Биотехнология и генная инженерия Методичка с лекциями


Чтобы посмотреть этот PDF файл с форматированием и разметкой, скачайте его и откройте на своем компьютере.
1

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА

РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ

ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ

«ЮЖНО
-
УРАЛЬСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ

АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»


ИНСТИТУТ ВЕТЕРИНАРНОЙ МЕДИЦИНЫ



Кафедра инфекционных болезней

Т.Б. Щербакова, П. Н. Щербаков



Биотехнология, генная инженерия


Методические указания к


практическим занятиям для обучающихся по

направлению подготовки 36.04.01 Ветеринарно
-
санитарная экспертиза
(уровень высшего образования магистрату
ра)

Форма обучения: очная


























Троицк
-
2017









2



УДК 575(07)

ББК 28.04я7


Утверждены на заседании Методической комиссии факультета ветеринарной
медицины (протокол № 12от 21.0.2017 г.)



Рецензент

Е.П. Циулина, кандидат ветеринарны
х наук, доцент кафедры
незаразных болезней


Щербакова Т.Б.: Биотехнология , генная инженерия:
-

методические указания к
практическим занятиям для обучающихся по направлению подготовки:
36.04.01 Ветеринарно
-
санитарная экспертиза (уровень высшего образов
ания
магистратура)


Форма обучения: очная/ Т.Б. Щербакова, П.Н. Щербаков


Троицк: ФГБОУ
ВО Южно
-
Уральский ГАУ, 2017.


74с


В учебно
-
методическом издании представлены указания по организации
контактной работы (практических занятий) по д
исциплине « Биотехнология ,
генная инженерия.». Включают в себя содержание практических занятий, цель,
план проведения, содержание изучаемых вопросов, практические задания ,
вопросы и задания для контроля знаний.



























УДК 575(07)

ББК 28.04я7


© ФГБОУ ВО Южно
-
Уральский ГАУ




3



ОГЛАВЛЕНИЕ





Введение................................................................................
..................................3

Тематика практических занятий ….......................................................................4

Cодержание практических занятий........................................................................7

ТЕМА 1 «
Ре
шение проблемы питания с помощью биотехнологии.

Техника
безопасности в биотехнологическом производстве
.»...........................................7

ТЕМА 2 «
Биообъекты. Получение накопительных культур

микроорганизмов

».....................................
............................................................12

ТЕМА 3 «Принципы составления питательных сред в биотехнологическом
производств
е.
Определение оптимального субстрата для выращивания
хлебопекарных дрожжей
».......................................
...............................................18

ТЕМА 4 «
Подготовительная стадия биотехнологического
производства
»..........................................................................................................24

ТЕМА 5 «
Биотехнологическая стади
я производства хлебопекарных
дрожжей»..................................................................................................................29

ТЕМА 6 «
Выделение и очистка целевого продукта (биомассы и ферментов
дрожжей)
».........................
........................................................................................31

ТЕМА 7 «
Стабилизация продуктов биотехнологического производства
Влияние криопротекторов на устойчивость растительных клеток к
замораживанию»
.......................
..............................................................................34

ТЕМА 8 «
Определение наличия фермента амилазы в продуктах
битехнологической стадии (биомассе и культуральной жидкости)
».................37

ТЕМА 9 «
«
Определение активности фер
ментного препарата амилазы ,
полученного из биомассы дрожжей
».....................................................................41

ТЕМА 10 «
Иммобилизация клеток микроорганизма и определение их
ферментативной активности
»...............................
..................................................43

ТЕМА 11 «
Биотехнологические основы производства кисло
-
молочных
продуктов
»..................................................................................................................47

ТЕМА 12 «
За
кваски для кисломолочных продуктов и определение их
качества
».....................................................................................................................52

ТЕМА 13 «
Получение термостатного йогурта
»...............................
....................56

ТЕМА 14 «Определение качества полученного термостатного йогурта»..........59

ТЕМА 15 «
Особенности работы в лаборатории генной инженерии. Выделение
ДНК и работа с ней
».................................................................
.................................63

ТЕМА 16 «
Геномные библиотеки, клонирование ДНК
».......................................68

Рекомендуемая литература и источники………………………............................72








4







Введение



Биотехнология


стремительно развивающаяся и интегрирующая

наука, пронизывающая все биологические науки и направления исследований.
Использование биотехнологических принципов и биологических процессов в
производстве может
существенно изменить многие направления развития
промышленности и сельского хозяйства.


Дисциплина «Биотехнология, генная инженерия» относиться к обязательным
дисциплинам и в
ходит в вариативную часть (Б.1.В.ОД.7)

учебного плана
подготовки магистров по

направлению
подготовки:
36.04.01 Ветеринарно
-
санитарная экспертиза.


Изучение дисциплины предполагает освоение лекционного материала,
материала практических занятий и вопросов, выносимых на самостоятельное
изучение. Организация учебного
процесса предусматривает проведение
практических занятий.


Целью учебно
-
методического издания является формирование у магистрантов
профессиональных компетенций, повышение качества обучения, активизация
мышления, развитие творческих способностей студентов
, их стремления к
приобретению новых знаний
. З
нания и навыки, приобретаемые магистрантами,
могут помогут в решении задач ветринарно
-
санитарной экспертизы сырья и
продуктов животного и растительного происхождения, полученных
современными биотехнологическим
и методами или подвергнутых генной
модификации.


Дидактические задачи:

1 Сформировать навыки осуществления научных методик

в области
биотехнологии и генной инженерии

2 Развивать учебно
-
логические умения, проявляющиеся в правильном
выполнении практ
ических заданий.

3 Воспитать ответственность за своевременное исполнение должностных
обязанностей.


















5





Тематика практических занятий




те
мы

Тема практического занятия

Труд
оемкост
ь в
часах

1

Решение проблемы питания с помощью биотехнолог
ии.

Техника безопасности в биотехнологическом производстве

2

2

Биообъекты. Получение накопительных культур
микроорганизмов

2

3

Принципы составления питательных сред в
биотехнологическом производств
е.
Определение
оптимального субстрата для выращивания хле
бопекарных
дрожжей

4

4

Подготовительный этап биотехнологического производства
дрожжей

2

5

Биотехнологический этап производства дрожжей

2

6

Выделение и очистка целевого продукта (биомассы и
ферментов дрожжей)

2

7

Стабилизация продуктов биотехнологическ
ого производства
Влияние криопротекторов на устойчивость клеток к
замораживанию

2

6

8

Определение наличия фермента амилазы в продуктах
битехнологичесой стадии (биомассе и культуральной
жидкости)

2

9

Определение активности ферментного препарата амилазы
,
полученного из биомассы дрожжей

2

1
0

Иммобилизация клеток микроорганизма и определение их
ферментативной активности.

2

1
1

Биотехнологические основы производства кисло
-
молочных
продуктов

2

1
2

Закваски для кисломолочных продуктов и определение их
кач
ества

2

1
3

Получение термостатного йогурта

2

1
4

Определение качества полученного термостатного йогурта

2

1
5

Особенности работы в лаборатории генной инженерии.
Выделение ДНК и работа с ней.

2

1
6

Геномные библиотеки, клонирование ДНК

2

1
7

Экологичес
кая биотехнология (занятие конференция)

2


7



Содержание практических занятий


ТЕМА 1

«
Решение проблемы питания с помощью
биотехнологии. Техника безопасности в биотехнологическом
производстве
»


Цель:

сформиро
вать знаня о решении проблемы обеспечения пищей
методами биотехнологии и умений соблюдения техники безопасности

в биотехнологическом производстве.


Материальное обеспечение


Плакаты: «Строение человека: системы организма », «Пищеварительная
система

человека», «Пристеночное пищеварение».


План

1 Решение проблемы питания с помощью биотехнологии.

2 Техника безопасности в биотехнологическом производстве



1 Решение проблем питания с помощью биотехнологии


По данным ООН более половины насел
ения Земли не обеспечено
достаточным количеством продуктов питания. Примерно 500миллионов
человек голодают, а около 2 миллиардов п
итаются недостаточно или не
правильно. К началу ХХ1 века население планеты с учетом контроля
рождаемости составляло 7,5 млрд

человек. Следовательно тяжелое положение
с продуктами питания уже сейчас в недалеком будущем для некоторых народов
может принять угрожающие масштабы. Это первая проблема человечества.


Вторая проблема качество пищевых продуктов. Существует тесная связ
ь
между продуктами питания и здоровьем человека. Доказано, что продукты или
их отдельные компоненты могут быть единственной причиной многих
патологий. Ухудшение структуры питания, дефицит важнейших компонентов в
продуктах (белков , витаминов, липидов,мине
ральных веществ и пищевых
волокон) ослабляют организм человека снижая иммунную защиту . Кроме того
глобальное загрязнение поверхностных вод и суши , локальные радиоактивные
и техногенные зоны приводят к насыщению пищи токсичными элементами ,
антибиотиками
, пестицидами, радионуклидами. Так в США на каждого
человека в год приходится 1,5 кг токсических элементов потребляемых с
пищей. Потребление токсичных продуктов на фоне дефицита важнейших
компонентов в пище также ослабляет защитные силы, в первую очередь с
нижая
антитоксическую функцию печени, почек, легких, кожи провоцируя
онкологические процессы в организме.


В последнее время важную роль в ухудшении качества питания играет
химизация пищи. С помощью этой великой науки можно создать практически
любой п
родукт используя различные вкусов
-
ароматические добавки и основу
для создания консистенции и формы продукта.


Сегодня эти проблемы решает одна из мощных ветвей постоянно
развивающейся науки биотехнологии.
-
пищевая биотехнология. Основными
направлениями
развития пищевой биотехнологии в ХХ1 вке являются:

1 Увеличение выхода сельскохозяйственной продукции и соответственно
8

пищевых продуктов.

2 Усовершенствование методов сохранение продуктов питания

3 Улучшение качества пищевых продуктов . Это обеспечение
безопасности и
повышение пищевой ценности пищевых продуктов .

4 Безотходные пищевые производства.


По первому направлению свой потенциал реализуют все разделы
биотехнологии Продукты получают с помощью микроорганизмов
совершенствуя старые и создавая но
вые методы. Так ренин (сычужный
фермент) получаемый с помощью микроорганизмов намного активнее и
дешевле, чем животного происхождения, соответственно выход сыра за
единицу времени выше. Клеточная и генная инженерия помогает получить
культуры растений и жи
вотных с высокой продуктивностью и устойчивые к
заболеваниям (трансгенные растения и животные, оздоровленные растения
полученные из клеток).


Второе направление. Улучшение сохранности продуктов питания достигается
различными методами биотехнологии На
пример, использование бактерий,
которые не только ферментируют продукт (кефир, сыр , и тд), но вырабатывают
вещества губительные для микроорганизмов порчи. Методами биотехнологии
теперь этим свойством наделены все бактерии ферментеры. Многие пищевые
добав
ки в продуктах для сохранения их качества также вырабатывают
микроорганизмы (ксантановая и гуаровая камедь). Сублимационная сушка
продуктов тоже достижение биотехнологии .


Третье направление . В улучшении качества продукции биотехнологии нет
равных.



Это модификация продукции. Например, превращение растительной
линолевой кислоты омега 6 в омега 3, которая встречается только в рыбе. Это и
значительное снижение содержания вредных транс
-
жиров в
гидрогенезированных маслах (маргарин, растительный жир д
ля жарки) за счет
биотехнологического метода обогащения стеариновой кислотой.


Это создание мяса с пониженным содержанием жира. Повышение
питательной ценности продуктов имеет огромное значение для развивающихся
стран Индийские ученые использовали ген
растения амарант для повышения
содержания белка в клубнях картофеля. Трансгенный картофель содержит даже
незаменимые аминокислоты не встречающиеся у обычного. В качестве примера
можно упомянуть золотой рис , обогащенный витамином А. И его дальнейшее
усовер
шенствование привело к повышению в зерне легко усвояемых форм
железа.


Это пищевые добавки повышающие пищевую ценность и качество
продуктов вырабатываются микробами или получают из растительного и
животного сырья биотехнологическими методами.(аминокис
лоты , витамины,
белок микробиальный, липиды микробного синтеза )


Модифицированный крахмал получают с использованием хим способов или
энергоемких механических процессов. С помощью биотехнологии можно
изменить характеристики крахмала который не требуе
т промышленной
9

переработки.


Биотехнология подает большие надежды на создание и совершенствование
продуктов функционального питания это продукты
-
лекарства.
Систематическое употребление которых оказывает регулирующие действие на
определенные системы и о
рганы организма, улучшая здоровье человека. Такие
продукты содержат например повышенное количество незаминимых
аминокислот , витаминов, минералов и других биологических активных
веществ. Знакомы всем чеснок и лук , содержащие вещества снижающие
холестерин
и усиливающие иммунитет, брокколи и кочанная капуста ,в составе
которых входят глюкозинолаты стимулирующие активность противоопухолевых
ферментов. Биотехнологические методы и в частности генная инженерия
используется для повышения содержания этих и других
полезных соединений в
продуктах питания. Например, американцы создали сорт томатов, содержащий
в 3 раза больше чем в обычных уровень антиоксиданта ликопина, снижающего
риск возникновения рака простаты и молочной железы, снижает уровень
плохого холестирина
в крови. Работают американцы и над повышением
содержанием в клубнике противоопухолевого вещества эллаголовой кислоты.


Биотехнология способствует улучшению качества продуктов за счет
выявления и удаления аллергенных белков Так биотехнологическими мето
дами
проведена блокировка или удаление генов аллергенности из геномов сои
креветок арахиса. Этими же методами удаляют токсические вещества из
некоторых растительных культур (картофель, маниока).


Широкое использование ферментов в пищевой промышленности та
кже
способствует повышению качества продукции. Это изготовление выпечки,
хлеба, фруктовых соков, некоторых сортов конфет.


Безопасность продуктов питания обеспечивается не только технологией
изготовления , где имеют место биотехнологические методы и про
цессы но и
контролем качества с использованием биотехнологических методов . В
настоящие время используются тесты на основе моноклональных антител,
биосенсоры, ПЦР. С их помощью можно легко и быстро обнаружить
присутствие в продуктах микроорганизмов, токс
инов различного
происхождения,аллергенов, генно
-
модифицированных структур.


Безотходные пищевые производства это дело уже нашего и будущего
времени. Биотехнологические методы позволяют разрабатывать такие
технологические линии , которые предусматривают

полную переработку
отходов и вторичных продуктов. Так например производство сыра
сопровождается ся получением молочной сыворотки которая не только идет в
корм животным но является ценным сырьем для получения с помощью
биотехнологических методов творога
,молочного сахаора лактозы, аминокислот.
Ферментные гидролизаты используют в других отраслях пищевой
промышленности
-
хлобопечении , кондитерской и даже в самой биотехнологии
как питательная среда для микроорганизмов. Получение биогаза из отходов ,
очистки

стоков
-
это тоже биотехнологический процесс , который постоянно
совершенствуется.

10


2 Техника безопасности в биотехнологическом производстве


Целью любого биотехнологического процесса (производства) является
получение какого
-
либо продукта. Первой сос
тавляющей биотехнологического
производства является то, из чего мы будем получать продукт


это сырье.
Второй составляющей является то, с помощью чего мы будем осуществлять
превращение сырья в конечный продукт. Чаще всего, это живой организм. И,
наконец,
третья составляющая


это аппаратура, которая обеспечивает
комфортные условия живым организмам в производстве конечного продукта.
Для человека обслуживающего биотехнологический процесс опасность могут
составлять все его составляющие


сырье, организм, коне
чный продукт и
аппаратура. Кроме того, человек контролирует весь ход биотехнологического
процесса, и обеспечивает соблюдение все условий : стерильность, временной
интервал, температурный режим. Эти процессы, естественно,
автоматизированы, но без участия че
ловека не обойтись.
В наше время
наблюдается расширение научных исследований, диагностической и
производственной работы с различными микроорганизмами, в том числе
использование методов генной инженерии, что потребовало
усовершенствования мер и средств, сво
дящих к минимуму возможность
нанесения вреда здоровью персонала биотехнологического производства.
Основу профессиональной системы техники безопасности в
биотехнологическом производстве составляет совокупность мероприятий,
предотвращающих контакт персонала
и окружающей среды с
профессиональными вредностями (опасностями) при работе с живыми
организмами и продуктами их жизнедеятельности или снижение до
приемлемого уровня вероятности такого контакта. В организации мероприятий
по технике безопасности предусматри
ваются две линии защиты.



Первая линия

защиты


инженерные системы и устройства, мероприятия для
обеспечения техники безопасности.


Задачи первой линии защиты:

1 Изолирование источника профессиональной опасности

в строго
определенных физических граница
х (внутри приборов, помещений)
герметичностью оборудования, боксированием операций и процессов,
зонированием помещений. Боксирование процессов и операций обеспечивается
защитными боксами представляющими жесткие конструкции из нержавеющей
стали, алюминиевых

сплавов, стекла и пластика. Выбор конструкции зависит от
степени опасности микроорганизма для человека. По степени удержания
микроорганизмов, различают боксы 1, 2 и 3 классов. Боксы 3 класса


герметичные. Герметичность обеспечивается пониженным давлением

и
газонепроницаемостью. Разрежение воздуха обеспечивает удержание
микроорганизмов и их продуктов в боксе. Работа в боксах обеспечивается с
помощью перчаток плечевого типа. Воздух очищается с помощью системы
фильтров тонкой очистки, жидкие отходы собираютс
я в емкость с
дезинфицирующим раствором и затем термически обрабатываются.

Зонирование помещений позволяет группировать помещения с одинаковым
11

уровнем опасности в зоны, разделять их между собой и отделять от внешней
среды. Все помещения производственных ко
рпусов делят на 3 санитарные
зоны:

Первая зона



территория, в которой располагают помещения, где не работают с
инфекционными агентами, допускается их хранение в герметичной упаковке.
Из всех зон только эта зона контактирует с внешней средой.

Вторая зона



территория, в которой располагают помещения для работы с
инфекционными агентами в условиях изоляции агентов, препятствующих их
выходу из помещения.


Третья зона



территория, в которой располагают помещения для открытой
работы непосредственно с инфекци
онными агентами в специальных костюмах
(высшая категория изоляции от окружающей среды).

Все зоны отделены между собой санитарными пропускниками. Передача
материалов, оборудования между зонами происходит через специальные
устройства шлюзы, исключающих прям
ой контакт зон.


2 Обработка «загрязненных» материальных потоков

(воздуховодные и
вентиляционные системы, стоки, отходы) методами фильтрации, обработки
теплом, химическими веществами;


3 Защита персонала


обучение персонала основам обеспечения
инфек
ционной безопасности, дезинфекция рабочих помещений, спецодежда и
средства индивидуальной защиты, очистка и стерилизация воздуха помещений,
санитарная обработка самого человека и профилактическая иммунизация.


Мероприятия

второй линии

защиты

разработаны

исходя из предположения,
что контакт с профессиональными вредностями персонала произошел. Их цель
предотвратить последствие контакта и направлены на организм человека. К ним
относят вакцинация, экстренная профилактика, лечение. На каждом
микробиологическо
м предприятии есть специальные службы для обеспечения
специальной техники безопасности и контроля соблюдения персоналом
соответствующих требований.

Работа на предприятиях, связанных с биотехнологическим производством
лекарственных препаратов, сопряжена с о
пасностью заразиться самим
работникам или заразить других патогенными агентами или токсинами В
уголовном кодексе предусмотрена ответственность за соблюдение безопасности
при обращении с патогенными биологическими агентами или токсинами. Это

статья 248. «
Нарушение правил безопасности при обращении с
микробиологическими либо другими биологическими агентами или
токсинами»


Нарушение правил безопасности

может состоять в действии и бездействии.


Действием являются использование ненадлежащих методов изме
рения и
контроля при обращении с агентами и токсинами, перемещение их с
применением ненадлежащих способов хранения и защиты, изменение
температурных и иных режимов производства и хранения, использование
указанных агентов и токсинов для проведения неразреше
нных экспериментов и
др.

12


Бездействие состоит в невыполнении правил безопасности,
устанавливающих необходимость, обязательность и последовательность
совершения определенных действий по обращению и контролю. Последствием
данного преступления может быть
причинение здоровью человека вреда любой
тяжести. Под эпидемией, распространение которой является последствием
данного преступления, понимается быстрое и непрерывное распространение
инфекционного заболевания в пределах определенной группы населения и
опред
еленного региона. Наиболее опасной формой является пандемия, т. е.
эпидемия, охватывающая подавляющую часть мира (например, грипп). Под
эпизоотией понимается одновременное распространение заболевания среди
большого числа животных (как домашних, так и диких
) одного или нескольких
видов на значительной территории. Иные тяжкие последствия могут быть
выражены в массовой гибели диких или домашних животных (при отсутствии
эпизоотии), возникновении и распространении эпифитотии, т. е. инфекционного
заболевания раст
ений, охватывающего отдельные регионы, страну, и др.
Субъектом данного преступления является лицо, на которое возложены
обязанности по обеспечению и соблюдению правил безопасности при
обращении с микробиологическими либо другими биологическими агентами и
т
оксинами в химической, медицинской, фармацевтической, пищевой,
сельскохозяйственной, научной и иных сферах деятель
ности.


Таким образом, биотехнологическое производство является объектом
повышенной опасности, в условиях которого необходимо неукоснительн
о
выполнять требования техники безопасности, за нарушение которых
предусмотрена уголовная ответственность.


Практическое задание

Составте схему системы техники безопасности в биотехнологическом
производстве.

Этапы выполнения задания:

1. Изучите составл
яющие первой линии защиты персонала и окружающей
среды от профессиональных вредностей.

2.Изучите составляющие второй линии защиты персонала и окружающей
среды от профессиональных вредностей.

3. Изобразите в виде схемы систему техники безопасности в
биотех
нологическом производстве.


Вопросы и задания для контроля знаний

1 Какие существуют проблемы питания человека в мире?

2 Как можно увеличить количество продуктов питания с помощью
биотехнологии?

3 Как повысить сохранность продуктов, используя достижени
я биотехнологии?

4 Можно ли улучшить качество продуктов биотехнологическими методами?

5 Возможны ли безотходные пищевые производства ?





13


ТЕМА 2 «
Биообъекты
.
Получение накопительных культур
микроорганизмов»


Цель:

сформировать знания о видах биообъектов
, используемых в
биотехнологии, навыков по выделению культур микроорганизмов из разных
объектов и получению накопительных культур.


