Занятие № 09 Генетика, фаги (2017-2018 гг)


Чтобы посмотреть этот PDF файл с форматированием и разметкой, скачайте его и откройте на своем компьютере.
ЗАНЯТИЕ
9


Тема:


ГЕНЕТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ.

МОЛЕКУЛЯРНО
-
БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В КЛИНИЧЕСКОЙ ПРАКТИКЕ

БАКТЕРИОФАГИ
.


ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БАКТЕРИОФАГОВ.



Цель занятия:
И
зучить фенотипическую и генотипическую изменчивость
микроорганизмов, познакомиться с классификацией мутаций
бактерий, оценить последствия изменчивости для бактериальных
клеток
.
И
зучить явления трансформации, коньюгации и
трансдукции в бактериальных клетках; оценить роль умеренного
бактериофага в переносе ге
нетической информации, определить
роль внехромосомных генетических элементов для бактерий,
познакомиться с молекулярно
-
генетическими исследованиями



И
зучить строение и свойства вирулентных и умеренных
бактериофагов, их взаимодействие с бактериальной
клеткой,
освоить качественные и количественные методы определения
фагов
.


План занятия

(вопросы для обсуждения)
:


1.

Организация генетического материала бактерий. Репликация ДНК. Генотип и
фенотип.

2.

Изменчивость микроорганизмов и ее виды.

3.

Модификации у
бактерий.

4.

Мутации у бактерий. Отличие мутаций от других видов изменчивости
микроорганизмов. Классификация мутаций по происхождению,
молекулярным механизмам и последствиям для бактериальной клетки.

5.

Практическое
использование учения о мутациях.

6.

Рекомбинация


обмен генетической информацией.

7.

Трансформация, ее механизм, основные этапы.

8.

Коньюгация. Роль полового фактора.
F
+
,
F
־
,
Hfr
-
клетки.

9.

Трансдукция, ее механизм. Роль умеренного бактериофага.

10.

Внехромосомные генетические структуры: строение, классификация, фун
кции
(плазмиды, транспозаны,
Is
-
последовательности).

11.

Молекулярно
-
биологические методы исследований в клинической практике

(ПЦР, иммуноблотинг и др.)

12.

Медицинская биотехнология.

13.

Генетическая инженерия.
Препараты медицинского и ветеринарного
назначения

полеченные методом генной инженерии.


2

14.

Строение и свойства бактериофага.

15.

Вирулентные и умеренные фаги. Их отличия, типы взаимодействия с
микробной клеткой.

16.

Взаимодействие вирулентного фага с бактериальной клеткой.

17.

Умеренный бактериофаг. Явление лизогении и
фаговой конверсии.

18.

Применение бактериофага в практической медицине.

19.

Качественные и количественные методы определения фагов. Методы
выделения фага из объектов окружающей среды.

20.

Фаготипирование бактерий
.



Оформление протокола лабораторного занятия
(выполнить дома)

1.

Вклеить
или нарисовать

рис 5.4 из учебника А.А. Воробьева
отражающий
процессы трансформации, трансдукции и конъюгации
(
на схемах имеются 2
ошибки, определить

их
!!!
)

стр. 111

2.

Записать после схемы понятия:

-

конъюгация
;

-

трансдукция;

-

трансформация;

3.


Кратко законспектировать методику ПЦР. Применение (См Атлас Воробьёва
и доп.

материал).


4.

Нарисовать бактериофаги, виды б/фагов, взаимодействие с бактериальной
клеткой (рис.
9.6
,
9.7
, 9.8
)

5.

Записать методику постановки фаготипирования
, титрования фага по
Аппельману, Грациа, метод Отто (принцип) и оставить место для фото
демонстрационного посева и записи учета результата; для записи учета
результата титрования фага по Аппельману нарисовать таблицу
9.2



Задания для выполнения лаборатор
ной работы
.

1.

Изучить демонстрационные посевы, зафиксировать их (сфотографировать или
нарисовать)
.

2.

П
о каче
ственным методам

изучения бактериофагов

сделать вывод. П
о
количественному методу
Аппельмана
учесть результат и
дать заключение.












3

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЙ МАТЕРИАЛ


ГЕНЕТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ




Опыт по и
зуч
ению

феномен
а

роения
Proteus

mirabilis

на питательном агаре и на агаре
с 1% сухой желчью в чашках Петри.

Выявление фенотипической изменчивости можно провести в опыте с феноменом роения у
Proteus

mirabilis
. Сначала изучают колонии бактерий рода
Proteus
, выросшие на питательном агаре
в чашке Петри через 24 ч после посева разведенной культуры. Отмечают, что все колонии протея
окружены «зоной роения»

(рис 9.1)
. Пересевают колонии петлей на пов
ерхность агара с 1%
желчью в чашках Петри и инкубируют при 37
0
С 18
-
24 ч. Все колонии протея, выросшие на
питательном агаре с желчью, не имеют «зон роения». Вновь пересевают колонию в чашку Петри с
питательным агаром и инкубируют при 37
0
С 18
-
24 ч. Наблюдают
, что все колонии, выросшие на
питательном агаре, окружены «зоной роения».

Изменение фенотипа протея на питательной среде с желчью (утрату роения) следует
считать модификацией, т.к. налицо все три ее отличительных признака:
определенность

(связь
отсутствия роения с определенным фактором


желчью),
общность изменений

(утрата роения
наблюдается у всех колоний популяции),
обратимость

(при отсутствии желчи в питательной
среде восстанавливается исходный фенотип).









Рис.
9.
1. Феномен роения
Proteus


mirabilis

на чашке Петри с МПА


Рис.
9.
2. Феномен роения отсутствует
на чашке Петри с МПА и 1% желчью



2.
Опыт по в
ыяв
лению

бактерий

мутантов и доказа
тельство спонтанности

мутаций
тестом перераспределения.

