Экспериментальная иммунология. Лекционная тетра..


Чтобы посмотреть этот PDF файл с форматированием и разметкой, скачайте его и откройте на своем компьютере.
Министерство образования Республики Беларусь
Учреждение образования
«Международный государственный экологический
университет имени А.Д. Сахарова»
Факультет экологической медицины
Кафедра иммунологии
Лекционная тетрадь
Составители
Т.Р. Романовская
А.Н. Харламова
Д.Б. Нижегородова
Рецензенты
О.В. Петракова
и радиобиологии МГЭУ им. А.Д.Сахарова
В.Д. Свирид
Экспериментальная
лекционнаятетрадь
сост.:Т. Р.Романов
41
ская
А.Н.Харламова, Д. Б. Нижегородова.
Минск : МГЭУ им. А.Д.Сахарова,
2009.–34c.
методическое пособие содержит описание основных применяемых в
иммунологических экспериментах методов, отмечены особенности постановки
in vivo
и
in vitro
, приведены экспериментальные модели иммуно-
578.08:612.017.1(075.8)
экологический университет
имени А.Д.Сахарова, 200
......................................................................................4
....5
.........................................12
.............................................15
Исследование иммунотропного влияния факторов
...............19
............................................27
.........................................................................33
Тема и краткое содержание
Экспериментальная иммунология:
задачи, объекты и методы
Иммунизация и ее возможности
при исследовании иммунной системы
Экспериментальное моделирование
Исследование иммунотропного влияния факторов
окружающей среды, лекарственных препаратов и др.
Серологический метод исследования и его
использование в иммунологии и смежных областях
Тема и краткое содержание
Экспериментальная иммунология:
задачи, объекты и методы
Иммунизация и ее возможности при исследовании
иммунной системы Экспериментальное моделирование
Исследование иммунотропного влияния факторов
окружающей среды, лекарственных препаратов и др.
Экспериментальная иммунология:
Экспериментальная иммунология
область иммунологии, которая
занимается воспроизведением иммунологических феноменов в экспери-
ментальных условиях.
Эксперимент
моделирование физиологического или патофизиоло-
гического процесса в искусственных условиях для изучения механизма
его развития, влияющих факторов или для других целей.
Задачи экспериментальной иммунологии
Изучение молекулярно
клеточных механизмов развития иммунно-
го ответа, его стадий и компонентов.
Изучение молекулярно
клеточных механизмов иммунного ответа
на инфекционные, опухолевые антигены
аутоантигены, т.е. изучение
закономерностей иммунного ответа в рамках иммунопатологии.
Разработка методов исследования молекулярно
клеточных меха-
низмов в теоретических и прикладных целях.
Разработка комплекса иммунобиотехнологических процедур для
изготовления диагностических и лекарственных иммунопрепаратов
(фракции антисывороток).
Исследование иммунотропных и иммунотоксических эффектов
лекарственных препаратов, факторов окружающей среды и т.д.
При проведении иммунологических экспериментов часто использу-
ется комплекс методологических подходов и различных методов иссле-
Для регистрации результатов в экспериментальной иммунологии ис-
пользуют самые различные методы, включая иммунологические, цитологи-
ческие, гистологические, серологические, молекулярно
биологические и
биохимические. Особое внимание уделяется новым высокотехнологиче-
ским методам, таким как проточная цитофлюорометрия, конфокальная,
термооптическая микроскопия, которые позволяют проводить регистрацию
основных молекулярно
клеточных феноменов с высоким уровнем специ-
фичности. Для обработки полученных данных широко используются мето-
ды математической и статистической обработки. Выбор конкретного метода
во многом определяется характером эксперимента, используемых объектов,
числа и динамики наблюдений, а также характером изучаемого процесса.
Алгоритм проведения иммунологического эксперимента
шагов к успеху
Постановка цели и задач эксперимента
определение временного промежутка которого должен быть поставлен эксперимент
проведение необходимых дополнительных процедур)
Статистический анализ полученных данных. Интерпретация результатов.
Выводы. Заключение о соответствии гипотезы полученным результатам
Методы, используемые в рамках проведения иммунологических экс-
периментов
Микроскопический(цитологический, морфологический, гистоло-
Метод культивирования
Иммунохимический
Метод иммунофенотипирования
Молекулярно
биологический метод
Математический и статистический методы
Объекты экспериментальной иммунологии
Объекты экспериментальной иммунологии связаны с характером
эксперимента в лабораторных условиях.
Существуют два основных направления экспериментальной имму-
Исследования на живых организмах (
invivo
) с использованием
животных (мышей, крыс, кроликов, овец, коз, лошадей, свиней, реже
приматов), рептилий, земноводных, птиц.
Исследования на культурах клеток (
invitro
), тканевых или
органных культурах
Особенности исследований
invitro
invivo
Исследования
invitro
Исследования
invivo
Объектом исследования
является культура клеток
invivo
ляет обеспечить естествен-
ные условия развития физио-
логического или патологиче-
влияния со стороны эндок-
ринной и нервной систем,
наличие детоксикационных
Возможно-
Есть возможность иссле-
дования молекулярно
клеточных механизмов
развития иммунных про-
Есть возможность исследо-
вания общей целостной реак-
ции организма при развитии
реакций иммунной системы
мость в обо-
Для исследований необхо-
димы дорогостоящие ре-
активы, такие как пита-
тельные среды, вспомога-
тельные клетки, сыворо-
точные белки, стерильные
условия, специально обу-
ченный персонал и т. д.