Материальное обеспечение


Cено из разнотравья в чашке Петри, патологический материал в чашке
Петри, фрукты (винград)

в чашке Петри, колба на 500 мл, ножницы, вата,
электроплита, вода водопроводная
-
200 мл, мел
,

спиртовка, пробирки
стерильные, термостат, МПБ, чашки Петри со средой Сабуро, чашки Петри со
средой Эндо, скальпель, пинцет , шпатель, бак. петля, спиртовые там
поны,
стирильные пипетки на 5 мл, карандаш по стеклу, средства индивидуальной
защиты (перчатки, маска)


План

1 Виды биообъектов используемых в биотехнологии

2.Получение посевного материала.



1 Виды биообъектов используемых в биотехнологии


Центральным и обязательным элементом биотехнологического

производства, создающим его специфику, является биообъект.

Функция
биообъекта


полный биосинтез целевого продукта, включающий обычно ряд
последовательных ферментативных реакций или катализ лиш
ь одной
ферментативной реакции, которая имеет ключевое значение для получения
целевого продукта. Биообъект, осуществляющий полный биосинтез продукта
называется
продуцентом.

Биообъект, являющийся индивидуальным ферментом
или выполняющий функцию одной фермен
тативной реакции используемой
биотехнологом


именуют «промышленным биокатализатором».


По размерам биообъекта их можно разделить на 3 группы:

1)

Макромолекулы:

ферменты всех классов

(чаще гидролазы и трансферазы);

в т.ч. в иммобилизированном виде (связ
анные с носителем)
обеспечивающем
многократность использования и стандартность
повторяющихся производственных циклов

ДНК и РНК



в изолированном виде, в составе чужеродных клеток

2)

Микроорганизмы:

вирусы

с ослабленной патогенностью используются для получе
ния вакцин,

благодаря относительной простоте их строения являются прекрасной
биологической моделью для решения фундаментальных проблем генной
инженерии
-
создание новых организмов, используемых в пищевой
промышленности
-

микробов , растений и животных.



Клетки прокариот

и эукариот

в современном
биотехнологическом

14

производстве занимают доминирующее положение.

Занимается ими
микробная биотехнология, которая изучает и совершенствует микробов с
целью использования для получения необходимых человеку продуктов

.
Биотехнологические функции в пищевой промышленности , выполняемые
бактериями разнообразны. Их используют в производстве уксуса(
глюконобактерии), молочнокислых напитков и продуктов (лактобациллы и
лейконосток,) белков (метиломоны), витаминов (клостридии
)
-
рибофлавин)
получении ферментов (ренин), при переработке отходов, пищевой
промышленности бактериальных удобрений.


Они являются продуцентами веществ , используемых в качестве
лекарственных
средств. Из
первичных метаболитов это

аминокислоты,
азотисты
е основания, коферменты, моно
-

и дисахара, ферменты для
заместительной терапии. Из
вторичных метаболитов:
антибиотики, алкалоиды,
стероидные гормоны, и другие вещества.


Сама биомасса отдельных видов микроорганизмов применяется для
профилактики и лечен
ия дисбактериозов
-
нормофлоры,


является источником антигенов
возбудителей инфекционных заболеваний
для производства вакцин.


Микромицеты

или грибы представляют собой обширную группу организмов,
около 100 тыс видов. Мукор

используется в биотехнологиче
ском производстве
для производства ферментов, переработки отходов, производстве кормового
белка, витаминов, аминокислот, ферментированных продуктов. Аспергилл
применяется широко для получения ферментированных продуктов с древности
(соевый соус). Пиницилл

применияется для производства антибиотиков, и
кроме этого, для производства сыров, аминокислот, витаминов. Каратиноиды
синтезирует гриб Рафия рходозима, белок синтезирует гриб Кандида.
Трихоспорум кутанеум способен окислять многочисленные органические

соединения в том числе фенол, что используют в переработке стоков. В
настоящие время плесневые грибы широко используют для получения
ферментов
-
амилазы, пектиназы, ренина, органических кислот (лимонная,
глюкороновая, итаковая).
Дрожжи применяются в пищев
ой биотехнологии
широко (хлебопекарное производство, виноделие, пивоварение, производство
кваса получение спирта). Они принимают участие в изготовлении кефира ,
кумыса квашеных овощей и фруктов. Дрожжи и сами служат источником
кормового белка. С помощью
генетической и клеточной инженерии дрожжи
совершенствуют , получая продуцентов белков, антигенов для вакцин,
ферментов.


Водоросли


наиболее древняя и разнородная группа ядерных организмов
(эукариоты). Они обитают везде где есть влага
-
водоемы, . в п
очве , на
поверхности растений. Большинство из них автотрофы так, как содержат
хлорофилл. На основании строения водоросли подразделяют на 10 отделов. В
биотехнологии нашли применение следующие:


1 Бурые водоросли обитают в прибрежной зоне мелководья
океанов и морей .
15

Один из известных представителей

-
ламинария является пищевым продуктом .
В Японии насчитывается более 300 блюд из ее и одно из них суши
-

ролы.


Ламинария также используется в кормовых, лекарственных и технических
целях. Она содержит мн
ого незаменимой аминокислоты метионина, йода,
углеводов, минеральных веществ и витаминов. Из ламинарии получают
альгинин
-

клеящее вещество, используемое для изготовления консервов, соков,
в в текстильной промти для пропитки тканей. Эту водоросль культиви
руют в
морях России и Юго
-
Восточной Азии.


2 Красные или багряные водоросли это морские обитатели глубины и лишь
немногие живут в пресных водах и почве (порфира, филофора, анфельция). Так
морская
-
порфира считается деликатесом во многих приморских стра
нах.
Другие виды служат источником получения агар
-
агара желирующего вещества,
которое применяется в кондитерской ,бумажной , микробиологической и
фармацевтической промышленности. Получают его длительным кипячением
водорослей. Применяют для изготовления ма
рмелада, пастилы, стабилизации
многих консервов, сиропов,шоколадных напитков, мороженого. Кожа и бумага
обработанные агаром более прочные . Агар используют для расфасовки
лекарств
-

делают капсулы , а в микробиологии для изготовления плотных
питательных ср
ед.


3 Зеленые водоросли (более 15 тыс видов) названы так из
-
за пигмента
хлорофилла. Они обитают в основном в пресных водоемах, некоторые в морях,
а также в почве, на стволах деревьев, растениях, заборах и цветочных горшках.
Типичным представителями явл
яется одноклеточная водоросль со жгутиком
-
хламидоманада и хлорелла, без жгутиковая одноклеточная водоросль , которые
можно обнаружить в любой луже.


Одноклеточные водоросли это кладовая полезных веществ Так хлорелла
содержит 50% белка (в сравнении с л
юцерной
-
18%), 40% углеводы, жиры 7
-
10
%, витамины (В2, К,РР), многие макро и микро элементы. Так витамина А в 20
раз больше чем в люцерне. Изменяя состав питательной среды можно сдвинуть
биосинтез в клетках хлореллы в строну накопления белков, или углево
дов, а
также активировать синтез тех или иных витаминов. В клетках содержится
даже антибиотик хлореллин. Кроме того растет эта водоросль очень быстро . В
теплый период за 6
-
8 месяцев дает 60 т с га (люцерна только15
-
20 т ). Поэтому
ее выгодно выращивать в

странах с теплым климатом. Применяется хлорелла в
различных целях например как БАД в пищевых продуктах. Подобная ей
спирулина тоже применяется как БАД.


Водоросли широко применяются как корм для рыб, птиц, как кормовая
добавка для с/х животных в о мн
огих странах и у нас на Севере. Доказано что
водорослями можно заменять до 50% сочных и 30% грубых кормов, при этом
продуктивность возрастает на 10%. Водоросли ценны и как удобрение.
Запахивание их в почву обогащает ее калием, йодом, микроэлементами.
Водо
росли разлагаются в почве быстрее чем навоз, не засоряют паразитами,
грибами. При этом прирост урожая дает до 300% пшеницы, ячменя и овощей.
Благодаря таким свойствам водорослей, как простота строения,
16

неприхотливость, и быстрое размножение, их применяют
широко в научных
исследованиях по молекулярной биологии, генетики, генной инженерии,
биохимии. Предпринимаются попытки использовать некоторые водоросли для
создания замкнутого круговорота веществ в отсеках космических кораблей. Это
например хлорелла , кото
рая способна поглощать вещества выделяемые
человеком, и производить все необходимые питательные вещества.


3)

Макроорганизмы



Высшие растения



сырье для получения БАВ ;Высшие растения
являются традиционным и к настоящему времени все
еще наиболее
обш
ирным источником получения лекарственных средств. При
использовании растений в качестве биообъектов основное внимание
сосредоточено на вопросах культивирования растительных тканей на
искусственных средах (каллусные и суспензионные культуры) и
открывающихся

при этом новых перспективах.



Животные

-


традиционные поставщики лекарственных и
диагностических средств
. Довольно часто, в качестве биообъекта
выступают млекопитающие, птицы, рептилии, амфибии, членистоногие,
рыбы, моллюски и их клетки Разнообразие

образуемых ими биологически
активных соединений, нашедших применение в медицине,
крайне велико.


В последние годы в связи с развитием технологии рекомбинантной ДНК

стремительно возрастает важность такого биообъекта как
человек
, хотя на

первый взгляд эт
о кажется парадоксальным. В принципе, человек уже давно

мог быть отнесен к биообъектам, например
, при получении гомологичной

антисыворотки или в случае использования различных тканей и органов

человека для их пересадки, например, костного мозга, почек и др
угих органов
Однако, биообъектом с позиций биотехнологии (при использовании
биореакторов) человек стал лишь после реализации возможности клонирования
его ДНК (точнее ее экзонов) в клетках микроорганизмов. Как уже указывалось
выше, за счет такого подхода бы
л ликвидирован дефицит сырья для получения

видоспецифических белков человека.


2 Получение посевного материала.


Биообекты для биотехнологического процесса человек находит в окружающей
среде. Например микроорганизмы :


-
патогенные культуры микрооргани
змов (бактерии и вирусы) выделяют в
условиях лабораторий из патологического материала от больных животных;

-
симбионтные микроорганизмы
-

из кишечника здоровых животных , из
растительного сырья;

-
микромицеты (плесневые грибы, дрожжи) из растительного сырья,

воздуха,
воды.


Для получения культуры микроорганизма создают условия, обеспечивающие
преимущественное развитие лишь данной группы или данного микроорганизма
и неблагоприятные для сопутствующих. Полученная таким образом культура
называется «
накопитель
ной
»

так как в ней преобладает одна группа или даже
17

один вид микроорганизма. Например культуру сенной палочки (Bacillus
subtillis) получают методом длительного кипячения пробы сена. При этом
погибают все вегетативные формы и остаются споры сенной палочки.
В
дальнейшем дают возможность спорам прорасти культивируя сенной отвар в
термостате при 25С. Другие микроорганизмы при этом вырастают редко и в
небольших количествах.


Биотехнологический процесс начинается с получения штаммов
микроорганизмов (продуцентов)

способных выдерживать такой процесс без
изменения своих свойств и давать продукцию в максимальных количествах.


Практическое задание 1


Получить культуру сенной палочки (Bacillus subtillis).


Этапы выполнения задания:

1 Сено мелко нарезать и помес
тить в колбу объемом 500 мл , заполняя ее на
четверть объема.

2 Добавить 100
-
150 мл воды и щепотку мела.

3 Смесь кипятить 15
-
20 минут, пока среда не приобретет цвет настоя крепкого
чая.

4 Сенной отвар разлить в стерильные пробирки по 2
-
3 мл, закрыть ватны
ми
пробками и поместить в термостат при температуре 25 С на 2 суток.

Через 2 скуток на поверхности среды образуется беловатая пленка Bacillus
subtillis, которая при старении на 3
-
4 сутки становится серовато
-
зеленоватой


Практическое задание 2


Выде
лить культуру микроорганизма из патологического материала.


Этапы выполнения задания:

1Одеть средства индивидуальной защиты и включить спиртовку.

2 Поверхность материала обжечь факелом или прижечь горячим шпателем.

3 Стерильным скальпелем сделать глубоки
й разрез материала.

4 Бактериологической петлей взять материал из глубины и сделать посев на
МПБ и на МПА в пробирках.

5 Поместить в термостат при 37 С на 24 часа


Практическое задание 3



Получить культуру дрожжей.


Этапы выполнения задания:

1 На
деть средства индивидуальной защиты и вкючить спиртовку.

2 Используя скальпель и пинцет взять часть растительного материала и внести
на скошеную среду Сабуро в прбирке.

3 Поместить в термостат при 30 С на
5 суток.


Вопросы и задания для контроля
знаний.


1 Что является обязательным элементом биотехнологического производства?

2 В чём заключается функция биообъекта?

3 Какой биообъект называют продуцентом?

4 Какой биообъект называют промышленным биокатализатором?

5 На какие группы делят микрообъект
ы в зависимости от их размера?

6 Для чего используются вирусы в биотехнологии?

18

7 Для чего используются бактерии в биотехнологии?

8 Расскажите о применении водорослей.

9 Какой процесс является начальным в биотехнологическом производстве?

10 Опишите технолог
ию получения культуры сенной палочки.

11 Опишите технологию получения культуры дрожжей

12
Опишите технологию выделения культуры микроорганизма из
патологического материала.










ТЕМА 3

«
Принципы составления питательных сред в
биотехнологическом произво
дств
е.
Определение оптимального субстрата
для выращивания хлебопекарных дрожжей
»


Часть 1


Цель :

Сформировать представление об основных принципах подбора
сырьевых источников для применения в качестве субстрата промышленной
питательной среды и умение п
роизводить выбор оптимального субстрата для
культивирования дрожжей.


Материальное обеспечение


3 стерильные колбы с ватными пробками, на 250 мл, качалка , меласса 10 мл в
пробирке, спирт
-
этанол 96%, 40% глюкоза (стерильная), минеральная среда для
дрож
жей 250 мл (стерильная), раствор микроэлементов стерильный , автолизат
дрожжевой (стерильная) 2 мл , пипетки на 10, 5 и 2 мл спиртовка, груша
суспензия дрожжей в стерильном физ. растворе или воде 10мл, среда для
культивирования дрожжей р. Saccharomyces, р
аствор микроэлементов .


План

1 Производственные питательные среды для микроорганизмов и принципы их
составления.

2 Виды углеродных субстратов для дрожжей.

3 Посев дрожжей на питательные среды с разными видами субстрата.


1 Производственные питате
льные среды для микроорганизмов и
принципы их составления


Для своей жизнедеятельности микроорганизмам необходимы определенные
условия внешней среды. В первую очередь это питательные вещества, которые
нужны им для роста и размножения. При подборе питате
льных сред для
культивирования микроорганизмов следует учитывать многие фактор. Один из
них связан с количеством биомассы которое нужно получить в ходе
кльтивирования. Для этого необходимо ввести достаточное количество
питательных веществ взятых в определе
нном соотношении.

Вода необходимый компонент питательной среды так как микробы только в
растворенном виде усваивают вещества. К качеству воды предьявляются
19

особые требования. Чаще всего используют дистиллированную воду с рН5,0
-
6,8. В некоторых случаях три
жды стиллировнную или обессоленную.

Источники углеродного питания должны составлять неменее 50%. Для этого
используют сахара полисахариды и многоатомные спирты. Они входят во
многие питательные среды.


Любое углеродное соединение расщепляется клеткой
до низко молекулярных
веществ с выделением энергии, которая в форме АТФ усваивается клетками.

Для развития микробов необходимы источники азота. Наиболее универсальным
источником являются аммонийные соли а также белки, аминокислоты, пептон и
пептиды. Потре
бность в аминокислотах разнообразна. Некоторые
микроорганизмы нуждаются в большом количестве (патогенные и
молочнокислые).Другим нужно определенное сочетание аминокислот.

Органические азотистые соединения используются микробами и как источники
углерода и д
аже некоторые предпочитают углеводам. Источником фосфорного
питания являются соли калия и натрия фосфорной кислоты а также
нуклеиновые кислоты. Фосфор входит в состав протоплазмы
клеток(фосфолипиды коферменты, нуклеиновые кислоты) определяя ее
структуру и
функции.


Кроме перечисленных компонентов микроорганизмам нужны так называемые
факторы роста. Это особо важные источники питания, которые необходимы в
малых дозах но без них невозможна жизнь и размножение клеток. К ним
относят аминокислоты, пуриновые и
перемидиновые основания, витамины.
Они используются клеткой микроорганизма для синтеза физиологически
активных веществ,регулирующих внутриклеточный метаболизм.

Из минеральных веществ кроме углерода, азота и фосфора в больших
количествах необходимы водород
, сера, калий, кальций, железо, магний.
Необходимы также и микроэлементы: медь, цинк, кобальт, никель, хлор,
кремний, молибден, марганец и другие.


В зависимости от состава и назначения питательные среда подразделяют по
консистенции на плотные,жидкие, по
лужидкие, сыпучие.


Плотные среды. В качестве уплотняющего вещества кроме агара может быть
желатина, силикагель, карбоксиметилцеллюлоза и др. К этим средам относят и
свернутую сыворотку, свернутый яичный белок. На таких средах легче изучать
микроорганиз
мы , выявить контаминацию, выделить чистую культуру. Именно
на них в производственных условиях хранят микроорганизмы.


Жидкие среды необходимо обогащать кислородом. В них легче изучать
влияние на культуру различных факторов, определять массу микробов,
об
разование веществ и побочных продуктов. Жидкие среды используют для
проведения более точных исследований и это основная группа сред для
промышленного культивирования микроорганизмов.


По строению питательные среды делят на простые (пептонная вода МПА,МПБ,
питательная желатина) и сложные (кровяной агар,асцитический бульон,
свернутая сыворотка).

По назначению питательные среды на:

20


-
диференциально
-
диагностические
, на которых разные виды микробов растут
по разному в зависимости от биохимических свойств;

-
селек
тивные

, обеспечивающие условия для роста одного вида микроба.
Применяют их для выделения какой либо культуры. Для этого добавляют
вещества подавляющие рост других микробов ( соли, красители, антибиотики,
органические вещества и тд . Так селективные среды
для кишечной группы
бактерий содержат соли желчных кислот, малахитовую зелень). Но селективные
вещества для поддержания культуры не должны содержать селективных
веществ так, как они способны вызвать изменение ее свойств;

-
консервирующие
среды необходимы дл
я первичного посева и транспортировки
исследуемого материала;

-
среды высушивания
добавляют к биомассе микроорганизма при ее
леофилизации. Это позволяет сохранить жизнеспособность организма в
процессе лиофильной сушки и последующем хранении. В состав так
их сред
входят вещества
-
крипротекторы: обезжиренное молоко, желатина,белковые
гидролизаты, лактоза,сорбитол, декстран, манитол, соли аминокислот и другие
соеденения. Эти вещества проникают внутрь клеток и стабилизируют
мембранные структуры или адсорбирую
тся на внешней оболочке клетки,
снижают ее проницаемость и замедляют процесс образования
внутриклеточного льда. Повышение защитных свойств сред вызывает
добавление ионов магния и кальция, стабилизирующих мембранный аппарат
клетки. Для каждого микроорганизм
а подбирается свой состав среды;

-
накопительные среды

это среды на которых определенный микроорганизм
растет интенсивнее сопутствующих. В этих средах присутствуют вещества
стимулирующие рост определенного вида микроба из смеси. Часто в эти среды
добавляют
селинитовые соли (для сальмонелл), желчь и ее соли (для кишечной
палочки) и тд


По происхождению среды могут быть:

-
натуральные комплексные , органические среды неопределенного состава
(молоко, сусло, картофель, сыворотка, экстракты трав и другие компоне
нты;

-
синтетические среды готовят из точных количеств органических и
неорганических веществ известного состава и воды . Они имеют постоянный
состав и легко воспроизводятся. Но в них требуется обязательно вносить
факторы роста;

-
полусинтетические среды кром
е веществ известного состав, содержат
не6значительное количество продуктов природного происхождения. Например
агаризированные среды , или картофельная среда с глюкозой.


Существует также понятие «минимальная среда» которая содержит лишь
источники питани
я, необходимые для роста и понятие «богатая среда», которая
кроме необходимых источников питания содержит дополнительные вещества,
позволяющие увеличить скорость роста и изменению ферментированного
состава биомассы. Кроме того потребности микробов могут из
менятся от
условий культивирования, например температуры, уровня рН среды. Поэтому
для культивирования микроорганизмов в промышленных масштабах,
21

конструируют производственные питательные среды. При этом должны
соблюдаются следующие принципы:

1 Удовлетворен
ие питательных потребностей микроорганизма.

2 Выбор сырьевых источников для конструирования питательных сред.

3 Дифференциация питательных сред по назначению.

4 Оптимизация питательных сред.

5 Стандартизация питательных сред.


В настоящее время для кул
ьтивирования микробов используют
нестандартные среды, которые в процессе производства контролируют по
содержанию общего и аминного азота и концентрации водородных ионов.


2 Виды углеродных субстратов для дрожжей


Питательная среда состоит из субстрата

-
источника углерода и энергии и
дополнительных компонентов. Для выращивания дрожжей в качестве субстрата
можно использовать различные вещества. Легкодоступными для
микроорганизмов , в том числе дрожжей считаются сахара: глюкоза, сахароза,
лактоза, но цена

на эти субстраты достаточно высока. В промышленном
производстве дрожжей широко применяют мелассу.


Мелассная барда



отход мелассно
-
спиртового производства.
Химический состав барды зависит от состава исходной мелассы и колеблется в
широких пределах. По с
воему химическому составу мелассная барда является
полноценным сырьем для производства кормовых дрожжей, не требующим
добавок ростовых веществ, так как содержит достаточное количество
витаминов. Содержание сухих веществ в натуральной барде


8
-
12 %, в
упар
енной барде


53 %.


Свекловичная меласса



отход производства сахара из свеклы,
богата органическими и минеральными веществами, необходимыми для
развития микроорганизмов. Она содержит 45
-
60 % сахарозы, 0,25
-
2,0 %
инвертного сахара, 0,2
-
3,0 % рафинозы. К
роме того, в мелассе содержатся
аминокислоты, органические кислоты и их соли, бетаин, минеральные
вещества, а также некоторые витамины. Используется для промышленного
производства этанола,
антибиотиков, органических кислот (лимонной ) и
коммерческих дрожж
ей для хлебопечения; помимо этого, она используется в
чистом виде в качестве добавки в корма животным


Масштабы производства, технологичность низших спиртов и качество

получаемого микробного белка выдвигают метанол и этанол в разряд
наибо
-

лее перспективн
ых субстратов для ля культивирования дрожжей.


3 Приготовление питательные среды с разными видами субстрата


Выбор вида субстрата для промышленной питательной среды начинают с
проведения эксперементальных исследований в лабораторных условиях в
не
больших объемах.