В две чашки Петри с питательным агаром вносят по 0,1 мл суточной бульонной культуры
E
.
Coli

М
-
17

(посевная доза 1×10
8

бактерий) и равномерно распределяют шпателем по поверхности
питательной среды. Через 6 часов инкубации при 37
0
С в одной из чашек перераспре
деляют шпателем

4

популяцию бактерий (микроколонии) по поверхности питательной среды, а другую чашку оставляют
нетронутой. Выросшие колонии через 24 ч пересевают из каждой чашки методом отпечатков с
помощью штампа


репликатора на поверхность питательного аг
ара с рифампицином (100 мкг/мл) в
отдельные чашки Петри и инкубируют при 37
0
С. Через 24 ч учитывают результат: на поверхности
среды с рифампицином в чашке без перераспределения выросли единичные колонии
рифампицинрезистентных мутантов; в чашке с перераспре
делением посевов выросли более
многочисленные (в десятки
-
сотни раз) колонии антибиотикоустойчивых мутантов.

Перераспределение бактерий шпателем по поверхности питательной среды без антибиотика
не оказывает влияния на число бактерий. Если допустить, что ант
ибиотикоустойчивые мутанты
возникают в результате индукции антибиотиком, то после перераспределения и без него на
питательной среде с антибиотиком должно вырасти одинаковое число колоний
антибиотикоустойчивых мутантов. Если же антибиотикоустойчивые мутанты

возникают спонтанно и
в отсутствии антибиотика, то результат будет иной. Уже в первой инкубации (через 6 часов) на среде
без антибиотика на чашках появляются микроколонии антибиотикоустойчивых клеток
-
мутантов.
Благодаря перераспределению бактерии
-
мутанты
из этих микроколоний распространяются по всей
поверхности среды и после посева отпечатками на среду с антибиотиками дадут начало
многочисленным колониям мутантов, в то время как отпечатки с чашки без перераспределения
выявляют только небольшое число колони
й, соответственно исходным микроколониям мутантов.
Полученный в данном опыте результат доказывает, что антибиотикоустойчивые мутанты возникли
спонтанно до контакта бактерий с селективным агентом рифампицином.




3
.
О
пыт по трансформации бактерий:

1)
сделать смыв культуры сенной палочки (ауксотрофный штамм,
нуждающийся в треонине) и разлить по 0,5 мл в две стерильные пробирки;

2) в первую пробирку добавить о,5 мл раствора ДНК прототрофного штамма,
во вторую


0,5 мл физиологического раствора, поставить

в термостат на 30 мин;

3) произвести посев (по 0,1 мл) на чашки с минимальной средой;

4) по демонстрационным посевам учесть рост микробов, записать результат.

Ауксотрофные штаммы микроорганизмов, в отличие от прототрофных,
требуют наличия определенных пит
ательных веществ в среде, поскольку сами их
синтезировать не могут. На минимальной питательной среде они не растут.

На питательной среде, где сделан посев сенной палочки или ДНК, роста колоний не будет. В
третьем секторе, если произошла трансформация и ба
ктерии получили
фрагмент ДНК с информацией о ферменте триптофансинтетазе,
произойдет рост микроорганизмов.


4
.
О
пыт по коньюгации бактерий:

1) сделать смыв культур
E
.
coli

тиминзависимого штамма (
Hfr
-
клетки)
и штамма
E
.
coli

(
F
־
), нуждающегося в лейцине;

2) по 0,5 мл суспензии каждого штамма смешать в отдельной
пробирке и поставить в термостат на 30 мин;

3) произвести высев препарата на чашку с минимальной средой;

4) по демонстрационным посевам учесть и записать результаты
опыта.

Посев исходных штаммов микроорганизмов на минимальную
питательную среду роста не дает, так как в ней нет необходимых
аминокислот. Если произошла коньюгация, то при посеве смеси вырастут
колонии кишечных палочек, получивших от
Hfr
-
клеток фрагмент ДНК,
ответ
ственный за синтез лейцина и треонина.

5
.
О
пыт по выявлению
Col
-
плазмид
.

Исследования проводят методом отсроченного антагонизма по Фредерику. Испытуемые
культуры (например, шигеллы Зоне) засевают уколом в 1,5% мясо
-
пептонный

агар по 4
-
5 штаммов
на одну чашку Петри. После инкубирования в течение 24 ч при 37
о
С выросшие макроколонии

5

стерилизуют парами хлороформа. С этой целью чашку размещают вверх дном и на внутреннюю
поверхность крышки наносят 4
-
6 капель хлороформа. Через 30 ми
н хлороформ удаляют, выдерживая
чашки с открытой крышкой 15
-
20 мин. Затем поверхность агара заливают слоем расплавленного и
охлажденного до 48
о
С 0,7 % мясо
-
пептонного агара (5 мл), предварительно смешанного с 0,1% мл
шестичасовой бульонной культуры индикат
орного штамма (например,
E
.
coli

W
1655). После
суточной инкубации при 37
о
С учитывают результат. Бактерии имеют
Col
-
плазмиду (продуцируют
колицин), если вокруг их макроколоний образовались зоны подавления роста индикаторной
культуры на фоне ее роста сплошны
м газоном в остальных участках среды. Идентификацию вида
Col
-
плазмид осуществляют этим же методом, используя коллекцию эталонных индикаторных
культур с известной резистентностью или чувствительностью к колицинам.




Молекулярно
-
генетический метод

позволяет осуществлять раннюю и более полную
диагностику различных заболеваний, своевременно проводить дифференциальную диагностику и
осуществлять контроль эффективности терапии.

В настоящее время имеется два направления генетической диагностики:

1
-

ги
бридизационный анализ нуклеиновых кислот

2
-

диагностика с использованием амплификации (полимеразная цепная реакция).

Гибридизационный анализ

использует способность нуклеиновых кислот в определенных
условиях образовывать специфические комплексы с нуклеино
выми же кислотами, имеющими
комплементарные к ним последовательности. Метод детекции инфекционных возбудителей ДНК
-
гибридизацией оказался крайне трудоемким, длительным и дорогостоящим.

Амплификация


многократное копирование определенного участка нуклеиновых кислот
(ДНК, РНК через обратную
транскриптазу) в процессе
повторяющихся температурных циклов.

Существует большое количество
методов амплификации нуклеиновых
кислот. В настоящее время предложено
подразделить все методы амплификации
,
в зависимости от технологии на три

основные категории.

1.

Метод ПЦР,
самоподдерживающаяся реакция
репликации последовательностей (3SR),
амплификация с вытеснением цепи
(АВЦ).


Рис 9.3. Схема ПЦР
-

амплификация


2.

Амплификация с
использованием QB
-
peпликазы, лигазная цепная реакция (ЛЦР).