Для содержания животных
необходимы специально обо-
рудованное помещение
варий, качественное кормле-
ние, витаминные добавки,
обученный персонал, обеспе-
чивающий правильный уход
Эксперимент прерывается
на определенной стадии,
так как поддерживать
культуры клеток при дли-
тельном мониторинге
за возможности
влияния дополнительных
Для регистра-
ции иммунологических
феноменов требуется до-
рогостоящее оборудова-
Реакция иммунной системы
оценивается по поведению
животного (оценка анафи-
лактогенной и аллергизи-
рующей активности ряда
есть возможность
мониторинга без проведения
эвтаназии, при использова-
нии крыс, морских свинок,
есть возмож-
ность прижизненного взятия
биологического материала и
длительного мониторинга
Исследования
invitro
Исследования
invivo
Нужно учитывать необхо-
димую концентрацию кле-
ток, желательность син-
хронизации культур кле-
ток, время их максималь-
но возможного поддержа-
invitro
Необходимо учитывать ин-
дивидуальные различия жи-
вотных по тем или иным
признакам, так как эта гете-
рогенность может влиять на
результаты исследования
Оба направления
эксперименты
invivo
и
invitro
дополняют друг
друга, не являясь взаимоисключающими.
Культуры клеток
Культуры клеток представляют собой приблизительно гомогенную
популяцию клеток, жизнеспособность и пролиферация которых поддер-
живаются в специальной среде. Культуры клеток бывают первичные, по-
луперевиваемые и перевиваемые
Культуры клеток
Описание
Культуры клеток, получаемые из ткани взрос-
лых животных. Они обладают низким пролифе-
ративным потенциалом и в лабораторных усло-
виях имеют низкую продолжительность жизни
(лимфоциты периферической крови, выделенные
на градиенте плотности)
Полуперевиваемые
Перевиваемые культу-
ры клеток (пересевае-
мые, пассируемые)
Примеры культур клеток, наиболее часто используемых в экспери-
ментальной иммунологии
Наименование
культуры
Характеристика
культуры
Назначение культуры
Используется в опытах по
исследованию цитотоксич-
ности лимфоцитов в качест-
Применяется дляисследо-
вания цитотоксичности лим-
фоцитов в качестве клеток
Клетки лимфомы
мыши, индуцирован-
лейкемии Молони
Используется для изучения
цитотоксического действия
натуральных киллеров
Клетки, полученные
из синовиальной
жидкости коленного
страдающего артри-
Применяется для диагно-
стики хламидийной инфек-
Имеет чувствительность к
некоторым вирусам (вези-
кулярный стоматит)
Лабораторные животные
Лабораторные животныеиспользуются для воспроизведения инфек-
ционного, аутоиммунного, иммунодефицитного или опухолевого процесса,
а также для изучения иммунного ответа при перечисленных состояниях.
По мере развития иммунологии для решения новых задач разрабаты-
вались специализированные технологии получения лабораторных живот-
ных с заданными качествами. Эти технологии позволили сократить чис-
ленность животных, участвующих в эксперименте, а также избежать арте-
фактов и влияния неспецифических факторов на моделируемый процесс.
Среди новых технологий нужно отметить следующие:
получение инбредных линий животных;
получение нокаутных по определенному гену животных;
получение трансгенных животных;
разработка гибридомной технологии
Гибридомная технология
представляет собой один из наиболее часто
используемых подходов для иммунобиотехнологических целей.
Характеристика основных линий лабораторных животных
животных
животные
Животные,
нокаутные
по определен-
ному гену
линии животных полу-
чаются путем последо-
вательного близкород-
ственного скрещива-
ния животных (по схе-
последовательных
скрещиваний).Основ-
ная характеристика
такой линии состоит в
том, что все ее особи
гомозиготны и неотли-
чимы в генетическом
отношении друг от
друга, как однояйце-
Это метод полу-
чения клеток или
целых организ-
мов (мышей), в
которых целена-
Дополнение транс-
гена тканеспецифи-
ческими и/или ин-
промоторами по-
зволяет манипули-
ровать экспрессией
трансгена по ус-
мотрению экспери-
ментатора (не во
только, например, в
островков Ланген-
гарнса, не постоян-
введения в орга-
низм индуктора)
животных
животные
Животные,
нокаутные
по определен-
ному гену
Линии мышей, отли-
чающиеся выражен-
ным иммунным отве-
том на корпускулярные
; линии жи-
вотных с низким отве-
том на корпускуляр-
; линии живот-
ных с высоким риском
развития опухолевых
–C3HSnell
Иммунизация и ее возможности
при исследовании иммунной системы
Иммунизация лабораторных животных
Иммунизация
введение антигена в организм в искусственных усло-
виях с целью последующей регистрации феноменов клеточного и гумо-
рального иммунного ответа
При введении антигена разными путями есть
возможность исследования развития иммунного ответа в различных тканях
Фундаментальное значение иммунизации заключается в том, что это
просто выполняемая модель, которая позволяет исследовать большинство
закономерностей иммунного ответа (изучение динамики гуморального и
клеточного иммунного ответа). Моделируя дозу, агрегатное состояние,
пути введения и схему иммунизации антигена
в лабораторных условиях
создаются модели арреактивности, гипперреактивности иммунной систе-
мы, а также оптимального иммунного ответа.
