буферной системы.
Tris Cl. Высокое значение рН нужно из-за того, что при повышении температуры рН Tris-буфера падает и при 72 °С составляет ~7,5.
KCl. Средние концентрации KCl стимулируют на 40-60% активность Taq-ДНК-полимеразы (но 0,2 M полностью ингибирует полимеразную активность).
MgCl2. Диапазон рабочих концентраций: 0,5-5 мМ. Увеличение концентрации Mg2+ оказывает очень резкое влияние на специфичность и эффективность ПЦР: увеличивается выход, но более высокими темпами уменьшается специфичность. Оптимум зависит от последовательностей матрицы и праймеров.
Таким образом, слишком низкая концентрация Mg2+ - низкий выход, слишком высокая - неспецифическая амплификация.
На молекулярном уровне: Mg2+ образует комплексы с dNTP's. Именно эти комплексы являются субстратом для Taq-ДНК- полимеразы. C Mg2+ стехиометрически связываются dNTP's, PPi, EDTA, PO4. Повышение концентрации Mg2+ вызывает повышение температуры плавления ДНК.
В полимеразной цепной реакции используется вода высокой очистки (MQ). В зависимости от конструкции прибора (если «крышка» амплификатора не нагревается) в реакцию бывает необходимым на ПЦР-смесь наслаивать стерильное минеральное масло для предотвращения испарения пробы.
ДНК-матрица. Общее количество ДНК, вносимой в пробирку для ПЦР, не должно превышать 1 мкг, ибо большой избыток неспецифической ДНК снижает специфичность и чувствительность ПЦРамплификации ДНК-матрицы. Подготовка пробы материала (выделение ДНК или РНК) должна проводиться в условиях, исключающих перекрестное загрязнение исследуемых проб выделяемыми нуклеиновыми кислотами.
Чтобы ПЦР прошла успешно, должна произойти гибридизация праймеров с нужной последовательностью-мишенью. Если эта последовательность слегка различается у разных индивидуумов или у микроорганизмов из разных изолятов (т.е. имеет место полиморфизм), может произойти ее неполное спаривание с амплимером и нарушение нормальной амплификации, что приведет к получению ложноотрицательного результата. Следует отметить: у человека большая часть геномных последовательностей консервативна и не различается у разных индивидуумов, а потому обычно в таких случаях для работы подходят одинаковые наборы «консервативных» праймеров.
Контаминация. Для исключения ложноположительного результата необходимо обязательное использование чистых перчаток, одноразовых пробирок и наконечников к автоматическим пипеткам, проведение предварительной ультрафиолетовой обработки помещения и рабочих поверхностей столов и приборов. Подчеркнем: ДНКматрицы генов клеток, вирусов и бактерий пригодны для ПЦР в течение десятков лет даже после замораживания, высушивания, температурной или химической денатурации белков и др.
Чувствительность ПЦР порой достигает математически возможного предела (детекции 1 копии ДНК-матрицы), поэтому существует высокая степень опасности получения ложноположительного результата в силу переноса через предметы и реагенты как самой ДНКматрицы (реже), так и амплификонов (очень часто), получаемых в больших количествах во многих пробирках в течение ежедневной работы.
Причинами ложноположительных результатов являются следующие 3 вида контаминаций.
1. Контаминация от пробы к пробе (в процессе обработки клинических образцов или при раскапывании реакционной смеси), приводящая к появлению спорадических ложноположительных результатов.
2. Контаминация рекомбинантными плазмидами, содержащими клонированные последовательности детектируемого гена.
3. Контаминация продуктами амплификации (амплификонами). Она - наиболее частая причина ложноположительных результатов, поскольку в процессе ПЦР-генодиагностики амплификоны накапливаются в больших количествах и очень легко переносятся с аэрозолями и через приборы. Поэтому детекция продуктов ПЦР должна проводиться в изолированной комнате сотрудником, не производящим обработку клинических образцов и не готовящим реактивы для ПЦР. Приготовление основных растворов также должно производиться в отдельной чистой комнате. Все растворы следует хранить и использовать небольшими порциями.
Необходимо постоянно осуществлять собственные виды лабораторного контроля и периодически применять зашифрованные отрицательные и положительные контрольные образцы для оценки специфичности и чувствительности ПЦР-генодиагностических исследований. Неуклонно выполняя эти требования и выполняя в каждой ПЦР отрицательный контроль разных типов (на процедуру обратной транскрипции, буферный раствор, праймеры), можно практически исключить ложноположительные результаты ПЦР.
Очень важен для правильной интерпретации результатов выбор способов контроля. Положительный и отрицательный контроль должен быть хорошо охарактеризован. Часто используют ДНК из клеточных линий, заведомо содержащих или не содержащих последовательность-мишень. В каждом анализе нужны как минимум три вида контроля:
1) положительный контроль (образец заведомо содержит последовательность-мишень);
2) отрицательный контроль (образец заведомо не содержит последовательность-мишень);
3) бланк-контроль (реакционная смесь, в которой присутствуют все компоненты за исключением ДНК; бланк-контроль является индикатором загрязнений).
Один тип положительного контроля должен содержать максимальное число последовательностей-мишеней, другой - небольшое их число. Это позволяет определить чувствительность и эффективность ПЦР.
Детекция. Для анализа ПЦР-амплифицированной ДНК существуют разные методы: гель-электрофорез, дот-блот-гибридизацию и блот-гибридизацию по Саузерну. С их помощью можно анализировать большинство ПЦР-продуктов, но абсолютно точные результаты получают только при секвенировании. Следует отметить: в дальнейших главах будет описана модификация ПЦР - полимеразная цепная реакция в режиме реального времени, в которой детекция возрастания количества ПЦР-продуктов осуществляется непосредственно в пробирке при прохождении реакции (см. ниже).
Рис. 6.5. Фотография электрофоретического геля с ПЦР-продуктами
Присутствие специфического ПЦР-продукта (амплификона) в подавляющем большинстве случаев детектируют электрофоретическим разделением ПЦР-амплификационной смеси на окрашенных бромистым этидием агарозном или полиакриламидном гелях. Для такого выявления необходимо не менее 20 нг ДНК. Специфичность полосы амплифицированной ДНК подтверждается ее положением (размерами) по отношению к маркерным фрагментам и ДНКстандарту. Дополнительные доказательства специфичности амплификона получают путем расщепления специфическими рестриктазными
ферментами или путем гибридизации со специфическим радиоактивным или флуоресцентным олигонуклеотидным зондом.
Рис. 6.6. Устройство горизонтальной электрофоретической камеры
Электрофорез в агарозном геле позволяет легко, без применения радиоизотопов, обнаружить амплифицированную ДНК и определить ее размер (рис. 6.5 и 6.6). Остановимся на некоторых ее особенностях применительно к анализу ПЦР-амплифицированной ДНК:
а) 10-20 мкл амплифицированной ДНК разделяют в 2% агарозном геле вместе со стандартными фрагментами размером 50-1000 пар нуклеотидов;
б) электрофорез проводят при высоком напряжении (10-15 В/см), поскольку образующиеся при ПЦР небольшие фрагменты сложно детектировать после электрофореза в течение ночи при небольшом напряжении вследствие их интенсивной диффузии.
Разрешение можно повысить, используя полиакриламидные или агарозные гели с высокой концентрацией агарозы (3-4%). Впрочем, если анализ нужно провести быстро и с небольшими затратами, вполне приемлемы 2% агарозные гели. Обычно при амплификации ДНК, выделенной из фиксированных тканей, выход ПЦР-продуктов ниже, и они менее специфичны, чем в случае амплификации высокоочищенной ДНК.
Метод гибридизации ПЦР-амплифицированной ДНК (по Саузер- ну) позволяет идентифицировать полосы в геле, наблюдаемые после электрофореза амплифицированной ДНК. Для гибридизации используются как изотопно, так и неизотопно меченые зонды.
Дот-блот-гибридизация дает простой ответ по типу «да-нет» и особенно полезна в тех случаях, когда проводится анализ большого числа образцов.
Прямое секвенирование амплифицированной ДНК - также высоконадежный метод доказательства ее специфичности, но применяется в основном для определения точечных мутаций генов. В последние годы для детекции и одновременно количественной оценки амплифицированной ДНК все больше начинают применять гибридизационно-ферментный метод на микропланшетах. Но существуют и другие варианты: используются олигонуклеотидный зонд, его метят дигоксигенином или флуоресцеином с последующим проявлением моноклональными антителами к дигоксигенину или флуоресцеину; меченные ферментами моноклональные антитела к двухцепочечной ДНК; зонд, меченный рутением (электрохемилюминесцентный метод). Весьма перспективна для количественных детекций амплификонов на гель-электрофореграммах миниатюрная видеокамера, передающая на экран монитора интенсивность флуоресценции полос ДНК-амплификонов, что позволяет одновременно получить соотношение полос ДНК-стандарта и ДНК-амплификонов исследуемого гена.
Результат ПЦР можно квалифицировать как положительный или отрицательный в зависимости от того, обнаружена в образце интересующая вас последовательность-мишень или нет. Однако нарушение нормального хода амплификации, недостаточная чувствительность метода и непредвиденный полиморфизм последовательности-мишени в области связывания праймеров или гибридизационного зонда порой обусловливают ложноотрицательный результат. При загрязнении образцов и случайной гомологии между зондом, праймерами и последовательностью, сходной с мишенью, получаются ложноположительные результаты.
Модификации. В последние годы широко используется такой простой прием, как «горячий старт ПЦР», который заключается в предварительном прогревании пробирок с ПЦР-амплификационной смесью при температуре 95 °С в течение 3-5 мин. Такой прием предупреждает амплификацию неспецифических ДНК-фрагментов
вследствие низкотемпературного, неспецифического спаривания праймеров.
При использовании РНК в качестве матриц для ПЦР предварительно на этой РНК-матрице посредством фермента РНК-зависимой ДНК-полимеразы (обратная транскриптаза, ревертаза) синтезируют комплементарную ДНК (кДНК), затем использующуюся в качестве матрицы в ПЦР. ПЦР с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР) широко применяется для детекции РНК вирусов, определения экспрессии вирусных, бактериальных и клеточных генов по их РНК.
Существуют различные модификации ПЦР, использующиеся в зависимости от конкретных целей проведения реакции или от характера последующего молекулярного анализа амплификатов. Так, для трудноамплифицируемых участков ДНК (содержащих различные повторяющиеся последовательности или необычные структурные элементы), а также в тех случаях, когда матричная ДНК присутствует в следовых количествах, ПЦР проводят в два этапа, используя в качестве матричной ДНК на втором этапе амплификации продукты ПЦР, синтезированные на первом этапе. Часто в этих случаях для повышения специфичности посадки праймеров применяют систему так называемых вмонтированных праймеров, т. е. при доамплификации в качестве праймеров выбирают последовательности, локализованные внутри амплифицированного на первом этапе участка ДНК.