3
. Амплификация сигнала, при которой усиление сигнала каждой молекулы зонда происходит
за счет использования сложных зондов, или технологии разветвленной ДНК.

Все методы амплификац
ии могут быть разделены
в зависимости от изменения
температурных режимов

на:

1) методы амплификации с циклической сменой температурных параметров: (методы ПЦР,
ЛЦР и их модификации);

2) изотермальные методы амплификации нуклеиновых кислот (метод изотермаль
ной
транскрипционной амплификации (TAS), самоподдерживающая репликация последовательностей
(3SR, NASBA), амплификация с вытеснением цепи (АВЦ), амплификация с использованием QB
-
репликазы.

Этапы амплификации
:


6

1. Подготовка исследуемого образца в целях выдел
ения ДНК (РНК) из клеток.

2. Непосредственная амплификация выделенных участков (копий) ДНК (РНК).

3. Детекция продуктов, полученных на втором этапе.

Для детектирования микроорганизмов наиболее часто используется цепная полимеразная
реакция
-

ПЦР (PCR


polymerase chain reaction)

Полимеразная цепная реакция



это метод, имитирующий естественную репликацию ДНК,
позволяющий обнаружить и многократно копировать с помощью термофильной ДНК
-
полимеразы
определенный фрагмент ДНК. Суть метода заключается в многокра
тном копировании
(амплификации) в пробирке определенных участков ДНК в процессе повторяющихся температурных
циклов. На каждом цикле амплификации синтезированные ранее фрагменты вновь копируются ДНК
-
полимеразой. Благодаря этому происходит многократное увели
чение количества специфических
фрагментов ДНК в миллионы раз, что значительно упрощает дальнейший анализ.

Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты:

1.

Анализируемый образец



это подготовленный к внесению в реакционную смесь пр
епарат,
служащий мишенью для последующего многократного копирования (например, кровь,
потенциально содержащая ДНК микроорганизмов). При отсутствии ДНК
-
мишени специфический
продукт амплификации не образуется.

2.

Два праймера

(соответствуют тому возбудителю
, который хотим найти). Праймеры


синтетические олигонуклеотиды, состоящие из 15
-
30 нуклеотидов, комплементарных сайтам
(участкам) на идентифициуемой матричной ДНК. Тем самым от исследователя зависит, какой
участок генома будет копироваться. От правильн
ости подбора праймеров зависит уровень
амплификации ДНК.

3.

Термостабильная ДНК
-
полимераза



фермент, который катализирует реакцию
полимеризации ДНК. Полимераза для использования в ПЦР должна сохранять активность при
высокой температуре длительное время
, поэтому используют ферменты, выделенные из термофилов


Thermus Aquaticus (Taq
-
полимераза), Pyrococcus furiosus (Pfu
-
полимераза), Pyrococcus woesei (Pwo
-
полимераза) и другие. Taq
-
полимераза выделена из водорослей Thermus Aquaticus, живущих в
горячих исто
чниках, обладает ДНК
-
полимеразной активностью. Несколько лет назад удалось
получить из бактерий Thermus Thermophilis Tth
-
ДНК
-
полимеразу, которая выполняет целый ряд
функций, в том числе обеспечивает репарацию и репликацию ДНК, обладает
обратнотранскриптазн
ой активностью, позволяя получать из РНК комплементарную ДНК.

4.

Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты

(dATP, dGTP, dCTP, dTTP)
-

«строительный материал»,
используемый Taq
-
полимеразой для синтеза второй цепи ДНК.

5.

Ионы Mg2
+
,

необходимые для работы полимеразы.

6.

Буферный раствор
, обеспечивающий необходимые условия реакции


рН, ионную силу
раствора. Содержит соли, бычий сывороточный альбумин.

7.

Положительный контроль



образец ДНК выделяемой биологической системы.



Оборудование.

Важным фактором
воспроизводимости реакции амплификации является
приборное обеспечение. Основным прибором для проведения ПЦР является
амплификатор

(термоциклер), представляющий собой аппарат, в гнезда которого устанавливаются специальные
амплификационные пробирки, изготовл
енные из особого термопроводимого пластика, с
реакционной смесью или предметные стекла с образцами тканей. Различными фирмами выпускается
большое количество разнообразных
моделей амплификаторов.



Модели отличаются друг от друга системами охлаждения (водяное, воздушное, фреоном и
более надежное и современное


на полупроводниковых кристаллах), способами обогрева (передача
тепла через пробирки с жидкостью и воздушная передача тепла в микроколориметр
для обогрева
срезов тканей, мазков и т.д.), объемом памяти при программировании, режимами регулирования
смены температуры (по матрице, активное), количеством платформ (от 1 до 4). Последние модели
осуществляют амплификацию по одной и той же программе на не
скольких платформах сразу, что
позволяет увеличивать число анализируемых одновременно проб или проводить амплификацию на

7

разных платформах по нескольким разным программам для одновременного анализа проб на наличие
нескольких типов возбудителей.

Если в анал
изируемом образце присутствует искомая ДНК, то в ходе реакции амплификации с
ней происходит ряд процессов, обеспечиваемых определенными температурными циклами.
Параметры температурного режима играют исключительно важную роль для успешного проведения
реакци
и.

Описанный метод «классической» направленной полимеразной цепной реакции, который
используется в
тест
-
системах первого поколения
, претерпевает в настоящее время значительные
изменения, связанные с разработкой и внедрением различных тест
-
систем (в том чи
сле и
отечественных) для ПЦР
-
диагностики
второго

(применяемых для количественного анализа ДНК
-
РНК),
и третьего

(«сухих» тест
-
систем, находящихся в стадии разработки)
поколений
, а также
различных модификаций ПЦР (лонг
-
ПЦР, гнездная ПЦР, РТ
-
ПЦР, LIPA
-
ПЦР
-
тех
нология, ПЦР in
situ, мультиплексная ПЦР) и альтернативных методов амплификации нуклеиновых кислот.