Иммунизация может проводиться различными способами
внутрикожно;
внутривенно
внутрибрюшинно
внутриселезеночно;
При введении антигена разными путями есть возможность исследо-
вания иммунного ответа различными тканями.
Степень выраженности и механизмы иммунного ответа определяются:
Структурой
антигена
В качестве антигенов могут использоваться экс-
тракты различных тканей животных и человека,
взвеси клеток, сыворотка крови, белковые антигены
(вызывают сильный иммунный ответ), липополиса-
хариды и полисахариды (вызывают слабый иммун-
ный ответ, поэтому вводятся
вантами), синтетические полипептиды, нуклеино-
вые кислоты и др.
Дозой антигена
Доза антигена зависит от животного, который уча-
ствует в эксперименте. Слишком высокие или
слишком низкие дозы способствуют развитию кле-
точного иммунного ответа, средние дозы направля-
ют иммунный ответ в сторону гуморального
Кратностью
введения антигена
В некоторых случаях для разрешения иммунного
ответа требуется повторная иммунизация антигеном
Путем
введения антигена
Введение антигена в область слизистых оболочек
инициирует гуморальный иммунный ответ. Под-
кожное и внутрикожное введение антигена вызыва-
ет клеточный иммунный ответ
С прикладной точки зрения иммунизация сохраняет свое значение
на предварительных этапах оценки эффективности вакцин, получения
препаратов антител, а также при исследовании иммунотропных факторов
окружающей среды и лекарственных веществ.
Индукция иммунного ответа. Адъюванты
Индукция иммунного ответа
сложный физиологический процесс.
На одну и ту же форму иммуногена в одном и том же организме можно
индуцировать иммунный ответ разной интенсивности в зависимости от
применения или неприменения определенных воздействий
адъювантов.
Адъюванты
(от лат.
помогать)
это вещества, способные
усиливать иммунный ответ на заданный иммуноген. Как правило, адъю-
вантными свойствами обладают вещества, способные вызывать доим-
мунное воспаление в тканях, а медиаторы доиммунного воспаления в
цитокины макрофагов, фибробластов, керациноцитов (
IL-1, IL-
способствуют развитию реакции иммунного ответа.
Таким образом, механизм действия адъювантов основан на:
способности удерживать антиген в том месте, где он экспонирует-
ся лимфоцитами (эффект
»);
дополнительной стимуляции вспомогательных звеньев иммунного
ответа (например, способностью индуцировать синтез цитокинов, регу-
лирующих функции лимфоцитов).
Адъюванты широко используются в лабораторной практике для
усиления выработки антител при иммунизации животных, в частности в
процессе получения гибридов
Примеры адъювантов
Механизм действия
Неполный адъю-
Депонирование антигена,
усиление захвата фагоцитами
Полный адъювант
Смесь вазелиновых
масел с инактивиро-
Mycobacterium
tuberculosis
или трипептиды
Иммуностиму
комплекс (ISOM)
Доставка антигена в цитозоль
Экспериментальное моделирование
Экспериментальное моделирование
это совокупность приемов
воспроизведения патологических процессов у экспериментальных жи-
вотных или воздействия факторами различной природы с целью изучения
их влияния на живой организм.
Экспериментальная модель
это термин, употребляемый в отношении:
Лабораторных животных, у которых искусственно полностью или
частично воспроизводятся признаки клинической картины иммунопато-
логического процесса человека.
Культуры клеток, тканей и изолированных органов, что логически
не правомерно, однако, связано с все большим развитием исследований
на молекулярно
клеточном и молекулярно
генетическом уровнях.
Создание экспериментальной модели позволяет решить следующие
Изучение молекулярно
клеточных механизмов иммунопатологии
invivo
Определение роли иммунной системы в возникновении, течении и
исходе конкретных заболеваний.
Разработка новых методов специфической диагностики, профи-
лактики и терапии заболевания.
Контроль безопасности и эффективности иммунопрепаратов.