В ряде случаев удобно проводить мультиплексную ПЦР, т.е. одновременную амплификацию нескольких участков матричной ДНК. Можно получать меченые продукты ПЦР, добавляя в реакционную смесь меченые dNTP. Особого внимания заслуживает возможность проведения ПЦР с молекулами кДНК. На основе этой реакции разработаны методы анализа экспрессии генов и получения больших количеств кДНК. Реакция амплификации осуществима не только в растворах, но и непосредственно на хромосомных препаратах, при этом в случае использования меченых нуклеотидов продукты амплификации гибридизуются и выявляют комплементарные им участки ДНК на хромосомах. До настоящего времени доступными амплификации были участки ДНК, не превышающие по длине 5 тыс. пар оснований. В последнее время благодаря внесению ряда кардинальных усовершенствований (особый подбор праймеров, использование сразу двух различных ДНК-полимераз, специального температурного режима полимеразных циклов) возможно про-
ведение амплификации фрагментов ДНК, достигающих 35 тыс. пар оснований.
Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени
В последние годы появилась такая модификация ПЦР, как ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ). Ей предшествовал вариант с флуоресцентной детекцией ПЦР-продукта в конечной точке: в реакционную смесь добавляли специфический флуоресцентный зонд и далее через 30-40 циклов определяли уровень флуоресценции.
В реакционную смесь при ПЦР-РВ также добавляется или специфический флуоресцентный зонд (TaqMan и др.), или интеркалирующий краситель (SYBR GreenI и др.), но в данном случае амплификатор позволяет детектировать флуоресценцию каждый цикл и наблюдать рост количества ПЦР-продукта в каждой пробирке, и далее по имеющейся калибровке определять точное исходное количество образца в пробе (рис. 6.7).
Прогресс в этой области позволяет использовать несколько независимых зондов в реакции, проводить одновременную детекцию нескольких ПЦР-продуктов и создавать ПЦР-системы мультиплексного формата.
Альтернативные ПЦР-методы амплификации нуклеиновых кислот
1. Лигазная цепная реакция (ЛЦР). Принцип аналогичен таковому при выполнении ПЦР, но вместо ДНК-полимеразы и dNTP используется термостабильная лигаза и 4 специфических олигонуклеотида, добавляемых в реакционную смесь в избытке. Каждые 2 олигонуклеотида комплементарны к детектируемому специфическому фрагменту цепи ДНК-матрицы и непосредственно примыкают друг к другу, одновременно они комплементарны и второй паре олигонуклеотидов. После денатурации ДНК-матрицы при 95 °С олигонуклеотиды связываются специфическими фрагментами цепей ДНК-матрицы и лигируются при 50 °С. Далее эти две стадии цикла повторяются много раз, в результате чего происходит экспоненциальное возрастание соединенных ковалентной связью олигонуклеотидов. Для быстрого количественного обнаружения лигированных олигонуклеотидов применяют 2 метки: биотин на одном конце, а флуоресцеин - на другом конце лигированных
олигонуклеотидов, поэтому они связываются антифлуоресцеиновыми антителами на поверхности мембраны или микропланшета. Антибиотиновые антитела, конъюгированные со щелочной фосфатазой, также количественно взаимодействуют с образовавшимся фиксированным комплексом и после добавления субстрата дают окрашенный продукт.
2. Каталитическая амплификационная система, или циклическая зондовая технология (ЦЗТ), - противоположность ЛЦР, поскольку принцип состоит не в сшивании двух олигонуклеотидных зондов, а напротив, в расщеплении рибонуклеотидной комплементарной вставки при помощи фермента РНК-азы Н и получении из одного длинного ДНК-РНК-ДНК-зонда двух коротких ДНКовых олигонуклеотидов, которые затем детектируются одним универсальным дезоксинуклеотидным зондом, конъюгированным с маркерным ферментом. Достоинства метода заключаются в изотермальности реакции, исключении возможности перекрестной контаминации, быстроте проведения (менее 1 ч) и в полной автоматизации.
Преимущества РЦР перед другими методами
Для выявления нуклеиновой кислоты-мишени методом гибридизации in situ с применением радиоактивно меченного зонда необходимо, чтобы мишень присутствовала в анализируемом препарате в количестве нескольких тысяч копий. Нередко число аномальных последовательностей в препарате диагностически значимо, но меньше необходимого числа копий мишени, и гибридизация может дать ложноотрицательный результат. Для выявления уникальной нуклеотидной последовательности методом ПЦР достаточно 10 копий матрицы. К преимуществам полимеразной реакции нужно отнести следующее.
1. Метод прямой и позволяет достичь предельно возможной чувствительности (от нескольких копий до одного возбудителя в пробе).
2. Специфичность метода приближается к 100%.
3. Для ПЦР-анализа пригоден любой материал, в том числе и гистологические препараты.
4. Метод позволяет определять число копий возбудителя в пробе и тем самым наблюдать динамику.
5. Исследуемый материал может быть дезинфицирован химической или термической обработкой в момент его забора, и, следова-
тельно, исключается возможность инфицирования персонала в процессе проведения ПЦР.
6. Метод прост в исполнении, возможна его полная автоматизация.
7. Результаты получают через несколько часов, т.е. в течение одного рабочего дня.
Рис. 6.7. Сопоставление результатов ПЦР-РВ с калибровочной прямой: наблюдается рост количества ПЦР-продукта в каждой пробирке (а), определяется по имеющейся калибровке точное исходное количество образца в пробе (б)
Области применения
Метод ПЦР применяется для выявления в клинических образцах вирусов, микобактерий, простейших и бактерий, для обнаружения врожденных и приобретенных генетических нарушений, а также для идентификации личности. Сфера применения ПЦР в диагностике будет постепенно расширяться, поскольку в клинической практике все чаще имеют дело с очень небольшими по размеру биоптатами, получаемыми, например, при эндоскопических исследованиях; или это тонкоигольные аспираты и т.д. В подобных случаях обычный гистологический анализ затруднен. Перечислим, для чего может служить ПЦР.
В иммунологических исследованиях ПЦР чаще всего используется:
•  для определения полиморфизма генов, белковые продукты которых участвуют в иммунологических реакциях;
•  для определения экспрессии цитокинов, рецепторов цитокинов и других эффекторных молекул;
•  для ДНК типирования HLA аллелей и др.
ДНК, выделенную из лимфоцитов, анализируют следующими вариантами ПЦР.
1. ПЦР-праймер со специфической последовательностью (PCRSSP).
2. ПЦР-олигонуклеотидные пробы со специфической последовательностью (PCR-SSOP).
3. ПЦР-рестрикционный анализ продуктов амплификации (PCRRFLP).
4. ПЦР-метод обратной гибридизации амплифицированного фрагмента с олигонуклеотидными зондами, фиксированными на мембране или другой твердой подложке (пластине).
6.2. ИССЛЕДОВАНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ МЕТОДОМ МИКРОЧИПОВ
Биологические микрочипы - один из новейших инструментов биологии и медицины.
Прообразом современных микрочипов стал саузерн-блоттинг, изготовленный в 1975 г. Эдом Саузерном. Он использовал меченую нуклеиновую кислоту для определения специфической последова-
тельности среди фрагментов ДНК, зафиксированных на твердой подложке.
Точнее всего биочипы описывает английское название «DNAmicroarrays», что означает «организованное размещение молекул ДНК на специальном носителе-платформе». В качестве платформы используют пластинку из стекла, иногда и другие материалы, например кремний, различные гели. На платформу наносятся биологические макромолекулы (ДНК, белки, ферменты), способные избирательно связывать вещества, содержащиеся в анализируемом растворе.
В зависимости от того, какие макромолекулы используются и каковы цели исследования, выделяют различные виды биочипов: ДНК-микрочипы и белковые микрочипы. Опишем методику с применением ДНК-микрочипов.
Размещенные на платформе макромолекулы занимают очень небольшой участок - размером с покровное стекло (рис. 6.8, см. также цв. вклейку). Микроскопический размер биочипа позволяет размещать на небольшой площади огромное количество разных молекул ДНК и считывать с этой площади информацию с помощью специального лазерного устройства.
Рис. 6.8. Стекла, используемые для приготовления микрочипов
В поверхностных матричных биочипах ДНК иммобилизуется на поверхности мембран или пластинок из стекла, пластика, полупроводника или металла. В гелевых биочипах ДНК иммобилизуется в слое полиакриламидного геля толщиной 10-20 мкм, нанесенного на специально обработанную поверхность стекла. Иммобилизуемая ДНК наносится на поверхность или через игольчатые растры механического робота, или с помощью технологии струйного принтера (рис. 6.9, см. также цв. вклейку). Контроль качества нанесения осуществляется с помощью специализированной оптики и компьютерного анализа изображения. Затем на биочипе гибридизуют молекулы ДНК, меченные с помощью флюоресцентной или радиоактивной
метки (рис. 6.10, см. также цв. вклейку). Интенсивность флюоресценции в ячейках измеряют с помощью сканера, передающего сигнал на прибор с зарядовой связью (рис. 6.9, см. также цв. вклейку). Данные о гибридизации получают также с помощью масс-спектрометрии, атомной силовой микроскопии и др. В основе принципа работы всех типов биочипов с иммобилизованной ДНК лежит точное соответствие между комплементарными ДНК (по правилу Уотсона-Крика): А-Т, G-С. Если соответствие между нуклеотидами иммобилизованной и гибридизуемой ДНК полностью отвечает условиям комплементарности, то образующиеся дуплексы будут термодинамически наиболее устойчивы и станут давать более сильный сигнал флюоресценции. Выявление и сопоставление наиболее ярко светящихся ячеек проводит прибор - анализатор биочипов.
Рис. 6.9. Оборудование для приготовления микрочипов: механический робот для нанесения через игольчатые растры проб на поверхность стекол (а); сканер для детекции интенсивности флюоресценции в ячейках (б); данные со сканера передаются на персональный компьютер для дальнейшей обработки
Гибридизуемая ДНК обычно заранее вырабатывается в достаточных количествах с помощью ПЦР. При использовании более современных технологий ПЦР осуществляется непосредственно на чипе. Анализ на 1 микрочипе занимает 6-10 ч и позволяет провести диагностику индивидуально.
Рис. 6.10. Схема гибридизации меченой пробы с микрочипом: а - исходная поверхность микрочипа; б - добавление меченой пробы; в - гибридизация микрочипа с пробой в течение 16 ч; г - отмывка микрочипа от несвязавшейся пробы; д - детекция результатов
С помощью микрочипов возможны:
•  одновременный анализ работы десятков тысяч генов, сравнение их экспрессии;
•  быстрое определение наличия вирусных и бактериальных возбудителей;
•  диагностика лейкозов и других вирусных заболеваний;
•  диагностика различных видов раковых опухолей;
•  скрининг действия новых лекарств на различные гены (такие исследования помогают создавать новые лекарственные препараты, выяснять, на какие гены и каким образом эти препараты действуют).
Еше биочипы - незаменимый инструмент для биологических исследований: в процессе одного эксперимента нередко выясняется влияние различных факторов на работу десятков тысяч генов.