Основное отличие тест
-
систем ПЦР
второго поколения

(Ген
-
гем
-
тест НС) от первого


наличие внутреннего стандарта
, который представляет собой ДНК или РНК выяв
ляемого
возбудителя в концентрации от 10 до 100 молекул, которая амплифицируется одновременно с
фрагментом гена инфекционного агента, но детектируется при этом в виде отдельных сигналов. При
этом гарантируется достоверность «отрицательного» результата ПЦР
-
определения инфекционного
агента и своевременного выявления ложноположительных результатов. Наличие внутреннего
стандарта при использовании системы видеокомпьютерной детекции позволяет рассчитать
концентрацию возбудителя в пробе, т. е. оценить нагрузку (ви
русную, бактериальную или иной
природы)


количество возбудителя в единице биологического материала. Повысить
чувствительность и специфичность тест
-
системы второго поколения можно при использовании
модификации ПЦР, такой как nested
-
PCR («гнездная» ПЦР) с и
спользованием внутреннего
стандарта, что нашло применение в тест
-
системах второго поколения, рекомендованных для
диагностики ВИЧ
-
инфекции.

Для удобства транспортировки и хранения систем генотестирования, а также для
обеспечения стандартности

проведения ана
лизов произведена разработка «сухих» тест
-
систем
третьего поколения.

Их несомненными преимуществами по сравнению с аналогичными «жидкими»
тест
-
системами являются возможность хранения и транспортировки при любой температуре (от
-
40°С до +30°С), ускорение и
упрощение работы исполнителя. При этом тест
-
системы третьего
поколения позволяют использовать все преимущества тест
-
систем первого и второго поколения в
различных модификациях.

Мультиплексная

ПЦР

(multi
-
PCR


multi
-
polymerase chain reaction).
Например, позволяет
проводить ПЦР с двумя
-
четырьмя и более не перекрещивающимися праймерами нескольких
возбудителей. Это дает возможность определить в одной пробе нуклеиновые кислоты сразу
нескольких возбудителей, что особенно актуально, так как часто при
диагностике обнаруживаются
смешанные формы инфицирования.

В последнее время для выявления ДНК
-
мишени используются
альтернативные методы
, не
уступающие по чувствительности и специфичности методикам, основанным на методе ПЦР, но
существенно более быстрые по

времени выполнения. Принципы этих методов несколько отличны от
классического варианта ПЦР.


Детекция продуктов амплификации методом гель
-
электрофореза
. Выявление или детекцию наработанного
продукта ПЦР (амплификата) чаще всего проводят при
помощи его эле
ктрофореза в 2
-
3% геле агарозы или
полиакриламидном геле (ПААГ), содержащем бромид
этидия (специфический интеркалирующий флуоресцентный
ДНК(РНК)
-
краситель). Поглощая ультрафиолетовый свет с
максимальной длиной волны 256 нм, бромид этидия,
связанный с участ
ком ДНК (ампликоном), способен в
соответствии с правилом Стокса флюоресцировать, что
регистрируется в видимом спектре (610
-
620 нм) в виде

8

оранжевой полоски. Получаемые результаты электрофореза ампликонов оценивают в проходящем
ультрафиолетовом свете на спе
циальных приборах


трансиллюминаторах и сравнивают с
положительным контролем (ДНК выявляемого микроорганизма или известная ДНК). При
положительном результате

Рис 9.
4
. Схема ПЦР


детекция


светящаяся полоска ДНК находится на том же уровне, что и положительный контроль
вследствие одинаковой молекулярной массы наработанных ампликонов в контроле и изучаемом
положительном образце.



Методы повышения количество амплифицированной ДНК

(усилить ПЦР
-
сигнал) при
низкой концентрации ДНК
-
матрицы (вируса, бактерии, мутантных и иных генов):

1
-

усиление денатурации ДНК
-
матрицы: денатурировать ДНК при +94
о
-
99°С до начала ПЦР
или удлинить начальную денатурацию до 3
-
5 мин.

2
-

увеличение специфичности прайме
ров: при длине 20
-
30 пар содержание Г + Ц должно
составлять около 50%.

3
-

применение «горячего старта»


прогревание пробирок с ПЦР
-
амплификационной смесью
(без фермента и магния) при температуре +95°С в течение 3
-
5 мин (предупреждение амплификации
неспец
ифических ДНК
-
фрагментов вследствие низкотемпературного неспецифического спаривания
праймеров). Суть подхода, получившего название, «горячий старт» (Hot
-
start), состоит в
предотвращении возможности начала реакции до момента достижения в пробирке условий,
обеспечивающих специфический отжиг.

4
-

применение метода «гнездной» амплификации. Суть его заключается в последовательном
использовании двух пар праймеров


внешней и внутренней. После использования первой пары
праймеров продукт амплификации переносят в д
ругую пробирку с внутренней парой праймеров.
Иногда вместо «гнездной» амплификации используют процесс реамплификации. В этом случае
проводят дополнительный раунд амплификации, в котором используют прежнюю пару праймеров, а
в качестве ДНК
-
мишени


продукт п
ервой реакции амплификации. Такая схема постановки
амплификации более трудоемка и требует особенно тщательного обустройства лабораторных
помещений, позволяющих гарантированно избегать контаминации продуктами реакции после
использования внешней пары праймер
ов. К «гнездной» амплификации или реамплификации
прибегают лишь в особых случаях, так как современные ПЦР
-
тест
-
системы позволяют добиваться
тех же результатов иными средствами.

5
-

увеличение продолжительности ПЦР до 40 циклов.

6
-

применение более чувстви
тельных методов детекции амплифицированной ДНК
(компьютерная видеодетекция гельэлектрофореграмм; дот
-
гибридизация и использование меченных
флуорохромами, лантаноидами, химическими веществами, вызывающими хемилюминесценцию,
моноклональных антител).


Потенциально высокая чувствительность полимеразной цепной реакции делает совершенно
необходимым особенно тщательное устройство ПЦР
-
лаборатории, это связано с наиболее острой
проблемой метода


контаминацией.

Контаминация



попадание из внешней среды в реакционную смесь молекул ДНК, способных
служить мишенями в реакции амплификации и давать ложноположительные результаты. Такими
мишенями могут быть продукты реакции, попадающие во внешнюю среду на этапе электрофореза из
проб
ирок, в которых успешно прошла амплификация, либо специфическая ДНК из образцов на этапе
пробоподготовки.

Для уверенности в отсутствии контаминации необходимо каждую серию экспериментов
сопровождать отрицательными контролями.

Преимущества ПЦР:

1. Полимера
зная цепная реакция в настоящее время является наиболее совершенным
диагностическим методом, позволяющим выявлять единичные клетки возбудителей многих
инфекционных заболеваний за счет многократного увеличения количества копий тестируемых
специфических посл
едовательностей ДНК.