Классификация экспериментальных моделей
По этиологии и патогенезуизучаемого процесса или заболевания
●Экспериментальные модели опухолей
●Экспериментальные модели инфекционных заболеваний
●Экспериментальные модели иммунодефицитов
●Экспериментальные модели аутоиммунных заболеваний
●Экспериментальные модели аллергических процессов
По уровню исследования
●Экспериментальное моделирование на уровне организма (предпо-
лагает использование лабораторных животных)
●Экспериментальное моделирование на уровне молекулярно
клеточных взаимодействий (предполагает использование культур клеток
●Экспериментальное моделирование на геномном уровне (предпола-
гает использование методов молекулярной биологии и генной инженерии
как на культурах клеток, так и на яйцеклетках, эмбрионах и животных)
Экспериментальные модели аутоиммунной патологии
Индуцированныемодели
Спонтанные модели
Активная индукция
осуществляется путем
введения в организм лабораторного
животного аутоантигенов в составе
Пассивная индукция
осуществляется пу-
тем адаптивного переноса лимфоци-
тов от сенсибилизированного ауто-
антигенами донора
С использованием метода генети-
ческого нокаута выведены специ-
альные линии лабораторных жи-
вотных, у которых аутоиммунные
заболевания возникают спонтанно
Примеры экспериментальных моделей аутоиммунной патологии
Аутоиммунное
заболевание
человека
Экспериментальная
модель на животных
Антиген,
индуцирующий
заболевание
Примеры индуцированных аутоиммунных процессов
у лабораторных животных
Рассеянный склероз
Экспериментальный аллер-
гический (аутоиммунный)
энцефалломиелит
ОБМ, МОГ, ПЛБ,
Ревматоидный
индуцированный
Аутоиммунный
тироидит (болезнь
Экспериментальный ауто-
иммунный тироидит
Тироглобулин
Миастения гравис
Экспериментальная тяжелая
к ацетихолину
Болезнь Шегрена
Экспериментальная модель
фодрин из эпите-
лия слюнных желез
Примеры спонтанных аутоиммунных процессов
у лабораторных животных
Сахарный диабет I
зависимый сахар-
Экспериментальная модель
сахарного диабета на транс-
генных мышах линии NOD
(нет гена инсулина)
Предположительно
Аутоиммунное
заболевание
человека
Экспериментальная
модель на животных
Антиген,
индуцирующий
заболевание
Системная красная
Экспериментальная модель
системной красной волчанки
на мышах (NZB
×NZW)F
Тироидит
Экспериментальный ауто-
иммунный тироидит на цып-
лятах линии OS (Obese
Тироглобулин
Экспериментальные модели иммунодефицитов
Экспериментальные модели
первичных (врожденных)
иммуноде-
Генетическая
мутация
Практическое
Первичный иммуноде-
nude»
й хромосоме,
который в гомозиготном
рецессивном состоянии
проявляется полным от-
сутствием волос, а тимус
находится в рудиментар-
ном состоянии
Тяжелый комбиниро-
ванный иммунодефицит
Создание модели
инфекции
Экспериментальные модели
вторичных (приобретенных)
нодефицитов индуцируются при помощи:
лекарственных препаратов (стероиды, циклофосфамид, метотрек-
сат, циклоспорин
ионизирующего излучения;
инфекционных агентов;
стрессовых ситуаций
недостаточностью питания.
Экспериментальные модели опухолей
кимодели
Исследование иммунотропного влияния
факторов окружающей среды,
лекарственных препаратов и др
Оценка иммунотропного и иммунотоксическогодействия
лекарственных веществ
Для оценкииммунотропного и иммунотоксического действия ново-
го лекарственного препарата разработана двухступенчатая система.
я ступень
регистрация иммунотоксических свойств препа-
Если в процессе исследования обнаруживаются токсические свой-
ства лекарственного препарата, то он не допускается к производству, за
исключением тех лекарств, основной эффект которых связан с противо-
опухолевой и иммуносупрессорной активностью.
Иммунотоксичность
оценивается на лабораторных животных. При
этом в эксперименте участвуют 2
3 линии мышей. Мыши должны быть
обоих полов; кроме того, эксперимент ставится на животных разных воз-
растных групп. При определении иммунотоксичности, как правило, изуча-
ется вероятность развития острого и хронического токсического эффекта.
Моделирование острой и хронической токсичности регулируется до-
зой препарата.
моделируется введением в организм
животного одномоментно целой (курсовой) дозы препарата, иногда 5
для препаратов с общей малой токсичностью.
Хроническая токсич-
в лабораторных условиях моделируется продолжительным, еже-
дневным введением максимально допустимой дозы препарата.
Эффект токсичности оценивают по ряду тестов:
влияние на жизнеспособность животных
изучение общей ток-
иммунотоксические эффекты в отношении неспецифических фак-
торов резистентности
активность системы комплемента, влияние на функ-
циональную активность нейтрофилов и перитонеальных макрофагов и др.
влияние на клеточность органов иммунной системы;
влияние иммунотоксических свойств препарата на развитие гумо-
рального и клеточного иммунного ответа. Для этого препарат вводят па-
раллельно с иммунизацией животного каким
либо антигеном;
иммунотоксический эффект лекарственного препарата в отноше-
нии индуктивной и продуктивной фаз иммунного ответа изучается от-
В первом случае для оценки иммунотоксичности в отношении
индуктивной фазы иммунного ответа иммунизацию проводят одномо-
ментно с введением препарата. Для оценки иммунотоксичности эффек-
торной фазы иммунного ответа лекарственный препарат вводят не ранее
7 дней после иммунизации.
я ступень
оценка иммунотропного действия препарата
Впроцессе проведения исследования иммунотоксичности препарата ино-
гда проявляются не столько его токсические эффекты, сколько эффекты
модуляции и стимуляции иммунной системы
Такие препараты в экспе-
риментальном плане переходят на следующий этап оценки
уровень оп-
ределения иммунотропных свойств препарата.
Оценка
иммунотропного
действия проводится в тестах
invivo
и
invitro
Invivo
повторяют проведение исследования иммунотоксических
свойств, а также модели патологического состояния. Основная модель
для исследования иммунотропных свойств препарата (в условиях на-
грузки)
инфекционная
Она создается путем введения в организм жи-
вотного чистой культуры микроорганизмов в инфицирующей дозе. Са-
мым точным тестом, позволяющим зарегистрировать протективный эф-
фект лекарственного препарата
является тест на выживание. В этом слу-
чае экспериментальных животных делят на две группы, обе группы полу-
чают инфекционный агент на уровне
, затем опытной подгруппе
вводят лекарственный препарат. Через некоторый интервал времени (за-
висит от свойств микроорганизма) регистрируют результат по выживае-
мости животных. Если в опытной группе животных удалось снизить ко-
личество летальных исходов
это служит доказательством иммунотроп-
ного эффекта препарата. Если эффект снижения летальных исходов ми-
нимален и не позволяет говорить о его достоверности
ренную схему экспериментов:
Оценивают иммунотропность к неспецифическим факторам им-
мунитета
Оценивают иммунотропность в отношении развития гуморально-
го иммунного ответа.