Состав питательной среды для каждого микроорганизма
устанавливают экспериментально. Задача специалиста, оптимизирующего
состав среды для конкретного вида микроорганизма,
-

выбрать такие источники
22

углерода и других веществ веществ, которые

наиболее оправданы в
экономическом и экологическом отношениях.


Приготовление питательной среды состоит из этапов:


1 Согласно рецептуре среды проводят взвешивание компонентов;


2 Растворимые компоненты среды растворяют в небольшом количестве воды
.


3 Нерастворимые компоненты (например, кукурузную, соевую муку, мел)
измельчают, и из них готовят суспензию на воде.


4 Смешивание подготовленных компонентов проводится в реакторах с
мешалкой. Воду добавляют в процессе перемешивания до заданного объе
ма .


5 Проверка питательной среды по основным параметрам: содержание сухого
вещества , рН среды, количество аминного азота и др.


6 Стерилизация
-

конечный этап приготовления питательной среды. Наиболее
широкое распространение получила термическая стер
илизация. Важнейшей
проблемой при этом является сохранение питательных свойств среды, так как
большинство субстратов, особенно углеводы, оказываются термически
нестабильными. Некоторые субстраты не требуют стерилизации, так как сами
обладают асептическим д
ействием: метанол, этанол, уксусная кислота и др.


Практическое задание 1


Подготовить различные питательные среды для культивирования дрожжей и
провести посев на них.


Этапы выполнения задания
:


1 Соблюдая стерильность ( над спиртовкой), раствор
микроэлементов вносят
в колбу с минеральной средой из расчета 1 мл на 1 л минеральной среды (на 250
мл 0,25 мл ) .


2 Пронумеровать 4 колбы на 250 мл. В колбу № 0 внести 1,2 мл физ. раствора
(контроль), в колбу №1 внести 1 мл 40% глюкозы , в колбу №2,

внести 1мл
мелассы, в колбу №3 внести 1 мл этанола


3 Во все 4 колбы стерильно налить минеральной среды для дрожжей 20 мл.


4 Соблюдая стерильность ( над спиртовкой) добавить 0,2 мл автолизата
дрожжей в колбы №1,№2,№3.


5 Во все колбы со средой вне
сти по1 мл суспензии дрожжей (соблюдая
стерильность).

6. Колбы поместить №1,№2,№3 в термостат 30 С на 3 суток, колбу №0
(контроль) поместить в холодильник.




ТЕМА 3

«
Принципы составления питательных сред в
биотехнологическом производств
е.
Определение опт
имального субстрата
для выращивания хлебопекарных дрожжей
»


Часть 2


Цель: с
формировать знания о
к
ритериях выбора вида субстрата питательной
среды для биотехнологического производства и
навыков по выбору
оптимального субстрата для изготовления промыш
ленной питательной среды
для дрожжей .

23

Материальное обеспечение

Колбы с прошлого занятия с биомассой дрожжей. Центрифуга, центрифужные
пробирки, пипетки на 2 мл и 5 мл, весы, микроскоп предметные и покровные
стекла, раствор Люголя.


План


1

Критерии

выбора вида субстрата питательной среды для промышленного
культивирования дрожжей.


2 Выбор субстрата для приготовления промышленной питательной среды для
культивирования дрожжей.



1

Критерии выбора вида субстрата питательной среды для
промышленного к
ультивирования дрожжей


К основным критериям выбора субстрата для промышленной питательной
среды относят:

1 доступность для биообъекта (способность использовать субстрат для своей
жизнедеятельности;

2 быть не диффицитным компонентом;

3 быть экономиче
ски выгодным;

4 обеспечивать максимальное получение продукта.


Для описания процессов роста микроорганизмов используют такие

характеристики, как общая и удельная скорости роста биомассы (или числа

клеток).


Общая скорость роста биомассы
-

масса сухого в
ещества культуры
микроорганизма образовавшегося за еденицу времени.

Другой важной характеристикой роста культуры является время

генерации, за которое биомасса культуры удваивается. Время генерации из

разных культур микроорганизмов сильно различается. Наиб
олее
быстрорастущие бактерии при благоприятных условиях генерации имеют

период генерации
-

20
-
25 мин.


Продолжительность генерации в лог
-
фазе у разных микроорганизмов не

одинакова. Так, для сальмонелл она равна 20
-
30 мин., для стрептококков и

стафилокок
ков
-

25
-
35 мин., для эшерихий
-

15
-
17 мин.

На продолжительность генераций влияют температура, рН среды, состав среды
и другие факторы.


Рост периодической культуры можно проследить не только по числу клеток,
но и по урожаю клеток. Под урожаем понимают
разность между полученной и
исходной массами бактерий. Массу выражают в граммах сухого вещества. Это
имеет производственное значение, так как рост микробной клетки
сопровождается не только делением клеток, но и увеличением размеров и массы
одной конкретно
й особи между двумя делениями.


2 Выбор субстрата для приготовления промышленной питательной
среды для культивирования дрожжей


Для того чтобы выбрать оптимальный субстрат для питательной среды
культивирования, необходимо определить при каком субстр
ате происходит
24

максимальное накопление биомассы, и насколько эффективно клетки
накапливают питательное вещество гликоген. Кроме этого нужно расчитать
экономическую выгоду данного субстрата.


Практическое задание


Выбрать оптимальный субстрат производс
твенной питательной среды для
культивирования дрожжей.


Этапы выполнения задания:

a.


1Определить скорость роста биомассы дрожжей после культивирования на
средах с разным углеводным субстратом.

1.1 Тщательно взболтать культуральную жидкость в 4 колбах и

и отобрать по2
мл в пронумерованные центрифужные пробирки.

1.2 Центрифугировать при 6 000 об/мин 2 минуту и надосадок слить.

1.3 Провести взвешивание каждой пробирки с биомассой дрожжей.

1.4 Определить чистый вес биомассы. Для этого из веса пробирки с би
омассой
вычесть вес пустой пробирки .

1.5Определить урожай клеток дрожжей в каждой колбе. Для этого вычесть
вес биомассы в пробе из колбы № 0 (контроль) от веса биомассы проб из колб
№1, №2, №3 .

1.6 Расчитать скорость роста дрожжей на каждом субстрате
.


2 Выявить запасы энергетически важного вещества дрожжевой клетки


гликогена в биомассе дрожжей из каждой колбы.

2.1 На предметном стекле приготовить препарат «раздавленная капля» из
каждой колбы и добавить каплю раствора Люголя.

2.2 Микроскопиров
ать под увеличением в 40 раз. Гликоген в дрожжевых
клетках окрашивается в красновато
-
бурый цвет. Определить степень
накопления вещества в препаратах из каждой колбы .


3 Расчитать экономические затраты на питательные среды с разным видом
углеводного субс
трата расчет вести из того что 1 л мелассы стоит 30 руб, 1
литр спирта стоит 300 руб и 1 кг глюкозы стоит 250 руб и выбрать наиболее
дешевую питательную среду.


4 По критериям : урожай клеток, скорости накопления биомассы, накоплению
гликогена и це
не питательной среды, выбрать экономически более выгодный
углеводный субстрат.


Вопросы и задания для контроля знаний

1 Что понимают под понятием «субстрат» питательной среды?

2
Какие существуют критерии выбора субстрата для промышленной
питательн
ой среды ?

3 Какие характеристики используют для описания процессов роста
микроорганизмов ?

4
Что означает термин «урожай клеток»
?

5 Что означает термин «время генерации»?

6 Как определяется экономически выгодный субстрат?




25


ТЕМА 4

«Подготовительная ста
дия биотехнологического
производства»


Цель:

формирование умения осуществлять подготовку оборудования ,
питательных сред, посевного материала для биотехнологического производства
дрожжей.



Материальное обеспечение


Детали биореактора, пробирка скос с

культурой дрожжей, колба с питательной
средой для дрожжей 50 мл (с мелассой), колба с раствором микроэлементов для
дрожжей , колба с с мелассой 50 мл , пустая колба с ватной пробкой для среды
промышленной, бумага, бечевки, фильтрующий материал (нитроцеллю
лоза ,
асбест вата, фильтр Зейца разобранный, пипетки и посуда для стерилизации,
бикс, шланги для биореактора, соли в чашках петри: сульфат аммония, хлорид
кальция, сульфат магния, хлорид натрия, фосфат калия однозамещеный ,
фосфат калия двузамещеный.



План

1 Этапы подготовительной стадии биотехнологиченского процесса.

2 Подготовка оборудования , питательных сред, посевного материала для
культивирования дрожжей.


1 Этапы подготовительной стадии биотехнологиченского процесса


Промышленный биотехнол
огический процесс производства продукта в
котором используют клеточные системы или микроорганизмы обычно состоит
из 4 стадий.


1 Подготовительная .


2 Биотехнологическая


3 Получение готовой продукции.


4 Переработка и утилизация отходов (би
омассы, культуральной жидкости
и).



Подготовительная стадия


Важнейшим условием успешного осуществления ферментации является

соблюдение стерильности процесса. Это означает и
сключение загрязнения
посторонними микроорганизмами всей системы аппаратов к
оторые
обеспечивают технологический процесс синтеза целевого продукта

В реальных
условиях добиться стерильности не просто. Этому мешают большой объем

ферментера и сложность состава среды, а также большой объем пропускаемого
через него воздуха и сложность
конструкции самого ферментера.


Попадание в культуральную среду и размножение в ней различных
микроорганизмов во время ферментации приводит к изменению ее состава, рН
и свойств, что, в конечном счете, ведет к снижению выхода целевого продукта.

Также, в

нем могут присутствовать в виде примесей (или микропримесей)

новые соединения, образовавшиеся в результате жизнедеятельности

посторонней микрофлоры. Как правило, ферментер заполняется питательной
средой только на две трети своей емкости. Вносимый в фермен
тер посевной
материал, должен быть представлен чистой культурой биообъекта (не
зараженной другимимикроорганизмами).

26


Следует иметь в виду, что при нарушении стерильности в одном месте

контаминируется вся система и содержимое ферментера по жаргонному

выра
жению производственников «сливается в трап», то есть выбрасывается.

Сложность ситуации заключается еще и в том, что для обнаружения

заражения воды, воздуха и компонентов питательных сред

микробиологическим путем, необходимо длительное время (от 24
-
х часов
до

нескольких суток). Такой период времени нужен для того, чтобы

концентрация посторонних клеток увеличилась до 103 клеток/мл, что

составляет их видимое количество в микробиологическим мазке.


Не стерильные ферментации недопустимы. Ввиду этого перед
пров
едением
каждого ферментационного цикла проводится подготовительная
стадия

включающая

:

-
Подготовка и стерелизация технологического воздуха;

-
Герметизация и стерилизация оборудования ( всех внутренних
поверхностей ферментера и входящих в него трубопроводов);
.

-

Стерилизация питательных сред.

-
Подготовка посевного материала


Подготовка и стерилизация технологического воздуха.


Эта подготовительная операция требуется для

обеспечения дыхания

микроорганизмов


биообъектов, большинство которых являются аэроб
ами.

Использовать для аэрации кислород целесообразно, но не экономически, ни

с точки зрения техники безопасности. Используется воздух. Забор воздуха,

который под давлением поступает в ферментер, производится

непосредственно на территории предприятия.


Для
очистки и стерилизации воздуха используется его многократная
фильтрация .


На первом этапе получения пригодного для пропускания через ферментер

(«технологического») воздуха производится его очистка от пыли в фильтре

предварительной очистки. Далее, принц
ипиальная схема получения

стерильного воздуха включает: компрессор с системой холодильников,

фильтр грубой очистки, а также систему стерилизации (головной фильтр,

фильтры для тонкой очистки). Таким образом, воздух подвергается не менее,
чем трехкратной фи
льтрации и, как минимум, дважды пропускается через
стерилизующие фильтры.


На стадии грубой очистки (головной фильтр) используются волокнистые

фильтрующие материалы с диаметрами волокон от 15 до 50 мкм из стекла и

базальта и грубозернистые пористые пере
городки. Эффективность очистки

на этой стадии достигает 98%.

На стадии тонкой очистки (индивидуальные фильтры) применяются

тонковолокнистые материалы с диаметром 0,5 мкм в виде картона и бумаги;

зернистые жесткие фильтрующие перегородки


керамические и
ме
таллокерамические из различных полимеров, асбестовые материалы.
Используются также мембранные фильтры.

27

Постоянное использование фильтров, стерилизующих технологический

воздух, требует также периодической стерилизации самих фильтров, так как

задержанные фил
ьтром микроорганизмы могут при благоприятных условиях

размножаться.Обычно рекомендуемая температура при обработке

паром 120
-
125о С, время обработки
-

20
-
30 минут.


Герметизация и стерилизация оборудования.


Асептические условия производства требуют с
терилизации перед

началом процесса всей аппаратуры (изнутри) и всех материальных потоков.

Этого, однако, недостаточно. Стерильность должна быть сохранена в течение

всего рабочего цикла. Иными словами, технологический процесс должен

быть защищен от контамин
ации за счет герметизации, то есть обеспечения

герметичности всех соединений в аппаратуре.Промышленные ферментеры
большого объема стерилизуют один час при температуре 125
-
130С.


Подготовка и стерилизация питательных сред.


При стерилизации промышленн
ых сред необходимо полностью
исключить контаминантную флору и сохранить их биологическую
полноценность .

Используемые в промышленности

среды (как правило, это жидкие,

комплексные среды реже


синтетические), стерилизуются тепловым

методом (насыщенным паро
м).Устойчивость микроорганизмов к тепловому
воздействию определяется многими факторами, к числу которых относится,
например, видовая принадлежность микроорганизма; также учитывается то
обстоятельство, что споры гораздо устойчивее к нагреванию, чем вегетати
вные
клетки. Определяющее значение при тепловой стерилизации имеют
температура и время ее поддержания. Чем выше температура, тем меньше
времени нужно для получения стерилизующего эффекта. При тепловой
стерилизации помимо гибели контаминирующих микроорган
измов, может
происходить разрушение термолабильных веществ среды: витаминов,
ферментов, некоторых аминокислот. С этим явлением, ухудшающим качество
питательных сред борются, повышая температуру и уменьшая время
стерилизации.


Подготовка посевного матери
ала


В биотехнологии «производительная сила « это микроорганизм
-
продуцент
именно его свойств зависит характер производства .


Процесс подготовки посевного материала является многоступенчатым и

состоит из нескольких последовательных этапов.Сначала
исходная

культура выращивается на агаризированной среде в пробирке. На этом этапе

при высеивании исходной культуры на агаризированной среде можно

посмотреть ее морфологию с целью изучения чистоты этой культуры. Далее,

-

выращивание в колбах в жидкой среде
на качалке. На этой стадии уже

включается процесс аэрации и происходит перемешивание исходной

культуры с жидкой питательной средой при определенной температуре.

Далее, исходную культуру, перемешанную с жидкой питательной средой,

переливают в посевной аппар
ат в количестве 10
-
25% от объема

28

инокулятора. Здесь также осуществляется процесс перемешивания и аэрации.


Необходимо подчеркнуть, что при подготовке

посевного материала происходит ступенчатое увеличение биомассы.

Поэтому могут использоваться один или неск
олько посевных аппаратов,

возрастающие по объему (выращивание посевного материала осуществляется

примерно до уровня 5
-
10% от объема основного ферментера).

Среда для выращивания посевного материала обычно не совпадает по составу с
ферментационной средой, п
ри выращивании посевного материала среда может
быть обогащена для быстрого роста биомассы.


2 Подготовка оборудования , питательных сред, посевного материала для
культивирования дрожжей


Практическое задание 1



Подготовить оборудование для культив
ирования дрожжей для стерилизации.


Этапы выполнения задания:


1Собрать систему фильтрации воздуха.

1.1 В стеклянный фильтр предварительной очистки поместить вату и
присоединить шланг.

1.2 Фильтр Зейца разобрать , на решетку разместить фильтрующий м
атериал
нитроцеллюлозу затем асбестовую пластину и собрать, присоеденив шланг от
фильтра грубой очистки.


2 Собрать ферментер.

2.1 В верхнее отверстие ферментера поместить систему борботажа.

2.2 В нижнее отверстие пробку резиновую ср стеклянной трубкой
.

2.3 К стеклянным патрубкам присоеденить шланги.


3 Провести монтировку оборудования: все отводные патрубки на фкерментере
и системе фильтрации обернуть бумагой и завязать шпагатом.

4 Все подготовленное оборудование разместить в биксе для автоклавирован
ия.


Практическое задание 2


Составить питательную среду для выращивания дрожжей и подготовить к
стерилизации.


Этапы выполнения задания:


1 Согласно рецепта взвесить компоненты питательной среды и высыпать в
колбу на 0,5 литра довести до 400
мл дистиллированной водой.


2 Добавить раствор микроэлементов 0,5мл.


3 Внести в среду субстрат


мелассу до 10 % от объема
-
50 мл

питательной среды.


4 Довести объем среды до 500 мл. Тщательно перемешать.


5 Проверить рН среды и довести до 4
,5.


6 Подготовить колбу с питательной средой для стерилизации: закрыть ватной
пробкой закрыть бумагой пробку вместе с горловиной и обвязать бечевкой.


7 Подготовленную питательную среду в колбе разместить в биксе для
автоклавирования.


Рецепт минер
альной основы питательной среды для выращивания дрожжей:

NH2SO4
-

10 г

29

CaCL2x4H2O
-

2 г

MgSO4xH2O
-

14 г

NaCl
-
`10 г

KH2PO4
-

60 г

K2HPO4
-

2 г


Практическое задание 3



Подготовить посевной материал культуры дрожжей для посева в биореактор.


Этапы выпол
нения задания:

1. В пробирку с культурой дрожжей на скосе влить 5 мл стерильного физ.
раствора и встряхивать до смыва всей культуры.

2. Полученную взвесь дрожжей перенести в колбу с 50 мл питательной среды.

3 Посев разместить в термостат на 5 дней.

Вопрос
ы и задания для контроля знаний


1. Из каких этапов состоит биотехнологическое производство?

2.В чем заключается подготовительный этап?

3.Что такое посевной материал и как он готовиться.?

4. Как готовят оборудование для стерилизации?




ТЕМА 5
«
Биотехнолог
ическая стадия производства
хлебопекарных дрожжей
»


Цель:
сформировать навыки контроля посевного материала культуры
дрожжей, расчета посевной массы дрожжей и осуществления
биотехнологической стадии производства хлебопекарных дрожжей.


Материальное
оборудование

Колбы с 2 поколением культуры дрожжей с прошлого занятия на жидкой
питательной среде 100 мл, колба со стерильной питательной средой 500 мл

с прошлого занятия, биореактор простерелизованый , система фильров
простерелизованная, компрессор, спи
ртовка, термостат, предметные стекла,
микроскоп, пипетка , краситель мителеновый голубой.


План

1 Биотехнологическая стадия производств хлебопекарных дрожжей.

2
Демонстрация фильма «Промышленное производство хлебопекарных
дрожжей»

3 Подготовка биореакт
ора и запуск для культивирования хлебопекарных
дрожжей .




1 Биотехнологическая стадия производства хлебопекарных дрожжей
Биотехнологическая стадия

это основная стадия в биотехнологическом
производстве. Именно на этой стадии в промышленных
масштабах с
использованием того или иного биообъекта преобразуется сырье различными
способами и получается целевой продукт . Главной целью этой стадии может
быть получение какого
-
то вещества или биомассы клеток. Разберем ее на
примере промышленного полу
чения хлебопекарных дрожжей.


Дрожжи


постоянный спутник человека, они используются в разных
30

микробиологических процессах. Хлебопекарные дрожжи в России начали
выращивать в монастырях еще 14
-
15 ввеках. Прессованные дрожжи начали
производить в 1972 г.
в Германии.

Биомассу дрожжей, как источник пищевого белка, человек применяет только в
экстремальных условиях (во время голода или в качестве компонента сухого
пайка для альпинистов, мореплавателей). Одной из причин малой популярности
дрожжевых блюд являетс
я сравнительно толстая клеточная оболочка дрожжей,
которая затрудняет их усвоение организмом.


Человек хорошо овладел искусством выращивания дрожжей в
промышленных условиях, биотехнологи освоили технологию выращивания
богатой белками биомассы хлебопека
рных дрожжей Saccharomyces cerevisiae на
простых синтетических средах (например, на этиловом спирте микробного или
химического происхождения), а химики разработали способы выделения из
дрожжевой биомассы очищенных белковых концентратов.

Обычно для промышл
енного производства дрожжей используют питательную
среду, основным компонентом которой является меласса


отход сахарного
производства (свекловичная или из сахарного тростника). Дрожжи выращивают
в биореакторах (ферментерах) периодического действия аэробн
ым глубинным
способом при рН 4,4
-
4,5 по так называемому приточному методу. В чистый
аппарат вводят 70
-
80 % теплой воды от необходимого конечного разведения
мелассы (1 : 17


1 : 30, в зависимости от первоначальной концентрации
сахаров), добавляют 10 % мела
ссы и растворы солей, устанавливают
оптимальные рН среды и температуру и начинают умеренную аэрацию (1 об/
(об • мин)). В такую среду вносят посевной материал в количестве 10 % от
общего объема среды. В течение 1
-
го часа среду не добавляют, а в последующие

10 ч ее вводят непрерывным потоком в количествах 5; 6; 7,2; 8,2; 9,2; 10,2; 12,8;
11,0 и 9 % в час от общего количества питательной среды. Аэрация в течение
всего процесса ферментации также меняется. В первый и последний час
культивирования она меньше (1
: 1), а в период интенсивного размножения
дрожжей достигает 1,5


2,0 об / (об • мин). В таких условиях дрожжи проходят
все стадии развития. В стационарной фазе роста культуру выдерживают до
полного прекращения интенсивного почкования.

Во время ферментации

незначительно возрастает концентрация среды (от 0,9 до
2,2 по сахариметру) и титруемая кислотность (от 0,3 до 0,8 мл 1 н раствора
кислоты на 100 мл среды). В таких условиях выход прессованных дрожжей
составляет 150 % от количества использованного сахара (
или 37,5 % сухой
биомассы).

2 Демонстрация фильма «Производство хлебопекарных дрожжей»

3 Подготовка биореактора и запуск для культивироания хлебопекарных
дрожжей


Культивирование дрожжей начинают с контроля посевного материала
культуры дрожжей. При пол
учении удовлетворительных результатов проводят
рассчет посевной дозы дрожжей в биореактор . Затем заливают питательную
среду в биореактор и вносят посевной материал в рассчитанной дозе проводят
31

засев и осуществляют биотехнологическую стадию получения хл
ебопекарных
дрожжей.