9

2. Тест
-
системы, основанные на принципе амплификации ДНК, позволяют обнаруживать
патогенные для человека бактерии и вирусы даже в тех случаях, когда другими способами
(иммунологическим, бактериологическим, микроскопическим) их выявлени
е невозможно. Это
преимущество достигается за счет высокой чувствительности ПЦР
-
системы, которая составляет
около 10 бактериальных клеток, в то время как чувствительность других тестов колеблется в
пределах 103
-
106 клеток.

3. Тест
-
системы на основе ПЦР эфф
ективны при диагностике трудно культивируемых, не
культивируемых и персистирующих форм патогенных бактерий. ПЦР
-
диагностикумы позволяют
избежать основной трудности, связанной с неспособностью таких бактерий размножаться в
лабораторных условиях. При ПЦР
-

д
иагностике размножению подвергается не бактерия, а только ее
ДНК, причем не вся молекула ДНК, а только определенный фрагмент, являющийся маркером
данного возбудителя.

4. ПЦР
-
диагностикумы, в отличие от иммунологических тест
-
систем, позволяют избежать
пробл
ем, связанных с перекрестно
-
реагирующими антигенами, тем самым обеспечивая абсолютную
специфичность.

5. Определение можно проводить непосредственно в клиническом материале (кровь,
сыворотка, лаважные массы, мокрота, слюна, желудочный сок, биопсийный матери
ал, мазки, смывы)
и в материале, получаемом из объектов внешней среды (вода, почва).

ПЦР длительное время являлась лишь качественным методом диагностики, но сегодня
существует
количественная ПЦР в реальном времени

(Quantitative real
-
time PCR). В этом метод
е
используют флуоресцентно меченые реагенты для точного измерения количества продукта реакции
по мере его накопления.


Устройство ПЦР
-
лаборатории.
ПЦР
-
лаборатория должна быть разделена на три зоны по
числу технологических операций:

1
-

зона подготовки реак
ционной смеси («чистая зона»);

2
-

зона пробоподготовки;

3
-

электрофоретическая комната.



Все три зоны должны быть изолированными комнатами, снабженными предбоксниками.
Полезно иметь устройство фильтрации воздуха. Если первую и вторую зоны, в крайнем случа
е,
допускается объединить (при наличии специальных боксов), то комната для электрофореза
должна размещаться как можно дальше от двух других зон (другой этаж, другое здание) и
иметь не связанную с другими зонами систему вентиляции. Это является одним из наи
более
важных требований при организации ПЦР
-
лаборатории.



Необходимо предусмотреть отдельные помещения для переодевания и хранения верхней
одежды, приема пищи персоналом, складское помещение для лабораторных материалов.



Все производственные комнаты должны б
ыть снабжены коротковолновыми УФ
-
лампами.
Перемещение пробирок, штативов и прочего должно производиться только
в одном
направлении
, при этом потоки не должны пересекаться.



Клинический материал, поступивший в лабораторию, должен быть как можно быстрее
обраб
отан в комнате пробоподготовки. В эту же комнату должны поступать пробирки с
реакционной смесью из «чистой зоны» для внесения в них препаратов ДНК. После этого
пробирки помещают в амплификатор и по окончании термоциклирования, не открывая крышек,
переносят

в комнату для электрофореза.



В идеале все операции (пробоподготовка, подготовка реакционной смеси, электрофорез)
должны выполнять разные люди.

При работе необходимо соблюдать такие же строгие меры предосторожности, как и
используемые в микробиологической
лаборатории.



Для обработки клинических образцов должны быть установлены ламинарные шкафы,
обеспечивающие вертикальный поток воздуха для безопасности персонала при работе с
инфекционным материалом, а также предусматривающие возможность работы без ламинарног
о
потока и длительное облучение внутренних поверхностей бокса УФ
-
светом.



Инактивацию биологического материала проводят в автоклаве в течение 1 ч при 1,5 атм.
Допускается использование настольных автоклавов.


10



Запрещается внесение пробирок с положительными ко
нтролями или клиническими образцами
как до, так и после обработки, в комнату подготовки реакционной смеси («чистую зону»).



Все производственные комнаты должны быть снабжены необходимым оборудованием и
расходными материалами, в том числе халатами, закреплен
ными за соответствующими
помещениями.



Классическая ПЦР
-
лаборатория

А. Зона приема, регистрации и первичной обработки материала

Б. Зона выделения ДНК/РНК

В. Зона приготовления реакционной смеси и проведения ПЦР

Г. Зона детекции результатов ПЦР

Д. Зона
дезинфекции материалов


Рис 9.
5
. Схема ПЦР
-
лаборатории
















11

БАКТЕРИ
О
ФАГИ.



Рис
9.6

Взаимодействие бактериофага

Рис 9.7
. Развитие умеренного фага

с оболочкой бактерии


С

развитием электронной микроскопии появилась возможность классифицировать фаги
по

морфологии. Дэвид Бредли в

1967 году предложил разделить фаги на

шесть морфологич
еских
групп: с

A по

F

(табл.

9.1
). Вторая используемая классификация, предложенная А.С. Тихо
ненко
в

1968, объединяет фаги групп

D и

E в

одну (табл.

9.1
). Микрофотографии фагов, относящихся
к

разным морфогруппам, представлены на

рисунках
9.9

(
https://biomo
lecula.ru/articles/pozhirateli
-
bakterii
-
ubiitsy
-
v
-
roli
-
spasitelei
)


Классификация бактериофагов по морфологическим признакам

Таблица
9
.
1
.



12


Рисунок

9.8
. Схематическое изображение фаговых м
орфогрупп по

Тихоненко (1968).



Рисунок

9.9
. Различные
морфоварианты бактериофагов. Микрофотогр
афии получены автором
статьи.

(https://biomolecula.ru/articles/pozhirateli
-
bakterii
-
ubiitsy
-
v
-
roli
-
spasitelei)


Методы изучения вирулентных фагов

Подготовка материала

Материалом, из которого выделяют фаг
, обычно
являются фильтраты, полученные с помощью
бактериальных фильтров из объектов внешней среды, органов и выделений человека и животных,
культур микроорганизмов и т. д.