Оценивают иммунотропность в отношении развития клеточного
иммунного ответа.
Отдельно оценивают влияние препарата на индуктивную и про-
дуктивную фазу иммунного ответа.
Моделирование эксперимента в условиях
invitro
дает возможность
изучить молекулярно
клеточный механизм иммунотропного эффекта пре-
парата. В этом случае спектр исследуемых параметров и тестов неограни-
чен и определяется интеллектуальным уровнем исследовательской группы
техническими возможностями и наличием необходимых реактивов
По совокупности результатов исследования
invivo
и
invitro
опреде-
ляют механизм действия препарата и формулируют показания к его приме-
нению. Параллельно с показаниями к применению дополнительно проводят
эксперименты, посвященные направленному действию препарата при кон-
кретной патологии. В этом случае создается экспериментальная модель того
состояния, в отношении которого оцениваетсяэффект препарата
Оценка иммунотропного и иммунотоксического действия
факторов окружающей среды
Оценка иммунотропного и иммунотоксического действия факторов
окружающей среды представляет собой сложную задачу, так как это об-
ласть научных исследований, которая не регламентирована какими
требованиями и условиями, а следовательно
эффективность исследова-
ния связана главным образом с человеческим фактором, т.е. с интеллек-
том исследовательской группы. Человеческий фактор
это уровень обра-
зовательной и организаторской подготовки исследователей.
Для выявления действия веществ на иммунную систему разработаны
многочисленные методы исследования, выполняемые
in vivo
и
in vitro
Иммунные клетки легко изолировать, а их функции изучить
Стратегия определения иммунотоксичности состоит в последова-
тельном изучении в эксперименте состояния элементов иммунной систе-
мы (от клетки до целостного организма), в условиях воздействия испы-
туемого токсиканта. Ни одна отдельно взятая методика не является в
полной мере надежной и достаточной для оценки потенциальной опасно-
сти ксенобиотика. Содержание одного из тестов представлено в таблице.
Двухэтапный пакет тестов оценки иммунотоксичности ксенобиотика
Параметры
Методы исследования
Иммуноморфология
Гематологические: общий анализ
крови, формула крови
Вес тела, селезенки, тимуса, почек,
печени, легких
Гистология селезенки, тимуса,
лимфатических узлов
Параметры
Методы исследования
Подсчет колоний клеток, образую-
зависимым и
независимым антигенам
и ответ на митогены
Ответ на действие митогена и сме-
шанный лейкоцитарный ответ на
аллогенные лейкоциты
Фагоцитарная активность клеток
Морфология
Подсчет числа В
лимфоцитов в
Подсчет колоний клеток, образую-
зависимым антигенам
Функции цитотоксических
Неспецифический
Количество перитонеальных мак-
рофагов и анализ их функциональ-
ной активности
Оценка резистентно-
Прививка опухолевых тканей:
саркома PYB6
меланома B6F10
Бактериальныемодели
Listeria monocytogenes
Streptococcus spp
Паразитарныемодели
Trypanosoma musculi
Plasmodium yoellii
Вирусные модели:
Исследования первого этапа предназначены для выявления потенци-
альных иммунотоксикантов. Тесты второго этапа позволяют установить
механизм иммунотоксичности и потенциальную способность вещества
нарушать общую резистентность организма. Обычно токсикант вводится
мышам в течение 14 дней, хотя в случае неясных результатов введение
может быть продолжено до 30 и даже 90 суток.
Для изучения иммуносупрессорных свойств токсикантов в лабора-
торных условиях могут быть применены животные, зараженные патоген-
ными микроорганизмами. С целью инфицирования используют Listeria
monocytogenes, Streptococcus pneumonia, Trypanosoma musculi, Plasmodium
yoellii, вирус гриппа, вирус простого герпеса и т. д. В подобного рода ис-
следованиях удается оценить состояние отдельных элементов иммунной
системы. Продолжительность анализа составляет в среднем
3 недели.
Примером хорошо отработанного теста на иммунотоксичность ксе-
нобиотика является метод введения мышам, подвергшимся действию
токсиканта, культуры трипаносом (
rypanosoma musculi). Эти эукариоты
являются непаразитическими, экстрацеллюлярными микроорганизмами.
Поражение мышей этими организмами на ранних этапах заражения кон-
тролируется врожденными механизмами резистентности, в частности фа-
гоцитозом. В поздние стадии (10 дней инфекционного процесса) парази-
темия контролируется механизмами антителообразования. Конечный
й день) инфекционного процесса проходит под контролем
как клеточного, так и гуморального иммунитета. Таким образом, в одном
эксперименте можно определить влияние ксенобиотика на несколько
элементов иммунной реакции (фагоцитоз, выработку антител, клеточный
иммунитет). Вызванные токсикантом повреждения фагоцитоза, либо ан-
тителообразования, либо механизмов клеточного иммунитета, проявля-
ются паразитемией в соответствующем периоде развития инфекции. Эта
модель достаточно чувствительна и эффективна при оценке иммуносу-
прессорных свойств ксенобиотиков.