6.3. ПОЛУЧЕНИЕ МЫШЕЙ С НОКАУТОМ
(KNOCK-OUT) И НОКИНОМ (KNOCKIN) ГЕНОВ -
МЕТОД НАПРАВЛЕННОГО МУТАГЕНЕЗА
Метод нокаута/нокина генов (т.е. удаления или добавления определенного гена или генов в геном организма) - это метод получения клеток или целых организмов (мышей), в которых целенаправленно разрушен определенный ген или встроен дополнительный ген. Для осуществления подобного необходимо иметь:
1) клонированный заданный ген;
2) два «методических» гена для селекции искомых клеток с удачно инактивированным геном и соответствующую селективную среду культивирования;
3) особую уникальную линию перевивных стволовых эмбриональных мышиных клеток - ES (embryonic stem cell line), сохраняющих способность дифференцироваться в надлежащих условиях во все типы клеток организма мыши, включая гаметы;
4) здоровых мышей и трудолюбие примерно на год упорной работы.
Эванс, Кауфман и соавт. опубликовали в «Nature» работу о выведении перевиваемой (трансформированной) линии эмбриональных стволовых клеток - ES (embryonic stem cells). Независимо от них аналогичную работу выполнил G. Martin и опубликовал ее в том же
1981 г. в PNAS. Эти перевивные линии клеток авторы получили из эмбрионов мышей на самых ранних стадиях развития - стадиях бластулы, выводя их в культуру на подслой фидерных клеток - эмбриональных фибробластов в присутствии факторов, подавляющих дифференцировку (например, LIF - leukemia inhibitory factor).
Позже разные авторы вывели несколько линий и сублиний ES (D3, CCE, AB-1, E14TG2a, J1, R1, HM-1 и др.). Данные клетки используют для создания мутантных мышей - с отсутствием определенного гена (генетический нокаут) или с введением лишнего гена (генетический нокин) в исследовательских целях. Массовый характер работы по генетическому нокауту приняли с 1991 г. Работы по выведению эмбриональных стволовых клеток человека имеют место, но в настоящее время такие работы «не принимают» в ответственном научном сообществе по двум причинам:
1) всегда подозревается трансформированность перевиваемых in vitro клеток, т.е. возможность их опухолевого перерождения, что для подавляющего большинства биологов и медиков является абсолютным запретом на применение эмбриональных стволовых клеток у людей;
2) в настоящее время нет благоразумных аргументов для оправдания работ по созданию запланированных кем бы то ни было людей-мутантов, аналогичных мышам с генетическим нокаутом или нокином.
Методики удаления/встраивания генов основаны на природном феномене гомологичной рекомбинации. При половом размножении живых организмов природа «предусмотрела» мейоз и кроссинговер в мейозе, при котором происходят физическое сближение гомологичных генов в гомологичных хромосомах и обмен участками ДНК между гомологичными генами. Оказывается, если в клетку ввести отдельный ген, то он тоже в состоянии найти в хромосомах гомологичный себе ген (одноименный) и вступить с ним в гомологичную рекомбинацию, т.е. произвести обмен участками ДНК. Для направленного мутагенеза (или нокаута) заданного гена в клетку вводят не интактный гомологичный ген, а умышленно поврежденный. Дальше все происходит по природным механизмам: поврежденный, но гомологичный экзоген находит одноименный интактный клеточный ген, вступает с ним в гомологичную рекомбинацию, и в результате в хромосоме на месте прежнего интактного гена появляется поврежденный «подлог». Цель достигнута.
Учитывая выдающиеся возможности этой методики, опишем ее подробнее. В качестве «методических» генов используют обычно два - ген резистентности к неомицину neor и ген вирусной тимидинкиназы из вируса простого герпеса HSV-tk. Если в некой клетке есть ген neor, то такая клетка способна жить в присутствии препарата - аналога неомицина G418. Клетки, не имеющие гена neor, погибают в присутствии G418. Если в клетке есть вирусный ген HSV-tk, то такая клетка погибнет при добавлении в среду культивирования противовирусного препарата ганцикловира. Клеткам, не имеющим гена HSV-tk, ганцикловир не страшен.
Сначала в ДНК препарата заданного гена (т.е. in vitro), примерно в середину последовательности, встраивают ген neor. Сбоку на некотором расстоянии помещают ген HSV-tk. Это и есть экзогенетическая конструкция, необходимая и достаточная для попытки направленного мутагенеза в какой-либо клетке. Для «создания» целой мыши без заданного гена используют клетки линии ES. В них трансфицируют описанную выше генетическую конструкцию, клетки помещают в селективную культуральную среду, содержащую G418 и ганцикловир.
Возможны 3 варианта внутриклеточной «судьбы» экзогенетической конструкции:
1) она не встраивается в хромосомы и бесследно теряется при делении клетки; такие клетки, просто ES, погибают в селективной среде от отравления препаратом G418;
2) экзогенетическая конструкция встраивается на случайные места в геноме; она, как правило, сохраняет свою целостность, несет и ген neor, и ген HSV-tk; такие клетки тоже погибают в селективной среде, но под действием ганцикловира;
3) экзогенетическая конструкция находит гомологичный клеточный ген и вступает с ним в гомологичную рекомбинацию: эти клетки и есть искомые; «хвост» с геном HSV-tk (он вне гомологичной области) выщепляется и теряется при делении клетки; ген neor, поскольку он расположен в середине гомологичной последовательности ДНК, как раз оказывается встроенным в хромосому; в результате искомые клетки несут ген neor, но не несут ген HSV-tk и поэтому способны жить и делиться в селективной среде, содержащей и G418, и ганцикловир; такие клетки и выделяют из массы остальных.
В описанном варианте направленный мутагенез, или нокаут гена, произошел на одной из гомологичных хромосом. Его можно выполнить и на обеих гомологичных хромосомах, для чего нужны еще два других «методических» гена для селекции. Но мышей с нокаутом гена можно получить и в случае нокаута одного из гомологичных генов в клетках ES следующим образом. От «свежезабеременевшей» мыши выделяют эмбрионы на стадии бластулы или морулы (или проводят оплодотворение in vitro). В эти ранние эмбрионы инъецируют одномутированные клетки ES и имплантируют их в матку подготовленной псевдобеременной самке. Из такой сконструированной бластулы развиваются здоровые (по мышиным меркам) эмбрионы, рождаются мышата-мозаики, часть клеток которых во всех тканях, включая половые клетки, происходит из одномутированных клеток ES. Поскольку половые клетки гаплоидны, то часть из них несет в «чистом виде» нокаутированный ген.
Подобных мышат используют для инбредного размножения, и в потомстве второго поколения какая-то часть мышат обязательно получается гомозиготной по нокаутированному (испорченному) гену. Это и есть конечная цель работы. Чтобы удостовериться в правильности полученного результата, выполняют контрольную ПЦР на ген neor.
Таких мышей размножают инбридингом и получают необходимое и достаточное для запланированной работы число особей с заданным генетическим нокаутом (т.е. с отсутствием функционально дееспособного гена).
Генетический нокаут возможен только в отношении генов, отсутствие которых позволяет организму развиться, родиться и начать жить. Если какой-то ген абсолютно необходим для реализации онтогенеза организма, то нокаут по данному гену осуществим в перевиваемых in vitro клетках, и в какой-то мере на моделях in vitro исследуемы последствия отсутствия гена для жизнедеятельности клетки.
Вышеперечисленным потенциал метода не исчерпывается. Можно получить библиотеку экзогенов, в которых «методический» ген (а именно его внедрение и нарушает генетический код, т.е. является мутирующим фактором) повреждает разные участки исследуемого гена. Одним из генов библиотеки производят нокаут. Затем в отдельные «нокаутированные» клетки трансфицируют интактный ген (если происходит реставрация экспрессии соответствующего белка, то она доказывает «от противного»: исходно сделанный нокаут был истин-
ным), а также (по одному) разные гены из библиотеки поврежденных генов. Анализируют, не произойдет ли реставрация экспрессии продукта в случае ретрансфекции каких-то генов из поврежденных. Таким образом, удается установить функциональную нагрузку различных участков одного гена.
Существенные усовершенствования в методы генетического нокаута внесли работы B. Sauer (1993), N.J. Kilby и соавт. (1993), H. Gu и K. Rajewsky (1993) и других исследователей, первыми использовавших сайтспецифичную рекомбиназу Cre (Causes recombination), выделенную Sauer из бактериофага Р1. Если в геном мыши ввести ранее описанным методом «слева» и «справа» от интересующего гена сайты, специфичные для Cre, то вырезание гена (точнее, его инверсию и как следствие потерю функции) можно осуществить не в клетках ES, а в любой момент онтогенеза, т.е. у мышей в любом возрасте. Последовательность нуклеотидов, узнаваемая Cre, носит название LoxP (locus of X-over P1) и состоит из 34 пар оснований, включающих 13 пар инвертированных повторов по краям: ATAACTTGGTATAGCATACAT-TATACGAAGTTAT.
Систему «LoxP-Cre» используют и в модели трансгенных мышей. Таким образом, существуют способы тканеспецифичного выключения заданного гена в заданный момент онтогенеза. Это весьма трудоемкие работы, но их познавательная ценность сегодня кажется огромной.
Трансгенная мышь есть мышь, в чей геном введен посторонний ген (экзоген). Чтобы «сделать» трансгенную мышь, необходимо иметь в качестве препарата чистую ДНК, строго воспроизводящую последовательность нуклеотидов заданного экзогена (как минимум). Обычно к ДНК экзогена с определенным смыслом пристраивают еще регуляторные последовательности ДНК-промоторы и энхансеры. Получают вектор экспрессии в виде кольцевой ДНК (фактически - искусственный вирус).
«Готовят» мышь-самку: ей вводят фолликулостимулирующий гормон и хорионический гонадотропин для индукции суперовуляции. Такую самку спаривают с самцом, после чего у самки быстро извлекают оплодотворенные яйцеклетки. Микроманипулятором в мужской пронуклеус инъецируют ДНК экзогена в дозе несколько сот копий, и такие яйцеклетки имплантируют в матку или яйцеводы другой подготовленной псевдобеременной самки. И ждут от нее потомства. Опыт показывает, что примерно 25% новорожденных мышат несут
экзоген (теперь уже трансген) в своем геноме. Экзогены ковалентно встраиваются (интегрируются) в одно или в несколько десятков мест собственного генома мыши (кстати, как ретровирусы типа ВИЧ). Если в собственном геноме нет генов, гомологичных экзогену, то встраивание экзогена происходит в случайные места генома.
Встраивание осуществляется очень быстро после ввода экзогенной ДНК в пронуклеус - до первой репликации ДНК зиготы, так как большинство мышей, получивших экзоген (75%), имеют его в каждой клетке своего тела, включая гаметы. Интересно, но факт: встраивание чужеродной ДНК в геном в большинстве случаев допускает нормальное развитие и рождение организма, разумеется, если трансген не кодирует синтез токсичного для организма белка. В первом поколении мышей трансген находится в гетерозиготном состоянии. Таких мышей спаривают, и во втором поколении отбирают гомозигот по трансгену. Вот они уже и есть полноценные трансгенные мыши.
Дополнение трансгена тканеспецифичными и/или индуцибельными промоторами позволяет манипулировать экспрессией трансгена по усмотрению экспериментатора (не во всех клетках; а только, например, в Т-лимфоцитах или только в β-клетках островков Лангерганса, не постоянно, а только после введения в организм индуктора). Таким образом, можно изучать как будут проходить развитие и жизнедеятельность организма при излишней экспрессии определенного гена (overexpression).