Перед фильтрацией исследуемый материал подготавливают следующим образом:

Жидкости

(кровь, мо
чу, воду, смывы с предметов и т. п.) освобождают от крупных частиц с
помощью бумажного фильтра или центрифугированием, чтобы они не забили поры бактериального
фильтра.

Вязкий материал

(гной, кал) эмульгируют в изотоническом растворе натрия хлорида или
буль
оне, после чего освобождают от крупных частиц, как описано выше.

Плотный материал

(кусочки органов, пищи и т. п.) предварительно измельчают
-

обычно
растирают в ступке со стерильным кварцевым песком. Вместо песка можно использовать стерильные

13

кончики пастеровских пипеток или битые покровные стекла. Растертый материал тщательно
эмульгируют в изотоническом растворе натрия хлорида или бульоне и освобождают от крупной
взвеси.

Подготовленный материал пропускают через бактериальный фильтр, освобождая

от посторонней
микрофлоры.

Культуры микроорганизмов (известные или изучаемые)
. В работе с фагом применяют 20
-
24
-
часовые культуры, выращенные на агаре, или 2
-
6
-
часовые культуры в жидких средах. Чистоту
культуры устанавливают в мазках, окрашенных фуксином П
фейффера или по Граму. Из культур,
выращенных на скошенном агаре, готовят взвесь. В пробирку с культурой наливают 3
-
5 мл
изотонического раствора натрия хлорида. Вращая пробирку между ладонями, осторожно смывают
культуру с поверхности среды так, чтобы не на
мочить пробку. Взвесь переносят в стерильную
пробирку и разводят изотоническим раствором натрия хлорида 1:10 (0,5 мл взвеси в 4,5 мл
раствора).

При работе с фагом необходима стерильная посуда (градуированные и пастеровские пипетки,
чашки Петри, пробирки, к
олбы, ступки), термостат, фильтровальное устройство, центрифуга,
штативы, прибор для счета колоний.

Внимание! Вся работа с фагом требует соблюдения асептики.

Качественные методы

О наличии фага в том или ином субстрате узнают по лизису чувствительной к нему

микробной
культуры (тест
-
культура).

Обнаружение фага на плотных средах
. Тест
-
культуру засевают "газоном" (см. главу 7) на
поверхность агара в чашке Петри. Посев подсушивают в термостате 30
-
40 мин при открытой
крышке, после чего на него наносят каплю изуча
емого материала. Через несколько минут, когда
жидкость впитается, чашки помещают в термостат на 18
-
20 ч. Если в изучаемом материале есть
фаг, произойдет лизис культуры и на месте, куда была нанесена капля, культура или совсем не
вырастет (сплошной лизис) и
ли образуются отдельные колонии фага.

Обнаружение фага в жидких средах
. В две пробирки с одинаковым количеством бульона
вносят по одной капле культуры, микроба, в отношении которого изучают фаг. В одну из них
добавляют исследуемый фаг или фильтрат материал
а, в котором его определяют. Вторая пробирка
служит контролем роста культуры. Пробирки помещают в термостат на 12
-
20 ч. Учет результатов
производят только при наличии роста культуры в контроле (помутнение среды). Отсутствие
видимого роста или последующее п
росветление среды в пробирке с исследуемым материалом
свидетельствует о присутствии фага. Если содержимое этой пробирки мутное, исследование
необходимо дополнить посевом на плотную среду: помутнение могло произойти от роста
устойчивой к фагу культуры. Толь
ко в том случае, если в посеве на агар фаг не будет обнаружен,
можно сделать вывод, что его нет в изучаемом материале.

Количественные методы

Количественные методы имеют большое значение при проведении многих исследований, в том
числе и фага. Врачу нужно зн
ать активность фага, чтобы правильно установить его дозу при
лечебно
-
профилактическом применении, исследователю
-

чтобы выяснить, как изменяется
активность фага в эксперименте.

Активность фага выражают понятием титр, различая титр фага в жидкой и на
плотной среде.

При исследовании в жидкой среде (по Аппельману) титр фага
-

это наибольшее его разведение
(или наименьшее количество), которое подавляет рост тест
-
культуры в условиях данного опыта.

На плотной среде (титрование по Грациа) титр фага
-

количес
тво частиц (корпускул) фага в 1
мл исходного материала.



14

Титрование фага по Аппельману (в жидкой среде)
. При титровании фага объем и состав
среды, температура, аэрация, количество микробов, пробирки, в которых проводят титрование
(диаметр, конфигурация дна
, толщина стекла), должны быть одинаковыми. Изменяется только
количество фага.

Все компоненты, участвующие в биологических опытах, подлежат обязательному контролю на
правильность их работы.

При титровании фага ставят контроль фага и бульона на стерильность
, контроль культуры
-

на
ее жизнеспособность.

Постановка опыта.

1. В 12 стерильных пробирок наливают по 4,5 мл стерильного бульона.
Уровень жидкости во всех пробирках должен быть одинаковым. Если это не так, значит допущена
ошибка. В этом случае нестандарт
ную пробирку заменяют новой и заново наполняют бульоном.
При разливе бульона пользуются пипетками вместимостью 5
-
10 мл.

2. Пробирки ставят в штатив и нумеруют от 1 до 10, на одной из оставшихся пробирок пишут
"КК" (контроль культуры), на другой
-

"КФ" (кон
троль фага). Все пробирки, в которых проводят
опыт, должны быть надписаны.


3.

В десяти пробирках готовят последовательные десятикратные разведения фага от 10
-
1

до 10
-
10

(табл. 13
.2
). В 1
-
ю пробирку вносят 0,5 мл фага. Такое же количество вносят в пробирку контроля
фага. Сменив пипетку, новой пипеткой тщательно перемешивают содержимое 1
-
й пробирки и
переносят 0,5 мл его во 2
-
ю пробирку; 0,5 мл содержимого 2
-
й пробирки переносят в 3
-
ю

и так далее
до 10
-
й пробирки, меняя каждый раз пипетки. Перемешав содержимое 10
-
й пробирки, 0,5 мл
жидкости из нее выливают в дезинфицирующий раствор. Также поступают с содержимым пробирки
контроля фага. Для разведения фага пользуются пипетками вместимост
ью 1
-
2 мл. Проверяют
уровень жидкости в пробирках. Он должен быть одинаковым.