Методы оценки анафилактогенного, аллергизирующего,
сенсибилизирующего действия лекарственных препаратов
ксенобиотиков и других веществ
Термины, понятия, условия
Расшифровка, пояснения
Анафилактогенное действие
Аллергизирующее действие
Сенсибилизирующее действие
Лабораторные животные
Крысы, мыши, морские свинки,
Формирование опытных
и контрольных групп
10 животных, при необходимо-
сти отдельно по полу и возрасту
Обычные дозы препаратов
Терапевтическая и 10
кратная те-
1. Анафилактогенность исследуемого препарата
(сенсибилизирующие свойства)
Основной принцип
исследуемый препарат вводят животным (мор-
ским свинкам, реже
мышам, крысам или кроликам) вместе с адъюван-
том Фрейнда для индукции сенсибилизации (иммунного ответа). На вы-
соте сенсибилизации (21 сутки) вводят разрешающую дозу исследуемого
препарата, регистрируя внешние признаки анафилаксии (частота дыха-
ния, почесывание, дефекация, мочеиспускание, дрожь, судороги, смерть)
Проведение исследований требует постановки двух контролей: пози-
тивного (моделирование анафилактического шока) и негативного. Форми-
рование позитивного контроля проводят с помощью введения лаборатор-
ным животным чужеродного белка (яичного альбумина
овальбумина,
либо лошадиной сыворотки крови), т.е. проводят иммунизацию животных
контрольной группы по разработанной схеме. При этом применяются схе-
мы иммунизации (свойства антигена, дозы антигена, кратность введения,
способы введения), которые наиболее эффективны в инициации гумораль-
ного иммунного ответа с выработкой антител класса
IgE.
Схема эксперимента
. Три группы животных
одна опытная (соот-
ветственно двум исследуемым дозам
две группы) идве контрольные
(негативный и позитивный контроль)
Опытная группа
Негативный
контроль
Позитивный
контроль
Введение исследуемого
препарата (2дозы)
внутримышечно, введе-
ние адъюванта Фрейнда
Введение адъ-
юванта Фрейн-
Введение оваль-
бумина (15 мг/кг)
Введение исследуемого
препарата (2 дозы)
внутримышечно
Введение адъ-
юванта Фрейн-
Введение оваль-
бумина (10 мг/кг)
Регистрация внешних проявлений анафилаксии
Анафилактическая реакция обычно наступает через 1
2 мин
после
введения разрешающей дозы антигена. Ее оценку проводят по внешним
признакам по четырехплюсовой системе:
+ –
кратковременное почесывание носа, взъерошивание шерсти, па-
дение температуры тела (не менее чем на 1 °С);
++ –
четко выраженное почесывание, единичные чихания, падение
температуры тела;
+++–
спастический кашель, боковое положение животного, дефека-
ция и мочеиспускание
++++ –
спазм дыхательной мускулатуры, конвульсивные прыжки,
судороги, гибель животного
2. Активная кожная анафилаксия
Основной принцип
исследуемый препарат вводят животным (мор-
ским свинкам или мышам СВА или
Balb/c)
в режиме сенсибилизации,
затем вводят разрешающую дозу строго внутрикожно. Одновременно
внутривенно или в ретроорбитальный синус вводят раствор синьки Эван-
са, которая, диффундируя по кровотоку, наиболее активно задерживается
в кожных покровах в местах развития сенсибилизации, т.е. в точках, куда
вводили антиген. После умерщвления животного оценивают площадь
прокрашенного кожного лоскута.
Опытная группа
Позитивный контроль
Введение исследуемого пре-
парата (2 дозы) внутримы-
шечно, введение адъюванта
Фрейнда внутрикожно
Введение овальбумина
(15 мг/кг) внутрикожно
Введение исследуемого пре-
парата (2 дозы) внутримы-
разрешающая доза
Введение овальбумина
(10 мг/кг) внутрикожно
Введение 0,5 мл 1%
ного раствора синьки Эванса внутривен-
но, учет реакции через 30 мин
.–
измерение площади окра-
шенного участка кожи
Другой способ учета реакции. Окрашенный участок кожи вырезать и
поместить в пробирку с 1 мл 1
раствора К
, инкубировать 12
14 час
при температуре +37°С. Затем в пробирку вносят 9 мл лизирующей сме-
си (0,6
и ацетон в соотношении 5 : 13). Пробирку встря-
хивают и центрифугируют. На спектрофотометре определяют оптиче-
скую плотность супернатанта при 620 нм. Одновременно строят калибро-
вочный график с образцами,содержащими 2
10 мкг красителя в
мл ли-
зирующей смеси. По калибровочному графику определяют содержание
красителя в участке кожи животного.
Гиперчувствительность замедленного типа
в рамках исследования иммунотропного действия при иммуниза-
ции антигеном
Конъюнктивальная проба
Морским свинкам ежедневно на протяжении 21 дня вводят внутри-
мышечно исследуемый препарат, контрольной группе животных
рас-
творитель. На 21
й день проводят пробу
субконъюнктивально вводят
разрешающую дозу препарата. Позитивный контроль
введение раствора
гистамина. Реакцию регистрируют по внешним проявлениям
слезотече-
нию,гиперемии, отеку век.