Практическое задание 1


Провести контроль посевного
материала культуры дрожжей


Этапы выполнения задания:


1 Зажечь спиртовку. Соблюдая правила асептики стерильной пипеткой взять
каплю посевного материала культуры дрожжей

и поместить на предметное
стекло.


2 Добавить каплю красителя и перемешать.


3 Накрыть покровным стеклом и микроскопировать


4 В 10 полях зрения определить содержание живых и мертвых клеток(много
м, мало или равное количество).


5 Дать оценку кач
ества посевного материала.( мертвых клеток должно быть 5
-
10%)


Практическое задание 2


Рассчитать посевную биомассу дрожжей.


Этапы выполнения задания:


1 Отлить по 2 мл посевного материала в центрифужные пробирки.


2 центрифугировать при 5
тыс об/мин 2 минуты .


3 Слить надосадочную жидкость и провести взвешивание пробирок.


4 От полученного веса пробирок с биомассой дрожжей вычесть вес пустых
пробирок.


5 Рассчитать посевную биомассу на 500 мл питательной среды.


Практическое задание

3



Осуществить биотехнологическую стадию получения хлебопекарных
дрожжей.


Этапы выполнения задания:


1 Подготовить биореактор для культивирования дрожжей.

1. 1 Включить спиртовку руки обработать спиртовыми томпонами.

1.2. Соблюдая правила асептики
к биореактору присоеденить систему
фильтрации воздуха и компрессор.

1.3. Соблюдая правила асептики перелить питательную среду 500 мл из колбы
в биореактор.

1.4 Соблюдая правила асептики, внести посевной материал (культуру дрожжей
с прошлого занятия )
в биореактор в количестве 50 мл (10%) от объема среды.


2 Поместить биореактор в термостат с температурой 30 С и включить систему
аэрации.


3 Культивировать дрожжи в течение 24 часов.


4 Культуральную жидкость с биомассой клеток слить в колбу и сохранить
в
холодильнике при температуре 4 С до следующего занятия.


Вопросы и задания для контроля знаний


1.Какое значение имеют хлебопекарные дрожжи в питании человека?

2. Какие среды используют в промышленом производстве для выращивания
дрожжей?

32

3 Каким спос
обом выращивают дрожжи?

Что включает биотехнологическая стадия производства?

4 Опишите процесс контроля посевного материала культуры дрожжей.

5 Как рассчитать посевную биомассу дрожжей?



ТЕМА 6

«Выделение и очистка целевого продукта (биомассы и
ферментов

дрожжей)»


Цель:

формирование навыков п
олучения биомассы дрожжей и их продуктов
метаболизма


Материальное обеспечение

Колбы с культуральной жидкостью после биотехнологической стадии
культивирования дрожжей 100 мл, центрифужные пробирки, центрифуг
а,
весы, качалка, пипетки , ацетатный буфер, толуол, раствор щелочи, соль
сульфита натрия, пробирки с резиновыми пробками, рН
-
метр, ступка с
пестиком, песок в пробирке, физ. раствор в пробирке, пипетки на 2
-
10 мл,
воронка с бумажным фильтром, маркер.


План

1 Конечные стадии биотехнологического процесса.

2 Получение биомассы дрожжей и продуктов метаболизма.




1
Конечные стадии биотехнологического процесса


К завершающим стадиям биотехнологического процесса относят:

1 разделение биомассы и ку
льтуральной среды;

2 выделение целевого продукта;

3 концентрирование.


Отделение биомассы клеток проводят разными способами.


Осаждение (седиментация)
-

это процесс расслоения дисперсных систем под
действием силы тяжести и отделение дисперсной фазы

в виде осадка.


Флотация

это метод отделения
клетки продуцента , которые в силу низкой
смачиваемости накапливаются в поверхностных слоях
содержимого
биореактора и отделяются вместе с пеной от културальной жидкости.
Фильтрация
-
это разделен
ие твердой и жидкой фаз суспензии при
пропускании
ее через пористую перегородку.


Центрифугирование

-

это разделение неоднородных систем под воздействием
поля центробежных сил.Для центрифугирования применяют центрифуги
различных конструкций.


Методы
выделения целевого продукта существенно различаются в
зависимости от того, накапливается продукт в клетке или он выделяется в
культуральную жидкость, или же продуктом является клеточная биомасса.
Наиболее сложным является выделение внутриклеточного продукт
а. При этом
клетки необходимо отделить от среды культивирования, подвергнуть их

разрушению, а затем целевой продукт очистить от остатков разрушенных

клеток. Процесс называется дезинтеграцией. Дезинтеграция клеток
проводится физическими, химическими и фер
ментативными методами.После
33

дезинтеграции клеток необходимо избавляться от их«обломков», для чего
используют те же методы, что и при сепарации, т.

е. центрифугирование или
фильтрацию.


Выделение целевого продукта из культуральной жидкости или гомогената

разрушенных клеток осуществляется путем кристализации , осаждения
растворами солей или органическими полимерами, экстракцией или
различными методами адсорбции. Все эти методы позволяют перевести
растворенное вещество в мало растворимое состояние. Ес
тественно, что в
зависимости от целей и свойств выделяемого продукта подбирается тот или
иной метод и то или иное воздействие, подбирается реагент.


Концентрирование продукта может происходить и во время его выделения .
Например, осажденные белковые ве
щества растворяют в меньшем объеме.

Другими методами концентрирования являются упаривание, обратный осмос,
микрофильтрация .


3 Получение биомассы дрожжей и продуктов метаболизма


Биомассу дрожжей отделяют от культуральной среды среды путем
центрифу
гирования или фильтрации на фильтр
-
прессе, затем биомассу
тщательно промывают водой придают форму брикетов и упаковывают.

Прессованные дрожжи хранят при пониженной температуре (4
-
6 оС), так как
при комнатной температуре бактерии и микромицеты быстро повре
ждают
дрожжевые клетки. Для длительного хранения хлебопекарные дрожжи
высушивают до содержания влаги 8
-
9 %.


В биомассе дрожжей содержится около 50 % белков, аминокислоты и
витамины и другие. Для получения внутриклеточных метаболитов сначала
проводя
т разрушение дрожжевых клеток с помощью ферментов гидролаз
зимолиазы улитки или ферментом грибного или актиномицетного
происхождения, либо механическим способом. Для выделения белковых
компонентов, например ферментов, используют методы высаливания ,
о
саждения , кристаллизации, экстракции.


Метод высаливания

основан на различной растворимости продукта в
солевых растворах различной концентрации. Обычно для этого применяют
сульфаты , фосфаты натрия, калия , аммония.


Экстракция
-

это процесс выделе
ния вещества из раствора с помощью
избирательного растворителя
-
экстрагена в котором это вещество растворяется
лучше. Для этого достаточно широко применяются различные органические
растворители алкилфенолы, эфиры, галогениды, гексан, хлороформ, толуол,
ац
етон или просто вода или буферные растворы.


Практическое задание 1


Получить биомассу дрожжей и рассчитать выход продукта.


Этапы выполнения задания:


1Разлить культуральную жидкость с клетками после стадии ферментации
(16 мл) в центрифуж
ные пробирки по 2 мл, центрифугировать при 5 тыс
оборотах /мин 2 мин.


2. Слить надосадочную жидкость в пробирку №1 и закрыть резиновой
34

пробкой.


3 Определить выход биомассы дрожжей.

3.1 провести взвешивание всех пробирок с дрожжами и из полученног
о
показателя вычесть массу пустых пробирок.

3.2 Рассчитать вес всей биомассы после биотехнологической стадии
культивирования дрожжей.

3.3. Используя расчеты с прошлого занятия определить выход продукта . Для
этого вычесть из биомассы продукта биомассу п
осевного материала.


Практическое задание 2


Получить белок (фермент амилазу ) дрожжей из биомассы дрожжей
методом высаливания.


Этапы выполнения задания:

1 Провести дезинтеграцию клеток механическим способом.

1.1 Биомассу дрожжей в количестве
10 г выложить в ступку с 1 г песка.

1.2. Тшательно перетереть пестиком до получения однородной массы.

1.3 Влить физраствор 16 мл и тщательно перемешать.

1.4 Удалить осколки разрушенных клеток. Для этого полученную суспензию
разлить по центрифужным пробир
кам и центрифугировать при 8 000 об/мин 2
минуты.

2 Осадить белковые вещества клеток дрожжей методом высаливания.

2.1 Надосадочную жидкость перелить в чистую пробиркиу довести рН до 7,2
и добавить до 19,6 % концентрации соли сульфита натрия.

2.2 Посл
е выпадения осадка суспензию разлить по центрифужным пробиркам и
цетрифугировать 2 мин при 8тыс оборотах/мин.

2.3. Надосадок слить в дезраствор, а осадок белка растворить в небольшом
количестве дистиллированной воды.

3. Полученный раствор фермента перели
ть в пробирку №2, довести до 5 мл , и
закрыть резиновой пробкой.


Практическое задание 3


Получить ферментативную вытяжку из биомассы дрожжей методом
экстракции.


Этапы выполнения задания:


1 В колбу на 250 мл внести биомассу дрожжей 5 г добави
ть 10 мл.
дистиллированной воды и 10 мл ацетатного буфера рН=4,7 и толуола 1 мл


2 Колбу разместить на качалке и встряхивать 30 мин.


3 Суспензию профильтровать через фильтровальную бумагу в пробирку №3
и закрыть резиновой пробкой.


Пробирки ( №№1
, 2, 3) с продуктами сохранить до следующего занятия в
холодильнике.


Вопросы и задания для контроля знаний

1.Что может быть целевым продуктом?

2 Назовите методы получения готового продукта?

3 Как проводят отделение биомассы от культуральной жидкости?

4 Что понимают под дезинтеграцией?

35

5 Опишите процесс экстракции.

6 В чем заключается суть метода высаливания?



ТЕМА 7 «Стабилизация продуктов биотехнологического производства.
Влияние криопротекторов на устойчивость растительных клеток к
замораживанию»



Цель :

Сформировать знания об использовании криопротекторов для
сохранении клеток в живом состоянии при заморозке и навыки оценки влияния
различных криопротекторов на устойчивость клеток к низким температурам.


Материальное обеспечение


1М раств
ор сахарозы (342 гна 1л) и 1М раствор глицерина (73 мл на 1л), 8%
раствор хлорида натрия, дистиллированная вода, пробирки, штативы для
пробирок , микроскопы, термометр, скальпели пинцеты, препаровальные иглы,
пипетки , стеклянные палочки, предметные и покр
овные стекла,
фильтровальная бумага, охладительная смесь( смесь льда с солью 3 частей льда
1 часть соли (
-
20 С), пробойники, маркер, корнеплоды свеклы в чашке Петри,
капустные листья , терка, марля, учебный фильм сублимация.


План

1Способы стабилизации

конечных продуктов биосинтеза.

2 Изучение влияния криопротекторов на белки цитоплазмы растительных
клеток, и клеток дрожжей подвергнутых замораживанию.



1 Способы стабилизации конечных продуктов биосинтеза


Для сохранения требуемых свойств получаем
ых продуктов в

процессе их хранения, реализации и использования потребителями

применяют различного рода физико
-
химические воздействия с целью

повышения его стабильности. Необходимость стабилизации материалов
биологического происхождения, связанная с их чре
звычайной не стойкостью.
Известно что продолжительность сохранения большинства биопродуктов таких
как гормоны, ферменты, клетки животных и растений а также некоторых
микроорганизмов исчисляется несколькими днями. В связи разрабатываются
различные способы

стабилизации биопродуктов.


Способы (стабилизации )и сохранения биопродуктов , в том числе ,
микроорганизмов , культур клеток растений и животных :

1 консервирование химическими веществами

при положительных температурах
3
-
10 С (хлороформ, фенол, формал
ьдигид, глицерин и тд)

2 криосохранение.

3 сушка : сублимациолнной, конвективной, токами высокой частоты,
инфракрасными лучами.


Криосохранение
-

это хранение объектов при очень низкой температуре (
обычно при 196 С). или многоэтапный процесс обеспечив
ающий неограничено
долгое хранение живых клеток, органов и тканей в состоянии анабиоза. Только
в условиях анабиоза, когда полностью останавливаются обменные и
биохимические реакции и отсутствует жидкая фаза, создаются условия для
длительного хранения биоло
гической системы с последующим полным
36

возвратом ее к исходному состоянию жизнедеятельности. Единственным пока
средством создающим глубокий холод является жидкий азот. Изучив эти
природные механизмы человек создал способы криосохранения живых
объектов с
использованием криопротекторов. Среди них выделяются вещества
легко проникающие в клетки как диметилсульфоксид 5
-
10 % глицерин 10
-
20 %,
а также не проникающик высокомолекулярные поливинилпиролидон (ПВП),
декстран, полиэтиенгликоль 6000. Криопротектором мож
ет быть сахароза,
трегалоза и смеси. Ослабление стрессового воздействия при замораживании
клеток можно подбором состав смеси протекторов и также оптимальной
скорости замораживания.


Сублимация
-
лиофилиная сушка (лиофилизация)

основана на том, что
темпе
ратура кипения воды при 4,6 мм рт. ст. составляет 0 С , а при 0,034 мм рт
ст понижается до
-
50 С. При этой температуре вода замерзает, и поэтому
процесс упаривания представляет собой типичную возгонку паров. Водный
раствор полностью замораживают в тонком с
лое и выдерживают в вакууме пр
давлении 0,01
-
2 мм рт ст. Благодаря быстрому испарению воды,замороженный
раствор постоянно охлаждается. Водяные пары улавливают поглотителями.
Таким образом продукт можно высушить за пару часов. Основные
преимущества лиофилиз
ации:

-

объект находится при низкой температуре , что важно при нестабильных
продуктах белков , микробов, вирусов, антибиотиков и тд

-
продукт не вспенивается

-
низкая температура не дает развиваться микробам порчи или резко снижает
активность расщепления фе
рментами


-
нет опасности окисления веществ кислородом воздуха так как глубокий
вакуум

-

полученные объекты обезвожены 0,5% влаги и хранится могут очень долго не
опасаясь разрушения и заражения. (просмотр фильма сублимация)


3 Изучение влияния криопроте
кторов на белки цитоплазмы
растительных клеток, подвергнутых замораживанию.


На основе изучения природных механизмов сохранения живых клеток
при замораживании человек создал способы криосохранения живых объектов.
Были созданы защитные сред
ы для замораживаемых объектов
-

микроорганизмов и тканей животных и растений на основе веществ
называемых криопротекторы. Эти вещества должны быть нетоксичными, не
иметь антигенных свойств,обладать свойствами

структурирующего
-
опорного
материала, подавлять а
ктивность гидролитических ферментов в биоматериале
обладать нтиокислительной активностью. Практически всем требованиям
соответствуют такие вещества: лактоза, сахароза, манитолл,
сорбитол,пептон,белковые гидролизаты, декстран, желатина,
поливенилпиорролидо
н, аминокислоты, глутамат натрия, тиомочевина и др
соединения.


Практическое задание 1


Изучить влияние криопротекторов на белки цитоплазмы растительных клеток,
37

подвергнутых заморажиаванию.


Этапы выполнения задания :


1 Листья капусты мелко нашинкова
ть и выжать сок и профильтровать через
двойной слой марли .


2 Сок разлить в 3 пробирки по 0,5мл. Пробирки пронумеровать.


3 В пробирку №1 добавить 0,5мл 1 М раствора глицирина; в пробирку №2
добавить 0,5 мл 1М растворва сахарозы; в пробирку №3 добав
ить 0,5мл 0,5 М
раствора глицирина; в пробирку №4 добавить 0,5 мл 0,5М растворва сахарозы;
в пробирку №5 добавить 0,5 мл дистиллированной воды (контроль).


4 Пробирки поместить в охладительную смесь на 10 минут затем вынуть и
разморозить в стакане т
еплой воды температуры 30 С.


5 Отметить в каких пробирках образовались хлопья коагулированного белка и
сделать вывод о защитном действии на белки растительных клеток


Практическое задание 2


Изучить защитное действие на криопротекторов на устойчи
вость клеток
дрожжей к действию низких температур.


Этапы выполнения задания:


1 Суспензию дрожжей разлить по 0,5 мл впробирки, которые пронумеровать
№1
-
6


2 В пробирки добавить :


1пробирка
-
0,5мл дистиллированной воды (контроль);


2прбирка
-
0,25 м
л 1М раствор сахарозы, и 0,25 мл дистиллированной воды;


3 пробирку


0,5 мл 1М раствор сахарозы;


4 пробирку 0,25 мл 1М раствор глицерина и 0,25 дистиллированной воды;


5 пробирку


0,5мл раствора 1М раствор глицерина


6 пробирку
-
0,25 мл 1М раствор саха
розы, и 0,25мл 1М раствор глицерина.


3 Пробирки поместить в охладительную смесь на 10 минут затем вынуть и
разморозить в стакане воды комнатной температуры.


4 Проверить жизнеспособность клеток дрожжей в каждой пробирке.

4.1 Пместить каплю дрожжево
й суспензии из каждой пробирки на предметные
пронумерованные стекла и добавитькаплю красителя накрывают покровным
стеклом и просмотреть на малом увеличении.

4.2 В одном поле зрения подсчитать общее число клеток и число окрашенных
(мертвых) клеток.

Ра
ссчитать процент гибели клеток из каждой пробы.


5 Сделать вывод о защитном действии криопротекторов на цитоплазму
дрожжевых клеток.


Вопросы и задания для контроля знаний

1 Каким образом можно сохранить стабильность трансгенных организмов?

2 В чем с
уть замедления роста биообъекта?

3 Опишите метод лиофильной сушки

4 Что такое криосохранения живого объекта?

5 Что происходит с живой клеткой при заморозке

6 Как клетки защищаются от замораживания?

38

7 Что такое криопротекторы?




ТЕМА 8

«Определение нал
ичия фермента амилазы в продуктах
битехнологической стадии (биомассе и культуральной
жидкости)»


Цель:

Формирование навыков осуществления методики о
пределения наличия
ферментов в продуктах, полученных при культивировании дрожжей.


Материальное обесп
ечение

Штативы, пробирки, термостат t=37оС, ацетатный буфер рН=4,7; реактив
Феленга, 0,1% раствор крахмала , 0,1% раствор сахарозы, 0,1% раствор йода
,
пробирки с культуральной жидкостью и ферментативной вытяжкой из
биомыссы дрожжей


полученные на прошлом

занятии , маркер по стеклу,
пипетки на 2 мл.


План


1 Получение ферментов .

2 Определение наличия ферментов в продуктах, полученных при
культивировании дрожжей.


1 Получение ферментов


Мельчайшая клетка, например диаметром 0,1 мкм(Mollicutes), дл
я
самостоятельного функционирования должна иметь в своем арсенале более 100
ферментов. Ферменты


это специфические белки выполняющие

роль биологических катализаторов.
В качестве источника получения
ферментных препаратов биотехнологическим способом использ
уют ткани и
органы растений, животных и микроорганизмы. По экономическим и
технологическим соображениям получать ферменты с помощью
микроорганизмов более выгодно, чем из растительных и животных источников.
В специально созданных условиях микроорганизмы спо
собны синтезировать
огромное количество разнообразных ферментов. Они неприхотливы к составу
питательной среды, легко переключаются с синтеза одного фермента на другой
и имеют сравнительно короткий цикл роста (16
-
100 часов). Продуцентами
ферментов могут быт
ь различные микроорганизмы: бактерии, грибы, дрожжи,
актиномицеты.


Поскольку микробные ферменты являются малообъемными
препаратами
относительно невысокой стоимости, методы, применяемые для их
производства, обычно осуществляются с использованием биореа
кторов
(ферментеров). Выбор питательной среды является весьма важным моментом в
процессе производства, так как она обеспечивает растущий микроорганизм
энергией, является источником необходимых элементов (углерода, азота и т. д.).
Стоимость сырьевого мате
риала непосредственно связана с ценой конечного
продукта.


В большинстве случаев ферменты получаются при ферментации с
одноразовой загрузкой, длящейся от 30 до 150 часов; процессы, основанные на
непрерывном (проточном) культивировании, нашли пока еще ма
лое применение
39

в промышленном производстве ферментов.

Существует ряд факторов, влияющих на биосинтез ферментов. В первую
очередь, к ним относится генетический. Состав и количество синтезируемых
ферментов наследственно детерминированы. Применяя мутагены мож
но
изменить генетические свойства микроорганизмов и получить штаммы с
ценными для промышленности свойствами. Несмотря на определяющую роль
генетического фактора в биосинтезе ферментов, производительность
биотехнологических процессов зависит и от состава п
итательной среды. При
этом важно не только наличие источников основных питательных веществ, но и
веществ, играющих роль индукторов или репрессоров биосинтеза данного
конкретного фермента или их групп. Механизм этого явления еще не вполне
изучен, но сам фак
т должен учитываться при выборе технологии.


В процессе выращивания продуцентов ферментов, последние могут

накапливаться внутри клеток или же секретироваться во внешнюю среду. В
мицелии трёхсуточной культуры обычно остается не более 15% ферментов.
Остальные выделяются в окружающую клетки жидкую среду. В этом случае
препараты ферментов выделяют из фильтратов после отделения биомассы .
Культуральная жидкость может быть готовым ферментным препаратом без
выделения фермента и очистки. Либо из нее выделяю
т фермент очищают и
готовят ферментный препарат. Если культивирование проводят поверхностном
способом, то весь спектр ферментов будет находиться в биомассе
-
мецелии.
Именно из него выделяют и очищают фермент если необходимо или из
биомассы готовят ф
ерментный препарат без очистки.


Основную часть ферментов, получаемых промышленным способом,
составляют гидролазы. К ним относятся, в первую очередь амилолитические
ферменты: α
-
амилаза, β
-
амилаза, глюкоамилаза. Их основная функция
-

гидролиз крахмала и г
ликогена. Крахмал при гидролизе расщепляется на
декстрины, а затем до глюкозы. Эти ферменты применяются в спиртовой
промышленности, хлебопечении.


Протеолитические ферменты образуют класс пептидгидролаз. Их действие
заключается в ускорении гидролиза пе
птидных связей в белках и пептидах.
Важная их особенность
-

селективный характер действия на пептидные связи в
белковой молекуле. Например, пепсин действует только на связь с
ароматическими аминокислотами, трипсин
-

на связь между аргинином и
лизином. Прот
еазы находят широкое применение в разных отраслях
промышленности:


мясная
-

для смягчения мяса;


кожевенная
-

смягчение шкур;


кинопроизводство
-

растворение желатинового слоя при регенерации
пленок;


парфюмерная
-

добавки в зубную пасту, кремы, лосьоны;


прои
зводство моющих средств
-

добавки для удаления загрязнений
белковой природы;


медицина
-

при лечении воспалительных процессов, тромбозов и т.д.