Схема титрования фага по Аппельману

Таблица
9
.
2
.

Ингредиенты, мл

Пробирки

опыт

контроль

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

культуры

фага

Бульон (МПБ)

4,5

4,5

4,5

4,5

4,5

4,5

4,5

4,5

4,5

4,5

4,5

4,5

Исследуемый фаг

0,5 →

0,5 →

0,5 →

0,5 →

0,5 →

0,5 →

0,5 →

0,5 →

0,5 →

0,5

-

0,5

Культура м/о

0,05

0,05

0,05

0,05

0,05

0,05

0,05

0,05

0,05

0,05

0,05

-


Разведение

10
-
1

10
-
2

10
-
3

10
-
4

10
-
5

10
-
6

10
-
7

10
-
8

10
-
9

10
-
10

-

10
-
1

Пробирки
тщательно встряхивают и инкубируют при 37˚C 18
-
20ч

Результат













Условные обозначения: + рост культуры,
-

отсутствие роста культуры.


Примечание. Стрелки указывают перенос фага из пробирки в пробирку. Из пробирки 10 и из
пробирки контроля фага 0,5 мл выливают в дезинфецирующий раствор.

4. Во все пробирки, кроме пробирки контроля фага, вносят по 1 капле (0,05 мл) взвеси тест
-
культуры. Про
бирки встряхивают. Во всех пробирках, кроме пробирки контроля фага, должна
появиться слегка заметная муть. Если этого не происходит, все операции с нестандартной
пробиркой повторяют вновь.

5. Пробирки помещают в термостат на 18
-
20 ч, после чего учитывают р
езультат титрования.
Учет результатов обязательно начинают с контролей.

При правильной постановке опыта в контроле культуры должно быть размножение бактерий
-

содержимое пробирки становится мутным. Этот контроль позволяет сделать вывод, что взятая в
опыт к
ультура жизнеспособна и что питательная среда обеспечивает ее развитие в данных
условиях опыта. Значит, если в пробирках с фагом культура не выросла, на нее подействовал фаг.

Жидкость в пробирке с контролем фага должна остаться прозрачной. Этот контроль по
зволяет
сделать вывод, что посуда, бульон и фаг стерильны.

При правильных результатах в контролях регистрируют характер изменений в первых десяти
пробирках. Рост культуры в пробирках "опытного" ряда говорит об отсутствии или недостаточном
количестве в них
фага. Устанавливают титр фага, т. е. его наибольшее разведение, в котором

15

произошел лизис культуры (содержимое пробирки прозрачно). Обозначают титр степенью
разведения фага с обратным знаком, что соответствует порядковому номеру пробирки. Например,
если ку
льтура не растет в первых семи пробирках, титр фага равен 10
-
7
.

Титрование фага по Грация (на плотной среде) методом агаровых слоев

позволяет
определить количество частиц фага в титруемом материале. Метод основан на том, что каждая
частица фага дает зону
просветления (лизиса) на чашке с газоном чувствительного к нему
микроба, т. е. образует отдельную колонию.

Постановка опыта. Чашки с 20
-
25 мл МПА покрывают стерильной фильтровальной бумагой и
подсушивают в термостате или под бактерицидной лампой (расстояни
е от лампы не более 2 м).
Титруемый фаг разводят от 10
-
1

до 10
-
10

(как в предыдущем опыте) и по 1 мл переносят в другие
пронумерованные пробирки (соответственно из 1
-
й в 1
-
ю и так далее до 10
-
й), в которые заранее
наливают по 2,5 мл 0,7% МПА, расплавленног
о и остуженного до 45° С. В каждую из этих
пробирок добавляют по 0,1 мл тест
-
культуры. Содержимое пробирок быстро перемешивают (не
дать застыть агару) и выливают на поверхность среды в чашки Петри с номерами,
соответствующими номерам пробирок. Через 30 мин

чашки ставят в термостат.

Учет результатов проводят через 18
-
20 ч. При большой концентрации фага (в первых чашках)
произойдет сплошной лизис культуры. В тех разведениях фага, в которых находилось небольшое
количество частиц фага, появятся изолированные ко
лонии, которые подсчитывают. Чтобы не
ошибиться в счете, каждую учтенную колонию помечают со стороны дна чашки. Аппарат для
счета колоний намного облегчает работу (см. рис. 54). Чтобы установить количество частиц фага в
1 мл фаголизата, пользуются формулой
: n = y×x, где n
-

искомое число; y
-

количество выросших
на чашке колоний фага; x
-

разведение фага в чашке, в которой подсчитаны колонии.

Например, если в чашке с разведением фага 10
-
8

(1:10
8
) выросло 25 колоний, то в 1 мл
исходной жидкости содержится 25
×10
8

или 2,5×10
9
частиц фага.

Более точные результаты получают, если определяют количество частиц фага в исходной
жидкости по нескольким разведениям и вычисляют среднее арифметическое. Например, при
разведении фага 10
-
6

выросло 320 колоний, следовательно, в

1 мл исходной жидкости было
320×10 или 3,2×10
8

частиц фага. При разведении фага 10
-
7

выросло 42 колонии, следовательно, в
исходной жидкости было 4,2×10
8
/мл частиц фага. При разведении фага 10
-
8

выросло 5 колоний,
следовательно, в исходной жидкости было
5×10
8
/мл частиц фага. Сложив величины, полученные
при этих подсчетах и разделив сумму на 3 (количество проведенных подсчетов), устанавливают
число частиц фага в 1 мл титруемого препарата. В нашем примере оно равно 4,1×10
8
.

Подсчитывать колонии лучше всего
на чашках, где выросло не меньше 5 и не больше 50
колоний. В противном случае страдает точность подсчёта. Если на чашке много колоний, чашку
можно разделить на несколько секторов, сосчитать колонии на одном из них и полученную цифру
умножить на количество
секторов.

Как правило, все биологические исследования проводят в трех параллельных опытах. В данном
примере каждое разведение фага одновременно титруют трижды.

Методы выделения фагов

Прямой метод
. Фаг получают и изучают непосредственно в фильтратах исследу
емого
материала. О наличии и активности фага узнают по лизису чувствительной к нему культуры.

Как правило, прямой метод не дает убедительных результатов из
-
за малого количества
содержащегося в фильтрате фага. Для повышения его количества используют методы
обогащения.