6.4. ПРИМЕНЕНИЕ РЕГУЛЯТОРНЫХ МИКРО-РНК В ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ
Клетки животных содержат множество некодирующих РНК, таких, как транспортная РНК и рибосомальная РНК, а также регуляторные РНК, влияющие на экспрессию других генов. Один из классов малых некодирующих РНК - микроРНК (miRNA) - охарактеризован как наиболее многочисленный и филогенетически обширный. На генах микроРНК синтезируются миниатюрные транскрипты длиной приблизительно в 22 нуклеотида, функционирующие как негативные регуляторы других РНК. Первая молекула miRNA - lin-4 - открыта только в 1993 г. и охарактеризована V. Ambros и соавт. при скрининге генов нематоды Caenorhabditis elegans. Последующее изучение функций этого класса молекул показало их участие во многих физиологических процессах: пролиферации, дифференцировки, клеточной
гибели и т.д. (табл. 6.1). Нарушение функций микроРНК может привести к различным заболеваниям, в том числе раковым.
Таблица 6.1. Функции и мишени miRNA, участвующих в иммунном ответе (модифицирована по Lindsay M.A., 2008)
В настоящее время известно более 700 различных молекул miRNA, и они регулируют более 30% генов человека. Микро-РНК - пожалуй, самый большой класс регуляторов белков.
Молекулярный механизм формирования зрелой молекулы miRNA следующий. Первоначально РНК-полимеразой II транскрибируется длинный олигонуклеотид, называемый первичной микро-РНК (primiRNA). Молекула pri-miRNA кепирована и полиаденилированна, как и другие транскрипты РНК-полимеразы II. Участки, кодирующие miRNA, могут располагаться как в интронах белоккодирущих генов, так и в экзонах и интронах генов, которые белок не кодируют. Pri-miRNA имеет длину около 60-80 оснований и содержит в своей структуре одну или несколько петель. Такая структура распознается ферментом РНКазой III, называемой Drosha, и ее кофактором DGCR8. Молекула pri-miRNA разрезается этим ферментом до молекулы предшественника микроРНК - pre-miRNA. Pre-miRNA на своем 3' конце содержат два основания, которые распознаются белком экспортином-5. Данный белок, связываясь с pre-miRNA, транспортирует ее через ядерную мембрану в цитоплазму, где находится другая РНКаза III - Dricer, разрезающая pre-miRNA и оставляющая от нее участок в 20-23 нуклеотида. Таким образом, формируется зрелая miRNA, встраивающаяся в белковый комплекс RISC (RNA-induced silecing complex). Только в составе такого комплекса miRNA способна оказывать свое действие на мРНК, заключающееся в разрушении мРНК-мишени или в торможении ее трансляции. Негативная регуляция мРНК реализуется за счет комплементарности между miRNA и мРНК-мишенью. Когда связь miRNA с участком 3' UTR (3'-нетранслируемый регион) мРНК-мишени несовершенна вследствие неполной комплементарности, происходит репрессия трансляции. Когда же комплементарность сохранена полностью, мРНК-мишень разрушается комплексом RISC.
В последние годы особый интерес вызывает возможность регулирования врожденного и адаптивного иммунного ответа с помощью семейства miRNA.
На сегодняшний день хорошо охарактеризована небольшая группа молекул miRNA, участвующих в регуляции генных механизмов врожденного иммунитета. Мы приводим данные о наиболее изученных miRNA, играющих важную роль в регуляции генов врожденного иммунитета.
MiRNA-146
Семейство miRNA представлено двумя молекулами: miRNA-146а и miRNA-146b. Они локализованы на хромосомах 5 и 10 соответственно. Молекулы отличаются лишь по двум нуклеотидным основаниям в 3' регионе. Важность этих miRNA для врожденного иммунитета впервые показал K.D. Таganov и соавт. (2006). Уровень miRNA в клетках линии THP-1 человека повышается в ответ на стимуляцию липополисахаридом (ЛПС) - лигандом TLR4. Такой же эффект наблюдается в ответ на активацию паттернами бактерий и некоторых грибов TLR2, 4 или 5, а также после действия провоспалительных цитокинов (ФНОα и ИЛ-1β). Экспрессия miRNA-146 не повышается в ответ на активацию TLR3, рецепторов 7 и 9. Увеличения уровня miRNA-146а не происходит при стимуляции ИЛ-1β эпителиальных клеток легких и бронхов. В промоутерном регионе miRNA-146а выявлены несколько потенциальных транскрипционных факторов, которые могут быть вовлечены в регуляцию экспрессии этой молекулы: IRF3, IRF7 (interferon regulatory factor) и CCAAT enhancer-binding protein-b (C/EBPb). Однако непосредственный регулятор экспрессии микроРНК-146 до сих пор не известен. При изучении мишеней для miRNA-146 показано: молекула может блокировать мРНК генов адаптерных белков IRAK1 (IL-1 receptor associated kinase 1) и TRAF6 (TNF receptor-associated factor 6). IRAK1 и TRAF6 - адаптерные белки, участвующие в передаче сигнала с TLR и рецептора ИЛ-1. Отрицательная регуляция данных молекул с помощью miRNA-146 приводит к тому, что сигнал с TLR не проводится в клетку и провоспалительные медиаторы не секретируются. Это может иметь чрезвычайно важное значение при разработке новых TLR-опосредованных подходов в регуляции врожденного иммунитета через адаптерные молекулы.
MiRNA-155
MiRNA-155 образуется из первичного транскрипта, который считывается со второго экзона белокнекодирующего гена, называемого «BIC». Ранние исследования miRNA-155 показали усиленную экспрессию этой молекулы у человека при В-клеточной лимфоме. Трансгенная экспрессия miRNA-155 в В-клетках мышей приводит к малигнизации, что дало основание для предположения о роли miRNA-155 в дифференцировке и пролиферации В-лимфоцитов. Ведущая роль miRNA-155 в регуляции Т- и В-клеточного ответа
выявлена в исследованиях на мышах, дефицитных по miRNA-155. У них не развивается оптимальный иммунный и протективный ответ на патогены после иммунизации. В последние годы показано значение miRNA-155 в реакциях врожденного иммунитета. Экспрессии miRNA-155 возрастает после стимуляции ЛПС и липопротеином (лиганд TLR2) в моноцитах, макрофагах и в спленоцитах мышей, которых иммунизировали Salmonella enteritidis, содержащей ЛПС. В отличие от таковой miRNA-146а экспрессия miRNA-155 увеличивается и после активации врожденного иммунного ответа вирусными и бактериальными нуклеотидами, имеющими в своей структуре лиганды для TLR3 - poly (I:C) и для TLR9 - CpG. Экспрессия miRNA-155 может возрастать в ответ на стимуляцию ИФβ и ИФγ. Количество miRNA-155 варьирует после стимуляции ФНОа и зависит от сроков инкубации с цитокином. В подобных случаях miRNA-155 оказывает как позитивное, так и негативное действие на экспрессию своих мишеней (NF-κΒ, IKKb, IKKe, а также FADD домен - Fasassociated death domain и Ripk 1 - receptor iteracting serine - threonine kinase 1). В отличие от miRNA-146, miRNA-155 позитивно регулирует экспрессию провоспалительных цитокинов в процессе врожденного иммунного ответа. Такой эффект продемонстрирован на эмбриональных клетках человека (HEK-293), в которых miRNA-155 увеличивает продукцию ФНОа путем снижения связанной с 3' UTR посттрансляционной ингибицией. Усиленная экспрессия miRNA-155 наблюдается в В-клетках мышей, трансгенных по miRNA-155. При очень высоких уровнях miRNA-155 мыши высокочувствительны к септическому шоку. Трансфекция miRNA-155 в гемопоэтические стволовые клетки и трансплантация их летально облученным мышам приводят к появлению у них признаков миелоидной неоплазии. Эти данные позволили авторам предположить, что связь между воспалением и канцерогенезом вызвана хронически высоким уровнем miRNA-155.
MiRNA-223 - регулятор пролиферации и активации нейтрофилов
Многими исследованиями показано: экспрессия miRNA-223 связана с миелоидными клетками в костном мозгу; она повышается при дифференцировке миелоидных предшественников в гранулоциты. Интересны наблюдения за мышами с нокаутом гена miRNA-223, которые оставались здоровыми и у них обнаруживалось повышенное число предшественников гранулоцитов в костном мозгу и зрелых
нейтрофилов в циркуляции. Считается, что miRNA-223 вовлечена в негативную регуляцию созревания, но не дифференцировки гранулоцитов. Действие miRNA-223, вероятно, опосредовано через отрицательное влияние другого миелоидного фактора (подобного ELF-1). Этот транскрипционный фактор участвует в пролиферации клеток миелоидного ряда. Функциональные исследования циркулирующих нейтрофилов нокаутных животных показали: miRNA-223 не вовлечена в выход клеток из сосудистого русла, миграцию или фагоцитоз ими Escherichia coli. Однако уменьшение количества miRNA- 223 приводит к усилению кислородного взрыва и цитотоксического ответа на действие грибов Candida albicans. У животных, нокаутных по miRNA-223, спонтанно развиваются воспалительные процессы в легких и наблюдается повышенное разрушение тканей после воздействия эндотоксинов. Обнаруживается быстрое и селективное увеличение экспрессии miRNA-223 в эпителии легких и бронхов после аэрозольного воздействия токсином. Большое количество факторов может регулировать экспрессию miRNA-223 в процессе дифференцировки и созревания гранулоцитов.
Таким образом, накапливается все больше фактов, свидетельствующих о том, что микроРНК представляет собой новый большой класс регуляторных молекул, участвующих во многих физиологических процессах организма. Важную роль микроРНК играют в развитии врожденного иммунного ответа. В основном эти молекулы блокируют или активируют адаптерные молекулы, которые необходимы для проведения сигнала с рецепторов врожденного иммунитета или для регуляции факторов транскрипции, участвующих в дифференцировке и созревании различных клеток врожденного иммунитета. Важно, что данные молекулы реализуют свое действие на посттранскрипционном уровне, благодаря чему изучение микроРНК представляет интерес, ибо, вероятно, оно будет способствовать более глубокому пониманию механизмов регуляции врожденного иммунитета. Следует отметить перспективность такого направления исследований, так как с каждым годом возрастает количество данных о возможностях miRNA регулировать врожденный иммунитет. Несомненно: miRNA вскоре станут основой для создания перспективных лекарственных средств, дающих эффект строго направленной коррекции нарушений врожденного иммунитета. Становится очевидной и необходимость разработки новых подходов к синтезу miRNA, изучению механизмов
их действия, поиску молекул-мишеней и новых методов тестирования, основанных в первую очередь на принципе ПЦР (см. табл. 6.1).
В настоящее время известно несколько методов для определения экспрессии генов микроРНК в биологических образцах.
Первым методом анализа является Northern blot. Он хорошо изучен и описан, однако довольно трудоемок, а кроме того, существует много ограничений использования образцов. Для определения зрелой микроРНК в пробе общую РНК наносят на 12% денатурирующий полиакриламидный гель. В качестве маркера используют низкомолекулярный олигонуклеотид. После электрофореза пробы помещают на мембрану и проводят гибридизацию с олигонуклеотидными пробами (меченными 32Р изотопом или другой меткой), комплементарными зрелой форме изучаемой микроРНК. Далее мембраны отмывают от несвязавшихся олигонуклеотидных последовательностей и осуществляют детекцию с помощью радиочувствительной пленки (если метка 32Р).