40


Пектолитические ферменты уменьшают молекулярную массу и снижают
вязкость пектиновых веществ. Пектиназы делятс
я на две группы
-

гидролазы и
трансэлиминазы. Гидралазы отщепляют метильные остатки или разрывают
гликозидные связи. Трансэлиминазы ускоряют негидролитическое расщепление
пектиновых веществ с образованием двойных связей. Применяются в
текстильной промышлен
ности (вымачивание льна перед переработкой), в
виноделии
-

осветление вин, а также при консервировании фруктовых соков.


Целлюлолитические ферменты очень специфичны, их действие проявляется в
деполимеризации молекул целлюлозы. Обычно используются в вид
е комплекса,
доводящего гидролиз целлюлозы до глюкозы (в гидролизной промышленности).
В медицинской промышленности их используют для выделения стероидов из
растений, в пищевой
-

для улучшения качества растительных масел, в сельском
хозяйстве
-

как добавки
в комбикорма для жвачных животных.

Из многих тысяч
изученных и охарактеризованных ферментов на долю 20 приходится более 90 %
ферментов, которые используются в настоящее время в промышленности.


2 Определение активности ферментов в продуктах, полученных
при
культивировании дрожжей


Дрожжи при размножении синтезируют для своей жизнедеятельности
большое количество ферментов. Наиболее значимые это гидролазы :амилаза ,
инвертаза , протеаза. Ферменты могут находиться как в клетке так и в
культуральной жид
кости . Определить где фермент накапливается можно с
помощью качественных реакций на продукты действия ферментов.


Практическое задание


Определить наличие ферментов инвертазы, амилазы и протеазы в пробах
фермента , полученных при культивир
овании дрожжей.



Этапы выполнения задания:


1 Взять по 3 пробирки для обнаружения каждого фермента и пронумеровать.


2 В 3 пробирки налить по 1 мл 0,1% раствора крахмала (К1,К2,К3) и в другие 3
пробирки налить 0,1 % раствора сахарозы (С1,С2,С3)и еще
в 3 пробирки налить
0,1% раствор желатина (Ж1,Ж2,Ж3).


3 В пробирки К1,С1, Ж1 добавить по 1мл пробы культуральной жидкости
после культивирования дрожжей . В пробирки К2,С2, Ж2 добавить по 1мл
пробы экстракта биомассы дрожжей (ферментативная вытяжка). Дл
я контроля в
пробирки К3,С3, Ж3 внести по 1 мл физ. раствора.


4 Все пробирки поместить на водяную баню на 15 минут температурой 37 С.


5Из пробирок К1,К2,К3 по 1мл перенести в чистые пробирки и
пронумеровать аналогично.


6 В пробирки К1,К2,К3 (3 проби
рки) вносят по одной капле 0,1% раствора
йода. Отмечают наличие синего окрашивания . В контрольной пробирке
должно быть окрашивание Отсутствие окраски расвора крахмала в опытных
пробирках свидетельствует о гидролизе крахмала.


7 В другие пробирки К1
,К2,К3 (3 пробирки) внести по одной капле реактива
Феленгера. Нагреть над спиртовкой до кипения. Желто
-
оранжевое помутнение
сведетельствует о наличии глюкозы , продукта гидролиза сахарозы. В
41

контрольной пробирке помутнения быть не должно.


8 В пробирки с

раствором сахарозы добавить по 2 капли реактива Фелингера.
Нагреть над спиртовкой до кипения. Желто
-
оранжевое помутнение
свидетельствует о наличии глюкозы , продукта гидролиза сахарозы. В
контрольной пробирке помутнения быть не должно.


9 В пробирки с ра
створом желатина добавить порошок оксида меди и кипятят 2
минуты .И
зменение цвета раствора на голубой указывает на наличие
продуктов гидролиза белка (аминокислоту глицин). В контрольной пробирке
изменения цвета быть не должно.


10 Сделать вывод о содержа
нии ферментов амилазы, инвертазы и протеазы в
культуральной жидкости и экстракте биомассы дрожжей.


11 Определить какой продукт биотехнологической стадии биомасса или
культуральная жидкость можно использовать для получения каждого фермента.


Вопросы и
задания для контроля знаний

1 Дайте определение понятию «Фермент».

2 В чем состоит преимущество ферментов микробного происхождения?

3 Как получают ферменты микробным синтезом?

4 Какие ферменты применяют в промышленности и сельском хозяйстве?

5 Как получит
ь фермент из биомассы микроорганизма?




ТЕМА 9

«Определение активности ферментного препарата
амилазы , полученного из биомассы дрожжей»


Цель:

сформировать умение определять активносить ферментного препарата
-
амилазы.


Материальное обеспечение

Вытяжка из биомассы дрожжей (экстракт фермента амилазы) , пробирки,
штатив, ацетатный буфер, пипетки на 1
-
2 мл насыщенный раствор хлорида
натрия, баня 40 С, 0,1 % раствор крахмала , 1% раствор йода.


План

1 Ферментные препараты и определение их актив
ности.

2 Определение активности фермента амилазы .



1 Ферментные препараты и определение их активности


Коммерческие препараты ферментов могут выпускаться в продажу либо в

жидкой, либо в кристаллической форме; В виде неочищенных

"грубых" препар
атов с различными примесями содержащихся в культуральной
среде или прессованной высушенной и измельченной биомассы
микроорганизма . Ферментные препараты выпускают очищенными в разной
степени. Степень очистки препарата указывается на этикетке виде индекса

Индекс 2х обозначает жидкий неочищенный концентрат исходной культуры; 3х
-

сухой ферментный препарат, полученный высушиванием распылением
неочищенного раствора фермента (экстракта из поверхностной культуры или
культуральной жидкости). Технические ферментн
ые препараты с индексами 2х
и 3х чаще используются в легкой промышленности и сельском хозяйстве.
42

Например, в препаратах, используемых для гидролиза крахмала, целлюлозы,
основным критерием является высокая активность основного фермента в
препарате, а наличи
е других активностей зачастую не принимают во внимание.
Для пищевой промышленности, медицины и научных
исследований(молекулярной биологии, генной инженерии) требуются
очищенные и высоко очищенные ферментные препараты. Индекс 10х означает
сухие препараты, п
олученные осаждением ферментов органическими
растворителями или методом высаливания; цифрами 15х, 18х, 20х обозначают
препараты, частично освобожденные не только от балластных веществ, но и от
сопутствующих ферментов; выше 20х
-

высокоочищенные и даже гомо
генные
ферментные препараты.


Микроорганизмы, служащие источником для получения разнообразных

ферментов, существенно различаются между собой по способности синтези
-

ровать данные биологически активные соединения. Эти различия проявляются
как в ассорт
именте синтезируемых ферментов тем или иным микробным видом,
так и в их активности и исходных свойствах. Ферменты могут накапливаться в
самой биомассе микроорганизма , либо выделяться в культуральную жидкость.
Чтобы определить какой из продуктов биотехнол
огической стадии биомасса
или культуральная жидкость будет дальше использоваться для получения
препарата фермента, определяют где активность фермента выше. После
получения препарата фермента обязательно определяют его активность ,
которую отображают такж
е на этикетке препарата.


Ферменты


вещества белковой природы, поэтому в смеси с другими белками
определить их не представляется возможным. Наличие и активность фермента
устанавливают по протеканию той реакции, которую катализирует фермент;
количеств
енное определение фермента проводят по величине образовавшегося
продукта реакции либо по расходу исходного субстрата. Принята так
называемая стандартная единица активности (E или U)
, которая

выражается в
микромолях субстрата, прореагировавшего под действ
ием 1 мл

ферментного


раствора или 1 грамма

препарата


в оптимальных условиях за 1 минуту. Если

ферментный



препарат


не содержит балласта, то его активность выражается в
тех же стандартных единицах на 1 мг фермента. Если же есть балласт, то
активность

считается на 1 мг белка в

ферментном



препарате

. Активность
выпускаемого препарата
-

важнейший нормируемый показатель качества.


2 Определение активности фермента амилазы



Амилазную активность выражают в миллилитрах 0,1%
-
ного раствора
крахмала,
гидролизуемого одним миллилитром раствора фермента амилазы при
40
-
оС в течение 15 мин


Практическое задание


Определить амилолитическую активность пробы ферментативной вытяжки
из биомассы дрожжей .


Этапы выполнения задания:


1 Взять 6 пронум
ерованных пробирок для пробы и 1

пробирку для контроля.

43


2 В каждую пробирку внести 1 мл ацетатного буфера.


3 В пробирку №1
-
1/2 внести пробу фермента 1 мл из пробирки №1,
перемешать и перенести 1 мл в пробирку №1
-
1/4, перемешать и перенести 1 мл
в п
робирку №1
-
1/8, перемешать и перенести перемешивают и перенести 1 мл в
пробирку №1
-
1/16, перемешать и перенести 1 мл в пробирку №1
-
1/32,
перемешать и перенести 1 мл в пробирку №1
-
1/64. М Из этой пробирки 1 мл
удалить в дез. раствор.


4 В контроль внести

вместо фермента 1 мл дистиллированной воды


5 Во все пробирки внести по 2мл 0,1% раствора крахмала и 0,4 мл
насыщенного раствора хлорида натрия.


6 Все пробирки инкубировать водяной бане 40 С 15 мин и охладить.


7 В каждую пробирку внести раствор йод
а по 1 капле.


8 Расчитать амилолитическую активность каждой пробы

Для расчета принимают во внимание последнее разведение, в котором после
добавления йода не появился синий цвет. Например, это третья пробирка, а в
четвертой уже синее окрашивание, тогда р
азведение соответствует 1/8.

Расчет: 1/8 мл разведения фермента расщепляет 2 мл 0,1%
-
го крахмала:

1 мл
-----

Х мл;



Х= 1х 2 :1/8 =16

Следовательно, 1 мл не разведенного фермента расщепляет за 15 мин 16 мл
0,1%
-
го раствора крахмала. Значит амилолитическа
я активность ( Е )фермента
дрожжей составляет 16


Вопросы и задания для контроля знаний


1 Чем отличается фермент от ферментного препарата?

2 Как можно определть активность фермента?

3 Как определяют активностьфермента амилазы?

4 какую ферментативную р
еакцию катализирует амилаза?

5 Опишите методику определения амилолитической активности пробы
ферментативной вытяжки из биомассы дрожжей.



ТЕМА 10

«Иммобилизация клеток микроорганизма и
определение их ферментативной активности»



Цель:
сформирова
ть навыки получения иммобилизированных клеток в в
агаровом геле и проверки их активности.


Материальное обеспечение


Физиологический раствор, культура бульонная микроорганизма с
пераксидазной активностью,

4 % раствор альгината натрия,
4% агаровый
гель,
0,2М раствор хлорида кальция, чашка Петри, стеклянная пластина,
пипетки на 1
-
2 мл, спиртовка, пробирки, держатели для пробирок, насыщеный
раствор сульфата аммония, водяная баня 37 С, штатив,


План

1 Иммобилизированные ферменты преимущества и получен
ие.

2 Иммобилизированные клетки преимущество и получение.


44


1 Иммобилизированные ферменты преимущества и получение


Использование в биотехнологическом производстве

ферментов в изолированном виде, резко повысило его уровень в целом, а

также предсказуе
мость результатов на каждой производственной стадии.

Однако, при этом пришлось решать проблему нестабильности многих

ферментов. Дело в том, что изолированные ферменты не защищены

системами клеточного гомеостаза и большинство их в таком виде

относительно бы
стро теряет активность, которая зависит даже от

незначительных физико
-
химических изменений среды. С другой стороны,

при цикличности производственных процессов требуется постоянно

повторяющаяся наработка высокоочищенных ферментных препаратов, что

связано с
большой затратой сил и средств. Проблема была решена, путем

создания так называемых «промышленных биокатализаторов»
-

иммобилизованных ферментов.



Иммобилизованные ферменты обнаруживают несколько преимуществ над
своими растворимыми аналогами:

1) могут б
ыть отделены от продукта и использованы повторно,

что снижает стоимость процесса;

2) часто обнаруживают повышенную стабильность и длительно сохраняют
активность;

3) пригодны для непрерывных процессов, которые, в свою очередь, облегчают
контроль за качеств
ом и снижают стоимость труда;

4) время реакции может быть уменьшено за счет создания более выокого
соотношения ферментов и субстратов;

5) можно создавать мультиферментные системы.


Для получения иммобилизованных ферментов обычно применяют

следующие мето
ды:


1 Ковалентное присоединение молекул ферментов к водонерастворимому

носителю, в качестве которого используют как органические (природные и

синтетические) полимеры, так и неорганические материалы. К природным

материалам относятся целлюлоза, хитин, аг
ароза, декстраны, бумага,

ткани, полистирол, ионообменные смолы и так далее.


2 Захват фермента в сетку геля или полимера.


3 Ковалентная сшивка (сшивание) молекул фермента друг с другом или с

инертными белками при помощи би
-

или полифункционального ре
агента.


4 Адсорбция фермента на водонерастворимых носителях (часто на ионитах)


5 Микрокапсулирование (захват раствора фермента в полупроницаемые

капсулы размером 5
-
300 миллимикрон).


Способ иммобилизации ферментов путем включения в трехмерную струк
туру
полимерного геля широко распространен благодаря своей простоте и
уникальности. Метод применим для иммобилизации не только

индивидуальных ферментов, но и мультиэнзимных комплексов и даже

интактных клеток. Иммобилизацию ферментов в геле осуществляют

дву
мя способами. В первом случае фермент вводят в водный раствор

45

мономера, а затем проводят полимеризацию, в результате которой

возникает пространственная структура полимерного геля с

включенными в его ячейки молекулами фермента. Во втором случае

фермент внос
ят в раствор уже готового полимера, который

впоследствии переводят в гелеобразное состояние. Для первого

варианта используют гели полиакриламида, поливинилового спирта,

поливинилпирролидона, силикагеля, для второго


гели крахмала,

агар
-
агара, каррагинана,

агарозы, фосфата кальция.


Иммобилизация ферментов в гелях обеспечивает равномерное

распределение энзима в объеме носителя. Большинство гелевых матриц

обладает высокой механической, химической, тепловой и

биологической стойкостью и обеспечивает возможн
ость многократного

использования фермента, включенного в его структуру. Однако метод

непригоден для иммобилизации ферментов, действующих на

водонерастворимые субстраты.


2 Иммобилизированные клетки преимущество и получение


Однако применение ферменто
в ограничено из
-
за их низкой стабиль
-

ности, способности катализировать только одну единственную реакцию,

высокой стоимости чистых препаратов. Кроме того, для практических

целей могут использоваться только те ферменты, для которых не требу
-

ется регенераци
и кофакторов. Поэтому в настоящее время наряду с им
-

мобилизацией ферментов внимание исследователей все больше привле
-

кает иммобилизация клеток и органелл. Живая клетка в отличие от фер
-

мента представляет собой готовый биотехнологический реактор, в кото
-

ром реализуются не только процессы, приводящие к образованию конеч
-

ного продукта, но и многие другие, способствующие поддержанию ката
-

литической эффективности системы на высоком уровне (например, реге
-

нерация кофакторов). Поскольку ферменты функциониру
ют в нативном

окружении, их денатурация в процессе работы сводится к минимуму.

Это расширяет число применяемых ферментов и позволяет осуществлять

как процессы синтеза, так и процессы деградации.


Использование иммобилизованных клеток имеет несколько пре
имуществ.


Во
-
первых, появляется возможность длительной эксплуатации клеток в случае
непрерывной ферментации.


Во
-
вторых, известны примеры повышения устойчивости клеток к действию
различных неблагоприятных внешних факторов (температуры, кислотности,
к
онцентрации токсичных веществ и других) в результате иммобилизации.


В
-
третьих, существенно упрощаются процедуры выделения используемых
клеток и культуральной жидкости, содержащей целевой продукт.


В
-
четвертых, благодаря применению иммобилизации обыч
но снижаются
энергозатраты на процесс в целом: за счет уменьшения (а следовательно, и
удешевления) размеров применяемых ферментеров; а также за счет упрощения
процедур выделения и очистки конечного продукта.

В промышленной микробиологии системы твердожидко
стного типа нашли
46

применение при очистке сточных вод, в производстве органических
растворителей и кислот и т.

д.


Иммобилизованные клетки идеально подходят для использования в

реакторах с перемешиванием, через которые пропускают субстрат. Пре
-

имущество
м таких реакторов является возможность их многократного

использования и получения продукта, свободного от фермента. Конечно,

использование иммобилизованных клеток не лишено недостатков. На
-

пример, клеточная стенка или плазматическая мембрана могут препятс
т
-

вовать проникновению субстрата к ферменту или диффузии продукта из

клетки. Кроме того, возникает необходимость поддержания целостности

клеток и удержания их в той фазе роста, в которой синтезируются тре
-

буемые ферменты. Наконец, из
-
за большого числа пр
исутствующих в

клетке ферментов (что в ряде случаев рассматривается как достоинство)

возможно протекание нежелательных побочных реакций.

Для иммобилизации клеток используется множество способов (сорб
-

ция инертными и ионообменными носителями, ковалентное с
вязывание

с полимерным носителем, включение в гель) и носителей разных типов

(природные и синтетические полимеры и неорганические вещества).

Включение живых клеток требует мягких условий иммобилизации, но
-

ситель при этом должен представлять собой систему
открытых пор с хо
-

рошими условиями для газообмена. Следует принимать во внимание и

возможное вредное влияние на жизнеспособность клеток сшивающих

агентов. Наибольшее распространение получило включение клеток в по
-

лиакриламидный гель и гель альгината каль
ция.


Альгинат


основной структурный полисахарид бурых морских водо
-

рослей. В присутствии моновалентных катионов полисахарид образует

вязкий раствор, тогда как в присутствии двухвалентных катионов, осо
-

бенно кальция, наблюдается образование геля. Пос
кольку гель образует
-

ся в мягких условиях, в нем можно иммобилизовать живые клетки.


Практическое задание 1



Осуществить иммобилизацию клеток Pseudomonas fluorescens в гель

альгината кальция.


1 3 мл ночной культуры бактерий Pseudomonas fluoresce
ns центри
-

фугировать 5 мин при 7 000 об/мин и ресуспендировать в физиологи
-

ческом растворе (1,5 мл).


2 Осторожно смешать 1,5 мл клеточной суспензии с 1,5 мл

4 %

раствора альгината натрия.


3 С помощью стеклянной пипетки (объемом 1

2 мл) полученную

с
месь скапывают с высоты около 20 см в чашку Петри с 0,2 М рас
-

твором CaCl2;


4 оставляют частицы альгината кальция с включенными в них клет
-

ками в растворе CaCl2 на 5 мин для затвердевания.


Практическое задание 2


Провести иммобилизацию клеток м
икроорганизма в агаровом геле

47


Этапы выполнения задания:

1. Приготовить суспензию микроорганизма

1.1 В пробирку с культурой на косяке внести 2 мл физ. Раствора и смыть
культуру с агара вращательными движениями.

1.2 Перелить в чистую пробирку 1мл суспенз
ии.

2. Расплавить 1 мл 4% агарового геля на водяной бане или над спиртовкой и
остудить до 45 С.

3. В гель влить 1 мл суспензии микроорганизма и тщательно перемешать.

4. Набрать в шприц смесь и каплями нанести на необезжиренное предметное
стекло и дать з
астыть.


Практическое задание 3


Определить эффективность работы фермента каталазы у иммобилизованных
клеток двумя способами.


Этапы выполнения задания:

1 Несколько сферических частиц с иммобилизованными клетками каждым
способом с помощью пинцета

поместить в пробирки с перекисью водорода (3
% раствор).Появление пузырьков воздуха сведетельствует об активности
ферментов клеток включенных в гель.

2 Эффективность работы каталазы оценить по интенсивности образования
пузырьков водорода.

3 Сделать выв
од об эффективности иммобилизации клеток разными способами


Вопросы и задания для контроля знаний

1. Охарактеризуйте способы иммобилизации клеток и ферментов.

2. Приведите примеры успешного применения иммобилизованных

клеток и ферментов в практике.

3. О
пишите преимущества и недостатки иммобилизации клеток и

ферментов по сравнению с использованием бактериальных культур

и очищенных ферментов.





ТЕМА 11
«
Биотехнологические основы производства кисло
-
молочных продуктов
»


Цель:

сформировать знания о би
отехнологическими основах производства
кисломолочных продуктов и умения различать их виды .


Материальное обеспечение


Мультимедийная аппаратура, фильмы: «Производство йогурта»,

«Производство кефира», «Производство сметаны», «Производство ряженки»,
«Производство сыров»


План

1 Общие правила изготовления кисломолочных продуктов.

2 Классификация кисломолочных продуктов в зависимости.

от используемой закваски.

3 Виды кисло
-
молочной продукции.

48

4 Просмотр фильмов «Производство йогурта», «Производств
о кефира».
«Производство сметаны», «Производство ряженки» «Производство сыров».



1 Общие правила изготовления кисломолочных продуктов


Технологический процесс производства кисломолочных продуктов
складывается из тех же составляющих как и любой биоте
хнологический
процесс:

1 Подготовительная.

2 Биотехнологическая.

3 Получение готовой продукции.


Подготовительная стадия включает подготовку оборудования и питательной
среды и посевной культуры. В данном производстве питательной средой
является молоко.

Подготовка его заключается в уничтожении микрофлоры,
находящейся в молоке
-
пастеризации. Суть ее заключается в кратковременном
нагревании молока до 80
-
90°С с резким охлаждением до 10°С. Такой метод
позволяет уничтожить микрофлору и сохранить все ценные св
ойства молока, в
том числе и витамины. Так как обычная стерилизация (нагрев до 100°С и
выше), либо разрушает биологически ценные вещества, либо изменяет
структуру.


В качестве посевной культуры используют закваски. Закваска


основной
источник внесения

желаемой микрофлоры в молоко при производстве
кисломолочных продуктов. Закваска является чистой посевной культурой
микроорганизмов. При внесении закваски молоко обогащается микрофлорой,
производящей сквашивание молока и способствующей накоплению вкусовых
и
ароматических веществ.


Для заквашивания молока и сливок издавна применяли простоквашу или
сливки высокого качества. В качестве естественных заквасок использовали
пахту, сквашенные сливки или кислое молоко. Они не гарантировали получение
продукта высо
кого качества, так как содержали различные микроорганизмы и
часто загрязнялись посторонней микрофлорой, вызывающей порчу продукта.
Бактериальные закваски в промышленном масштабе впервые стали применять в
маслоделии в конце прошлого столетия.