Метод обогащения
. Подготовленный фильтрат вносят в 2
-
3
-
часовую бульонную культуру
соответствующих микроорганизмов. Посев инкубируют в термостате. Фаг размножается в клетках

16

культуры и титр его значительно увеличивается. После этого бульон фильт
руют и в фильтрате
определяют свойства и активность фага.

Практическое применение фагов

Применение фагов основано на их строгой специфичности и способности разрушать
микробные клетки или вступать с ними в симбиоз.

Фагопрофилактика и фаготерапия

-

предупреж
дение и лечение инфекций с помощью фагов
основаны на том, что, встречая в организме больного возбудителя болезни, фаг уничтожает его. В
настоящее время фаги широко применяют при лечении и профилактике стафилококковых и
стрептококковых поражений, даже таких
, которые не поддаются действию антибиотиков, а также
холеры, чумы и ряда других инфекций, например инфекций, вызванных кишечной палочкой и
протеем.

Фагодиагностика

включает:


а) идентификацию выделенных культур с помощью известных (диагностических) фагов.
Культура соответствует тому фагу, который ее лизировал. Например, если лизис вызвал холерный
фаг, то это культура холерного вибриона. Строгая специфичность типовых фагов дает

возможность
типировать варианты внутри вида (фаговары). Фаготипирование имеет большое значение в
эпидемиологии, так как позволяет установить источник инфекции и решить ряд других вопросов

(эпидемиологическое маркирование)
;


б) определение неизвестного фаг
а по тест
-
культуре микробов. Если фаг лизирует культуру
возбудителя дизентерии, то это дизентерийный фаг;

в) ускоренный метод диагностики с помощью реакции нарастания титра фага РНТФ не требует
выделения чистой культуры возбудителя. Исследуемый материал (
от больного или из объектов
внешней среды) и индикаторный фаг, титр которого строго установлен, вносят в бульон. После
инкубации в термостате определяют титр фага по Грациа. Увеличение титра (числа корпускул
фага) в 5 раз и более говорит о том, что в иссле
дуемом материале есть соответствующие
возбудители, в которых фаг размножился.

Умеренные фаги широко применяют при решении кардинальных вопросов биологии. С их
помощью изучен генетический код, достигнуты большие успехи в генной инженерии, их
используют для
изучения опухолевого роста, как фактор изменчивости микроорганизмов и в
других исследованиях. Так как лизогенные культуры в отличие от "здоровых" чувствительны к
радиации, они служат для определения надежности защиты космических кораблей от космических
луч
ей: при ненадежной защите профаг переходит в вирулентную форму и лизирует культуру.

Препараты фагов

При производственном получении препаратов фага пользуются хорошо изученными штаммами
микроорганизмов и фагов, которые обычно выращивают в реакторах, что поз
воляет получать
большие количества фаголизата.

Фаги выпускают в жидком виде (ампулы и флаконы), в таблетках и свечах. Таблетки фагов,
предназначенные для применения через рот, покрыты кислотоустойчивой оболочкой,
защищающей фаги от действия соляной кислоты

желудочного сока.

Все препараты фагов подлежат обязательному контролю на отсутствие посторонней флоры,
безвредность и активность (титр), который осуществляется на выпускающем их производстве.
Выборочный контроль производят в Государственном НИИ стандартиз
ации и контроля медицинских
биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича. Выпускаемый фаг снабжен этикеткой, на которой
указано: учреждение, его выпускающее, название фага, серия, номер контроля и срок годности.
Каждая упаковка снабжена
инструкцией

по применению и

хранению фага.



17

Применение бактериофагов в

медицине

Первый отчет об

успешной
фаготерапии был опубликован в

1921 году
фламандцами Р.

Бранохе и

Ж.

Майсином,
которые использовали бактериофаг для
лечения кожн
ой стафилококковой инфекции
.
Как уже было упомянуто, западная медицина
c

середины

ХХ века практически отказалась
от

использования бактериоф
агов
в

терапевтических целях
, однако в

СССР фаги
довольно широко применялись. Одним
из

самых, пожалуй, масштабных примеров
практического применени
я фагов является использование
комплексного препарата бактериофагов в

Сталинграде
во

время Великой Отечественной войны. З.В. Ермольева
во

время работы в

Ташкентском институте вакцин
и

сывороток разработала препарат, содержащий 19

видов
бактериофагов, в

том

числе холерный, брюшнотифозный
и

дифтерийный. Во

время Сталинградской битвы в

связи
с

угрозой эпидемии холеры было налажено производство
холерного фага в

самом Сталинграде, и

препарат ежедневно
прини
мали около 50

тысяч человек
. После войны в

СССР
приступи
ли к

промышленному производству фаговых
препаратов, которое действует и

в

настоящее время. В

России
производством бактериофагов занимаются в

основном филиалы НПО «Микроген»:
«Иммунопрепарат» (г. Уфа), «ИмБио» (г. Нижний Новгород), «Биомед» (г. Пермь). На

д
анный
момент в

РФ зарегистрировано и

производится 13

фаговых препаратов ...


С

терапевтической целью

бактериофаги применяют, например, в

России, Грузии и

Польше,
причем самыми разными способами. Для коррекции кишечных дисбиозов жидкие препараты
применя
ют внутрь или per rectum при помощи клизмы. Таблетированные формы принимают внутрь,
возможно использование бактериофагов и

в

составе ректальных свечей. При кожных и

раневых
инфекциях их

применяют в

виде примочек на

очаги поражения. При фарингитах, ларингит
ах
и

тонзиллитах препараты используют для орошения или полосканий, при отитах



закапывают
в

уши. Для лечения абсцессов в

их

полость вводят ватный шарик, пропитанный препаратом.
Больным, страдающим хроническими остеомиелитами, препарат вводят непосредствен
но
в

пораженный участок кости. Также препараты можно вносить в

брюшную, плевральную
и

суставные полости, а

также применять в

форме аэрозолей при поражениях легких. При инфекциях
мочевыводящих путей бактериофаги вливают непосредственно в

пораженный орган с

помощью
зонда. При гинекологических заболеваниях препарат вливают в

матку либо применяют влагалищные
тампоны, пропитанные фаговым раствором
.



Приложенные файлы

  • pdf 4009477
    Размер файла: 1 MB Загрузок: 0

Добавить комментарий