В последнее время для обнаружения молекул микроРНК в биологическом образце используют метод микрочипов (см. выше). Он позволяет исследовать образец на наличие одновременно большого количества молекул микроРНК. Недостаток такого подхода - необходимость содержания в образце больших количеств исследуемой РНК, что не всегда возможно.
Из клеточной культуры, в которой нужно определить микроРНК, выделяют общую РНК. Выделенный материал инкубируют с малыми последовательностями РНК, меченными флуоресцентными метками (Cy5, Cy3 и др). Далее меченый образец наносится на микрочип, содержащий ДНК-последовательности известных (по крайней мере 200) молекул микроРНК. После инкубации в течение 14 ч происходит гибридизация и затем планшет отмывается. Результат считывается при помощи флуоресцентного сканера (методически процесс описан выше). По свечению в лунках планшета определяют, какой из 200 образцов микроРНК экспрессируется в пробе.
Новый метод для определения уровня экспрессии генов микроРНК - количественная обратная транскрипция с ПЦР (ОТ-ПЦР) (см. выше). Этот метод имеет высокую специфичность и чувствительность.
Чтобы исследовать микроРНК с помощью ПЦР, необходимо модифицировать последнюю, ибо праймеры в обычной системе для ПЦР имеют тот же размер, что и исследуемая микроРНК. Разработан
новый методический подход, основанный на модификации ПЦР, названный miR-Q. Первым шагом в данной методике является встраивание последовательности искомой микроРНК в кДНК с известной последовательностью. Это осуществляется при реакции обратной транскрипции. После проводят ПЦР и детекцию полученного амплификата2.
Вопросы и задания
1. Какие молекулярно-генетические методы используются для решения иммунологических задач?
2. Дайте определение термина «полимеразная цепная реакция» и опишите суть метода.
3. Какие существуют модификации ПЦР, применяемые в иммунологии? Почему они используются?
4. Нарисуйте схему последовательности этапов ПЦР.
5. Опишите трудности, возникающие при постановке ПЦР.
6. Перечислите преимущества ПЦР перед другими методическими подходами.
7. Что такое микрочипы?
8. Какие виды микрочипов вы знаете?
9. Какие иммунологические цели достижимы при использовании микрочипов?
10. Опишите метод получения мышей с нокаутом (knock-out) и нокином (knock-in) генов.
11. Как получить трансгенную мышь?
12. Что такое регуляторные микроРНК?
13. Каким образом регуляторные микроРНК могут быть применены в иммунологических исследованиях?
14. Назовите основные методы для определения микроРНК.
15. Что такое гибридомы?
16. Дайте определение моноклональных антител.
17. Опишите этапы получения гибридом.
18. Проиллюстрируйте принципы метаболической селекции клеток.
Глава 7
Методы оценки системы цитокинов
В настоящей главе будет рассмотрен комплексный подход в оценке системы цитокинов с использованием описанных ранее современных методов исследования.
Вначале мы изложим основные представления о системе цитокинов.
Цитокины в настоящее время рассматривают как белковопептидные молекулы, продуцируемые различными клетками организма и осуществляющие межклеточные и межсистемные взаимодействия. Цитокины - универсальные регуляторы жизненного цикла клеток, они контролируют процессы дифференцировки, пролиферации, функциональной активации и апоптоза последних.
Цитокины, продуцируемые клетками иммунной системы, называют иммуноцитокинами; они представляют собой класс растворимых пептидных медиаторов иммунной системы, необходимых для ее развития, функционирования и взаимодействия с другими системами организма (Ковальчук Л.В. и соавт., 1999).
Являясь регуляторными молекулами, цитокины играют важную роль в осуществлении реакций врожденного и адаптивного иммунитета, обеспечивают их взаимосвязь, контролируют гемопоэз, воспаление, заживление ран, образование новых кровеносных сосудов (ангиогенез) и многие другие жизненно важные процессы.
В настоящее время существует несколько различных классификаций цитокинов, учитывающих их строение, функциональную активность, происхождение, тип цитокиновых рецепторов. Традиционно, в соответствии с биологическими эффектами, принято выделять следующие группы цитокинов.
1. Интерлейкины (ИЛ-1-ИЛ-33) - секреторные регуляторные белки иммунной системы, обеспечивающие медиаторные взаимодействия в иммунной системе и связь ее с другими системами организма. Интерлейкины разделяют по функциональной активности на про- и противовоспалительные цитокины, ростовые факторы лимфоцитов, регуляторные цитокины и др.
3. Факторы некроза опухоли (ФНО) - цитокины с цитотоксическим и регуляторным действиями: ФНОа и лимфотоксины (ЛТ).
4. Факторы роста гемопоэтических клеток - фактор роста стволовых клеток (Kit - ligand), ИЛ-3, ИЛ-7, ИЛ-11, эритропоэтин, тробопоэтин, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор - ГМ-КСФ, гранулоцитарный КСФ - Г-КСФ, макрофагаль-
ный КСФ - М-КСФ).
5. Хемокины - С, СС, СХС (ИЛ-8), СХ3С - регуляторы хемотаксиса различных типов клеток.
6. Факторы роста нелимфоидных клеток - регуляторы роста, дифференцировки и функциональной активности клеток различной тканевой принадлежности (фактор роста фибробластов - ФРФ, фактор роста эндотелиальных клеток, эпидермальный фактор роста - ЭФР эпидермиса) и трансформирующие факторы роста (ТФРβ, ТФРα).
Среди прочих в последние годы активно изучается фактор, ингибирующий миграцию макрофагов (миграцию ингибирующий фактор - МИФ), который рассматривается как нейрогормон с цитокиновой и ферментной активностью (Суслов А.П., 2003; Ковальчук Л.В. и соавт.,
2004).
Цитокины различаются по строению, биологической активности и другим свойствам. Однако наряду с различиями цитокины обладают общими свойствами, характерными для данного класса биорегуляторных молекул.
1. Цитокины - это, как правило, гликозилированные полипептиды средней молекулярной массы (менее 30 кD).
2. Цитокины вырабатываются клетками иммунной системы и другими клетками (например, эндотелием, фибробластами и др.) в ответ на активирующий стимул (патогенассоциированные молекулярные структуры, антигены, цитокины и др.) и участвуют в реакциях врожденного и адаптивного иммунитета, регулируя их силу и продолжительность. Некоторые цитокины синтезируются конститутивно.
3. Секреция цитокинов - короткий по времени процесс. Цитокины не сохраняются как преформированные молекулы, а их
синтез начинается всегда с транскрипции генов. Клетки вырабатывают цитокины в низкой концентрации (пикограммы на миллилитр).
4. В большинстве случаев цитокины продуцируются и действуют на клетки-мишени, находящиеся в непосредственной близости (короткодистантное действие). Основное место действия цитокинов - межклеточный синапс.
5. Избыточность системы цитокинов проявляется в том, что каждый тип клеток способен продуцировать несколько цитокинов, а каждый цитокин может секретироваться различными клетками.
6. Для всех цитокинов характерна плейотропность, или полифункциональность действия. Так, проявление признаков воспаления обусловлено влиянием ИЛ-1, ФНОα, ИЛ-6, ИЛ-8. Дублирование функций обеспечивает надежность работы системы цитокинов.
7. Действие цитокинов на клетки-мишени опосредуется высокоспецифичными высокоаффинными мембранными рецепторами, представляющими собой трансмембранные гликопротеины, состоящие, как правило, более чем из одной субъединицы. Внеклеточная часть рецепторов ответственна за связывание цитокина. Существуют рецепторы, устраняющие избыток цитокинов в патологическом очаге. Это так называемые рецепторы-ловушки. Растворимые рецепторы представляют собой внеклеточный домен мембранного рецептора, отделенный с помощью фермента. Растворимые рецепторы способны нейтрализовывать цитокины, участвовать в транспорте их в очаг воспаления и в выведении из организма.
8. Цитокины работают по принципу сети. Они могут действовать согласованно. Многие функции, приписываемые первоначально одному цитокину, как оказалось, обусловлены согласованным действием нескольких цитокинов (синергизм действия). Примерами синергического взаимодействия цитокинов являются стимуляция воспалительных реакций (ИЛ-1, ИЛ-6 и ФНОа), а также синтеза IgE
(ИЛ-4, ИЛ-5 и ИЛ-13).
Одни цитокины индуцируют синтез других цитокинов (каскад). Каскадность действия цитокинов необходима для развития воспалительных и иммунных реакций. Способность одних цитокинов усиливать или ослаблять продукцию других обусловливает важные позитивные и негативные регуляторные механизмы.
Известно антагонистическое действие цитокинов, например продукция ИЛ-6 в ответ на увеличение концентрации ФНОа может быть
негативным регуляторным механизмом контроля выработки этого медиатора при воспалении.
Цитокиновая регуляция функций клеток-мишеней осуществляется с помощью аутокринного, паракринного или эндокринного механизмов. Некоторые цитокины (ИЛ-1, ИЛ-6, ФНОα и др.) способны участвовать в реализации всех перечисленных механизмов.
Ответ клетки на влияние цитокина зависит от нескольких факторов:
•  от типа клеток и их исходной функциональной активности;
•  от локальной концентрации цитокина;
•  от присутствия других медиаторных молекул.
Таким образом, клетки-продуценты, цитокины и специфические для них рецепторы на клетках мишенях формируют единую медиаторную сеть. Именно набор регуляторных пептидов, а не индивидуальные цитокины, определяют окончательный ответ клетки. В настоящее время система цитокинов рассматривается как универсальная система регуляции на уровне целостного организма, обеспечивающая развитие защитных реакций (например, при инфекции).
В последние годы сложилось представление о системе цитокинов, объединяющей:
1) клетки-продуценты;
2) растворимые цитокины и их антагонисты;
3) клетки-мишени и их рецепторы (рис. 7.1).
Нарушения различных компонентов системы цитокинов приводят к развитию многочисленных патологических процессов, а потому выявление дефектов в этой регуляторной системе имеет важное значение для правильной постановки диагноза и назначения адекватной терапии.
Вначале рассмотрим основные компоненты системы цитокинов.
Клетки-продуценты цитокинов
I. Основную группу клеток-продуцентов цитокинов в адаптивном иммунном ответе представляют лимфоциты. Покоящиеся клетки не секретируют цитокины. При распознавании антигена и при участии рецепторных взаимодействий (CD28-CD80/86 для Т-лимфоцитов и СD40-CD40L для В-лимфоцитов) происходит активация клеток, приводящая к транскрипции генов цитокинов, трансляции и секреции гликозилированных пептидов в межклеточное пространство.
Рис. 7.1. Система цитокинов
CD4 Т-хелперы представлены субпопуляциями: Тh0, Тh1, Тh2, Тh17, Tfh, которые различаются между собой спектром секретируемых цитокинов в ответ на различные антигены.
Тh0 вырабатывают широкий спектр цитокинов в очень низких концентрациях.
Направление дифференцировки Th0 определяет развитие двух форм иммунного ответа с преобладанием гуморальных или клеточных механизмов.
Природа антигена, его концентрация, локализация в клетке, тип антигенпрезентирующих клеток и определенный набор цитокинов регулируют направление дифференцировки Тh0.