В молочной

промышленности используются закваски, полученные из чистых
культур микроорганизмов, которые готовят в специальных лабораториях.
Состав микрофлоры подбирают таким образом, чтобы обеспечить для каждого
вида продукта свойственный ему запах, вкус, консистенци
ю. В молочной
промышленности применяют в основном жидкие закваски и закваски,
высушенные способом сублимационной сушки; сухие, жидкие и подвергнутые
глубокому замораживанию бактериальные концентраты, бактериальные
препараты. Для приготовления кисломолочных

продуктов на молоко
-
перерабатывающих предприятиях готовят производственные закваски из
поступивших сухих или жидких препаратов. Для этого порцию закваски вносят
в стерилизованное молоко и выдерживают 12
-
18 часов. Получают первичную
или материнскую закваск
у. Затем эту закваску в объеме 0,5
-
1% вносят в
49

стерилизованное молоко и через 4
-
8 часов получают производственную
закваску.


2 Классификация кисломолочных продуктов в зависимости

от используемой закваски


В зависимости от состава микрофлоры заквасо
к и способа приготовления
кисломолочные продукты делят на следующие группы:


-
Вырабатываемые с использованием многокомпонентных заквасок
(кефир, кумыс). Микрофлора этой группы продуктов состоит из молочнокислых
бактерий (одного или нескольких видов), дрожж
ей и нередко уксуснокислых
бактерий. Дрожжи и уксуснокислые бактерии придают продуктам
специфические вкус и аромат. При производстве кефира применяют
естественную симбиотическую закваску


кефирные грибки, состоящие из
молочнокислых бактерий , дрожжей и н
екоторых видов стрептококков. Кумыс
получают из кобыльего молока с помощью молочнокислых бактерий ,
стрептококков и дрожжей, сбраживающих лактозу. Сквашивание молока при
использовании таких заквасок проводят при 20
-
22°С в течение 10
-
12 часов.


-
Вырабатывае
мые с использованием мезофильных молочнокислых
стрептококков (творог, сметана, простокваша обыкновенная). Основными
представителями микрофлоры таких продуктов являются молочнокислые
стрептококки: . Сквашивание молока происходит через 6
-



-
Изготовляемые с применением термофильных молочнокислых бактерий
(ряженка, варенец, йогурт, простокваша Южная, Мечниковская). Для
приготовления этих кисломолочных продуктов используют смесь
молочнокислых бактерий (10:1) Streptococcus thermophillu
s и Lactobacillus
bulgaricus (болгарская палочка). Заквашивание молока этими бактериями
проводят при 40
-
42°С в течение трех часов.


-
Вырабатываемые с применением термофильных и мезофильных
молочнокислых бактерий (любительская сметана, сметана с пониженным
содержанием жира, напитки «Любительский» «Юбилейный», «Русский»).
Основными представителями микрофлоры таких продуктов являются
мезофильные и термофильные молочнокислые стрептококки. Температура
сквашивания молока при использовании смешанных заквасок
-

33
-
38°С.


-
Приготовляемые с использованием ацидофильных бактерий и
бифидобактерий: ацидофильное молоко, ацидофилин, бифидопродукты


продукты лечебно
-
профилактического питания. В состав микрофлоры этих
продуктов входят: ацидофильная палочка, болгарская палочк
а, молочнокислый
стрептококк, бифидобактерии и др.


Технологический процесс изготовления кисломолочных продуктов
называется сквашивание и сводится в общих чертах к тому, чтобы,
предоставить «избранным» видам полезных микроорганизмов наиболее
благоприят
ные условия для развития и, благодаря этому, получить готовый
продукт с характерными для него свойствами.


Свойства конечного продукта зависят от характера и интенсивности реакции
ферментации. В молоке при ферментации могут протекать шесть основных
50

реа
кций. В результате образуется молочная, пропионовая или лимонная
кислота, спирт, масляная кислота или же происходит колиформное
газообразование. Главным процессом является молочнокислое брожение,
вызываемое стрептококками и молочнокислыми бактериями, при к
отором
лактоза (молочный сахар) превращается в молочную кислоту.


В результате биотехнологического процесса получают готовый продукт
представляющий собой культуральную жидкость и биомассу бактерий. В
данном случае измененное молоко с заквасочными микр
оорганизмами.


3 Виды кисло
-
молочной продукции


Виды кисло
-
молочной продукции разнообразны.


Йогурт.
Это один из древнейших продуктов, получаемых путем
ферментации. После термообработки молоко заквашивают добавлением 2
-
3 %
закваски йогурта.
Температура при брожении поддерживается около 40°С.
Главную роль здесь играют бактерии термофильный стрептококк, болгарская
палочка Для получения желаемой консистенции продукта, вкуса и запаха эти
организмы должны содержаться в культуре приблизительно в ра
вных
количествах.

Своим характерным вкусом йогурт обязан молочной кислоте, получаемой из
лактозы молока, и ацетальдегиду.


Сметана.
Ее готовят почти так же, как сброженную пахту. К пастеризованным
сливкам добавляют 0,5
-
1 % закваски, используемой при пр
оизводстве масла
(молочнокислые бактерии). Эта закваска представляет собой смесь
молочнокислых стрептококков и образующих ароматические вещества
бактерий лейконосток. И те, и другие микроорганизмы нужны для
формирования полноценного вкуса и запаха ; стре
птококки при этом
доминируют. Роль молочнокислых стрептококков в закваске заключается в
образовании молочной кислоты (она дает желаемый кисловатый вкус),
свертывании молока и снижении рН до значений, при которых образующие
ароматические вещества бактерии с
интезируют наибольшее количество
летучих кислот. Продукт выдерживают, пока концентрация кислоты не
достигнет 0,6 %.


Кефир.

Получают этот продукт, используя закваску на кефирных грибках.
Для этого молоко , содержащее высокий процент белка и сахара пасте
ризуют и
вносят кефирные грибки, выдерживают 12 часов при 20 С. Полученную
закваску добавляют в емкости с подготовленным молоком. Процесс
сбраживания идет 12
-
13 часов затем полученный кефир охлаждают и
выдерживают для созревания 10 часов.


Бифидопродукт
ы
представляют группу продуктов лечебно
-
профилактической направленности и относятся к эубиотикам (биологически
активным добавкам, обеспечивающим нормальный состав и функциональную
активность микрофлоры кишечника). В большинстве бифидопродуктов
используются

бактерии вида бифидобактерии бифидум.


Ассортимент бифидопродуктов:

-

бифидокефир


вырабатывается на цельном или обезжиренном молоке с
51

использованием кефирного грибка и закваски бифидобактерий или
бактериального концентрата бифидобактерий;

-

бифидойо
гурт или биойогурт


вырабатывается на цельном молоке с
использованием заквасок на ацидофильной или болгарской палочках,
термофильном стрептококке и обогащением закваской бифидобактерий или
бактериальным концентратом бифидобактерий;

-

бифидосметана или би
осметана


вырабатывается на сливках с
использованием заквасок на молочнокислых бактериях и обогащением
закваской или бактериальным концентратом бифидобактерий;

-

бифилин


вырабатывается из натурального коровьего молока путем
сквашивания чистой культурой
бифидобактерий, способных подавлять условно
-
патогенную микрофлору кишечника.


Сыр.
Готовят сыр из творога, полученного в результате свертывания казеина
цельного или обезжиренного молока. Свертывание казеина происходит под
влиянием микробных ферменто
в и молочной кислоты или с помощью
сычужного фермента. В свертывании принимают участие молочнокислые
бактерии В результате свертывания белка кальций отделяется от казеина,
последний выпадает в виде хлопьев водонерастворимой казеиновой кислоты.
Для изготов
ления различных видов сыра используют овечье, козье, коровье или
кобылье молоко. В зависимости от технологии сыроварения сыворотку
полностью или частично отделяют от творога на фильтр
-
прессе. Творог
засевают культурами микроорганизмов в соответствии с сорт
ом получаемого
сыра. При его созревании под влиянием выделяемых микроорганизмами
ферментов химический состав и физические свойства творога существенно
меняются. Большое разнообразие сортов сыра объясняется природой и
свойствами микробных культур, служащих
исходными культурами при
свертывании молока, температурой изготовления и наличием или отсутствием
вторичной микрофлоры, растущей на сыре. Некоторые виды сыров специально
заражают спорами плесневого гриба
Penicillium roquefortii
. Рост плесени в
мякоти сыра
придает ему характерный вкус и аромат (Датский голубой,
Горгонзола, Рокфор и др.) Острый привкус сыра Рокфор также обусловлен
действием микробной липазы


фермента, расщепляющего жиры молока с
образованием жирных кислот (капроновой, каприновой, каприловой
и др.).
Другой сорт сыра с плесенью


Камамбер


получают с помощью гриба
пенициллум камамберти

и
готовят по той же технологии. Созревание сыра
длится от нескольких недель до нескольких месяцев (для сыра Чеддер


8 мес.).
В первые недели созревания число
микроорганизмов в массе сыра
увеличивается и достигает нескольких сотен миллионов на 1 г сыра, потом
число живых бактерий и дрожжей снижается. Сыр должен созревать при
пониженной температуре (для сыра Рокфор


не выше 9°С).


Коровье масло.

Из молочных п
родуктов проще всего получать коровье масло.
В зависимост
и от сорта производимого масла используют сливки с
концентрацией жира от 30
-
32 до 40 %. При их сбивании эмульсия масла в воде
превращается в эмульсию воды в масле.
При производстве масла для
52

улучшени
я вкуса и лучшей сохранности используют особые культуры бактерий.
Улучшение вкуса было достигнуто путем создания
специальных

штаммов
бактерий, отобранных по способности синтезировать нужные вещества,
влияющие на вкус. Первыми для этой цели были использован
ы штаммы
молочнокислого стрептококка и леконостока.

Помимо улучшения вкуса таким
путем удается устранить и некоторые нежелательные привкусы. Перспективный
способ доработки масла основан на добавлении липаз (ферментов,
расщепляющих липиды). Внедрение его п
озволит пускать масло в продажу
непосредственно из маслобойки.


Новые продукты
.
Известно, что некоторые люди не переносят лактозу; для
них можно выпускать молоко, обработанное
-
галактозидазой


ферментом,
который уменьшает содержание лактозы. Для этой

цели нужно разработать
недорогой промышленный способ производства такого молока.
-
галактозидазу получают из дрожжей, плесневых грибов и бактерий.


Практическое задание


Зарисовать схему производства кисломолочного продукта (на выбор).


Этапы вы
полнения задания:

1 Выбрать технологию одного кисломолочного продукта и изучить материал
занятия и просмотренных фильмов.

2 Выделить основные этапы производства этого продукта.

3 Изобразить в виде схематического рисунка технологию производства,
выбранног
о кисломолочного продукта в тетради.


Вопросы и задания для контроля знаний

1 Что относят к кисломолчным продуктам?

2 Назовите сырье и биообъекты, которые используют для производства
кисломолочных продуктов.

3 Что такое закваска?

4 Раскройте общие прав
ила изготовления кисломолочных продуктов

5 Какие кисломолочные продукты вы знаете?

6 Опишите технологический процесс изготовления кисломолочных продуктов .

7 В чем особенности производства сметаны и ряженки?

8 Как делают кефир ?

9 Что относят к бефидопрод
уктам?

10 Почему изготовление коровьего масла является биотехнологическим
процессом?

11 Чем отличается производство сыра и творога от получения других кисло
-
молочных продуктов .

12 Какой фермент используют для производства сыра?




ТЕМА 12 «
Закваски для

кисломолочных продуктов и
определение их качества
»


Цель:
сформировать знания о заквасках и навыки осуществления методики
определения качества заквасок, применяемых для получения кисломолочных
53

продуктов.


Материальное обеспечение


Закваски жидки
е, в колбах для ряженки, для йогурта, закваска сухая для
сметаны, Среда Кесллера в пробирках, среда Сабуро в чашке Петри, солевой
агар в чашке Петри, молоко стерильное в пробирке, молоко стерильное с
метиленовой синью в пробирке,пипетки, спиртовки, термос
тат,предметные
стекла , метиленовая синь, микроскоп.


План

1 Закваски, правила изготовления и пороки.

2 Определение качества заквасок.



1 Закваски, правила изготовления и пороки


Закваска


основной источник внесения желаемой микрофлоры в моло
ко при
производстве кисломолочных продуктов. Закваска является чистой посевной
культурой микроорганизмов. При внесении закваски молоко обогащается
микрофлорой, производящей сквашивание молока и способствующей
накоплению вкусовых и ароматических веществ.

В
молочной промышленности используются закваски, полученные из чистых
культур микроорганизмов, которые готовят в специальных лабораториях.

Различают одноштаммовые закваски, состоящие из одного штамма
микроорганизма, многоштаммовые
-
из нескольких штаммов одно
го вида и
смешанные


из штаммов нескольких видов микроорганизмов. Состав
микрофлоры подбирают таким образом, чтобы обеспечить для каждого вида
продукта свойственный ему запах, вкус, консистенцию.

По составу микрофлоры закваски бывают трех групп бактериа
льные, грибковые
и смешанные (бактериально
-
грибковые).


В молочной промышленности применяют в основном жидкие закваски и
закваски, высушенные способом сублимационной сушки; сухие, жидкие и
подвергнутые глубокому замораживанию бактериальные концентраты,
б
актериальные препараты.
Закваску готовят на цельном или обезжиренном
молоке хорошего качества, которое стерилизуют при температуре 121 С с
выдержкой 15
-
20 минут (при приготовлении лабораторной закваски) или
пастеризуют при 92
-
95 С с выдержкой 20
-
30 минут
(при приготовлении
производственной закваски). Сразу после термической обработки молоко
охлаждают до температуры заквашивания.


Для проиготовления кисломолочных продуктов на молокоперерабатывающих
предприятиях используют производственные закаски, которы
е готовят в
несколько этапов из поступивших концентратов.


1 Проверка лабораторной культуры на активность. Для этого порцию
закваски вносят в 100 мл подготовленного молока. Сквашивание должно
наступить через 16
-
18 часов


2 Приготовление материнской (
первичной ) закваски .

Для изготовления творога, сметаны 0,5 порции сухой закваски вносят в 1 л
подготовленного молока. Для изготовления жидких кисломолочных продуктов
54

кроме кефира 1 порцию сухой закваски на 100 мл молока. Сквашивание
наступает через 12
-
18 часов.


3 Приготовление производственной закваски . 0,5
-
1 % материнской
закваски вносят в необходимый объем подготовленного молока . Сквашивание
наступает через 4
-
8 часов. При приготовлении закваски проводят несколько
последовательных перес
евов каждые сутки в возрастающие объемы (1:10) до
доведения объема, необходимого в производстве. После каждого пересева и
перед выпуском в производство закваску контролируют по органолептическим,
химическим и микробиологическим показателям.

Полученную прои
зводственную закваску вносят в пастеризованное молоко в
количестве 1
-
5 % в зависимости от условий производства. В результате
биохимических процессов в молоке происходит образование белого сгустка,
частично расщепляются белки молока, формируется вкус и ар
омат продукта

Более удобно использовать бактериальные концентраты. В этом случае нет
необходимости готовить производственную закваску. После активизации
концентрат вносят в пастеризованное молоко.



В заквасках могут быть различные пороки. Так, в закваска
х, состоящих из
мезофильных молочнокислых стрептококков, одним из наиболее
распространенных пороков является развитие термоустойчивых
молочнокислых палочек. Он возникает в результате нарушения режимов
пастеризации, неэффективного охлаждения готовой закваск
и. Закваски для
масла и сыра нередко имеют сниженную способность к образованию аромата,
что может быть связано с качеством исходной закваски, содержащей
недостаточное количество ароматобразующих стрептококков; качеством
молока; нарушением температурного р
ежима сквашивания; недостаточной
продолжительностью созревания.
Снижение качества заквасок может быть
связано с развитием бактериофагов, наличием в молоке ингибирующих
веществ. Иногда в закваске для сметаны, реже


для творога, появляется
тягучесть. В случ
ае появления этого порока данную закваску заменяют
закваской из другой партии и тщательно следят, чтобы не снижалась
температура сквашивания.В заквасках, состоящих из термофильных
молочнокислых стрептококков, чаще всего наблюдается развитие
термоустойчивых

молочнокислых палочек, а также возникновение излишней
тягучести.В многокомпонентных заквасках пороки, как правило, обусловлены
нарушением условий культивирования кефирных грибков. Одним из наиболее
распространенных пороков является ослизнение кефирных гри
бков и появление
тягучести в грибковой закваске уксуснокислых бактерий.

Распространен порок,
выражающийся в снижении активности кефирной закваски. Он возникает в
результате накопления в закваске молочнокислых палочек, которые, повышая
кислотность, подавляю
т развитие молочнокислых стрептококков
-

активных
кислотообразователей.Чрезмерное увеличение дозы вносимой закваски
приводит к повышению кислотности молока и получаемого продукта.
Недостаточное внесение заквасочных культур может приводить к нарушению
биохи
мических процессов в сырной массе, и активизации посторонней,
55

технически вредной микрофлоры, что в результате увеличивает вероятность
появления горечи, нечистоты и других пороков вкуса и запаха.


При переработке молока с механической загрязненностью, при
менении
молока с низкой первоначальной кислотностью, слабом молочнокислом
процессе увеличивают дозы вносимых заквасочных культур. Однако
чрезмерное увеличение дозы вносимой закваски не способствует увеличению
объема действующей микрофлоры, а приводит к пов
ышению кислотности
молока и получаемого продукта. Недостаточное внесение заквасочных культур
может приводить к нарушению биохимических процессов в сырной массе, а
отсутствие конкуренции


к активизации посторонней, технически вредной
микрофлоры, что в резу
льтате увеличивает вероятность появления горечи,
нечистоты и других пороков вкуса и запаха.


2 Определение качества заквасок.


Контроль активности
-
проводят по времени сквашивания молока и предельной
кислотности. Продолжительность сквашивания при внесени
и закваски
молочнокислых стрептококков (1
-
3%) составляет 6
-
8 часов, молочнокислых
палочек (0,5
-
1%)
-
4
-
6 часов.


Микроскопический контроль проводят с целью определения чистоты
закваски, а также соотношения между компонентами закваски. В препаратах
просма
тривают не менее 10 полей зрения. При этом должны обнаруживаться
только те микроорганизмы, которые входят в состав закваски.


О наличии посторонних микроорганизимов можно судить по санитарно
-
показательным микробам кишечной палочке, золотистому стафилоко
кку и
плесневым грибам и бактериофагу. Для этого проводят посев продукта на
селективные среды, на которой растет только определенный микроорганизм.


Наличие группы бактерий кишечных палочек (БГКП) в закваске определяют
путем посева на среду Кесслера.
Наличие
золотистого стафилококк
а
определяют путем посева на солевой агар. Наличие плесеней определяется
путем посева на среду Сабуро. Загрязнение продукта бактериофагом
проверяют посевом на стерильное молоко с метиленовой синью. И если в
процессе культиви
рования после обесцвечивания молока через 5
-
6 часов вновь
наблюдается посинение молока, это указывает на наличие в закваске
бактериофага.


Практические задание


Определить качество закваски для производства йогурта.


Этапы выполнения задания:

1
Определить активность. 1мл каждой закваски внести в пробирку с 10 мл
стерелизованного молока засечь время и поместить в термостат . Определить
время образования молочного сгустка.

2 Провести микроскопический контроль микрофлоры закваски

2.1 Из каждой закв
аски сделать мазок
-
препарат.

2.2 Окрасить метиленовой синью.

2.3 Просмотреть под микроскопом на большом увеличении 10 полей зрения и
определить вид микрофлоры и соответствует она заквасочной.. Отметить
56

наличие посторонней микрофлоры.

3 Определить наличие п
осторонней микрофлоры путем посева на селективные
среды.

3.1 1 мл закваски внести в пробирку со средой Кесллера (на кишечную палочку)


3.2 0,5 мл закваски внести на солевой агар и растереть шпателем по
поверхности ( на золотистый стафилококк).


3.3 0,5
мл закваски внести на среду Сабуро и растереть шпателем по
поверхности( на плесени).

4. Установить наличие бактериофага. В пробирку с 10 мл метиленового молока
внести 1мл закваски и поместить в термостат на 24 часа.

5 Провести учет посевов на кишечную пало
чку, золотистый стафилококк и
бактериофаг через 24 часа; на плесени через 3
-
5 суток.

Учет активности закваски определить исходя из вида микроорганизмов .


Вопросы и задания для контроля знаний

1 Дайте определение понятию «закваска».

2 На какие группы
делят закваски по составу?

3 Какие пороки заквасок вы знаете?

4 В каком виде закваска поступает на производство?

5 Как готовят производственную закваску?

6 Какие показатели используют для оценки качества закваски?




ТЕМА 13 «
Получение термостатног
о йогурта
»


Цель:

сформировать представление о биотехнологических основах
производства йогурта и умение осуществлять методику получения
термостатного йогурта.


Материальное обеспечение


Молоко не пастеризованное, колба на 250 мл, закваска йогу
ртовая в пробирке ,
стаканы на 100 мл стерильные, пипетка ,термостат, спиртовка, водяная баня,
термометр.


План

1 Йогурт как продукт биотехнологического производства.

2 Технологический процесс производства термостатного йогурта.



1 Йогурт как про
дукт биотехнологического производства


Йогурт один из древнейших продуктов биотехнологического производства,
получаемых путем ферментации. Как правило, йогурт представляет собой
кисломолочный напиток, приготовленный из цельного пастеризованного
молока

В состав йогурта входят коровье молоко, закваска для йогурта,
состоящая из термофильного стрептококка и болгарской палочки, различные
пищевкусовые продукты, ароматизаторы и пищевые добавки [12]. Йогурты
дают необходимые организму человека: легко усваиваем
ые белки,
способствующие обновлению тканей, поддержанию хорошей физической
формы; в небольшом количестве жиры для восполнения затраченной энергии и
лучшего усваивания витаминов; углеводы, несущие организму необходимое
57

количество сахара; кальций и фосфор, р
егулирующие артериальное давление и
укрепляющие кости.В йогурте содержаться живые йогуртовые бактерии
помогающие организму перерабатывать лактозу (молочный сахар).