Все перечисленные тесты нужны для оценки собственно аллергизи-
рующих свойств исследуемого препарата. Если предполагаются его анти-
аллергизирующие свойства, то результаты тестов будут отрицательными
на фоне позитивных контролей. Кроме этого, оценивают синтез
в
культуре мононуклеаров периферической крови человека. Это пролифе-
ративный тест с ФГА с инкубацией лимфоцитов в течение 7 суток с по-
следующим определением
в супернатанте с помощью набора ИФА
Серологический метод исследования
и его использование в иммунологии
и смежных областях
Серологический метод
представляет собой совокупность реакций,
основанных на взаимодействии антиген
антитело и направленных на вы-
явление в биологическом материале антител либо антигенов.
Серологический метод широко используется в различных областях
фундаментальной и прикладной науки.
Области применения
Определяемые параметры
или изучаемые явления
Экспериментальная
Определение эффективности развития ан-
тительного иммунного ответа на антиген
при изучении его динамики и механизмов
Иммунобиотехнология
Определение эффективности иммунизации
при разработке диагностических и лечеб-
Диагностика в медицине
(и ветеринарии), включая
иммунодиагностику, клини-
ческую иммунологию и др.
Определение групп крови, диагностика ин-
фекционных и аутоиммунных болезней,
определение напряженности поствакци-
нального иммунитета
Микробиология
Проведение серологического типирования
(идентификации антигенов) чистой культу-
ры микроорганизмов
Определение видовой принадлежности бел-
ка с последующей его идентификацией
Этапы серологического метода
Получение исследуемого биологического материала, при необхо-
димости его предварительная обработка или подготовка к исследованию.
Выбор серологической реакции, который определяется особенно-
стями взаимодействующих антигенов или антител, а также особенностя-
ми исследуемого биологического материала
Постановка серологических реакций.
Регистрация результатов чаще всего осуществляется визуально
либо под небольшим увеличением.
Интерпретация результатов и оформление заключения
Преимущества и недостатки серологического метода
Преимущества
Недостатки
Серологический метод
характеризуется высокой
чувствительностью и спе-
Большинство реакций это-
го метода просты в прове-
дении и учете, доступны
широкому кругу лабора-
Как правило, безопасны,
экономичны, поддаются
стандартизации
Высокий процент ложноположительных
и ложноотрицательных реакций
следствие кросс
реактивности между
разными антигенами и антителами
Невысокая степень чувствительности или
разрешающей способности (определяе-
мая концентрация белка
мкг/мл). Для повышения чувст-
вительности впоследствии был разрабо-
тан иммунохимический анализ
Ограниченность возможностей метода:
серологические реакции эффективны в
отношении лишь определенного спектра
антител(агглютинирующих, преципити-
рующих или комплементсвязывающих),
что связано с их особенностями и осо-
бенностями антигенов. Другие антитела и
антигены к ним идентифицируются с по-
мощью реакций иммунохимического
Взаимодействие антиген
В основе всех серологических реакций лежит взаимодействие анти-
гена и антитела. Эта реакция основана на взаимодействии между эпито-
пами антигена и активными центрами антител. Прежде всего следует
учесть, что все антитела дифференцируются на полные и неполные, от-
личающиеся валентностью, т.е.наличием паратопов
участков для свя-
зывания с антигеном.
имеют две свободные валентности
(
т.е. они
, способны не только связывать антиген, образуя
иммунный ком-
, но и объединять несколько иммунных комплексов в один. При
этом образуется крупный белковый агломерат.
(моновалент-
ные, блокирующие) антитела имеют лишь одну свободную валентность, в
связи с чем они могут связывать лишь молекулу антигена иприкреплять-
ся к поверхности клетки
В первой фазе
специфической
молекулы антител и антигена
объединяются в
иммунные комплексы
эпитопом антигена и паратопом
антитела, высококомплементарными по структуре и заряду. На первом
этапе взаимодействия основными связующими силами являются куло-
новские, а после сближения эпитопа и паратопа на расстояние в доли нм
решающую роль в формировании комплекса играют ван
ваальсовы
силы. Первую фазу взаимодействия формируют любые антитела и анти-
гены. Данная фаза взаимодействия антиген
антитело не имеет видимых
неспецифической
у полныхантител происходит
неспецифическое объединение (за счет водородных, гидрофобных и иных
сил) иммунных комплексов в видимые невооруженным глазом преципи-
таты или агглютинаты. У неполных, непреципитирующих антител неспе-
цифическая фаза отсутствует.
Визуально образование комплекса антиген
антитело сопровожда-
ется двумя основными феноменами
агглютинацией (объединение ком-
плексов антиген
антитело при поливалентности и корпускулярности
антигена, что приводит в последующем к образованию плотного осадка)
и преципитацией (укрупнение комплексов антиген
антитело в случае во-
дорастворимости и поливалентности антигена)
.1).
Условия эффективного протекания серологичеких реакций
Наличие стандартных сертифицированных диагностикумов либо
диагностической антисыворотки.
Эквивалентное соотношение компонентов реакции
Присутствие электролита в среде
Поддержание оптимальной температуры и
среды.
обнаружения антител в исследуемом образце
из двух компо-
нентов реакции (антитело, антиген) неизвестными являются антитела.
Поэтому такое исследование требует постановки реакции с заведомо из-
вестными антигенами (диагностикумом)
Рис.1 Схема реакции агглютинации:а
неполное (моновалентное) антитело; в
В случаеу
становленияспецифичности антигена
необходима по-
становка реакции с заведомо известными иммунными сыворотками(ди-
агностические сыворотки)
Иммунные диагностические сыворотки
Иммунные сыворотки получают путем многократного введения жи-
вотным в нарастающих дозах убитых или живых микроорганизмов, про-
дуктов их распада, обезвреженных или нативных токсинов. Иммунные
диагностические сыворотки должны содержать антитела в высоком титре
и быть строго специфичными.