Дендритные клетки после захвата и процессинга антигена представляют антигенные пептиды Th0 клеткам и вырабатывают цитокины, регулирующие направление их дифференцировки в эффекторные клетки. Роль индивидуальных цитокинов в данном процессе отражена на рис. 7.2. ИЛ-12 индуцирует синтез ИФНγ Т-лимфоцитами и ]ЧГК. ИФНу обеспечивает дифференцировку ТЫ1, которые начинают секретировать цитокины (ИЛ-2, ИФНу, ИЛ-3, ФНОа, лимфотоксины), регулирующие развитие реакций на внутриклеточные патогены
(гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) и различные типы клеточной цитотоксичности).
ИЛ-4 обеспечивает дифференцировку Тh0 в Тh2. Активированные Тh2 вырабатывают цитокины (ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-13 и др.), определяющие пролиферацию В-лимфоцитов, их дальнейшую дифференцировку в плазматические клетки,и развитие реакций антителогенеза, преимущественно на внеклеточные патогены.
ИФНу негативно регулирует функцию Тh2-клеток и, наоборот, ИЛ-4, ИЛ-10, секретируемые Тh2, угнетают функцию Тh1 (рис. 7.3). Молекулярный механизм этой регуляции связан с транскрипционными факторами. Экспрессия Т-bet и STAT4, детерминированная ИФНу, направляет дифференцировку Т-клеток по пути Тh1 и супрессирует развитие Тh2. ИЛ-4 индуцирует экспрессию GATA-3 и STAT6, что соответственно обеспечивает превращение наивных ТЫ0 в Тh2-клетки (рис. 7.2).
В последние годы описана особая субпопуляция Т-клеток хелперов (Тh17), продуцирующих ИЛ-17. Члены семейства ИЛ-17 могут экспрессироваться активированными клетками памяти (CD4CD45RO), у5Т-клетками, NKT клетками, нейтрофилами, моноцитами под влиянием ИЛ-23, ИЛ-6, ТФРβ, вырабатываемых макрофагами и дендритными клетками. Основным дифференцировочным фактором у человека является ROR-C, у мышей - ROR-γl Показана кардинальная роль ИЛ-17 в развитии хронического воспаления и аутоиммунной патологии (см. рис. 7.2).
Кроме того, Т-лимфоциты в тимусе могут дифференцироваться в естественные клетки-регуляторы (Treg), экспрессирующие поверхностные маркеры CD4+ CD25+ и транскрипционный фактор FOXP3. Эти клетки способны подавлять иммунный ответ, опосредуемый Тh1 и Тh2-клетками, путем прямого межклеточного контакта и синтеза ТФРβ и ИЛ-10.
Схемы дифференцировки клонов Тh0 и секретируемых ими цитокинов представлены на рис. 7.2 и 7.3 (см. также цв. вклейку).
Т-цитотоксические клетки (CD8+), естественные киллеры - слабые продуценты цитокинов, таких, как интерфероны, ФНОа и лимфотоксины.
Избыточная активация одной из субпопуляций Тh может определить развитие одного из вариантов иммунного ответа. Хроническая несбалансированность активации Тh способна привести к формированию иммунопатологических состояний, связанных с проявления-
ми аллергии, аутоиммунной патологии, хронических воспалительных процессов и др.
Рис. 7.2. Различные субпопуляции Т-лимфоцитов, продуцирующие цитокины
II. В системе врожденного иммунитета основными продуцентами цитокинов являются клетки миелоидного ряда. С помощью Toll-по- добных рецепторов (TLRs) они распознают сходные молекулярные структуры различных патогенов, так называемые патогенассоциированные молекулярные патерны (РАМП), например липополисахарид (ЛПС) грамотрицательных бактерий, липотейхоевые кислоты, пептидогликаны грамположительных микроорганизмов, флагеллин, ДНК, богатую неметилированными СрG повторами, и др. В результате
такого взаимодействия с TLR запускается внутриклеточный каскад передачи сигнала, приводящий к экспрессии генов двух основных групп цитокинов: провоспалительных и ИФН типа 1 (рис. 7.4, см. также цв. вклейку). Главным образом эти цитокины (ИЛ-1, -6, -8, -12, ФНОа, ГМ-КСФ, ИФН, хемокины и др.) индуцируют развитие воспаления и участвуют в защите организма от бактериальных и вирусных инфекций.
Рис. 7.3. Спектр цитокинов, секретируемых ТЫ1- и ТЫ2-клетками
III. Клетки, не относящиеся к иммунной системе (клетки соединительной ткани, эпителия, эндотелия), конститутивно секретируют аутокринные факторы роста (ФРФ, ЕФР, ТФРр и др.). и цитокины, поддерживающие пролиферацию гемопоэтических клеток.
Цитокины и их антагонисты подробно описаны в ряде монографий (Ковальчук Л.В. и соавт., 2000; Кетлинский С.А., Симбирцев А.С.,
2008).
Рис. 7.4. TLR-опосредованная индукция выработки цитокинов клетками врожденного иммунитета
Избыточная экспрессия цитокинов небезопасна для организма и может привести к развитию чрезмерной воспалительной реакции, острофазового ответа. В регуляции выработки провоспалительных цитокинов принимают участие различные ингибиторы. Так, описан ряд веществ, которые неспецифически связывают цитокин ИЛ-1 и препятствуют проявлению его биологического действия (а2-макроглобулин, С3-компонент комплемента, уромодулин). Специфическими ингибиторами ИЛ-1 могут быть растворимые рецепторы-ловушки, антитела и рецепторный антагонист ИЛ-1 (ИЛ-1RA). При развитии воспаления происходит усиление экспрессии гена ИЛ-1RA. Но и в норме этот антагонист присутствует в крови в высокой концентрации (до 1 нг/мл и более), блокируя действие эндогенного ИЛ-1.
Клетки-мишени
Действие цитокинов на клетки-мишени опосредуются через специфические рецепторы, связывающие цитокины с очень высокой аффинностью, причем отдельные цитокины могут использовать
общие субъединицы рецепторов. Каждый цитокин связывается со своим специфическим рецептором.
Рецепторы цитокинов представляют собой трансмембранные белки и делятся на 5 основных типов. Наиболее распространен так называемый гемопоэтиновый тип рецепторов, имеющих два экстраклеточных домена, один из которых содержит общую последовательность аминокислотных остатков двух повторов триптофана и серина, разделенных любой аминокислотой (WSXWS-мотив). Второй тип рецепторов может иметь два внеклеточных домена с большим количеством консервативных цистеинов. Это рецепторы семейства ИЛ-10 и ИФН. Tретий тип представлен рецепторами цитокинов, относящихся к группе ФНО. Четвертый тип рецепторов цитокинов принадлежит к суперсемейству иммуноглобулиновых рецепторов, имеющих внеклеточные домены, напоминающие по строению домены молекул иммуноглобулинов. Пятый тип рецепторов, связывающих молекулы семейства хемокинов, представлен трансмембранными белками, пересекающими клеточную мембрану в 7 местах. Рецепторы цитокинов могут существовать в растворимой форме, сохраняя способность связывать лиганды (Кетлинский С.А. и др., 2008).
Цитокины способны влиять на пролиферацию, дифференцировку, функциональную активность и апоптоз клеток-мишеней (см. рис. 7.1). Проявление биологической активности цитокинов в клетках-мишенях зависит от участия различных внутриклеточных систем в передаче сигнала от рецептора, что связано с особенностями клеток-мишеней. Сигнал к апоптозу проводится в том числе с помощью специфического участка семейства рецепторов ФНО, так называемого домена «смерти» (рис. 7.5, см. цв. вклейку). Дифференцировочный и активирующий сигналы передаются посредством внутриклеточных белков Jak-STAT - сигнальных трансдукторов и активаторов транскрипции (рис. 7.6, см. цв. вклейку). G-белки участвуют в передаче сигнала от хемокинов, что приводит к усилению миграции и адгезии клеток.
В комплексный анализ системы цитокинов входит следующее.
I. Оценка клеток-продуцентов.
1. Определение экспрессии:
•  рецепторов, распознающих патоген или антиген TКР, TLR) на уровне генов и молекулы белка (ПЦР, метод проточной цитофлуориметрии);
•  адаптерных молекул, проводящих сигнал, запускающий транскрипцию цитокиновых генов (ПЦР и др.);
Рис. 7.5. Передача сигнала с ФНО-рецептора
Рис. 7.6. Jak-STAT - сигнальный путь с цитокиновых рецепторов типа 1
• генов цитокинов (ПЦР); белковых молекул цитокинов (оценка цитокинсинтезирующей функции мононуклеарных клеток человека).
2. Количественное определение субпопуляций клеток, содержащих те или иные цитокины: Th1, Th2 Th17 (метод внутриклеточного окрашивания цитокинов); определение количества клеток, секретирующих определенные цитокины (метод ELISPOT, см. гл. 4).
II. Оценка цитокинов и их антагонистов в биологических средах организма.
1. Tестирование биологической активности цитокинов.
2. Количественное определение цитокинов с помощью ИФА.
3. Иммуногистохимическое окрашивание цитокинов в тканях.
4. Определение соотношения оппозитных цитокинов (про- и противовоспалительных), цитокинов и антагонистов рецепторов цитокинов.
III. Оценка клеток-мишеней.
1. Определение экспрессии рецепторов цитокинов на уровне генов и белковой молекулы (ПЦР, метод проточной цитофлуориметрии).
2. Определение сигнальных молекул во внутриклеточном содержимом.
3. Определение функциональной активности клеток-мишеней.
В настоящее время разработаны многочисленные методы оценки системы цитокинов, которые дают разноплановую информацию. Среди них различают:
1) молекулярно-биологические методы;
2) методы количественного определения цитокинов с помощью иммуноанализа;
3) тестирование биологической активности цитокинов;
4) внутриклеточное окрашивание цитокинов;
5) метод ELISPOT, позволяющий выявить цитокины вокруг единичной цитокинпродуцирующей клетки;
6) иммунофлюоресценцию.
Приводим краткую характеристику этих методов.
С помощью молекулярно-биологических методов можно исследовать экспрессию генов цитокинов, их рецепторов, сигнальных молекул, изучать полиморфизм указанных генов. В последние годы выполнено большое число работ, выявивших ассоциации между вариантами аллелей генов молекул системы цитокинов и предрасположенностью
к ряду заболеваний. Изучение аллельных вариантов генов цитокинов может дать информацию о генетически запрограммированной продукции того или иного цитокина. Наиболее чувствительной считается полимеразная цепная реакция в реальном времени - ПЦР-РВ (см. гл. 6). Метод гибридизации in situ позволяет уточнить тканевую и клеточную локализацию экспрессиии цитокиновых генов.
Количественное определение цитокинов в биологических жидкостях и в культурах мононуклеарных клеток периферической крови методом ИФА можно охарактеризовать следующим образом. Поскольку цитокины являются локальными медиаторами, более целесообразно измерять их уровни в соответствующих тканях после экстракции тканевых протеинов или в естественных жидкостях, например в слезе, смывах из полостей, моче, амниотической жидкости, спинномозговой жидкости и т.д. Уровни цитокинов в сыворотке или других биологических жидкостях отражают текущее состояние иммунной системы, т.е. синтез цитокинов клетками организма in vivo.