После термообработки молоко заквашивают добавлением 2
-
3 % закваски
йогурта. Температура
при брожении поддерживается около 40 ºС. Главную роль
здесь играют бактерии Streptococcus thermophillus и Lactobacillus bulgaricus. Для
получения желаемой консистенции продукта, вкуса и запаха эти организмы
должны содержаться в культуре приблизительно в ра
вных количествах. Кислоту
в начале заквашивания образует в основном Streptococcus thermophillus.
Смешанные закваски нужно часто обновлять, поскольку повторные пересевы
неблагоприятно сказываются на соотношении видов и штаммов бактерий: в них
начинает домин
ировать Lactobacillus bulgaricus.

Своим характерным вкусом йогурт обязан молочной кислоте, получаемой из
лактозы молока, и ацетальдегиду. Оба этих вещества вырабатывают
Lactobacillus bulgaricus.

При производстве кисломолочных напитков применяются два спосо
ба:
термостатный и резервуарный. При выработке йогурта термостатным способом
сквашивание продукта производится в потребительской таре в больших
термостатных камерах. Продукт получается с ненарушенным сгустком и более
густой. Все компоненты вносятся до сква
шивания.

При выработке йогурта резервуарным способом сквашивание проходит в
большом резервуаре, добавляют компоненты и потом разливается в
потребительскую тару. Продукт получается с нарушенным сгустком и жидкий.


2 Технологический процесс производства т
ермостатного йогурта


Технологический процесс производства йогурта складывается из тех же
составляющих как и любой биотехнологический процесс


1 Подготовительная .


2 Биотехнологическая.


3 Получение готовой продукции.


Подготовительная стад
ия включает подготовку оборудования и питательной
среды и посевной культуры. В данном производстве питательной средой
является молоко. Для производства используется молоко 1 сорта, с
кислотностью не выше 200Т, по редуктазной пробе
-

не ниже 1
-
го класса и п
о
механической загрязненности
-

не ниже первой группы. Для большинства
йогуртов содержание жира должно быть не менее 6%. Пастеризацию молока
проводят при температуре 85
-
870С с выдержкой в течение 5
-
10 мин или при 90
-
920С с выдержкой 2
-
3 мин. Такой метод по
зволяет уничтожить микрофлору и
сохранить все ценные свойства молока в том числе и витамины. Так как
обычная стерелизация (нагрев до 100 С и выше) либо разрушает биологически
ценные вещества либо изменяет структуру. Тепловая обработка молока обычно
сочетае
тся с гомогенизацией. Гомогенизация при температуре не ниже 550С и
давлении 17,5МПа улучшает консистенцию и предупреждает отделение
сыворотки. Пастеризованное и гомогенизированное молоко немедленно
охлаждают в регенеративной секции пастеризационной установ
ки до
58

температуры заквашивания его чистыми культурами молочнокислых бактерий:
при использовании термофильных культур
-

до 50
-
550С.


В качестве посевной культуры используют производственную закваску или
бактериальный концентрат. Оборудование предназначе
нное для производства
йогурта должно соответствовать требованиям Сан и Пин для данного
производства, а значит быть стерильным.


Биотехнологическая стадия изготовления кисломолочных продуктов , в том
числе и йогурта, называется сквашивание и сводится в о
бщих чертах к тому,
чтобы, предоставить «избранным» видам полезных микроорганизмов наиболее
благоприятные условия для развития и, благодаря этому, получить готовый
продукт с характерными для него свойствами. В охлажденное до температуры
заквашивания молок
о должна быть немедленно внесена закваска. Закваску
перед внесением в молоко тщательно перемешивают до получения жидкой
однородной консистенции, затем вливают в молоко при постоянном
перемешивании. Наиболее рационально вносить закваску в молоко в потоке.
Д
ля этого закваска через дозатор подается непрерывно в молокопровод, в
смесителе она хорошо смешивается с молоком. Сквашивание молока
производят при определенной температуре, в зависимости от вида закваски.
При использовании заквасок, приготовленных на чист
ых культурах
молочнокислого стрептококка термофильных рас
-

2,5
-
3ч.


Чтобы получить продукт с плотной однородной консистенцией необходимо
поддерживать температуру сквашивания, оптимальную для данного продукта. В
молоке при ферментации могут протекать шес
ть основных реакций; в
результате образуется молочная, пропионовая или лимонная кислота, спирт,
масляная кислота или же происходит колиформное газообразование. Главным
процессом является молочнокислое брожение, вызываемое стрептококками и
молочнокислыми ба
ктериями, при котором лактоза (молочный сахар)
превращается в молочную кислоту. На нем основаны все способы сквашивания
молока. Лактоза молока гидролизуется при этом с образованием галактозы и
глюкозы. Обычно галактоза превращается в глюкозу еще до сквашив
ания.
Имеющиеся в молоке бактерии преобразуют глюкозу в молочную кислоту.
Образование сгустка казеина происходит под действием молочной кислоты.


Отличительной особенностью термостатного способа производства
кисломолочных продуктов является проведение п
роцесса сквашивания
непосредственно в потребительской таре. Поэтому, после тщательного
перемешивания в течение 10
-
15 мин, заквашенную при температуре 41
-
42 С
смесь из резервуара направляют на розлив в стаканчики из полимерных
материалов, упаковывают и марк
ируют. Розлив заквашенной смеси из одного
резервуара требуется завершить в течение 30
-
45 мин во избежание нарушения
процесса гелеобразования, что должно обеспечиваться производительностью
имеющегося на предприятии оборудования.После розлива тару с заквашен
ной
смесью немедленно транспортируют в термостатную камеру, где
поддерживается соответствующая температура, и протекает сквашивание в
течение 4
-
5 ч. Окончание этого процесса определяют по формированию
59

плотного сгустка и достижению титруемой кислотности 75
-
110 Т


В результате биотехнологической стадии получают готовый продукт,
представляющий собой культуральную жидкость и биомассу бактерий в данном
случае измененное молоко с микроорганизмами.


Окончание сквашивания определяют по характеру сгустка и по к
ислотности,
которая должна быть немного ниже кислотности готового продукта. По
достижении требуемой кислотности и образовании сгустка йогурт немедленно
охлаждают
-

при резервуарном способе производства в универсальных
резервуарах или в пластинчатых охладит
елях до температуры не выше 8 С, а
затем разливаются в бутылки.

На каждую единицу потребительской тары должна быть нанесена
типографским способом несмывающейся не пахнущей краской, разрешенной
Минздравом РФ для контакта с пищевыми продуктами маркировка с у
казанием
следующих информационных данных: наименование или номер предприятия
-
изготовителя или товарный знак предприятия; наименование вида продукта;
масса нетто; информационные данные о массовой доле жира, белка, углеводов,
калорийности; обозначение соотве
тствующего стандарта; дата конечного срока
реализации (наносится компостером или тиснением, или штемпелем).


Практическое задание


Получить йогурт термостатным способом.


Этапы выполнения задания:

1 Провести пастеризацию молока.

1.1 Молоко налить
в колбу, закрыть марлевой пробкой и поместить в водяную
баню 85 С.

1.2 Постоянно помешивая довести температуру до 85 С и выдержать 5 минут.

1.3 Колбу с молоком охладить под струей водопроводной воды до температуры
40
-
45С .

2. Молоко разлить в стерильные ст
аканы по 50 мл закрыв фольгой.

3. Закваску в колбе перемешать круговыми движениями и стерильной пипеткой
набрать закваску и по 2, 5 мл и внести в каждый стакан с подготовленным
молоком.

4. Стаканы закрытые фольгой поместить в термостат и выдержать при
те
мпературе 40
-
42 С до образования сгустка (4
-
5часов).


Вопросы и задания для контроля знаний

1 К каким продуктам относят йогурт?

2 какие культуры микроорганизмов используют для производства йогурта?

3 Из каких стадий складывается технологический процесс
производства
йогурта?

4 что включает подготовительная стадия производства йогурта?

5 В чем суть биотехнологической стадии производства йогурта?

6 Что представляет собой йогурт как продукт биотехнологического
производства.

7 Опишите методику изготовления
темостатного йогурта.



60


ТЕМА 14 «Определение качества полученного термостатного йогурта»


Цель:
сформировать навыки определения качества термостатного йогурта


Материальное обеспечение


Йогурт полученный на прошлом занятии, пипетки, колба на 100м
л стерильная,
10% раствор двууглекислого натрия, пробирки с физ. Раствором, ложка для
дегустации, рН метр, среда Кеслера в пробирках, среда Сабуро , солевой агар.


План

1 Характеристика и требования к качеству йогурта

2 Определение показателей качеств
а термостатного йогурта


1 Характеристика и требования к качеству йогурта


Йогуртом называется кисломолочный продукт с нарушенным или
ненарушенным сгустком, повышенным содержанием сухих обезжиренных
веществ молока, вырабатываемый из обезжиренного или н
ормализованного по
жиру и сухим веществам молока или молочных продуктов, подвергнутых
тепловой обработке, путём сквашивания их протосимбиотической смесью
чистых культур термофильного молочнокислого стрептококка и болгарской
молочнокислой палочки, концентра
ция которых в живом состоянии в готовом
продукте на конец срока годности должна составлять не менее 107 КОЕ в 1г
продукта, с добавлением или без добавления различных пищевкусовых
продуктов, ароматизаторов и пищевых добавок. (ГОСТ Р 51331
-
99 Продукты
молочн
ые. Йогурты. Общие технические условия).


Йогурт должен быть выработан в соответствии с требованиями стандарта с
соблюдением санитарных норм и правил по технической и технологической
документации, утвержденной в установленном порядке для конкретного
на
именования йогурта.


Качество йогурта по ГОСТ Р 51331
-
99 определяется по следующим
показателям:

органолептические: внешний вид и консистенция, вкус и запах, цвет;

физико
-
химические: массовая доля жира, молочного белка, сухих
обезжиренных веществ молока,

сахарозы и общего сахара в пересчёте на
инвертный сахар, витаминов; кислотность, фосфатаза, температура при выпуске
с предприятия;

микробиологические: количество молочно
-
кислых микроорганизмов в 1г
продукта на конец срока годности, КОЕ, количество бактери
й молочно
-
кислой
ацидофильной палочки в 1г продукта на конец срока годности биойогурта,
КОЕ.


По микробиологическим показателям безопасности йогурт должен
соответствовать «Гигиеническим требованиям к качеству и безопасности
продовольственного сырья и пи
щевых продуктов» применительно к
кисломолочным напиткам. Содержание токсичных элементов, микотоксинов,
антибиотиков, пестицидов и радионуклидов в продукте не должно превышать
допустимых уровней, установленных СанПиН 2.3.2.1078. Микробиологические
показател
и продукта должны соответствовать требованиям СанПиН 2.3.2.1078.


Микробиологические показатели кисломолочных напитков приведены в
61

табл. 1.

Таблица 1
-

Микробиологические показатели кисломолочных напитков

Группа
продуктов

КМАФАнМ,
КОЕ/г

Масса продукта
(г)
,

в которой не
допускаются

Дрожжи (Д),
плесени (П), КОЕ/г,
не более



БГКП (коли
-
формы)

S. aureus

Патогенные, в
том числе
сальмонеллы

Жидкие
кисло
-
молочные
продукты, в том
числе йогурт, со
сроками годности
не более 72 ч

МКБ не менее
·107

0,01

1,0

Жидк
ие
кисло
-
молочные
продукты, в том
числе йогурт, со
сроками годности
более 72 ч:





без
компонентов

МКБ не менее
·107

0,1

1,0

25

с
компонентами

МКБ не менее
·107

0,01

1,0

25


2 Определение показателей качества термостатного йогурта


Контроль готовой пр
одукции проводят по методам, принятым для
кисломолочных напитков. Готовый термостатный йогурт должен иметь
плотный, однородный сгусток, сметанообразную консистенцию и кислотность
70


140 Т. Не должно быть отделение сыворотки, запах и вкус свежие
кисломоло
чные, цвет зависит от внесенного красителя и наполнителя.
Определяют также плотность, вязкость и микробиологические показатели.



Готовую продукцию контролируют на наличие бактерий группы кишечных
палочек и по микроскопическому препарату . Для определения

наличия БГКП
кисломолочные продукты предварительно нейтрализуют. Для этого отбирают
стерильной пипеткой 10 см3 исследуемого продукта в стерильную колбочку и
добавляют 1 см3 10 %
-
го раствора двууглекислого натрия. Содержимое
колбочки перемешивают и засеваю
т в три пробирки со средой Кесслера по 1
см3 самого продукта, а также его первого и второго разведений. Для контроля
состава микрофлоры готовых кисломолочных напитков просматривают
62

микроскопические препараты, окрашенные метиленовым синим. В поле зрения
пре
парата, приготовленного из йогурта должны находиться цепочки кокков и
длинные тонкие палочки.

Практическое задание



Провести контроль качества термостатного йогурта полученного на прошлом
занятии.


Этапы выполнения задания:

1 Провести орагно
-
лептичес
кую оценку продукта и внести данные в таблицу2 .

1.1 Оценить консистенцию продукта и плотность сгустка надавливанием
стеклянной палочкой на поверхность продукта.

1.2 Оценить цвет продукта и запах.

1.3 Определить вкус продукта.

2 Провести контроль состав м
икрофлоры продукта.

2.1

Из продукта сделать мазок
-
препарат.

2.2 Окрасить метиленовой синью.

2.3 Просмотреть под микроскопом на большом увеличении 10 полей зрения и
определить вид микрофлоры и соответствует она заквасочной. Отметить
наличие посторонней мик
рофлоры.

3. Провести контроль микробиологических показателей.

3.1 Отобрать стерильной пипеткой 10 см3 исследуемого продукта в стерильную
колбочку и добавляют 1 см3 10 %
-
го стерильного раствора двууглекислого
натрия. Содержимое колбочки перемешать.

3.2 Приг
отовить два десятикратных разведения продукта.

3.3 Для контроля на БГКП засеять в три пробирки со средой Кесслера по 1 см3
самого продукта, а также его первого и второго разведений. Поместить посев в
термостат 40 С на 24 часа.

3.4 Провести посев на золотис
тый стафилококк :1 мл продукта из колбочки
внести на солевой агар в чашке Петри и растереть шпателем по поверхности.
Поместить посев в термостат 30 С на 24 часа.

3.5 Провести посев на дрожжи и плесени: 1 мл продукта из колбочки внести на
среду Сабуро в чаш
ке Петри и растереть шпателем по поверхности. Поместить
посев в термостат 30 С на 5 суток.

4. Провести учет посевов внести в таблицу 2 и сделать вывод о качестве
полученного термостатного йогурта.


Таблица 2

Показатели качества

Характеристика по
стандарту

Характеристика
исследуемого продукта

Органо
-
лептические:



63


Плотность сгустка и
консистенция

плотный, однородный
сгусток,
сметанообразная
консистенция


цвет

Белый
-
кремовый


запах

свежий
кисломолочный,


вкус

свежий кисломолочный


Состав микрофлоры

(
микроскопия)

Стрептококки и
длинные палочки


Наличие БГКП

Не допускается в
0,01 г продукта


Наличие золотистого
стафиллококка

Не допускается в 1 г
продукта


Наличие дрожжей и
плесеней

Не допускается в 1 г
продукта



Вопросы и задания для контроля знан
ий

1 Что представляет из себя готовый йогурт?

2 Какими документами регламентируется качество йогуртов?

3 Какие показатели качества определяются у йогурта?

4 Какие показатели называют органо
-
лептическими?

5 Опишите методику определения микробиологических п
оказателей качества
йогурта.



64


ТЕМА 15 «
Особенности работы в лаборатории генной инженерии.
Выделение ДНК и работа с ней
»


Цель:
формирование знаний об особенностях работы в лаборатории генной
инженерии и теоретических навыков по выделению ДНК из биома
териала и
работы с ней.


Материальное обеспечение

фильм ы : «Выделение ДНК», «Рестрикция ДНК», «Разделение фрагментов
ДНК» «Южный блотинг по Саузену» ) набор реактивов для выделения ДНК и
набор реактивов для электрофореза ДНК фрагментов.


План

1Ос
обенности работы в лаборатории генной инженерии.

2 Выделение ДНК из биоматериала .

3 Методы работы с вделенной ДНК.



1 Особенности работы в лаборатории генной инженерии


Несмотря на то, что при описании генно
-
инженерных манипуляций с
генетическим м
атериалом почти всегда говорят так, будто речь идет об одной
молекуле (например,«...плазмида была рестрицирована с помощью фермента
BamHI...» или «...фрагмент ДНК человека был интегрирован в плазмиду
pBR322...»), под эти всегда подразумевается проведение х
имических реакций, в
которых участвуют как минимум десятки или сотни тысяч молекул.
Основополагающим фактором, обеспечивающим успех таких реакций,

является уровень чистоты участвующих в реакциях соединений. Поэтому
можно без преувеличения сказать, что
современная молекулярная биология и
генетическая инженерия


это, по сути, тонкая препаративная биохимия.

С одной стороны, применяемые в генетической инженерии ферменты


это
белки со сложной пространственной структурой и высокой чувствительностью
к услови
ям среды.


Источником ферментов являются клетки живых организмов, состоящие из
огромного множества различных молекул, в том числе и белковых. А для
успешной работы они должны быть не только гомогенными и максимально
очищенными препаратами, но и сохранят
ь свою каталитическую активность
при хранении и использовании. Поэтому для их выделения и очистки

используются сложные, длительно протекающие и дорогостоящие химические
методы. В середине 70
-
х годов 20 века первые генные инженеры испытывали в
связи с этим
значительные трудности, однако за несколько лет

возникла и развилась специальная индустрия, предназначенная для
обслуживания генно
-
инженерных работ. В настоящее время
специализированные фирмы производят не только

полный набор необходимых ферментных препара
тов, но и все остальные
химические реактивы, используемые в генно
-
инженерных и


молекулярно
-
биологических исследованиях. Кроме того, была разработана и
производится специальная химическая посуда для проведения реакций в
микрообъемах (из
-
за высокой цены реа
ктивов все реакции стараются проводить
65

с использованием минимальных количеств растворов) и

дозаторы (микропипетки), позволяющие набирать растворы в объемах порядка
0,1 микролитра (микролитр


одна миллионная часть литра). Важно, что эта
посуда сделана из х
имически инертных пластиков и используется, как правило,
единожды


это позволяет избегать возможных загрязнений и тем самым
максимально стандартизировать условия химических реакций.


С другой стороны, для успешного клонирования генетического материала
необходимо иметь чистые препараты нуклеиновых кислот, выделенные из
клеток конкретного вида организмов. Получать такие препараты приходится
уже собственно генным инженерам, но в настоящее время для выделения
нуклеиновых кислот из клеток животных, грибов, р
астений или бактерий
производятся специальные наборы реактивов и приборы. При этом надо
подчеркнуть, что техническое оснащение процессов выделения ДНК или РНК
имеет не меньшее значение, чем химическое. На определенных этапах для этих
процедур требуются гом
огенизаторы тканей, устройства для механического или
ультразвукового разрушения клеток, центрифуги с охлаждением,
ультратермостаты, приборы для электрофореза и спектрофотометры.


2 Выделение ДНК из биоматериала



Следует помнить, что нуклеиновые кисло
ты присутствуют в клетках в очень
небольшом количестве, по сравнению, например, с белками или липидами,
поэтому получать пригодные для генно
-
инженерных работ концентрации ДНК
или РНК было не просто. В последнем десятилетии 20
-
го века в методический
арсенал

молекулярной биологии и генетической инженерии вошел метод,
который позволяет при очень малом количестве исходной ДНК получать
нужные фрагменты (фактически, гены) в тех количествах, которые необходимы.

Выделяют ДНК из любого организма от вирусов до челов
ека . Для этого нужен
биоматериал: культура микроорганизма или ткань животного или растения.


Полученную суспензию клеток подвергают следующей обработке

1 Проводят лизис клеток для высвобождения ДНК.

1.1 Клетки из суспензии осаждают центрифугирован
ием.

1.2 К осадку клеток добавляют раствор ферментов . Один фермент разрушает
клеточную стенку (например лизоцим) и другой РНК
-
аза, разрушает РНК
клеток.

1.3 Суспензию выдерживают при 35 С 30 минут

2 Очищение ДНК от белков. К суспензии добавляют раствор
фермента
протеиназы и выдерживают при 55 С 1 час.

3 Очищение от других органических веществ (липиды сахара фермент)можно
проводить двумя способами

1способ.. К суспензии добавляем смесь фенола и хлороформа, перемешивают и
центрифугируют . Верхнюю фракцию с

ДНК переносят в чистую пробирку и
повторяют этот этап. Полученную ДНК в растворе осаждают


добавлением изопропилового спирта и выдерживают при

20
-

С 30 минут .

Центрифугируют и осадок дважды промывают этанолом.

Спирт испаряют, а осадок ДНК растворяют
в дистиллированной воде или
66

буферном растворе в течение нескольких дней при 4 С или быстрым
перемешиванием.


2 способ. К раствору ДНК добавляют сорбент, на который «
-
» заряженная ДНК
оседает связываясь с + ионами сорбента (оксидом кремния). После
центриф
угирования осадок сорбента с ДНК отмывают от органических и
неорганических веществ и элюируют в буферный раствор или
дистиллированную воду.


3 Методы работы с вделенной ДНК

Технология рекомбинантных ДНК использует следующие методы:

1специфическое расщ
епление ДНК рестрицирующими нуклеазами,
ускоряющее выделение и манипуляции с отдельными генами;

2 разделение фрагментов ДНК по размерам и обнаружение фрагментов с
определенной последовательностью нуклеотидов;

3 конструирование рекомбинантной ДНК;

4 клониро
вание ДНК: амплификация in vitro с помощью цепной полимеразной
реакции или введение фрагмента ДНК в бактериальную клетку, которая после
такой трансформации воспроизводит этот фрагмент в миллионах копий;

5 введение рекомбинантной ДНК в клетки или организмы.


1 Специфическое расщепление ДНК рестрицирующими нуклеазами


Ферменты рестрикции стали эффективным инструментом исследования. Они
позволяют превращать молекулы ДНК очень большого размера в набор
фрагментов длиной от нескольких сотен до нескольких ты
сяч оснований. Для
получения рекомбинантной молекулы ДНК на основе вектора
-
плазмиды,
рестриции подвергают как выделенную ДНК так и плазмидную ДНК.

Методика рестрикции заключается в следующем. Для составления
рестриктазной смеси в 2 пробирки вносят раств
оритель воду и буферный
раствор 10 кратной концентрации. Затем в одну вносят раствор выделенной
ДНК, из которой хотят вырезать ген, а в другую плазмидную ДНК. На
последней стадии вносят в первую пробирку рестриктазу для выделенной ДНК
, во вторую рестри
ктазу для разрезания плазмиды. Смеси помещают в
термостат при температуре 37 С на 1 час.