Используют нативные
неадсорбированные
и адсорбированные ди-
агностические иммунные сыворотки.
Неадсорбированные
диагностические сыворотки обладают высокими
титрами антител, но способны давать групповые (перекрестные) реакции.
Для удаления из сывороток перекрестно реагирующих антител при-
меняют различные варианты их истощения (адсорбции).
Адсорбирован-
сыворотки отличаются строгой специфичностью действия, но, как
правило, титр антител в них низкий
от 1:40 до 1:320. Существуют раз-
личные варианты истощения (адсорбции) иммунных сывороток. Одним
из эффективных приемов истощения является добавление к поливалетной
иммунной сыворотке растворенных антигенов, нейтрализующих антите-
ла, ответственных за перекрестные реакции
Адсорбированные таким об-
разом сыворотки применяют чаще всего в реакции преципитации и в ре-
акции агглютинации. Однако сыворотки, истощенные простым добавле-
нием гетерологического антигена, непригодны для использования в ре-
акции связывания комплемента
Для этой цели можно использовать ме-
тод истощения сывороток размельченными тканями, фиксированными
ным раствором формалина или спиртом.Существует также метод
«блокирования» побочных антигенов. Сущность этого метода заключает-
ся в том, что животных иммунизируют экстрактами, предварительно об-
работанными иммунными сыворотками, полученными к тем антигенам,
образование антител против которых нежелательно.
Классификация диагностических иммунных сывороток
Агглютинирующие
Применяются для обнаружения
антигенов микроорганизмов
Преципицирующие
Предназначены для выявления
антигенов в исследуемом мате-
По феномену
в серологиче-
ском методе
Препараты антител
Используются в иммунохимиче-
Антивирусные
Употребляются для типирования
вирусов в реакциях нейтрализа-
ции, торможения гемагглютина-
ции и гемадсорбции
Антибактериальные
Применяютсядля обнаружения
антигенов микроорганизмов
По направлен-
ности (по обна-
ружению анти-
тел/антигенов)
Антитоксические
Нейтрализующие токсины
Принцип взаимодействия антиген
антитело может быть использо-
ван в качестве
теста нейтрализации
для идентификации бактериальных
экзотоксинов и вирусов. Данный тест разработан в двух вариантах:
invivo
invitro
Область
Используется в диагностике инфекци-
онных болезней, в патогенезе которых
особое значение имеет экзотоксин.
Предназначен для идентификации выде-
ленного вируса, определения наличия
антител в сыворотке крови больных и
переболевших животных и т.д.
Принцип метода
Заключается в способности нейтрали-
зующих антител иммунных сывороток
подавлять свойства экзотоксина
Схема метода
В исследовательской и диагностической практике применяют серо-
логические реакции, основанные на прямом взаимодействии антигена с
антителом (агглютинация, преципитация)
и опосредованные реакции
(реакции непрямой гемагглютинации, реакция связывания комплемента),
а также реакции с использованием меченных антител или антигенов
(ИФА, РИА, метод флюоресцирующих антител).
А.А. Основы иммунологии / А.А.Ярилин.
М.: Меди-
1999. – 501
Р.М. Иммунология / Р.М. Хаитов.
М.: Медицина,
2000.– 298
3.Klaus,G.G.B. Lymphotyces. A practical approach / G.G.B. Klaus.–
Oxford, 1990. – 456
О.Е. Лабораторная иммунология / О.Е.Вязов.
.:
, 1970.–278
Г. Иммунологические методы / Г.Фримель.
М.
дицина, 1987.
–322
Р.М. Иммуномодуляторы и некоторые аспекты их клиниче-
ского применения / Р.М.Хаитов, Б.В.Пинегин // Клиническая иммуно-
–1996.–
Р.М.Методические указания по изучению иммунотроп-
ной активности фармакологических веществ / Р.М.Хаитов, И.С.Гущин,
Б.В.Пинегин.
М.: Медицина,
Никитин,В.М. Справочник методов иммунологии.
Методические рекомендации по экспериментальному (доклиниче-
скому) испытанию иммуномодулирующего действия фармакологических
средств /М.П.Потапнев, Л.Г.Борткевич, Д.В.Печковский
и др.
]. –
1999. –30
9.Hudson,L. Practical Immunology / L.Hudson, F.C.Hay.–London:
Oxford, 1989. – 507
В.М. Практикум по вирусологии / В.М.Жавненко,
В.И.Науменков, В.Н.Алешкевич.
М.: Дизайн ПРО,
1998. –
11.Julius, M. Atlas of immunology / M.Julius, B.A.Cruse.– L.: Taylor
and Francis, 2004.– 1567 p.
Романовская
Татьяна Ренольдовна
Харламова
Дарья Борисовна
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ИММУНОЛОГИЯ
С. О. Сараева, О.А.Кучинский
С.О.Сараева
А.Н.Мигиц
учреждение образования «Международный государственный
экологический университет имени А.Д.Сахарова»
ЛИ № 02330/0131580 от 28.07.2005г.
Республика Беларусь, 220070, г.Минск, ул.Долгобродская,

Приложенные файлы

  • pdf 8897510
    Размер файла: 415 kB Загрузок: 1

Добавить комментарий