Определение уровней продукции цитокинов мононуклеарами периферической крови (МНК) показывает функциональное состояние клеток. Спонтанная продукция цитокинов МНК в культуре свидетельствует, что клетки уже активированы in vivo. Индуцированный (различными стимуляторами, митогенами) синтез цитокинов отражает потенциальную, резервную способность клеток отвечать на антигенный стимул (в частности, на действие лекарственных препаратов). Сниженная индуцированная продукция цитокинов может служить одним из признаков иммунодефицитного состояния. Цитокины не специфичны в отношении конкретного антигена. Поэтому специфическая диагностика инфекционных, аутоиммунных и аллергических заболеваний с помощью определения уровня тех или иных цитокинов невозможна. В то же время оценка уровней цитокинов позволяет получить данные о тяжести воспалительного процесса, его переходе на системный уровень и прогнозе, функциональной активности клеток иммунной системы, о соотношении Th1- и Th2-клеток, что очень важно при дифференциальной диагностике ряда инфекционных и иммунопатологических процессов.
В биологических средах можно определить цитокины количественно с помощью целого ряда методов иммуноанализа, используя поликлональные и моноклональные антитела (см. гл. 4). ИФА позволяет узнать, каковы точные концентрации цитокинов в био-
логических жидкостях организма. Иммуноферментное выявление цитокинов имеет ряд преимуществ перед другими методами (высокая чувствительность, специфичность, независимость от присутствия антагонистов, возможность точного автоматизированного учета, стандартизации учета). Однако и этот метод имеет свои ограничения: ИФА не характеризует биологическую активность цитокинов, может давать ложные результаты за счет перекрестно-реагирующих эпитопов.
Биологическое тестирование проводят на основе знания основных свойств цитокинов, их действия на клетки-мишени. Изучение биологических эффектов цитокинов позволило разработать четыре разновидности тестирования цитокинов:
1) по индукции пролиферации клеток-мишеней;
2) по цитотоксическому эффекту;
3) по индукции дифференцировки костно-мозговых предшественников;
4) по противовирусному действию.
ИЛ-1 определяют по стимулирующему действию на пролиферацию мышиных тимоцитов, активированных митогеном in vitro; ИЛ-2 - по способности стимулировать пролиферативную активность лимфобластов; по цитотоксическому действию на мышиные фибробласты (L929) тестируют ФНОа и лимфотоксины. Колониестимулирующие факторы оценивают по их способности поддерживать рост костномозговых предшественников в виде колоний в агаре. Противовирусную активность ИФН выявляют по угнетению цитопатического действия вирусов в культуре диплоидных фибробластов человека и опухолевой линии фибробластов мышей L-929.
Созданы клеточные линии, рост которых зависит от присутствия определенных цитокинов. В табл. 7.1 представлен список клеточных линий, используемых для тестирования цитокинов. По способности индуцировать пролиферацию чувствительных клеток-мишеней проводят биотестирование ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-15 и др. Однако эти методы тестирования отличаются недостаточной чувствительностью и информативностью. Молекулы ингибиторов и антагонистов могут маскировать биологическую активность цитокинов. Некоторые цитокины проявляют общую биологическую активность. Тем не менее эти методы идеальны для тестирования специфической активности рекомбинантных цитокинов.
Таблица 7.1. Клеточные линии, используемые для тестирования биологической активности цитокинов
Окончание табл. 7.1
Лабораторная работа 7-1
Определение биологической активности ИЛ-1 по комитогенному действию на пролиферацию тимоцитов мышей
В основе метода биологического тестирования ИЛ-1 лежит способность цитокина стимулировать пролиферацию мышиных тимоцитов.
ИЛ-1 может быть определен в культуре моноцитов, стимулированных ЛПС, а также в любой биологической жидкости организма. Необходимо обратить внимание на ряд деталей.
1. Для тестирования применяют тимоциты мышей линии С3Н/ HeJ, стимулированные к пролиферации митогенами (конканавалин А - КонА и фитогемагглютинин - ФГА). Тимоциты С3Н/HeJ выбраны не случайно: мыши этой инбредной линии не отвечают на ЛПС, который может находиться в составе тестируемого материала и вызывать продукцию ИЛ-1.
2. Тимоциты отвечают на ИЛ-2 и митогены, поэтому в препаратах, тестируемых на ИЛ-1, следует определять также присутствие ИЛ-2 и митогенов.
Порядок работы
1. Получают суспензию тимоцитов в концентрации 12×106/мл среды RРМI 1640, содержащей 10% сыворотки эмбрионов коров и 2-меркаптоэтанол (5×10-5 М).
2. Готовят ряд последовательных двукратных разведений опытных (биологические жидкости организма) и контрольных образцов. В качестве контрольных используют биологические жидкости, содержащие ИЛ-1 или образцы, полученные при инкубации мононуклеарных клеток без ЛПС, и лабораторный стандартный ИЛ-1-содержащий препарат. В 96-луночные круглодонные планшеты из каждого разведения переносят по 50 мкл в 6 лунок.
3. В три лунки каждого разведения добавляют по 50 мкл растворенного в полной среде очищенного ФГА (Wellcome) в концентрации 3 мкг/мл, а в другие 3 лунки - по 50 мкл среды.
4. В каждую лунку добавляют по 50 мкл суспензии тимоцитов и инкубируют в течение 48 ч при 37 °С.
6. Перед завершением культивирования в лунки вносят по 50 мкл раствора (1 мкКи/мл) ['3Н]-тимидина и инкубируют еще 20 ч.
7. Для определения уровня радиоактивности клетки культуры переносят на фильтровальную бумагу с помощью автоматического сборщика клеток, фильтры высушивают и определяют включение метки жидкостным сцинтилляционным счетчиком.
8. Результаты выражают в виде коэффициента стимуляции.
где mcp - среднее число импульсов в 3 лунках.
Если тимоциты отвечают на стимуляцию стандартным ИЛ-1, то индекс стимуляции исследуемого образца, превышающий 3, достоверно свидетельствует об ИЛ-1-активности.
Биоанализ является единственным методом для оценки функционирования цитокина, но данный метод должен быть дополнен разными видами соответствующего контроля на специфичность с использованием моноклональных антител. Добавление определенных моноклональных антител к цитокину в культуру блокирует биологическую активность цитокина, что доказывает: сигналом к пролиферации клеточной линии служит определяемый цитокин.
Использование биоанализа для выявления интерферона. Принцип оценки биологической активности ИФН основан на его противовирусном действии, которое определяется по степени ингибиции размножения тест-вируса в культуре клеток.
В работе могут быть использованы клетки, чувствительные к действию ИФН: первично трипсинизированные клетки-фибробласты эмбрионов кур и человека, перевиваемые клетки диплоидных фибробластов человека и культура мышиных клеток (L929).
При оценке противовирусного действия ИФН целесообразно использовать вирусы с коротким циклом размножения, высокой чувствительностью к действию ИФН: вирус энцефаломиелита мышей, везикулярного стоматита мыши и др.
Лабораторная работа 7-2
Определение активности интерферона
1. Взвесь диплоидных фибробластов плода человека на среде с 10% сывороткой эмбрионов коров (концентрация клеток - 15-20×106/мл) разливают в стерильные 96-луночные плоскодонные планшеты по 100 мкл в лунку и помещают в СО2-инкубатор при температуре 37 °С.
2. После формирования полного монослоя из лунок удаляют ростовую среду и в каждую лунку добавляют по 100 мкл поддерживающей среды.
3. Титрование активности ИФН в исследуемых образцах проводят методом двукратных разведений на монослое фибробластов.
Одновременно с образцами в лунки вносят вирус энцефаломиелита мышей (ВЭМ) в дозе, вызывающей 100% поражение клеток через 48 ч после заражения.
4. Для контроля используют лунки с интактными (необработанными) клетками, зараженными вирусом.
В каждом исследовании в качестве референс-препаратов используют пробы референс-ИФН с известной активностью.
5. Планшеты с разведениями образца инкубируют 24 ч при температуре 37 °С в атмосфере с 5% содержанием СО2.
6. Уровень активности ИФН определяют величиной, обратной значению максимального разведения тестируемого образца, задерживающего цитопатическое действие вируса на 50%, и выражают ее в единицах активности на 1 мл.
7. Для определения типа ИФН в систему добавляют антисыворотку против ИФНα, ИФНβ или ИФНγ. Антисыворотка отменяет действие соответствующего цитокина, что позволяет идентифицировать тип ИФН.
Определение биологической активности миграции ингибирующего фактора. В настоящее время сформировались совершенно новые представления о природе и свойствах МИФ, открытого в 60-х годах прошлого столетия в качестве медиатора клеточного иммунитета и много лет остававшегося без должного внимания (Bloom B.R., Bennet В., 1966; David J.R., 1966). Лишь в последние 10-15 лет стало ясно: МИФ представляет собой один из важнейших биологических медиаторов в организме с широким спектром биологических функций цитокина, гормона, фермента. Действие МИФ на клетки-мишени реализуется через СD74--рецептор или через неклассический путь эндоцитоза.
МИФ рассматривают как важный медиатор воспаления, активирующий функцию макрофагов (выработку цитокинов, фагоцитоз, цитотоксичность и др.), а также как эндогенный иммунорегуляторный гормон, модулирующий глюкокортикоидную активность.
Накапливается все больше сведений о роли МИФ в патогенезе многих воспалительных заболеваний, включая сепсис, ревматоидный артрит (РА), гломерулонефрит и др. При РА значительно увеличена концентрация МИФ в жидкости пораженных суставов, коррелирующая с тяжестью заболевания. Под влиянием МИФ возрастает выработка провоспалительных цитокинов как макрофагами, так и синовиальными клетками.
Известны различные методы тестирования активности МИФ, когда мигрирующие клетки (клетки-мишени для МИФ) помещают в стеклянный капилляр (капиллярный тест), в каплю агарозы или в агарозный колодец.
Мы приводим сравнительно простой скрининговый метод, основанный на формировании на дне лунок 96-луночного плоскодонного планшета клеточных микрокультур (лейкоцитов или макрофагов), стандартных по площади и числу клеток, с последующим их культивированием в питательной среде и определением изменения площади этих микрокультур при действии МИФ (Суслов А.П., 1989).
Лабораторная работа 7-3
Определение МИФ-активности
Определение биологической активности МИФ проводят с помощью устройства для формирования клеточных микрокультур (рис. 7.7) - МИГРОСКРИН (НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН).
1. В лунки 96-луночного планшета (Flow, Великобритания или аналогичные) добавляют по 100 мкл разведенной на культуральной среде пробы, в которой определяют МИФ-активность (каждое разведение в 4 параллелях, опытные пробы). Культуральная среда включает RPMI 1640, 2 mM L-глутамина, 5% сыворотки эмбриона коровы, 40 мкг/мл гентамицина.
2. В контрольные лунки добавляют культуральную среду (в 4 параллелях) по 100 мкл.