2 Разделение фрагментов ДНК по размерам и обнаружение фрагментов с

определенной последовательностью нуклеотидов.


Для первоначального разделения полученных в ре
зультате действия
рестриктаз фрагментов ДНК используют метод, получивший название гель
-
электрофорез. Метод основан на том, что молекулы ДНК в растворе солей
определенной концентрации имеют на своей поверхности отрицательные
заряды. При пропускании через ра
створ постоянного электрического тока
хаотическое (броуновское) движение

молекул меняется на направленное перемещение их к положительно
заряженному электроду. Если такое воздействие осуществляется не в обычном
водном растворе, а в желеобразной массе застыв
шего 1% раствора агарозы,
молекулы ДНК различного размера движутся с различными скоростями


чем
длиннее молекула, тем медленнее она

67

движется, поскольку испытывает больше соударений с образовавшими гель
частицами агарозы. Агароза


это особым образом обраб
отанный полисахарид
агар
-
агар, получаемый изкрасных водорослей. Отличительной чертой этого
вещества является его способность даже в небольших (менее одного процента)
концентрациях при температурах ниже 40° С образовывать в водных растворах
сплошную плотную

массу, обычно называемую гель.

Раствор агарозы готовят путем растворения ее в воде при температурах от 70° С
до 100° С, а затем наливают еще не остывший раствор в специальную емкость с
ровным и гладким дном. При остывании раствор желируется и получается
о
пределенной толщины пластинка. Раствор молекул ДНК вносят в заранее
подготовленные в этой пластинке углубления (лунки), которые расположены у
одного из концов пластинки, и всю пластинку помещают в специальной камере
с электродами. Камеру заполняют водным р
аствором солей и подключают к
генератору постоянного электрического тока таким образом, чтобы ток
проходил через пластинку геля. Время воздействия электрического тока
выбирают такое, чтобы все молекулы ДНК успели переместиться из лунки в
толщу геля, но даж
е самые мелкие из них не прошли через весь гель.


При перемещении фрагментов ДНК различного размера из одного и того же
места (лунки), одинаковые по размерам молекулы движутся с одинаковой
скоростью. Поэтому через некоторое время в толще геля образуются ск
опления
одинаковых по размерам молекул, но они будут располагаться в разных
участках пластинки. После окончания электрофореза пластинку окрашивают
способным связываться с ДНК красителем, что

делает видимыми те участки, в которых расположились молекулы.



В тех случаях, когда просто требуется отобрать молекулы определенного
размера, соответствующий участок пластинки вырезают и вымывают из него
ДНК специальными растворами.


Размеры молекул ДНК можно выражать либо в специальных единицах
молекулярной массы

-

дальтонах, либо, что делают гораздо чаще, в числе пар
нуклеотидов или азотистых оснований. В последнем случае принято после
соответствующей цифры писать сокращение п.н. (синонимом является п.о.) или
т.п.н.
-

тысяч пар нуклеотидов (синоним


т.п.о.). Ино
гда в русскоязычных
публикациях сохраняют английскую

аббревиатуру, в этих случаях сокращению п.н. соответствует b (от англ. base


основание), а сокращению т.п.н.


kb (от англ. kilobase


тысяча оснований) Для
того, чтобы получить конкретную цифру для фра
гментов ДНК, размеры
которых неизвестны, одновременно в этой же пластинке геля проводят
электрофоретическое разделение молекул с уже известными размерами и
сравнивают положение в геле изучаемых и эталонных молекул.

(Фильм методы
молекулярной микробиологии
-
рестрикция, электрофорез)


Далее находят фрагмент ДНК , в котором находится ген для трансгеноза.
Если нуклеотидная последовательность для конкретного гена уже известна,
существует возможность обнаружить ее в разделенных электрофорезом
фрагментах.

Эта возможность основана на том, что молекулы ДНК состоят из
68

двух комплементарных цепей и при определенных условиях эти цепи могут
быть отделены друг от друга. Например, если молекулы ДНК нагреть до
температуры выше 70 °С, удерживающие две цепи водородны
е связи между
азотистыми основаниями разрываются. Такая тепловая денатурация ДНК
обратима


если температуру понизить, цепи объединяются вновь. Зная об этом,
и придумали метод гибридизации молекул ДНК, заключающийся в следующем.
Полученные в результате дей
ствия рестриктаз и разделенные по размерам с
помощью электрофореза фрагменты переносят на специальный
нитроцеллюлозный фильтр, но таким образом, чтобы порядок их расположения
в геле сохранялся и на

фильтре. Это легко достигается наложением фильтра на гель
и созданием
условий для движения молекул в сторону фильтра. Затем фильтр в специальном
растворе нагревают до температуры, при которой молекулы ДНК становятся
однонитевыми, и вносят в раствор

заранее подготовленные однонитевые фрагменты ДНК, последовательно
сть
нуклеотидов в которых соответствует конкретному гену. Но эти ДНК особые


их нуклеотиды содержат метку
-
радиоактивные изотопы какого
-
либо входящего
в нуклеотид химического элемента, чаще всего фосфора. После этого
температуру понижают, и происходит рен
атурация, т.е. восстановление
двунитевых молекул. Часть таких молекул будет включать не исходные
нерадиоактивные нити, а те, которые были специально внесены в

раствор. Причем здесь проявит себя комплементарность


радиоактивные нити
присоединятся к тем фра
гментам ДНК, в которых и находится искомый ген.
Далее, фильтр тщательно отмывают от не связавшихся радиоактивных молекул,
высушивают, и прикладывают к фотопластинке на несколько часов. После
проявления фотопластинки на ней будут заметны темные пятна засвеч
енной
радиоактивным излучением эмульсии.

Сопоставив расположение пятен с расположением фрагментов ДНК в геле,
легко установить, во фрагментах какого размера находится искомый ген.
Именно эти фрагменты и используют в дальнейшей работе. (фильм южный
блотинг
по Саузену )


Практическое задание 1


Изобразить в виде схемы процедуру выделения ДНК из биоматериала.


Этапы выполнения задания :

1 Изучить материал занятия и фильма по данной теме

2 Выделить основные этапы процедуры

3 Составить схему выделения
ДНК из биоматериала


Как провести разделение фрагментов ДНК по размерам?


Практическое задание 2


Изобразите в виде схематического рисунка процесс

расщепления ДНК
рестрицирующими нуклеазами.


Этапы выполнения задания :

1 Изучить материал занятия
и фильма по данной теме

2 Выделить основные составляющие элементы процесса

69

3 Нарисовать схематический рисунок процесса и обозначить все элементы


Вопросы и задания для контроля знаний

1 Почему степень чистоты химических веществ и тщательное соблюдение
условий проведения реакций имеют важное значение для генетической
инженерии?

2 Какие источники ДНК вы знаете?

3 Как проводят лизис клеток для выделения ДНК.

4 чем проводят удаление белков и липидов при выделении ДНК?

5 Назовите методы работы с вделенной
ДНК.



ТЕМА 16 «
Геномные библиотеки, клонирование ДНК
»


Цель:
сформировать знания и теоретические навыки по конструированию и
клонирования ДНК методом ПЦР.


Материальное обеспечение


Фильмы « Встраивание ДНК в вектор» « Клонированиеи ДНК»
«По
лимеразная цепная реакция (ПЦР)», набор реактивов для проведения ПЦР.


План

1 Конструирование рекомбинантной ДНК.

2 Клонирование ДНК в живых клетках.

3 Полимеразная цепная реакция (ПЦР).




1 Конструирование рекомбинантной ДНК


Конструирование Р
екомбинантной ДНК заключается
в смешивании
полученного фрагмента ДНК с векторной ДНК разрезанной рестриктазой. В
результате чего, липкие концы фрагмента ДНК и векторной ДНК
взаимодействуют друг с другом , образуя комплементарные пары . Происходит
гибридиза
ция векторной и чужеродной ДНК. Ген (или кластер генов),
выстроившийся в вектор, удерживается в нем вначале только за счет
водородных связей между комплементарными липкими концами. Эта стадия
получила название «отжига». Для того, чтобы ген оказался прочно
встроенным
в вектор, необходимо его закрепление за счет ковалентных связей. Для этих
целей служат ферменты
-
лигазы (от слова лигировать


сшивать), замыкающие
разрывы в углеводно
-
фосфатном каркасе ДНК. После этой стадии работы
генного инженера вектор с проч
но
закрепленным в нем геном может вводиться
в клетку реципиент. Весь процесс называется лигированием. Для этого в
пробирку вносят фрагмен ДНК
-
вставку, буфер для лигирования, вектор
обработанный рестриктазой и фермент лигазу. Лигазную смесь оставляеют при

комнатной температуре на 1
-
2 часа.

После того, как ДНК сшита в пробирке, ее необходимо размножить.
Существует два подхода к клонированию ДНК. Первый подход предполагает
использование бактериальных или дрожжевых клеток для размножения
введенной в них
чужеродной ДНК. Второй способ представляет собой
амплификацию ДНК in vitro.


2 Клонирование ДНК в живых клетках .

70


Для

к
лонирования ДНК in vivo использют микроорганизмы. При этом
можно создавать два типа библиотек ДНК: геномную и клоновую (кДНК).


Геномная библиотека.

Если геном какого
-
либо организма разрезать, вставить
в плазмидные или вирусные вектора и ввести в клетку, то в таком виде его
можно сохранить. При разрезании плазмидной или фаговой ДНК вероятность
выпадения целых и неизмененных ку
сков генома довольно высока. Такой
способ получения геномной библиотеки получил название «метод дробовика»,
так как геном в данном случае представлен отдельными фрагментами.


Принципы создания плазмидных и вирусных векторов общие, поэтому
рассмотр
им их на примере плазмидных. Следует отметить, что из вирусных
ДНК лучше использовать ДНК фагов, так как они имеют большую емкость и
позволяют вставлять более крупные куски генома.

Очищенные кольцевые молекулы ДНК обрабатывают рестриктазой, получая
линейну
ю ДНК. Клеточную ДНК обрабатывают той же рестриктазой,
добавляют к плазмидной, добавляют лигазы. Таким образом получают
рекомбинантную плазмидную ДНК, которую вводят в бактериальные или
дрожжевые клетки. Плазмида реплицируется с образованием многих копий.
Многие плазмиды несут ген устойчивости к антибиотикам, и если в
рекомбинантной плазмиде есть такой ген, то клетки легко выявлять, выращивая
на среде с антибиотиком.

Каждая такая колония представляет собой клон или потомство одной клетки.
Плазмиды одной кол
онии содержат клон геномной ДНК, а совокупность
плазмид можно назвать
библиотекой геномной ДНК.

Недостаток такого метода
в том, что фрагменты ДНК образуются в огромном количестве. Разрезание
геномной ДНК определяется случаем, поэтому лишь часть фрагментов
содержат полноценные гены. Некоторые фрагменты могут содержать только
часть гена или же интронные последовательности.


Библиотека копийных ДНК (кДНК )
. Создание кДНК начинается с синтеза на
матрице РНК с помощью обратной транскриптазы комплементарной ни
ти ДНК.
Затем создают щелочные условия, разрушают цепь РНК на нуклеотиды, после
чего с помощью ДНК
-
полимеразы синтезируют комплементарную цепь ДНК.
При этом образуется фрагмент ДНК с тупыми концами. Такую ДНК встраивают
в плазмиды и вводят в клетки бактери
й. При амплификации плазмиды
образуется клон комплементарной копии ДНК (кДНК).

Преимущества клоновой ДНК перед клонами геномной ДНК в том, что
кодирующая белок нуклеотидная последовательность гена ничем не
прерывается.

Гены эукариот содержат интроны, котор
ые должны удаляться из транскриптной
РНК перед превращением ее в матричную, после чего следует сплайсинг
(сращивание). Бактериальные клетки не могут осуществлять такую
модификацию РНК, образовавшуюся путем транскрипции гена
эукариотической клетки. Поэтому
если преследуют получение белка путем
экспрессии клонированного гена, то лучше использовать банк кДНК,
полученной на основе матричной РНК.

71


3 Полимеразная цепная реакция (ПЦР)


В 1985 году К. Мюллис с сотрудниками разработали метод клонирования
посл
едовательностей ДНК in vitro, который получил название полимеразной
цепной реакции (ПЦР).


К анализируемому образцу ДНК добавляют в избытке 2 синтетических
олигонуклеотида
-

праймера размером около 20 нуклеотидов. Каждый из них
комплементарен одному из
3‱
-
концов фрагмента ДНК. ДНК нагревают для
разделения цепей двойной спирали, а при охлаждении происходит
гибридизация праймеров с комплементарными участками фрагментов ДНК. В
результате в растворе будут находиться однонитевые ДНК с короткими
двухцепочечным
и участками
-

затравками (праймерами). При добавлении
нуклеотидов и ДНК
-
полимеразы синтезируются комплементарные цепи и
образуются идентичные фрагменты ДНК (первый цикл, рис. 43). Реакция
останавливается и ДНК снова денатурируется прогреванием.

В процессе
охлаждения праймеры, находящиеся в избытке, вновь эффективно
гибридизуются, но уже не только с цепями исходной ДНК, но и с вновь
синтезированными. Внесение в систему ДНК
-
полимеразы инициирует второй
цикл полимеразной реакции. Многократное повторение описан
ной процедуры
позволяет провести 30 и более циклов ферментативного удлинения праймеров.
При этом число сегментов ДНК, ограниченных с обоих концов используемыми
праймерами, с каждым циклом ПЦР увеличивается экспоненциально
(приближается к зависимости 2n, гд
е n


число циклов). Выход всех других
продуктов реакции увеличивается по линейной зависимости . Таким образом, в
процессе рассматриваемой реакции эффективно амплифицируется только та
последовательность ДНК, которая ограничена праймерами.


Используя мет
од ПЦР, можно in vitro селективно обогащать препарат ДНК
фрагментом с определенной последовательностью в миллион и более раз. Это
позволяет надежно выявлять однокопийные гены и их варианты в таких
больших и сложных геномах, каким является геном человека. Ч
увствительность
метода такова, что амплифицировать в ПЦР и выявить целевую
последовательность можно даже в том случае, если она встречается однажды в
образце из 100 000 клеток. Получаемый сегмент ДНК надежно выявляется в
виде дискретной полосы после электр
офоретического разделения молекул ДНК
и окраски их этидиум бромидом. Если к праймеру пришить фермент, то
ферментная метка будет накапливаться при амплифицировании. Продукт
амплификации проверяется по принципу ИФА, то есть добавляется субстрат и
отмечается
изменение окраски. В качестве метки можно использовать
стрептавидин. Его можно пришивать как к праймеру, так и к нуклеотидам. В
последнем случае нуклеотиды, меченные стрептавидином, добавляются к
обычным, идущим на синтез комплементарной цепи ДНК. Этим дос
тигается
еще большее усиление сигнала.


Размноженный in vitro фрагмент получают в количествах, достаточных для
его прямого секвенирования. Поскольку при этом не требуется промежуточный
этап клонирования фрагмента ДНК в молекулярных векторах, ПЦР иногда
72

называют бесклеточным молекулярным клонированием (cell
-
free molecular
cloning). Автоматизированная процедура Taq
-
полимеразной цепной реакции,
состоящая из 30 и более циклов, занимает 3

4 часа, что существенно быстрее
и проще процедуры клонирования определе
нного фрагмента ДНК в составе
векторных молекул.


В целях генетической инженерии амплифицированные фрагменты можно

использовать для клонирования. Для этого часть полученной после ПЦР
суспензии молекул используют для проведения электрофореза и убеждаются
,
что в смеси в значительном количестве присутствуют молекулы заданной
длины. Затем либо вымывают эти молекулы из геля, либо берут оставшуюся
часть раствора с продуктами ПЦР и проводят смешивание и лигирование с
заранее подготовленной ДНК плазмиды
-
вектора.


Помимо генетической инженерии метод ПЦР находит широкое практическое
применение в других сферах научной и практической деятельности. В
медицине,ветеринарии, в защите сельскохозяйственных растений от болезней с
помощью ПЦР можно обнаруживать вирусы, ба
ктерии или другие содержащие
ДНК объекты, даже если они присутствуют в исследуемых образцах в таких
количествах, которые не детектируются никакими другими методами.
Сочетание метода обратной транскрипции (о

нем вы уже знаете из предыдущего параграфа) и ПЦР

позволяет обнаруживать в
исследуемом материале и ничтожно малые количества определенных РНК. В
этом случае сначала получают соответствующую искомой РНК кДНК, а затем
амплифицируют ее до нужных количеств. Благодаря этому при постановке или
подтверждении ди
агноза можно

выявлять не только ДНК
-
содержащие, но и РНК
-
содержащие вирусы,
вызывающие болезни людей, животных или растений. В криминалистике метод
ПЦР позволяет в сочетании с другими методами установить принадлежность
исследуемого материала не только конк
ретному виду организмов, но и
конкретному индивидууму.

В научно
-
исследовательской работе клонирование генов с предварительным

использованием ПЦР также получило очень широкое распространение. При
исследовании конкретных организмов ПЦР позволяет быстро клони
ровать и
секвенировать (определять последовательность нуклеотидов) определенные
гены и межгенные участки ДНК, что, в свою очередь, дает возможность
определять видовую и внутривидовую принадлежность, устанавливать
происхождение и эволюционные взаимоотношени
я для конкретных видов.

Благодаря этому современная биологическая систематика все больше и больше
превращается в так называемую геносистематику, чему способствует создание
общемировых баз данных, доступных для исследователей разных стран через
систему Инте
рнет. Кроме того, ПЦР
-
амплификация, клонирование генов и
последующая их экспрессия в клетках микроорганизмов позволяет изучать
ранее недоступные для исследования из
-
за их малого количества белковые
молекулы, например, некоторые рецепторы для гормонов или д
ействующие
внутри клеток регуляторные белки. И это еще далеко не все возможности,
73

которые открывает ПЦР для современной биологии и медицины.


Практическое задание1


Изобразите схематично процесс клонирования фрагмента ДНК в живой
клетке.


Этапы вы
полнения задания:

1 Изучить материал занятия и фильма по данной теме

2 Выделить основные этапы процедуры

3 Составить схему процесса клонирования фрагмента ДНК в живой клетке.


Практическое задание2


На месте преступления обнаружены микроскопически
е фрагменты кожи
преступника. В преступлении подозреваются три человека.

Один из них страдает серповидноклеточной анемией, при которой в молекуле
гемоглобина шестой аминокислотный остаток
-

это не остаток валина, а остаток
глутаминовой кислоты. Составьте п
лан
-
схему исследования с применением
метода ПЦР, по результатам которого будет обвинен или оправдан один из
подозреваемых.


Этапы выполнения задания:

1. Изучить материал и фильм по принципу и методике постановки ПЦР.

2 Определить как можно использовать
ПЦР для решения поставленной задачи

3. Определить этапы работы по решению задачи

4. Изобразить в виде схемы исследований для решения поставленной задачи.



Вопросы и задания для контроля знаний

1 Опишите процесс конструирования рекомбинантной ДНК.

2 Чт
о такое ДНК
-
полимераза и зачем она нужна генным инженерам?

3Что такое геномная библиотека?

4 Чем клоновая библиотека отличается от геномной?

5 Что такое праймеры для ПЦР и почему их нужно два?

6 Зачем нужно неоднократно нагревать и охлаждать смесь, в котор
ой
проводится ПЦР?






















74


Рекомендуемая литература и источники


1 Григорьев, А. А. Введение в технологию отрасли. Технология рыбы и рыбных
продуктов : учеб. пособие / А. А. Григорьев, Г. И. Касьянов.


Москва : КолосС,
2008.


112 с.

2 Иванова, Л. А. Пищевая биотехнология. В 4 кн. Кн. 2. Переработка
растительного сырья : учеб. пособие / Л. А. Иванова, Л. И. Войно, И. С.
Иванова ; под ред. И. М. Грачевой.


Москва : КолосС, 2008.


472 с.

3 Клунова, С. М. Биотехнология : учебник

для вузов / С. М. Клунова, Т. А.
Егорова, Е. А. Живухина.


Москва : Академия, 2010.


256 с.

4 Мезенова, О. Я. Технология и методы копчения пищевых продуктов : учеб.
пособие / О. Я. Мезенова.


Санкт
-
Петербург : Проспект науки, 2007.


288 с.

5 Нечаев, А
. П. Пищевые добавки : учебник / А. П. Нечаев, А. А. Кочеткова, А.
Н. Зайцев.


Москва : Колос, 2001.


256 с.

6
Пащенко, Л. П. Технология хлебобулочных изделий : учеб. пособие / Л. П.
Пащенко, И. М. Жаркова.


Москва : КолосС, 2006.


389 с.

7 Процессы и
аппараты пищевой технологии : учеб. пособие / под ред. С. А.
Бредихина.


Санкт
-
Петербург : Лань», 2014.


544с.


(Учебники для вузов.
Специальная литература).


Режим доступа:
http://e.la
nbook.com/books/element.php?pl1_id=50164

8 Рогов, И. А. Пищевая биотехнология. В 4 кн. Кн. 1. Основы пищевой
биотехнологии / И. А. Рогов, Л. В. Антипова, Г. П. Шуваева.


Москва : Колос,
2004.


440

9 Шмид, Р. Наглядная биотехнология и генетическая инжен
ерия
[Электронный ресурс] / Р. Шмид.


Москва : Лаборатория знаний, 2015.


327 с.


Режим доступа:
http://e.lanbook.com/books/element.php?pl1_id=66240


10 Сироткин, А.С. Теоретические осн
овы биотехнологии : учебно
-
методическое
пособие / А.С. Сироткин, В.Б. Жукова ; Федеральное агенство по образованию,
Казанский государственный технологический университет.
-

Казань : КГТУ,
2010.
-

87 с. : ил., схемы, табл.
-

Библ. в кн.
-

ISBN 978
-
5
-
7882
-
09
06
-
7 ; То же
[Электронный ресурс].
-

URL:
http://biblioclub.ru/index.php?page=book&id=270560

11 Цымбаленко, Н.В. Биотехнология : учебное пособие / Н.В. Цымбаленко ;
Российский государственн
ый педагогический университет им. А. И. Герцена.
-

СПб : РГПУ им. А. И. Герцена, 2011.
-

Ч. 1.
-

128 с. : ил.
-

Библиогр. в кн.
-

ISBN
978
-
5
-
8064
-
1697
-
2 ; То же [Электронный ресурс].
-

URL:
http://biblioclub.ru/index.php?page=book&id=428265












75











Приложенные файлы

  • pdf 1270063
    Размер файла: 785 kB Загрузок: 0

Добавить комментарий