3. Готовят клеточную суспензию перитонеальных макрофагов, для чего 2 мышам-гибридам (СВАхС57В1/6)F1 внутрибрюшинно вводят по 10 мл раствора Хенкса с гепарином (10 ЕД/мл), осторожно массируют брюшко в течение 2-3 мин. Затем животное забивают декапитацией, осторожно прокалывают брюшную стенку в области паха и через иглу шприцем отсасывают экссудат. Клетки перитонеального экссудата дважды отмывают раствором Хенкса, центрифугируя их 10-15 мин при 200 g. Затем готовят суспензию клеток с концентрацией 10±1 млн/мл среды RPMI 1640. Подсчет проводят в камере Горяева.
4. Собирают систему МИГРОСКРИН, представляющую собой штатив для направленной и стандартной фиксации наконечников с клеточными культурами в строго вертикальном положении на заданной высоте над центром лунки 96-луночного культурального планшета, а также включающую 92 наконечника для автоматической пипетки фирмы «Costar», USA (рис. 7.7).
Вставляют ножки штатива в угловые лунки планшета. Клеточную суспензию набирают автоматической пипеткой в наконечники - по 5 мкл в каждый, ополаскивают от избытка клеток однократным опусканием в среду и вставляют вертикально в гнезда штатива системы. Заполненный штатив с наконечниками выдерживают при комнатной температуре в течение 1 ч на строго горизонтальной поверхности. За это время происходит оседание клеток суспензии на дно лунок, где формируются стандартные клеточные микрокультуры.
5. Штатив с наконечниками осторожно снимают с планшета. Планшет с микрокультурой клеток помещают в строго горизонтальном положении в СО2-инкубатор, где культивируют в течение 20 ч. В ходе культивирования клетки мигрируют по дну лунки.
6. Количественный учет результатов после инкубации проводят на бинокулярной лупе, визуально оценивая размер колонии по шкале внутри окуляра. Микрокультуры имеют форму круга. Затем исследователи определяют среднее значение диаметра колоний по результатам измерения колоний в 4 опытных или контрольных лунках. Погрешность измерения равна ±1 мм.
Индекс миграции (ИМ) рассчитывают по формуле:
Проба обладает МИФ-активностью, если значения ИМ равны
0,6±0,2.
За условную единицу (ЕД) МИФ-активности принимают обратную величину, равную значению наибольшего разведения пробы (образца), при котором индекс миграции равен 0,6±0,2.
Биологическую активность ФЕOα оценивают по цитотоксическому его действию на линию трансформированных фибробластов L-929. В качестве положительного контроля используют рекомбинантный ФНОа, а в качестве отрицательного контроля - клетки в культуральной среде.
Вычисляют цитотоксический индекс (ЦИ):
где a - количество живых клеток в контроле; b - количество живых клеток в опыте.
Рис. 7.7. Схема МИГРОСКРИН - устройства для количественной оценки миграции клеточных культур
Клетки окрашивают красителем (метиленовым синим), который включается только в погибшие клетки.
За условную единицу активности ФНО принимают значение обратного разведения образца, необходимого для получения 50% клеточной цитотоксичности. Удельная активность образца - отношение активности в условных единицах на 1 мл к концентрации белка, содержащегося в образце.
Внутриклеточное окрашивание цитокинов. Изменение соотношения клеток, продуцирующих различные цитокины, может отражать патогенез заболевания и служить критерием прогноза заболевания и оценки проводимой терапии.
Методом внутриклеточного окрашивания определяют экспрессию цитокина на уровне одной клетки. Проточная цитофлуориметрия позволяет подсчитать количество клеток, экспрессирующих тот или иной цитокин.
Перечислим основные этапы определения внутриклеточных цитокинов.
Нестимулированные клетки продуцируют небольшие количества цитокинов, которые, как правило, не депонируются, поэтому важным этапом оценки внутриклеточных цитокинов являются стимуляция лимфоцитов и блокада выхода этих продуктов из клеток.
В качестве индуктора цитокинов чаще всего используют активатор протеинкиназы С форбол-12-миристат-13-ацетат (ФМА) в комбинации с ионофором кальция иономицином (ИН). Применение такого сочетания вызывает синтез широкого спектра цитокинов: ИФНу, ИЛ-4, ИЛ-2, ФНОα. Недостаток использования ФМА-ИН - проблемы выявления CD4-молекул на поверхности лимфоцитов после такой активации. Также продукцию цитокинов Т-лимфоцитами индуцируют с помощью митогенов (ФГА). В-клетки и моноциты стимулируют
ЛПС.
Мононуклеарные клетки инкубируют в присутствии индукторов продукции цитокинов и блокатора их внутриклеточного транспорта брефельдина А или моненсина в течение 2-6 ч.
Затем клетки ресуспендируют в буферном растворе. Для фиксации добавляют 2% формальдегид, инкубируют 10-15 мин при комнатной температуре.
Потом клетки обрабатывают сапонином, который повышает проницаемость клеточной мембраны, и окрашивают моноклональными антителами, специфичными к определяемым цитокинам. Предварительное окрашивание поверхностных маркеров (CD4, CD8) увеличивает количество получаемой информации о клетке и позволяет более точно определить ее популяционную принадлежность.
Имеются некоторые ограничения в применении описанных выше методов. Так, с их помощью невозможно анализировать синтез цитокинов единичной клеткой, невозможно определить количество цитокинпродуцирующих клеток в субпопуляции, невозможно определить, экспрессируют ли цитокинпродуцирующие клетки уникальные маркеры, синтезируются ли различные цитокины разными клетками или одними и теми же. Ответ на эти вопросы получают, используя другие методы исследования. Для определения частоты цитокин-продуцирующих клеток в популяции применяют метод лимитирующих разведений и вариант иммуноферментного анализа ELISPOT (см. гл. 4).
Метод гибридизации in situ. Метод включает:
1) замораживание органа и приготовление криостатных срезов;
2) фиксацию параформальдегидом;
3) выявление мРНК с помощью меченой кДНК. В некоторых случаях цитокиновую мРНК определяют на срезах с помощью радиоизотопной ПЦР.
Иммунофлюоресценция. Метод включает:
1) замораживание органа и приготовление криостатных срезов;
2) фиксацию;
3) обработку срезов меченными флюоресцеином антицитокиновыми антителами;
4) изуальное наблюдение флюоресценции.
Эти методики (гибридизация in situ и иммунофлюоресценция) быстры и не зависят от пороговых концентраций секретируемого продукта. Однако они не определяют количество секретированного цитокина и могут быть сложны технически. Необходим разнообразный тщательный контроль на неспецифические реакции.
С помощью представленных методов оценки цитокинов были выявлены патологические процессы, связанные с нарушениями в системе цитокинов на различных уровнях.
Таким образом, оценка системы цитокинов чрезвычайно важна для характеристики состояния иммунной системы организма. Изучение различных уровней системы цитокинов позволяет получить информацию о функциональной активности разных типов иммунокомпетентных клеток, о тяжести воспалительного процесса, о его переходе на системный уровень и о прогнозе заболевания.
Вопросы и задания
1. Перечислите общие свойства цитокинов.
2. Приведите классификацию цитокинов.
3. Перечислите основные компоненты системы цитокинов.
4. Перечислите клетки-продуценты цитокинов.
5. Охарактеризуйте семейства рецепторов цитокинов.
6. Каковы механизмы функционирования сети цитокинов?
7. Расскажите о выработке цитокинов в системе врожденного иммунитета.
8. Каковы основные подходы к комплексной оценке системы цитокинов?
9. Каковы методы тестирования цитокинов в биологических жидкостях организма?
10. Каковы дефекты в системе цитокинов при различных патологиях?
11. Каковы основные методы биологического тестирования ИЛ-1, ИФН, МИФ, ФНОа в биологических жидкостях?
12. Опишите процесс определения внутриклеточного содержания цитокинов.
13. Опишите процесс определения цитокинов, секретируемых единичной клеткой.
14. Опишите последовательность применяемых методов выявления дефекта на уровне рецептора цитокина.
15. Опишите последовательность методов, применяемых для выявления дефекта на уровне клеток-продуцентов цитокинов.
16. Какую информацию можно получить, исследуя выработку цитокинов в культуре мононуклеарных клеток, в сыворотке крови?

Литература
1. Галактионов В.Г. Графические модели в иммунологии. - М.: Медицина, 1986. - С. 236.
2. Горбунова В.Н., Баранов В.С. Введение в молекулярную диагностику и генотерапию наследственных заболеваний. - СПб: Специальная литература, 1997. - С. 286.
3. Ершов Ф.И. Система интерферона в норме и при патологии. - М., Медицина, 1996.
4. Игнатьева Г.А., Ковальчук Л.В., Соколова Е.В., Ганковская Л.В. и др. Методические указания к практическим занятиям по иммуноана-
лизам. - М., 2006. - С. 56.
5. Кетлинский С.А., Симбирцев А.С. Цитокины. - СПб: ФОЛИАН,
2008. - С. 550.
6. Клаус Д. Лимфоциты. Методы. - М.: Мир, 1990. - С. 393.
7. Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Хорева М.В., Соколова Е.В. Система цитокинов, комплемента и современные методы иммунного анализа. - М., 2001. - С. 158.
8. Ковальчук Л.В., Чередеев Ч.А. Иммунорегуляторная роль моноцитов в норме и при иммунопатологии / Итоги науки и техн. ВИНИТИ. Сер. Иммунология. - М., 1991. - Т. 27. - С. 101-114.
9. Кондратьева И.А., Ярилин А.А. Практикум по иммунологии. - М.: Academa, 2004. - С. 272.
10. Львов Д.К. Медицинская вирусология. - М.: МИА, 2008. -
С. 655.
11. Масленникова А.Б. Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике. - Новосибирск: Альфа Виста, 2006. -
С. 208.
12. Макаров О.В., Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В. и др. Невынашивание беременности, инфекция, врожденный иммунитет. - М.: ГЭОТАР-
Медиа, 2007. - С. 175.
13. Петров Р.В. Иммунология. - М.: Медицина, 1987. - С. 414.
14. Сибиряк С.В., Черешнев А.А., Симбирцев А.С. и др. Цитокиновая регуляция биотрансформации ксенобиотиков и эндогенных
соединений. - УрО РАН, 2006. - С. 163.
15. Федосеева В.И., Порядин Г.В., Ковальчук Л.В., Чередеев А.Н., Коган В.Ю. Руководство по иммунологическим и аллергическим методам в гигиенических исследованиях. - М.: ПРОМЕДЭК, 1993. -
С. 320.
16. Хаитов Р.М., Игнатьева Т.А., Сидорович И.Г. Иммунология. - М.: Медицина, 2000. - С. 430.
17. Херингтон С., Макги Дж. Молекулярная клиническая диагностика. Методы // Метод представляет собой следующее. - М.: Мир, 1999. - С. 558.
18. Ярилин А.А. Основы иммунологии. - М.: Медицина, 1999. -
С. 607.
19. Brown T.A. Gen cloning and DNA analysis / Blackwell Publishing. -
2002. - С. 363.
20. Carthew R.W Curr Opin. Gene regulation by microRNAs / Genet. - 2006, Dev. - Vol. 16. - Р. 203-208.
21. Lindsay M.A. MicroRNAs and the immune response / Trends in I4.3.

Приложенные файлы

  • docx 8897489
    Размер файла: 4 MB Загрузок: 0

Добавить комментарий